Гуанідинвмісний аддукт як бактерицидна речовина

Винахід відноситься до гуанідину, його солей, комплексів або продуктів приєднання, конкретно до гуанідинвмісного аддукту формули: H2N - C - NH - CH2 - CH - R - CH - CH2 - NH - C - NH2 NH.HCl OH OH NH.HCl CH3 де R CH2 - O C O - CH2 CH3 який є бактерицидною речовиною та призначений для використання в мікробіологічній промисловості, а також для обробки води, як дезінфектант та антисептик. В літературі відомі способи отримання бактерицидних речовин, які містять у своєму складі вторинні та третинні аміногрупи [1, 2]. Відомою бактерицидною речовиною є алкоксиметилметиламонійметасульфат, комерційна назва алкамон ДС [3] формули: + [CnH2n+1 OCH2 N(CH3)(CH2CH3)2 ][CH3SO 4] n=10-18 Він широко використовується як дезінфікуюча речовина для обробки приміщень тваринницьких ферм, ветеринарного, промислового та медичного обладнання. Але після проведення досліджень він характеризується незначною бактерицидною активністю по відношенню до умовно-патогенних грампозитивних та грамнегативних бактерій. Крім того він не виробляється в Україні. Задачею винаходу є створення гуанідинвмісного аддукту, який забезпечує бактерицидну активність по відношенню до грампозитивних та грамнегативних бактерій. Поставлена задача виконується одержанням гуанідинвмісного аддукту формули: H2N - C - NH - CH2 - CH - R - CH - CH2 - NH - C - NH2 NH.HCl де R CH2 - O OH OH NH.HCl CH3 C O - CH2 CH3 Суть винаходу пояснюється наступним прикладом: Приклад 1 Отримання гуанідинвмісного аддукту. В реактор загружають 36г епоксидної смоли Epicot-828 (м.м. 360) (0,1моля) який розчиняють у етанолі концентрація 80%, та поступово прикапують спиртовий розчин 10,9г гуанідину (0,2молю) у 10,9г етанолу. Реакцію проводили 2-3 години при 50-60°С. Контроль за завершеністю реакції проводили титрометричним методом по вмісту епоксидних груп та методом ІЧ спектроскопії по зникненню смуг поглинання епоксидних груп 920см -1 та титруванням кінцевих аміногруп. Для дослідження дезинфікуючої та бактерицидної активності синтезованих сполук по відношенню до грампозитивних та грамнегативних бактерій використовували штами бактерій Чеської (ССМ), Американської (АТСС) та Української колекції мікроорганізмів (УКМ) та деякі ізоляти, які на даний час підтримуються у навчально-методичній лабораторії мікробіологічного профілю кафедри біології НаУКМА, зокрема: Escherichia coli BE, Escherichia coli HB 101, Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa CCM 1961; Serratia marcescens CCM 1257; Proteus vulgaris CCM 72; Enterobacter cloaceas; Klebsiella pneumoniae; Micrococcus luteus CCM 169 Tип; Staphylococcus aureis CCM 209; Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871Tип=У KM Ac-732; Corynebacterium variable ATCC 15753Тип=УКМ Ac-717; Rhodococcus erythropolis УКМ Ac-741Тип; Bacillus megaterium CCM 51 (Типштам, типовий для виду). Усі бактерії культивували на м'ясо-пептитидному агарі (МПА), для культивування кишкової палички застосовували середовище Ендо. Бактерицидну активність визначали суспензійним методом [6]. Оптимальний час дії вказаної сполуки за певних концентрацій визначали через 15 та 30 хвилин при висіву на чашки Петрі з середовищем МПА чи Ендо за методом Yould [7]. Кількість бактерій, що вижили після такої обробки, визначали за числом колонієутворюючих одиниць (КУО/мл) через 24 години інкубації при температурі 37°С за вказаним методом. Ефективність бактерицидної дії сполук визначали за кількістю клітин, що вижили, розраховуючи їх життєздатність за формулою: C=lgNt/Ntk, де Nt - кількість бактерій, що вижили після дезинфіктанту, Ntk - кількість бактерій у контролі за той самий проміжок часу. Ефективність препаратів оцінювали за шкалою, наведеною в таблиці 1. Таблиця 1 Шкала оцінки ефективності препаратів Значення С (lgNt/Ntk), КУО/мл від -2,0 до -2,9 від -3,0 до -3,9 від -4,0 до -4,9 від -5,0 до -5,9 від -6,0 та більше Кількість клітин, що загинули, % 99,0 99,9 99,99 99,999 >99,999 Досліди проводили у 3-х повторах, отримані результати обробляли математично на персональному комп'ютері. Мінімальну пригнічувальну концентрацію сполук по відношенню до грамнегативних та грампозитивних бактерій визначали методом розведень в агаризованому середовищі в модифікації реплік [8]. Кінцеві концентрації сполук в МПА відповідно становили: 200, 180, 140, 120, 100, 50, 25, 10ppm. Мінімальною пригнічувальною концентрацією (МПК) вважали ту найменшу концентрацію сполук в середовищі, за якою був відсутній ріст мікроорганізмів на МПА. Суспензії добових тест-к ультур готували у стерильному фізичному розчині (1´109кл/мл), в об'ємі 0,2мл вносили у лунки реплікатора та висівали паралельно на три чашки Петрі відповідно до схеми експерименту. Результати обраховували через 24 та 48 годин культивування бактерій, при 32-37°С. Як контроль використовували середовище МПА без додавання синтезованих сполук. Результати дослідження бактерицидної активності сполук по відношенню до грамнегативної бактерії Escherichia coli HB 101, так як ця культура є санітарно-показовою мікробіологічної якості води, наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Бактерицидна активність синтезованих сполук по відношенню до грамнегативної бактерії Escherichia coli HB 101 Сполука 10 ++++ ++++ Гуанідинвмісний аддукт алкамон ДС Кінцева концентрація сполук у середовищі (ppm): 25 50 100 120 140 180 ++++ ++++ ++++ +++ +++ ++ 200 + Контроль ++++ ++++ Примітка: в таблиці наведені зведені дані, після висіву культур на 3-х чашках Петрі; "-" - ріст мікроорганізмів відсутній; "+"- поодинокі колонії; "++++" - суцільний ріст. З таблиці видно, що у результаті порівнювання бактерицидної активності отриманої сполуки по відношенню до грамнегативної бактерії Escherichia coli HВ 101 було встановлено, що максимальну бактерицидну дію виявляє вже при концентрації 10ppm не росла ця культура, тоді як відома бактерицидна речовина алкамон ДС характеризується набагато нижчою бактерицидною активністю по відношенню до цієї культури. Результати визначення мінімальної пригнічувальної концентрації гуанідинвмісного аддукту по відношенню до грамнегативних та грампозитивних бактерій наведені в таблиці 3. Таблиця 3 Мінімальна пригнічуюча концентрація гуанідинвмісного аддукту по відношенню до грамнегативних та грампозитивних бактерій Культура Pseudomonas aeruginosa CCM 1961 Staphylococcus aureis CCM 209 Концентрація сполук, ppm Гуанідинвмісний алкамон аддукт ДС 50 195 10 195 Порівняльний аналіз МПК гуанідинвмісного аддукту з відомою бактерицидною речовиною (алкамон ДС) показав, що він характеризуються більш високою бактерицидною активністю ніж алкамон ДС по відношенню до грамнегативних та грампозитивних бактерій. Так, МПК алкамону ДС була більше ніж в 10 для грампозитивних і більше ніж в 4 для грамнегативних. Результати порівняльної оцінки чутливості тест-культур - представників грампозитивних та грамнегативних бактерій представлені в таблиці 4. Таблиця 4 Бактерицидні активність гуанідинвмісного аддукту по відношенню до різних груп бактерій Тест-культура (рід, вид, штам) Кінцева концентрація сполуки M1 у середовищі (ppm):Контроль 10 25 50 100 120 140 180 200 Грампозитивні бактерії Micrococcus luteus CCM 169Тип Corynebacterium ammoniagenes УКМ Ac-732 Corynebacterium variable УКМ Ac-717 Rhodococcus erythropolis УКМ Ас-741Тип Staphylococcus aureis CCM 209 Bacillus cereus Bacillus subtilis CCM 104 Bacillus megaterium CCM 52 + Грамнегативні бактерії Enterobacter cloaceas ++++ ++++ + Serratia marcescens CCM 1257 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ + Escherichia coli +++ Escherichia coli BE Escherichia coli HB 101 ++++ Pseudomonas aeruginosa CCM 1961 ++++ ++ Proteus vulgaris CCM 72 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ Klebsiella pneumoniae ++++ +++ + ++++ ++++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ Примітка: в таблиці наведені зведені дані, після висіву культур на 3-х чашках Петрі; "-" - ріст мікроорганізмів відсутній; "+" - поодинокі колонії; "++++" - суцільний ріст. У результаті вивчення бактерицидного гуанідинвмісного аддукту по відношенню до різних груп бактерій було встановлено, що максимальну бактерицидну дію він виявляє до грампозитивних бактерій. З концентрації 25100ppm не росла жодна з досліджених тест-культур - представників грампозитивних бактерій. Мінімальною пригнічувальною концентрацією для штамів Micrococcus luteus CCM 169Tип; Staphylococcus aureis CCM 209; Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871 Tип=УКМ Ac-732; Corynebacterium variable ATCC 15753Tип=УKM Ac-717; Rhodococcus erythropolis УКМ Ac-741Tип; Bacillus cereus, Bacillus subtilis CCM 104 була концентрація 10ppm. Виключення становив штам Bacillus megaterium, для якою визначена МПК становила 25ppm. Більш стійкими до гуанідинвмісного аддукту виявилися представники грамнегативних бактерій. Серед усіх досліджених грамнегативних бактерій найбільш чутливими виявилися штами Escherichia coli, зокрема для штаму Escherichia coli BE МПК становила 10ppm, а для штамів Escherichia coli; Escherichia coli HB 101 - 25ppm. Практично однаково гуанідинвмісний аддукт впливав на штами Klebsiella pneumoniae і Pseudomonas aeruginosa CCM 1961 - МПК для цих культур становила 50ppm, тоді як штам Enterobacter cloaceas витримував дещо більші концентрації. МПК для цього штаму була вдвічі вищою - 100ppm. Найбільш стійкими до гуанідинвмісного аддукту виявилися штами Serratia marcescens CCM 1257; Proteus vulgaris CCM 72 - лише збільшення концентрації гуанідинвмісного аддукту до 200ppm призводило до повної загибелі цих культур. Таким чином було встановлено, що за концентрації 200ppm гуанідинвмісний аддукт на середовищі не ріс жодний з досліджених штамів, тобто саме ця концентрація гарантувала 100% загибель усіх досліджених тест-культур. Перевагою синтезованого гуанідинвмісного аддукту є більш висока бактерицидна активність по відношенню до грамнегативних та грампозитивних бактерій ніж відомої бактерицидної речовини алкамон ДС. Джерела інформації: 1. Патент ГДР №215708, Спосіб одержання епоксидних змінних адуктів, 21.01.1981р. 2. Заявка ФРН №3736995, Синтетична смола, що містить азотні групи та її призначення, 11.05.89р. 3. N. Destais, D. Ades, J. Saue. Polym. Bull., 2000, 44, 401. 4. Macromolec. Mater. Eng., 2001, 286, №2, p.63-87. 5. Радченко О.С., Степура Л.Т., Фуртат І.М., Ми хальський Л.О., Крамарєв С.О., Перспективність застосування четвертинних амонійних сполук для санації слизових оболонок та дезинфекції ран // Інфекційні хвороби. - 2002. №1. - С.59-63. 6. Степура Л.Г., Радченко О.С., Фурта т І.М., Михальський Л.О., Бактерицидні властивості катіонних та інши х поверхнево-активних речовин // Агроекологічний журнал. - 2002. - №4. - С.60-63. 7. Yauld J.P. Quantity and anality in the diagnosis of ururory troot infection // Brit. J. Urol. - 1965. - 37. №1. - Р.7-12. 8. Василевская И.А., Сергейчук М.Г., Згонник В.В., Фур тат И.М., Ми хальский Л.А. Усовершенствование метода бактериологического контроля в производстве лизина // Мікробіол. журн. - 1996. - 58, №5. - С.66-76.