Протез на довгу куксу стопи

Даний винахід стосується кристалічної каротиноїдної сполуки з чистотою >95% без якої-небудь значної кількості органічного розчинника всередині просторової решітки кристалічного каротиноїду, і способу одержання вказаної сполуки.

Обґрунтування винаходу

Каротиноїди є найбільш численною і широко поширеною групою пігментів, знайдених в природі. Деякими окремими прикладами каротиноїдних сполук є: β-каротин, β-апо-4'-каротинал, β-апо-8'-каротинал, β-апо-12'-каротинал, β-апо-8'-каротинова кислота, астаксантин, кантаксантин, зеаксантин, криптоксантин, цитранаксантин, лютеїн, лікопен, торулародин-альдегід, торулародин-етиловий ефір, нейроспораксантин-етиловий ефір, зета-каротин ідегідроплектаниаксантин. Крім того, каротиноїд відомий як один з пігментів, які широко використовуються для фарбування харчових продуктів, косметики, ліків тощо.

Каротиноїдні кристали звичайно одержують загальноприйнятим хімічним способом. Однак на сьогоднішній день існує значна потреба в продуктах, одержаних з натуральних джерел. При одержанні з натуральних джерел каротиноїд переважно знаходиться в формі масляного екстракту (пальмове масло, масло водоростей). Хоча можливе також одержання кристалічного каротиноїду, наприклад, β-каротину, з природних джерел, таких як овочі (наприклад, морква), або мікроорганізми (наприклад, водорості (Dunaliella) або гриби (Blakeslea)), існуючі в цей час способи одержання відносно чистих кристалів з вказаних природних джерел мають істотні недоліки.

Виділення кристалічного каротиноїду, такого як β-каротин, з природних джерел включає, наприклад, екстракцію β-каротину з вказаного джерела, як описано в міжнародній патентній заявці WO 9803480, і стадії додаткового очищення. Екстракцію виконують за допомогою різних органічних розчинників, таких як ацетон, етилацетат, бутилацетат, гексан, дихлорметан або гексан, рослинні олії або надкритичні рідини, такі як пропан, етилен або двоокис вуглецю. Для одержання відносно чистого препарату β-каротину необхідне додаткове очищення екстракту. Описано декілька способів очищення, серед яких хроматографія, способи адсорбції/десорбції і кристалізація або осадження.

Каротиноїдні кристали, які кристалізують з екстракту, одержаного екстракцією розчинником з відповідного природного джерела, наприклад, шляхом упарювання розчинника, мають властивий початковому матеріалу запах і звичайно містять деякі домішки, наприклад, сам розчинник і домішки, що виникають на стадії екстракції. У таких випадках потрібна перекристалізація, наприклад, як описано в патентах Сполучених Штатів США 3.268.606 і США 4.439.629. Основний недолік перекристалізації полягає в тому, що для розчинення каротину потрібна велика кількість розчинника. Додатково, щоб перекристалізувати каротин з досить високим виходом, необхідна також велика кількість антирозчинника (осаджуючого розчинника). Таким чином, недолік вказаних способів полягає в тому, що вони вимагають великих кількостей розчинників і при цьому цілком можлива значна втрата каротину. Крім того, розчинник включається до просторової решітки кристалічного каротиноїду.

У міжнародній патентній заявці WO 9850574 описаний спосіб виділення каротиноїдної сполуки з мікробної біомаси, який включає стадії руйнування оболонок мікробних клітин і відділення продуктів розпаду клітин від залишку, який містить каротиноїд, що включає промивання мікробної біомаси. Зруйновану клітинну масу або залишок, що містить каротиноїд, обробляють відповідним розчинником для видалення ліпіду і суспендують одержані каротиноїдні кристали у воді, щоб вони спливали. Після чого кристалічний продукт відділяють і, необов'язково, додатково очищають. У міжнародних патентних заявках WO 9843620, WO 9723436 і WO 9731894 описаний спосіб одержання каротиноїдної сполуки з екстракційного ефірного масла, де спосіб включає обробку лужним реагентом в органічному середовищі, з подальшим додаванням антирозчинника для одержання кристалічної каротиноїдної сполуки. Основний недолік як розчинення зруйнованої клітинної маси в розчиннику, так і додавання антирозчинника полягає у включенні розчинника в каротиноїдні кристали.

Несподівано заявниками було знайдено, що дуже чисті каротиноїдні кристали, які по суті не містять розчинник в кристалічній решітці, можуть бути ефективно виділені з кристалічної суспензії мікробного джерела без використання способу екстракція/антирозчинник, що дає каротиноїдні кристали з чистотою, щонайменше, 95%.

Докладний опис винаходу

Даний винахід описує кристалічний каротиноїд з чистотою ³95%, переважно ³96%, більш бажано, ³97%, ще більш бажано, ³98%, найбільш переважно, ³99%, який по суті не містить розчинник в кристалічній решітці. «Який по суті не містить розчинник» означає, що кількість розчинника нижче за 0,5%(м/м), переважно, нижче за 0,2%(м/м), більш бажано, нижче за 0,1%(м/м), найбільш переважно, нижче за 0,05%(м/м).

Крім того, описаний ефективний і надійний спосіб виділення вказаної каротиноїдної сполуки, переважно з мікробних клітин. Згідно зі способом за даним винаходом, каротиноїдні кристали очищають від мікробних клітин, видаляючи всі домішки, присутні в суспензії кристалічного каротиноїду, що не приводить до включення розчинника в кристалічну решітку.

Спосіб за винаходом включає такі стадії;

(a) руйнування каротиноїд-вмісних клітин, переважно з мікробного джерела, і відділення масляної суспензії кристалічного каротиноїду,

(b) обробку масляної суспензії кристалічного каротиноїду лугом при рН9-12 і температурі 10-95°С, переважно, при 30-85°С, найбільш переважно при 50-75°С, і, необов'язково, в присутності нижчого спирту,

(c) необов'язкове додавання солі до обробленої лугом масляної суспензії кристалічного каротиноїду,

(d) необов'язкове відділення суспензії кристалічного каротиноїду від рідкої фази, (є) необов'язкове промивання суспензії кристалічного каротиноїду водним розчином, який містить сіль,

(f) промивання суспензії кристалічного каротиноїду на початковій стадії промивання нижчим спиртом, де порядок виконання стадій (b)-(е) і (f) довільний,

(g) промивання сирих каротиноїдних кристалів, що утворюються на стадіях обробки (a)-(f), водою або сумішшю нижчого спирту і води під час повторної промиваючої обробки,

(h) промивання кристалів свіжим розчинником і

(і) сушіння кристалів.

Каротиноїд-вмісні мікробні клітини (клітини мікроорганізмів) можуть бути одержані за рахунок будь-якого відповідного ферментаційного способу з вибраним каротиноїд-продукуючим мікроорганізмом. Каротиноїд-вмісним мікроорганізмом може бути бактерія, гриб, водорість або дріжджі. Переважно це гриб ряду Mucorales, краще Blakeslea trispora, водорість роду Dunaliella або дріжджі роду Phaffia, переважно, Phaffia rhodozyma.

Весь виникаючий внаслідок ферментації продукт, що включає як мікробні клітини, так і ферментативну рідину, може бути безпосередньо використаний для виділення кристалів каротиноїду. Альтернативно, перед здійсненням способу за винаходом мікробні клітини можуть бути відділені від ферментативної рідини будь-яким відповідним способом, таким як фільтрація або центрифугування.

Каротиноїд-вмісні мікробні клітини розкривають шляхом руйнування оболонок клітин за допомогою механічної, хімічної і/або ферментної обробки. Наприклад, клітини можуть бути піддані гомогенізації, впливу ультразвука, автолізу, осмолізу і/або плазмолізу, необов'язково, з додаванням відповідних агентів, таких як детергенти, кислоти, основи, ферменти, речовини, що спричинюють до автолізу, осмолізуючі агенти, такі як солі, і/або плазмолізуючі агенти. При такому способі з клітин виділяють масляну суспензію кристалічного каротиноїду, після чого масляну суспензію кристалічного каротиноїду відділяють від продуктів розпаду клітини, переважно центрифугуванням.

Одержану таким чином масляну суспензію кристалічного каротиноїду потім додатково очищають. Перед проведенням наступної стадії очищення масляна суспензія кристалічного каротиноїду може бути промита один або більше разів водою.

Наступна стадія очищення полягає в обробці масляної суспензії кристалічного каротиноїду лугом. Лужна обробка включає додавання лужного водного розчину з рН між 9 і 12 до масляної суспензії каротиноїду і подальшої інкубації, бажано при перемішуванні, протягом відповідного періоду часу при температурі між 10-95°С, переважно між 30-85°С, більш переважно між 50-75°С. Співвідношення лужного розчину і масляної суспензії каротиноїду звичайно може варіюватися приблизно від 5:1 до 1:1(м/м). Тривалість лужної обробки залежатиме від рН і температури, що використовуються, в значенні, що чим нижчі рН і 5 температура, які використовуються під час обробки, тим більшим повинен бути час. Наприклад, лужну обробку можна здійснювати протягом 2 годин при рН 12 і температурі 75°С, або протягом 8 годин при рН10 і температурі 50°С. Необов'язково, лужну обробку можна проводити в присутності нижчого спирту.

Після лужної обробки до обробленої лугом суспензії кристалічного каротиноїду, необов'язково, може бути додана водорозчинна сіль, така як хлорид натрію. Суспензії кристалічного каротиноїду може бути потім відділена від рідкої фази і, необов'язково, може бути промита водним розчином, що містить сіль. Відділення суспензії кристалічного каротиноїду може бути виконане у будь-який відомий у даній області спосіб, такий як фільтрація, центрифугування або охолоджування.

Суспензію кристалічного каротиноїду піддають потім первинному промиванню, що включає промивання суспензії нижчим спиртом, що приводить до утворення сирих кристалів каротиноїду. Первинне промивання може бути повторене один або більше разів.

Звичайно стадія промивання, що здійснюється за даним винаходом, включає перемішування (масляної) суспензії кристалічного каротиноїду або (сирих) кристалів каротиноїду з промиваючою рідиною і подальше відділення (масляної) суспензії кристалічного каротиноїду або кристалів від рідкої фази.

За одним з переважних варіантів виконання винаходу сирі кристали каротиноїду одержують з іншим порядком попередніх стадій.

Масляну суспензію кристалічного каротиноїду, одержану після відділення кристалів від зруйнованих клітин, спочатку промивають один або більше разів нижчим спиртом, після чого виконують лужну обробку як описано вище. Лужну обробку, необов'язково, проводять в присутності нижчого спирту. Альтернативно, спочатку виконують промивку (промивки) нижчим спиртом і потім промивку суспензії кристалічного каротиноїду один або більше разів лужною водою з рН між 9 і 12, необов'язково, в присутності нижчого спирту і, необов'язково, при підвищеній температурі.

Після чого суспензію кристалічного каротиноїду відділяють від рідкої фази, одержуючи сирі кристали каротиноїду.

Переважно стадії способу (a)-(f), описані вище, виконують в порядку (а), (b), (с), (d), (е), (f).

За даним винаходом нижчий спирт визначається як (С1-6)-спирт, наприклад, метанол, етанол, 1-пропанол, 2-пропанол і 1-бутанол. Нижчий спирт, стосовно до даного винаходу, може означати самостійний спирт або суміш двох або більше спиртів. Переважно, нижчим спиртом є етанол, 1-бутанол або суміш 1-бутанолу і етанолу.

Сирі кристали каротиноїду додатково очищають, використовуючи повторне промивання, що включає промивання кристалів один або більше разів водою або сумішшю нижчого спирту і води. Величина рН промивного розчину переважно має значення між 1 і 5, більш переважно, між 2 і 4. Вода може бути підкислена будь-якою відповідною кислотою, такою як сірчана кислота або соляна кислота, або кислотним буферним розчином, таким як буфер борат/сірчана кислота або цитрат/соляна кислота. Співвідношення нижчого спирту з водою в суміші нижчий спирт/вода переважно становить між 5:1 і 1:5, більш переважно, між 1:1 і 1:2.

Потім кристали відділяють від рідкої фази будь-яким відповідним способом, таким як фільтрація або центрифугування.

Далі кристали промивають один або більше разів свіжим розчинником. Свіжим розчинником є нижчий спирт, переважно етанол, або оцтовокислотний ефір нижчого спирту, переважно, етилацетат. Більш переважно, свіжий розчинник означає розчинник харчового класу.

У переважному варіанті виконання винаходу нижчий спирт, що використовується в перших двох промивках суспензії кристалічного каротиноїду, і свіжий розчинник, що використовується на кінцевій стадії промивання кристалів, є одним і тим самим розчинником.

На кінцевій стадії способу за винаходом кристали сушать.

Спосіб за даним винаходом приводить до кристалів з чистотою не менш як 95% згідно з аналітичним способом, описаним на стор. 90 в Food Chemical Codex (FCC), Edition IV (1996), National Academy Press, Washington DC.

Важлива перевага даного винаходу порівняно із загальноприйнятим способом екстракції/кристалізації для виділення кристалічного каротиноїду полягає в тому, що винахід дає змогу уникнути використання органічного розчинника для екстракції каротиноїду. Як наслідок, розчинник по суті не включається до кристалічної решітки каротиноїдної сполуки, що утворюється.

Згідно з іншим аспектом винаходу спосіб за даним винаходом використовується для підвищення вмісту каротиноїду в будь-якому неочищенному складі на основі кристалічного каротиноїду, переважно, будь-якої неочищеної суспензії кристалічного каротиноїду.

β-Каротин і астаксантин є переважними каротиноїдними сполуками даного винаходу.

Приклад 1

Одержання кристалів β-каротину з суспензії кристалічного β-каротину, одержаної з гомогенізованого ферментаційного бульйону Blakeslea trispora

(І). Ферментаційний бульйон Blakeslea trispora, що містить 0,9г/л β-каротину, гомогенізують одноразово з допомогою гомогенізатора (APV Gaulin) при 600 бар. Після чого гомогенізований бульйон центрифугують за допомогою дискової центрифуги. Верхній шар, що містить кристали β-каротину, видаляють з центрифуги. Цей верхній шар використовують як початковий матеріал для різних прикладів.

(II). 3000мл води додають до 2200г вказаного верхнього шару, що містить β-каротин, і потім суміш інкубують протягом 2 годин при рН12 (рН доводять до необхідного значення 8н NaOH) при 75°С. Реакційну суміш охолоджують до кімнатної температури і додають 350г хлориду натрію. Одержану суміш центрифугують протягом п'яти хвилин при 5000об/хв. Одержану таким чином суспензію кристалічного β-каротину одноразово промивають буфером з рН7, до якого додано 50г/л хлориду натрію.

Після центрифугування суспензію β-каротину промивають чотири рази 2,5 об'ємами (порядку 5000мл) свіжого 1-бутанолу. Кристали, що утворюються, виділені після центрифугування, тричі промивають сумішшю 1-бутанолу і буферного розчину рН2 (цитрат/соляна кислота) при співвідношенні буфера до бутанолу як 2 до 1.

Нарешті, збагачений β-каротином суміжний шар двічі промивають 2500мл 96% етанолу. Вологі кристали, одержані після центрифугування, сушать протягом ночі у вакуумі при 42°С.

Одержані кристали аналізують за FCC способом, як описано в Food Chemical Codex, Edition IV (1996), National Academy Press, Washington DC, що приводить до таких результатів:

вимоги FCC

виділені кристали

Аналіз:

>96%,<101%

97,3%

Показник А

1,14-1,18

1,16

Показник В

>15

17,4

Зольний вміст

<0,2%

0,072%

Приклад 2

Одержання кристалів β-каротину з верхнього шару, що містить кристали β-каротину промиванням кристалічного продукту сумішшю 1-бутанолу, етанолу і води.

1000мл води додають до 250г суспензії β-каротину, виділеної за прикладом 1(1) і інкубують протягом двох годин при рН12 при 75°С. Після охолоджування до кімнатної температури до реакційної суміші додають 50г хлориду натрію і одержану суміш центрифугують протягом п'яти хвилин при 5000об/хв.

Одержану таким чином суспензію β-каротину промивають буфером з рН7, до якого додано 50г/л хлориду натрію. Після центрифугування суспензію промивають 2,5 об'ємами (=500мл) свіжого 1-бутанолу. Вказану стадію повторюють тричі.

Після промивання 1-бутанолом осад після центрифугування промивають тричі 250мл суміші 1-бутанолу, етанолу і води в співвідношенні 2:3:1. Нарешті, збагачений β-каротином осад двічі промивають 50мл 96% етанолу. Одержаний після центрифугування осад сушать протягом ночі у вакуумі при 40°С. Чистота одержаних кристалів β-каротину, визначена способом за FCC, становить 98% і кількість розчинника в кристалах дорівнює 870 частин на мільйон.

Приклад 3

Одержання кристалів β-каротину з суспензії кристалічного β-каротину первинним промиванням суспензії 1-бутанолом з подальшим промиванням 1-бутанолом і буферним розчином з рН10.

250г верхнього шару, виділеного за прикладом 1(1) промивають 2,5 об'ємами (=500мл) свіжого 1-бутанолу. Вказану стадію повторюють тричі.

Після промивання 1-бутанолом суспензію кристалічного β-каротину суспендують в 250мл суміші 1-бутанолу і буферного розчину з рН10 при кімнатній температурі. Після центрифугування суспензію β-каротину промивають двічі сумішшю 1-бутанолу і буферного розчину з рН10. Нарешті, збагачену β-каротином суспензію двічі промивають 50мл 96% етанолу при температурі 50°С протягом 30 хвилин. Одержані після центрифугування кристали сушать протягом ночі у вакуумі при 40°С. Чистота кристалів β-каротину, визначена способом за FCC, становить 96%.

Приклад 4

Одержання кристалів β-каротину з суспензії, що містить кристали β-каротину, виконанням повторного промивання 1-бутанолом і водою.

П'ять різних ферментаційних бульйонів Blakeslea trispora з середнім вмістом β-каротину 1г/л гомогенізують одноразово при 900 бар. Гомогенізовану суміш різних бульйонів центрифугують, одержуючи близько 600мл верхнього шару, що містить кристали β-каротину. Верхній шар тричі промивають приблизно 600мл демінералізованої води.

Після чого 900мл води додають до 50г виділеної суспензії β-каротину. Величину рН доводять до 12 за допомогою 8 н гідроксиду натрію. Після 2 годин інкубації при вказаному рН і 75°С, реакційну суміш охолоджують до кімнатної температури.

До 500мл реакційної суміші додають 250мл 1-бутанолу. Після перемішування протягом 5 хвилин шар 1-бутанолу декантують і додають 250мл свіжого 1-бутанолу. Після додаткового перемішування протягом 5 хвилин суміш центрифугують. Суміжний шар, що містить кристали β-каротину, відділяють і суспендують в суміші 20мл води і 15мл 1-бутанолу, перемішують 5 хвилин і суміжний шар, що містить кристали β-каротину, відділяють центрифугуванням. Вказану стадію повторюють 5 разів. Потім кристали β-каротину промивають 40мл етанолу (96%) і сушать протягом 16 годин при 35°С у вакуумі. Чистота одержаних кристалів дорівнює 97% за способом згідно FCC і концентрація розчинника становить 340 частин на мільйон.