Спосіб визначення істинності отрути сірої медоносної бджоли apis mellifera

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунофармакологии, в частности идентификации и стандартизации лекарственного сырья и лекарственных средств. Прототипом заявляемого способа является способ определения подлинности пчелиного яда с помощью реакции иммуноп репарации [1], основанный на взаимодействии пчелиного яда с иммунной сывороткой животных, иммунизированных препаратами яда пчелы. Однако отмеченный выше прототип имеет значительные ограничения при применении в целях идентификации и стандартизации образцов пчелиного яда. 1. Большой процент неспицифических ("ложноположительных") реакций с нормальной кроличьей сывороткой при испытании Образцов пчелиного яда в концентрациях от 4,0 до 0,5 мг/мл, в частности при концентрации яда 4,0 мг/мл наблюдается 100% "ложноположительных" реакций с нормальной кроличьей сывороткой, при концентрации 2,0 мг/мл - 98%, при концентрациях 1,0 и 0,5 мг/мл соответственно 83,5 и 10% "ложноположительных" реакций. 2. Значительное снижение достоверности стандартизации исследуемых образцов пчелиного яда при снижении его концентрации от 0,2 мг/мл до 0,03 мг/мл. Так, при испытании различных образцов яда в концентрации 0,2 мг/мл остаются не идентифицированными 7,5% их, а, следовательно, природа изучаемых препаратов (веществ) не может быть определена. Количество образцов с неустановленной подлинностью при уменьшении концентрации яда возрастает: при 0,1 мг/мл - до 12,4%; при 0,06 мг/мл до 32,9%; при 0,05 мг/мл -до 30%; при 0,03 мг/мл-до 95%. Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют об ограниченном применении способапрототипа в связи с наличием отрицательных результатов при концентрациях пчелиного яда 0,2-0,03 мг/мл и неспецифических ("ложноположительных") реакций с нормальной кроличьей сывороткой в диапазоне концентраций пчелиного яда от 0,5 до 4,0 мг/мл (56). Указанная задача решается тем, что кроликов иммунизируют анатоксином пчелиного яда с полным адьювантом Фрейнда. затем реиммунизируют ядом пчелы, после чего из крови животных выделяют сыворотку, лиофилизируют ее и при помощи полученной сыворотки определяют подлинность яда пчелы реакцией преципитации между антителами сыворотки и ядом пчелы. Пример 1. Приготовление анатоксина пчелиного яда. Навеску пчелиного яда растворяют в физиологическом растворе рН 7,2 до конечной концентрации яда 2 мг/мл. К раствору яда при постоянном перемешивании на магнитной мешалке по каплям из бюретки добавляют формалин до конечной его концентрации 0,5%. Раствор яда помещают в термостат при +37°С, где выдерживают 60 суток. Пример 2. Приготовление эмульсии анатоксина пчелиного яда в полном адьюванте Фрейнда (ПАФ). 1,5 мл анатоксина, содержащего 2 мг/мл пчелиного яда, смешивают с 1 мл ПАФ при +56°С и эмульгируют на ультразвуковом дезинтеграторе 2-3 с. Пример 3. Приготовление рабочего раствора пчелиного яда. Навеску пчелиного яда растворяют в физиологическом растворе до конечной концентрации 2 мг/мл и сохраняют при +4°С в течение 2-х недель. Пример 4. Схема иммунизации кроликов (табл. 1). Пример 5. Получение сыворотки иммунизированных кроликов. На 7-е сутки после завершения иммунизации у кроликов берут кровь из краевой вены уха и отделяют сыворотку общепринятым методом [2]. Пример 6. Стабилизация сыворотки методом лиофильного высушивания. Лиофильное высушивание производят на установке KS-30 фирмы "Фригера" (можно использовать любую установку для лиофильного высушивания). Пример 7. Определение подлинности пчелиного яда. Образцы пчелиного яда исследуют при помощи полученной сыворотки в реакции иммунодиффузии, которую выполняют общепринятым методом [3], (табл. 2). Следовательно, при испытании заявляемого способа определения подлинности пчелиного яда путем иммунодиффузионного анализа с высоко специфической гипериммунной сывороткой, содержащей антитела против пчелиного яда, установлена высокая достоверность идентификации исследуемых образцов. Крайне необходимо подчеркнуть, что препараты пчелиного яда могут быть идентифицированы в 100% случаев (образцов) при их использовании в широком диапазоне концентраций - от 0,062 до 4 мг/мл. Пример 8. Оценка специфичности иммунодиффузионного метода определения подлинности пчелиного яда. а) Изучение спектра способа при испытании различных ядов животного происхождения (табл. 3). б) Изучение метода иммунодиффузионного анализа пчелиного яда ч: нормальной кроличьей сывороткой - выявление наличия "ложноположительных" реакций (табл. 4). в) Изучение специфичности метода путем постановки реакции преципитации пчелиного яда со специфической гипериммунной сывороткой (табл. 5). Таким образом, представленные в табл. 3-5 данные свидетельствуют о специфичности заявляемого способа определения подлинности пчелиного яда. Это подтверждают данные об отсутствии преципитации между сывороткой против яда пчелы и 13 ядами животного происхождения, в то время как яд пчелы в 100% случаев преципитирует указанную сыворотку. Заявляемый способ имеет преимущество в плане специфичности при изучении с нормальной кроличьей сывороткой, так как не дает "ложноположительных" реакций в данных условиях эксперимента. Кроме того, специфичность способа подтверждена путем торможения преципитации пчелиного яда с гипериммунной сывороткой. Применение для торможения пчелиного яда приводило к "гашению" преципитации, в то время как при применении гетерологичного яда шершня такого феномена не возникало. Следовательно, применение данного способа дает возможность быстро и надежно идентифицировать пчелиный яд, который широко используется в качестве природного сырья при производстве лекарственных препаратов и для выделения из него различных физиологически активных веществ (апамин, меллитин и др.). Способ идентификации пчелиного яда может найти применение в различных отраслях и видах хозяйства и научно-практической деятельности, начиная с пчеловодческих хозяйств и заканчивая фармацевтическими предприятиями и лабораториями, решающими проблемы идентификации и стандартизации пчелиного яда для Нужд фармации, биоорганической химии, нейрофармакологии и т. д.