Головна дозувальна система карбюратора

Цей винахід стосується опірності до захворювань у рослин, а також ідентифікації та прищеплення опірності до захворювань рослинам. Якщо більш конкретно, цей винахід стосується визначення, виділення та характеристики гена, який бере участь у різноманітних процесах, пов'язаних з опірністю рослин до захворювань.

Рослини постійно заражаються різними патогенними організмами, такими як віруси, бактерії, грибки та нематоди. Культурні рослини є особливо вразливими, оскільки вони зазвичай ростуть як генетично однорідні монокультури; при захворюванні втрати можуть бути значними.

Проте більшість рослин мають природні механізми захисту від патогенних організмів. Природні зміни опірності до патогенів зафіксовані фахівцями з рослинництва та патології та застосовані до багатьох культурних рослин. Такі природні гени, що відповідають за опірність до захворювань, часто гарантують досить високі рівні опірності або імунітету до патогенів.

У багатьох видів рослин початкова інокуляція некротизуючим патогеном може прищепити імунітет до відповідної інфекції. Ця набута опірність до захворювань була вперше задокументована в 1901 році, і тоді їй надавали великого значення для збереження рослин у природі. Особливо докладно було описано кілька прикладів імунітету рослин, відомих як феномени системної набутої опірності (SAR) та викликаної опірності рослин, таких як тютюн, Arabidopsis та огірки. У цих системах інокуляція некротизуючим патогеном призводить до системного захисту від відповідного зараження цим самим патогеном, а також від зараження цілою низкою інших відомих у сільському господарстві бактеріальних, грибкових та вірусних патогенів.

Системна набута опірність також може бути викликана хімічними імунізуючими сполуками, тобто певними хімікатами, що призводять до утворення імунної реакції в рослинах. Такі сполуки бувають природного походження, наприклад, саліцилова кислота (SA), або вони є синтетичними хімікатами, наприклад, 2,6-дихлорізонікотинова кислота (ΙΝΑ) та S-метиловий естер бензо(1,2,3)тіадіазол-7-карботіокислоти (ВТН). Обробка патогеном або імунізуючою сполукою викликає експресію принаймні дев'яти наборів генів у найкраще описаних видів тютюну. В різних рослинах експресуються різні кількості та типи генів. Рівень індукування для пов'язаних із SAR генів, утворених з використанням хімічних сполук, у 10,000 разів перевищує фоновий рівень. Зокрема, SAR характеризується експресією пов'язаних із SAR генів, включаючи пов'язані із патогенезом гени (PR).

Пов'язані з SAR гени індукуються подальшим зараженням патогеном. Деякі з цих генів відіграють роль у створенні в рослинах системної набутої опірності. Ці рослинні білки індукуються у великих кількостях як реакція на зараження різними патогенами, включаючи віруси, бактерії та грибкові організми. Пов'язані з патогенезом (PR) білки уперше було виявлено у тютюні {Nicotiana tabacum), який виявив підвищену чутливість до зараження мозаїчним вірусом тютюну (TMV).

Після цього пов'язані з патогенезом білки {далі - PR-білки] виявляли у багатьох видів рослин (див. Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89: 245-254: Van Loon (1985) Plant Моl. Biol. 4: 111-116; та Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656). Вважається, що такі білки являють собою звичайний захист системи від зараження патогенами.

До пов'язаних з патогенезом білків належать, крім інших, такі білки, як SAR8.2a та SAR8.2b, кислотні та основні форми головних (мажорних) білків PR-la, PR-lb, and PR-lc; PR-Г, PR-2, PR-2', PR-2", PR-N, PR-O, PR-O', PR-4, PR-P, PR-Q, PR-S та PR-R тютюну; пероксидази огірків; основна пероксидаза огірків; хітиназа, яка є основним аналогом PR-P або PR-Q; бета-1,3-глюканаза (глюкан ендо- 1,3-бета-глюкосидаза, EC 3.2.1,39), яка є основним аналогом PR-2, PR-N або PR-O; індукована патогеном хітиназа з огірків. Такі PR-білки описані, наприклад, у Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; посилання на згадану роботу наводиться у цьому тексті.

Гени системної набутої опірності [далі SAR-гени] або SAR-подібні гени у всіх видів рослин відзначаються створенням системної набутої опірності. Експресію таких генів визначають шляхом зондування відомими ДНК-послідовностями, пов'язаними із SAR. Див., наприклад, Lawton et al. (1992) Proceedings of the Second European Federation of Plant Pathology (1983), In: Mechanisms of Defence Responses in Plants, B. Fritig and M. Legrand (eds), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 410-420; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; а також Ward et al. (1991) Plant Cell 3:1085-1094. Методи гібридизації та клонування добре відомі у галузі. Див., наприклад, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd Edition, Vol. 1-3, Sambrook et al.(eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); посилання на згадані роботи наводяться у цьому тексті.

Як варіант, такі SAR- або SAR-подібні гени виявляють іншими способами, наприклад, за допомогою скринінгу білків, +/- -скринінгу тощо. Див., наприклад, Liang and Pardee (1992) Science 257: 967-971, а також St. John and Davis (1979) Cell 16: 443.

Незважаючи на велику кількість досліджень і на досить складні та інтенсивні заходи щодо захисту рослин від патогенів, включаючи генетичну трансформацію рослин, втрати від захворювань складають щороку мільярди доларів. Гени опірності до захворювань клонувалися й раніше, але трансгенні рослини, трансформовані цими генами, зазвичай були опірними лише до субпопуляції штамів окремих видів патогенів. Незважаючи на спроби та зусилля клонувати гени, які б відповідали за SAR, ще й досі не виділено та не описано гена, який би створював опірність до широкого кола захворювань.

Ряд фактів свідчать про те, що SA ендогенного походження є частиною шляху трансдукції сигналу, який пов'язує персепцію (сприйняття) патогенного зараження з початком розвитку SAR. Мутанти, які зберігають властивість акумулювати SA у відповідь на патоген, але втратили здатність індукувати SAR-гени після застосування SA або ΙΝΑ, описані у Delaney, et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 6602-6606 (1995) та в патентній заявці W094/16077; посилання на згадані роботи зі збереженням їхньої цілісності наведено у цьому тексті.

Було виявлено, що ці мутанти містять мутантний ген, який у його природному вигляді контролює експресію SAR-гена та власне SAR. Цей винахід розкриває той факт, що мутантний ген надає мутантним рослинам сприйнятливості до широкого спектра захворювань та робить їх такими, що не піддаються дії патогенів та хімічних індукторів.

Запропонований винахід стосується ідентифікації, виділення та характеристики природного гена (nim1), гена, який викликає активацію в рослині SAR та експресію SAR-гена у відповідь на дію біологічних та хімічних індукторів.

Мутантний ген ідентифіковано у мутагенізованих видах рослини Arabidopsis. Було виявлено, що ці рослинні види стають дефективними внаслідок їх нормальної реакції на зараження патогеном, і при цьому вони не лише не експресують генів, пов'язаних із системною набутою опірністю (SAR), але й не є здатними проявити власне SAR. Ці мутанти містять дефективний ген, який був помічений nim1 (для природженого імунітету).

Запропонований винахід також стосується використання клонованого гена nim1 та його аналогів для створення трансгенних рослин, які відзначаються опірністю до широкого кола різноманітних захворювань, а також продукованих у зазначений спосіб трансгенних рослин. Крім того, винахід стосується використання клонованого гена nim1 та його аналогів для скринінгу з метою ідентифікації сполук, здатних індукувати опірність рослин до широкого спектра захворювань.

На Фіг 1 відображено вплив хімічних індукторів на індукцію експресії PR-гена в природних рослинах і рослинах з геном nim 1,

На Фіг.2 відображено експресію гена PR-1 в інфікованих патогеном рослинах із генами Ws-Ο та nim 1 через 6 діб після початку зараження.

На Фіг.3 відображено рівні акумулювання SA в рослинах з Ws-Ο та nim 1, інфікованих P. Synngae.

На Фіг.4 відображено генетичну карту ділянки NIM1 , яку визначено з аналізів AFLP та SSLP.

На Фіг.5 зображено фізичну карту ділянки NIM1 , яку визначено з клонового аналізу YAC.

На Фіг.6 зображено фізичну карту розширеної сукупності клонів РІ/ВАС.

На Фіг.7 зображено фізичну карту, на якій визначено положення клонів РІ та ВАС відносно фланкуючих AFLP-маркерів та YAC-ів

На Фіг.8 зображено фізичну карту додатково продовженої сукупності клонів PI/ВАС, що містить ген NIM1,

На Фіг.9 зображено генетичну та детальну фізичну карту ділянки NIM1,

На Фіг.10 зображено інтегральну карту ділянки NIM1,

На Фіг.11 зображено інтегральну карту ділянки NIM1, включаючи нові маркери AFLP.

На Фіг.12 схематично зображені рекомбінанти D169 та С105.

Фіг.13 являє собою загальну карту хромосомної ділянки, центрованої по NIM1, з вказаними рекомбінантами, включаючи ВАС, YAC та косміди в ділянці NIM1.

На Фіг.14 зображено послідовність ділянки в 9,9 т.п.н. клону ВАС-04, яка містить ген NIM1.

На Фіг.15 зображено послідовність нуклеїнової кислоти гена NIM1 та амінокислотну послідовність генного продукту NIM1, включаючи зміни у різних алелях.

На Фіг.16 відображено експресію гена NIM1, індуковану ΙΝΑ, ΒΤΗ, SA та патогеном у природних та мутантних алелях nim1.

На Фіг.17 відображено експресію гена PR-1 в мутантах з nim1 та природних рослинах.

На Фіг.18 відображено опірність до захворювання у різних мутантів nim1.

На Фіг.19 відображено порівняння амінокислотної послідовності ділянок з міткою експресованої послідовності білка NIM1 та білкових продуктів кДНК 4 послідовностей гена рису (див. ПОСЛ. ІД № 3).

УМОВНІ ПОЗНАЧЕННЯ

АА: Амінокислота

AFLP: Поліморфізм довжини ампліфікованого фрагмента

avrRpt2: авірулентний ген Rpt2, виділений з Pseudomonas syringae ВАС: Штучна бактеріальна хромосома

ВТН: S-метиловий естер бензо(1,2,3)тіадіазол-7-карботіокислоти

Col: Arabidopsis, екотип Columbia

EC: Комбінації ензимів

ΙΝΑ: 2,6-дихлороізонікотинова кислота

Ler: Arabidopsis, екотип Landsberg erecta

NIM1: природний ген, який викликає в рослинах опірність до захворювання

nim: мутантна алель nim1, яка викликає в рослинах підвищену чутливість до захворювання

nim 1: мутантна лінія рослини

ORF: відкрита рамка зчитування

PCs Комбінації праймерів

SA: саліцилова кислота

SAR: Системна Набута Опірність

SSLP: Поліморфізм довжини простої послідовності

Ws-O: Arabidopsis, екотип Wassilewskija

YAC: Штучна хромосома дріжджів

Ген NIM1 був клонований за допомогою технологій картування та генної "прогулянки", які показали, що ген міститься в ділянці ~ 105 т.п.н. (Див. Фіг.13 та Таблицю 16). Ця ділянка зліва окреслюється маркером L84.6b, а справа -маркером L84.T2. Лише три перекриваючих косміди, одержані з природної ДНК 7 з ділянки 105 т.п.н., комплектують фенотип мутантного nim1 (Фіг.13 і Таблиця 16). Тільки ці три косміди перекриваються в ділянці 9,9 т.п.н., обмеженій лівим кінцем космідного клону D7 та правим кінцем косміди D5, як це зображено на Фіг.13. Багато інших космід, пов'язаних з іншими зонами ділянки 105 т.п.н., не комплектують фенотип піші (Фіг.13 та Табл. 16). Майже ціла довжина відрізку клону кДНК до гена NIM1 характеризує відповідні межі інтрон - екзон та окреслює амінокислотну послідовність генного продукту. Тільки ділянка гена NIM1 в межах комплектуючої ділянки 9,9 т.п.н. має зміни послідовності в різних мутантних алелях гена nim1 (Табл. 18). У трьох інших потенційних ділянках гена не виявлено жодних змін послідовностей, пов'язаних із фенотипом NIM1. Зміни послідовності, які було виявлено в ділянці гена NIM1, мають тісний зв'язок із зміною функцій або втратою функцій генного продукту. Ступінь зміни ділянки гена NIM1 в конкретній мутантній алелі у першому наближенні корелюється зі спостереженою фізіологічною чіткістю цієї алелі nim1. Лише ділянка гена NIM1 має детектовану РНК (транскрипція), і ця РНК відзначається численними змінами, пов'язаними з фізіологічним впливом гена NIM1 на процес патогенезу. (Таблиця 18 та Фіг.16).

Цей винахід стосується виділеного генного фрагмента, гена NIM1, який є ключовим компонентом шляху системної набутої опірності (SAR) у рослин. Ген NIM1 зв'язаний з активацією SAR хімічними та біологічними індукторами і, разом із подібними індукторами, є необхідним для власне SAR та експресії SAR-гена.

Положення гена NIM1 визначається біологічним аналізом генома мутантних рослин, про які відомо, що вони мають мутантний ген NIM1, що надає рослинам-хазяям надзвичайної чутливості до найрізноманітніших патогенів і робить їх нездатними реагувати на патогени та хімічні індуктори SAR.

Мутанти nim 1 використовують в "універсально сприйнятливих до захворювань" (UDS) рослинах через те, що вони є сприйнятливими до багатьох штамів та патотипів патогенів рослини-хазяїна, а також до патогенів, які за звичайних умов не заражають рослину-хазяїна, але заражають інших "хазяїв". Їх одержують шляхом обробки насіння або іншого біологічного матеріалу мутагенними агентами і подальшої селекції потомства рослин з метою відбору фенотипу UDS шляхом обробки потомства рослин відомими хімічними індукторами (наприклад, ΙΝΑ) системної набутої реакції, після чого рослини заражають відомим патогеном. За цих обставин у природжених мутантів проявляються важкі симптоми захворювань, у той час як немутовані рослини індукуються хімічною сполукою з одержанням системної набутої опірності. Мутанти nim так само відбирають з популяцій мутантів, утворених внаслідок хімічного та радіаційного мутагенезу, а також з популяцій, утворених внаслідок інсерції Т-ДНК та індукованого транспозоном мутагенезу.

Технологія утворення мутантних рослинних ліній є добре відомою в галузі. Рослинний фенотип nim застосовують як інструмент для ідентифікації виділеного генного фрагмента, який відповідає за експресію опірності до широкого спектра захворювань рослин.

Цей винахід стосується виділеної молекули ДНК, яка містить мутантний ген ΝΙΜ1, який являє собою ген nim 1.

Завдяки застосуванню гена nim1 або рослини, що його містить, для виділення природного гена ΝΙΜ1, необхідного для послідовної та надійної експресії генів SAR, ознаку опірності, разом із іншими характеристиками, які відіграють важливу роль для сільськогосподарського виробництва та одержання якісної продукції, можна включити у рослину лінію шляхом селекції та розмноження. Технологія селекції є відомою в галузі. Див., наприклад, Welsh J. R., Fundamentals of Plant Genetics and Breeding. John Wiley & Sons, NY (1981), Crop Breeding. Wood D. R. (Ed.) American Society of Agronomy Madison, Wisconsin (1963); Mayo O., The. Theory of Plant Breeding. Second Edition, Clarendon Press, Oxford (1987); Singh, D.P., Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests. Springer-Verlag, NY (1986), а також Wricke and Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding. Walter de Gruyter and Co., Berlin 1986).

Додатковим об'єктом винаходу є химерний ген, що включає активний у рослині промотор, функціонально зв'язаний із гетерологічною молекулою ДНК, що кодує амінокислотну послідовність генного продукту NIM1 та його аналогів згідно з цим винаходом.

Технологія створення рослинних касет експресії, а також інтродукції чужорідної ДНК в рослини, в цілому описана в рівні техніки. Загалом, з метою інтродукції чужорідної ДНК в рослини застосували плазмідний вектор Ті, який слугує для доставки чужорідної ДНК. Для такої доставки також застосували спосіб безпосереднього поглинання ДНК, ліпосоми, електропорацію, мікроін'єкцію та бомбардування мікрочастинками. Усі ці способи опубліковані у галузевих виданнях. Див., наприклад, Bilang et al. 1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al., (1991) Мої. Gen. Genet. 228: 104-112: Guerche et al., (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et. al (1987) Theor. Appl. Genet. 75: 30-36: Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al., (1980) Science 208:1265: Horsch et al., (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al., (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988), а також Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989). Див. також патентну заявку США , порядковий номер 08/438,666, зареєстровану 10 травня 1995 року, і WO 93/07278, посилання на які у всій їх цілісності наводиться у цьому тексті. Зрозуміло, що спосіб трансформації залежить від особливостей клітинної лінії, яку трансформують.

Після цього було визначено, що компоненти касети експресії можна модифікувати для збільшення експресії. Наприклад, застосовують "зрізані" послідовності, нуклеотидні заміщення або інші модифікації. Отже, рослинні клітини, трансформовані такими модифікованими системами експресії, мали б відзначатися переекспресією або конструктивною експресією SAR-генів, необхідних для активації SAR.

Молекулу ДНК або генний фрагмент, що створюють в рослинах опірність до захворювань шляхом стимулювання індукції експресії SAR-гена, вводять в рослинні або бактеріальні лінії за допомогою стандартної технології рекомбінантної ДНК. Зазвичай ця технологія передбачає введення молекули ДНК в систему експресії, для якої є гетерологічною молекула ДНК (тобто ця молекула є присутньою). Гетерологічну молекулу ДНК вставляють в систему експресії або вектор у відповідній просторовій орієнтації та у відповідну рамку зчитування. Вектор містить необхідні елементи для транскрипції та трансляції вставлених послідовностей, що кодують білок.

Для цього можна використовувати різноманітні векторні системи, відомі в галузі, наприклад, плазміди, віруси бактеріофагів та інші модифіковані віруси. До відповідних векторів належать, крім іншого, вірусні вектори, наприклад, лямбда-векторні системи IgtH, IgtIO та Charon 4, плазмідні вектори, наприклад, рВІ121, pBR322, pACYC177, pACYC184, ряд pAR, pKK223-3, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pRK290, pKC37, pKC101, pGDNAII, а також інші подібні системи. Послідовності ДНК клонують у вектор з використанням стандартних для галузі операцій клонування, описаних, наприклад, у Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).

Крім того, додатковим об'єктом цього винаходу є рекомбінантний вектор, який містить химерний ген згідно з цим винаходом.

Для того, щоб досягти ефективної експресії гена або генного фрагмента згідно з цим винаходом, у векторі експресії повинен бути присутнім промотор. Полімераза РНК зв'язується з промотором і починає транскрипцію гена. Промотори розрізняються за їхньою силою, тобто здатністю стимулювати транскрипцію. Залежно від застосовуваної системи клітин-хазяїв використовують будь-який з придатних для цього промоторів. До придатних для цього промоторів належать убіквітин, нос-промотор, промотор гена рібулози бісфосфат карбоксилази (мала субодиниця), промотор зв'язуючого хлорофіл А/В поліпептиду (мала субодиниця), промотор 35S мозаїчного вірусу цвітної капусти, а також промотори, що їх виділяють з генів рослин. Див. Публікацію C.E. Vallejos, et al_, "Localization in the Tomato Genome of DNA Restriction Fragments Containing Sequences Homologous to RRNA (45S), major chlorophyll A/BBinding Polypeptide and the Ribulose Bisphosphate Carboxylase Genes," Genetics 112: 93-105 (1986), в якій описаний склад малих субодиниць. Нос-промотор та промотор 35S мозаїчного вірусу цвітної капусти добре відомі в галузі.

Оскільки ген опірності до захворювань цього винаходу клонували в систему експресії, він готовий до трансформування в рослинну клітину. До придатних для трасформування рослинних тканин належать листя, коріння, меристеми та протопласти.

Бактерії з сімейства Agrobacterium використовують для трансформації рослинних клітин. До придатних для цього видів цих бактерій належать Agrobacterium tumefaciens та Agrobacterium rhizogens. Agrobacterium tumefaciens (наприклад, штами LBA4404 або ЕНА105) є особливо корисними завдяки їх добре відомій здатності трансформувати рослини.

Інший підхід до трансформування рослинних клітин геном передбачає "проштовхування" інертних або біологічно активних частинок у рослинних тканинах та клітинах. Ця технологія описана в патентах США №№ 4,945,050; 5,036,006; і 5,100,792, авторами яких є Sanford et al. Загалом ця технологія являє собою "проштовхування" інертних або біологічно активних частинок в клітинах при умовах, які сприяють проникненню частинок крізь зовнішню поверхню клітини та їх асиміляції всередині клітини. Якщо використовувати інертні частинки, вектор може бути введений в клітину шляхом покриття цих частинок вектором, що містить потрібний ген. В іншому варіанті клітина-мішень може бути оточена вектором таким чином, що вектор вноситься в клітину потоком частинок. Біологічно активні частинки (наприклад, клітини сухих дріжджів, сухі бактерії або бактеріофаги, кожна з яких містить потрібну для введення ДНК) також можна вводити в тканину рослинних клітин.

Виділений генний фрагмент цього винаходу використовують для створення опірності в різноманітних рослинних клітинах, включаючи голонасінні, однодольні та дводольні. Хоча ген можна вставляти в будь-яку клітинну рослину, що належить до цих широко розповсюджених класів, він найкраще використовується у клітинах культурних (сільськогосподарських) рослин, таких як рис, пшениця, ячмінь, жито, кукурудза, картопля, морква, батат (солодка картопля), цукрові буряки, бобові, горох, цикорій, салат-латук, капуста, цвітна капуста, бруква, ріпа, редиска, шпинат, спаржа, цибуля, часник, баклажани, перець, селера, морква, кабачки, гарбуз, цукіні, огірки, яблука, груші, айва, диня, сливи, вишні, персик, гладенький персик, абрикос, полуниця, виноград, малина, ожина, ананас, авокадо, папайя, манго, банани, соєві, тютюн, томат, сорго, цукрова тростина.

Система експресії згідно з цим винаходом може бути використана для трансформування клітини практично будь-якої культурної рослини за відповідних умов. Трансформовані клітини регенерують у цілі рослини таким чином, що ген створює опір до захворювання в інтактних трансгенних рослинах. Як було викладено вище, дану систему експресії можна модифікувати таким чином, що ген опірності захворюванню експресується постійно або конститутивно.

Трансформація

Система згідно з винаходом може бути використана у будь-якій рослині, здатній до трансформації та регенерації. Подібні способи трансформації та регенерації добре відомі в галузі.

Поряд із наведеними вище у посиланнях, дивиться також An. G., Watson, B.D., and Chiang, C.C. Transformation of tobacco, tomato, potato, and Arabidopsis thaliana using a binary Ті vector system. PLANT PHYSIOL. 81:301-305, 1986; Fry, J., Barnason, Α., and Horsch, R.B.Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens based vectors. PI.Cell Rep. 6:321-325, 1987; Block, M.d. Genotype independent leaf disc transformation of potato (Solanum tuberosum) using Agrobacterium tumefaciens. Theor.appl. genet. 76:767-774, 1988; Deblock, M., Brouwer, D.D., and Tenning, P. Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea з using Agrobacterium tumefaciens and Expression of the bar and neo genes in transgenic plants. PLANT PHYSIOL. 91 :694-701, 1989; Baribault, T.J., Skene, K.G.M., Cain, P.A., and Scott, N.S. Transgenic grapevines: regeneration of shoots expressing beta-glucuronidase. PI.Cell Rep. 41:1045-1049, 1990; Hinchee, M.A.W., Newell, C.A., ConnorWard, D.V., Armstrong, T.A., Deaton, W.R., Sato, S.S., and Rozman, R.J. Transformation and regeneration of non-solanaceous crop plants. Stadler.Genet.Symp. 203212.203-212, 1990; Barfield, D.G. and Pua, E.G. Gene transfer in plants of Brassica juncea using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Pl.Cell Rep. 10:308-314, 1991; Cousins, Y.L, Lyon, B.R,, and Llewellyn, D.J. Transformation of an Australian cotton cultivar: prospects for cotton improvement through genetic engineering. Aust. J.Plant Physiol. 18:481-494. 1991: Chee, P.P. and Slightom, J.L Transformation of Cucumber Tissues by Microprojectile Bombardment Identification of Plants Containing Functional and Nonfunctional Transferred Genes. GENE 118:255-260, 1992; Christou, P., Ford, T.L, and Kofron, M. The development of a variety-independent gene-transfer method for rice. Trends.BiotechnoL 10:239-246, 1992; D'Halluin, K., Bossut, M., Bonne, E., Mazur, В., Leemans, J., and Botterman, J. Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris L.) and evaluation of herbicide resistance in transgenic plants. Bio/Technol. 10:309-314. 1992; Dhir, S.K., Dhir, S., Savka, M.A Belanger, F., Kriz, A.L, Farrand, S.K., and Widholm, J.M. Regeneration of Transgenic Soybean (Glycine Max) Plants from Electroporated Protoplasts. Plant Physiol. 99:81-88, 1992; Ha, S.B., Wu, F.S., and Thome, T. K. Transgenic turf-type tall fescue (Festuca arundinacea Schreb.) plants regenerated from protoplasts. PI. Cell Rep. 11:601 -604, 1992; Blechl, A.E. Genetic Transformation The New Tool for Wheat Improvement 78th Annual Meeting Keynote Address. CEREAL FOOD WORLD 38:846-847, 1993; Casas, A.M.. Kononowicz, A.K., Zehr, U.B., Tomes, D.T., Axtell, J.D., Butler, L.G., Bressan, R.A., and Hasegawa, P.M. Transgenic Sorghum Plant via Microprojectile Bombardment. PROC NAT ACAD SCI USA 90:11212-11216, 1993; Christou, P. Philosophy and Practice of Variety Independent Gene Transfer into Recalcitrant Crops. IN VITRO CELL DEV BIOL-PLANT 29P: 119-124, 1993: Damiani, F., Nenz, E., Paolocci, F., and Arcioni, S. Introduction of Hygromycin Resistance in Lotus spp Through Agrobacterium Rhizogenes Transformation. TRANSGENIC RES 2:330-335, 1993; Davies, D.R., Hamilton, J., and Mullneaux, P. Transformation of Peas. Pl.Cell Rep. 12:180-183, 1993; Dong, J.Z. and Mchughen, A. Transgenic Flax Plant from Agrobacterium Mediated Transformation Incidence of Chimeric Regenerants and Inheritance of Transgenic Plants PLANT SCI 91:139-148, 1993; Fitch, M.M.M., Manshardt, P.M., Gonsalves, D., and Slightom, J.L Transgenic Papaya Plants from Agrobacterium Mediated Transformation of Somatic Embryos. PI.Cell Rep. 12:245-249, 1993; Franklin, C.I. and Trieu, T.N. Transformation of Forage Grass Caucasian Bluestem via Biolistic Bombardment Mediated DNA Transfer. PLANT PHYSIOL 102:167, 1993; Golovkin, M.V., Abraham, M., Morocz, S., Bottka, S., Feher, Α., and Dudits, D. Production of Transgenic Maize Plants by Direct DNA Uptake into Embryogenic Protoplasts. PLANT SCI 90:41 -52, 1993; Guo, G.Q., Xu, Z.H., Wei, Z.M., and Chen, H.M. Transgenic Plants Obtained from Wheat Protoplasts Transformed by Peg Mediated Direct Gene Transfer. CHIN SCI BULL 38:2072-2078. 1993; Asano, Y. and Ugaki, M. Transgenic Plants of Agrostis alba obtained by electroporationmediated direct gene transfer into protoplasts. PI. Cell Rep. 13, 1994; Ayres, N.M. and Park, W.D. Genetic Transformation of Rice. CRiT REV PLANT SCI 13:219-239, 1994: Barcelo, P., Hagel, C, Becker, D., Martin, Α., and Lorz, H. Transgenic Cereal (Tritordeum) Plants Obtained at High Efficiency by Microprojectile Bombardment of Inflorescence Tissue. PLANT. J 5:583-592, 1994; Becker, D., Brettschneider, R., and Lorz, H. Fertile Transgenic Wheat from Microprojectile Bombardment of Scutellar Tissue. PLANT J 5:299-307, 1994; Biswas, G.C.G., Iglesias, V.A., Datta, S.K., and Potrykus, 1, Transgenic Indica Rice (Oryza Sativa L) Plants Obtained by Direct Gene Transfer to Protoplasts. J BIOTECHNOL 32: 1-10, 1994; Borkowska, M., Kleczkowski, K., Klos, B,, Jakubiec, J., and Wielgat, B. Transformation of Diploid Potato with an Agrobacterium Tumefaciens Binary Vector System 1, Methodological Approach. ACTA PHYSIOL PLANT 16:225-230, 1994: Brar, G.S., Cohen, B.A., Vick, C.L. and Johnson, G.W. Recovery of Transgenic Peanut (Arachis Hypogaea L) Plants from Elite Cultivars Utilizing Accell(R) Technology. Plants. J 5:745-753, 1994; Christou, P. Genetic Engineering of Crop Legumes and Cereals Current Status and Recent Advances. AGRO FOOD IND HI TECH5; 17-27, 1994; Chupeau, M.C., Pautot, V., and Chupeau, Y. Recovery of Transgenic Trees 15 After Electroporation of Poplar Protoplasts. TRANSGENIC RES 3:13-19, 1994; Eapen, S. and George, L. Agrobacterium Tumefaciens Mediated Gene Transfer in Peanut (Arachis Hypogaea L). PI.Cell.Rep. 13:582-586, 1994: Hartman, C.L, Lee, L, Day, P.P., and Turner, N.E. Herbicide Resistant Turtgrass (Agrostis Palustris Huds) by Biolistic Transformation. BID-TECHNOLOGY 12:919923, 1994; Howe, G.T., Goldfarb, В., and Strauss, S.H. Agrobacterium Mediated Transformation of Hybrid Poplar Suspension Cultures and Regeneration of Transformed Plants. Plant Cell Tissue & Orgart Culture 36:59-71, 1994; Konwar, B.K. Agrobacterium Tumefaciens Mediated Genetic Transformation of Sugar Beet (Beta Vulgaris L). J PLANT BIOCHEM BIOTECHNOL 3:37-41, 1994; Ritala, Α., Aspegren, K., Kurten, U., Salmenkalliomarttila, M., Mannonen, L.Hannus, R., Kauppinen, V., Teeri, Т.Н., and Enari, T.M. Fertile Transgenic Barley by Particle Bombardment of Immature Embryos. PLANT MOL BIOL 24:317-325, 1994; Scorza, R., Cordts, J.M., Ramming, D.W., and Emershad, R.L. Transformation of Grape (Vltis Vinifera L) Somatic Embryos and Regeneration of Transgenic Plants. J CELL BIOCHEM :102, 1994: Shimamoto, K. Gene Expression in Transgenic Monocots. CURR OPINBIOTECHNOL 5:158-162, 1994; Spangenberg. G., Wang, Z.Y., Nagel, J., and Potrykus, 1, Protoplast Culture and Generation of Transgenic Plants in Red Fescue (Festuca Rubra L). PLANT SCi 97:83-94, 1994; Spangenberg, G., Wang, Z.Y., Nagel, J., and Potrykus, 1, Gene Transfer and Regeneration of Transgenic Plants in Forage Grasses. J CELL BIOCHEM :102, 1994; Wan, Y.C. and Lemaux, P.G. Generation of Large Numbers of Independently Transformed Fertile Barley Plants. PLANT PHYSIOL 104:3748, 1994; Weeks, J.T., Anderson, O.D., and Blechi, A.E. Stable Transformation of Wheat (Triticum Aestivum L) by Microprojectile Bombardment. J CELL BIOCHEM :104, 1994; Ye, X.J., Brown, S.K., Scorza, R., Cordts, J., and Sanford, J.C. Genetic Transformation of Peach Tissues by Particle Bombardment. JAMER SOCHORTSCI 119:367-373, 1994; Spangenberg, G., Wang, Z.Y., Nagel, J., and Potrykus, 1, PROTOPLAST CULTURE AND GENERATION OF TRANSGENIC PLANTS IN RED FESCUE (FESTUCA RUBRA L). Plant Science 1994 97:83-94,1995.

Оскільки рослини-"хазяї" гена nim1 також бувають чутливими до патогенів за межами "кола хазяїв", до якого вони належать за нормальних умов, ці рослини також охоче використовують у молекулярному, генетичному та біологічному дослідження взаємодії "хазяїн-патоген". Крім того, фенотип UDS рослин з nim1 також сприяє їх використанню для фунгіцидного скринінгу. Мутанти nim1, відібрані в певній рослині-хазяїні, з успіхом застосовують для скринінгу фунгіцидів, з використанням цього хазяїні та патогенів хазяїна. Перевага полягає у фенотипі UDS мутанта, який дозволяє вирішити проблеми, що виникають через диференційовану сприйнятливість хазяїв до різних патогенів та патотипів, або навіть через опірність до патогенів чи патотипів.

До патогенів цього винаходу належать, крім іншого, віруси або віроїди, наприклад, мозаїчний вірус тютюну або огірків, вірус кільчатої плямистості, вірус некрозу, вірус скручування листків пеларгонії, мозаїчний вірус конюшини лугової, кущиста карликовість томата і т.п. віруси; грибкові організми, наприклад, Phythophthora parasitica та Peronospora tabacina; бактерії, наприклад. Pseudomonas syringae та Pseudomonas tabaci, комахи, такі як попелиця, e.g. Myzus persicae; лускокрилі, наприклад, Heliothus spp.; нематоди, наприклад, Meloidogyne incognita.

Способи, які запропоновані у цьому винаході, застосовують для боротьби проти численних організмів, що викликають хвороби кукурудзи, включаючи, крім іншого, різні види несправжньої борошнистої роси, такі як Scleropthora macrospora, Sclerophthora rayissiae, Scierospora graminicoia, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora phippinensis, Peronoscierospora sacchariand Peronosclerospora maydis; покриті іржею гриби, такі як Puccinia sorphi, Pucciniapolysora and Physopeifazeae, інші грибкові паразити, такі як Cercosporazeae- maydis, Colletotrichum graminicoia, Fusarium monoliforme, Gibberella zeae, Exserohilum turcicum, Kabatieliu zeae та Bipolaris maydis, а також бактерії, такі як Erwinia stewartii.

ПОСЛ. ІД №:1 - Геномна послідовність 9919-Ьр, зображена на Фігурі 14.

ПОСЛ. ІД №:2 - Геномна послідовність 5655-Ьр, зображена на Фігурі 15.

ПОСЛ. ІД №:3 - Послідовність АА природного білка NIM, кодована cd-ми посл. №2.

ПОСЛ. ІД №:4 - Послідовність АА (33-155) рису "Rice-1", зображена на Фігурі 19.

ПОСЛ. ІД №:5 - Послідовність АА (215-328) рису "Rice-1", зображена на Фігурі 19.

ПОСЛ. ІД №:6 - Послідовність АА (33-155) рису "Rice-2", зображена на Фігурі 19.

ПОСЛ. ІД №:7 - Послідовність АА (208-288) рису Rice-2, зображена на Фігурі 19.

ПОСЛ. ІД №:8 - Послідовність АА (33-155) рису "Rice-З", зображена на Фігурі 19.

ПОСЛ. ІД №:9 - Послідовність АА (208-288) рису "Rice-З", зображена на Фігурі 19.

ПОСЛ. ІД №:10- Послідовність АА (33-155) рису "Rice-4", зображена на Фігурі 19.

ПОСЛ. ІД №:11 - Послідовність АА (215-271) рису "Rice-4", зображена на Фігурі 19.

ВІДІБРАНІ ТИПИ ВЕКТОРНИХ МОЛЕКУЛ

Наведені нижче у тексті векторні молекули було відібрано та внесено до Американської Колекції типових культур (АТСС), яка розташована за адресою: 12301 Parklawn Drive Rockville, MD 20852 U.S.A., за вказаними датами:

Плазміду ВАС-04 було внесено до АТСС 8 травня 1996 року як зразок АТСС 97543.

18 Плазміду Р1-18 було внесено до АТСС 13 червня 1996 року як зразок

АТСС 97606.

Косміду D7 було внесено до АТСС 25 вересня 1996 року як зразок АТС 97736.

ПРИКЛАДИ Приклад 1

Визначення NIM1 клонів за допомогою клонування з використанням карти молекули. Високороздільне генетичне та фізичне картування nim1 в Arabidopsis.

1. Рослинний матеріал та виділення генів-мутантів nim1,

Гени-мутанти nim1 виділяли з двох рослинних популяцій Ws-Ο екотипу Arabidopsis, описаних у Delaney et al., (1995) PNAS 32, 6602-6606. Одна з мутантних популяцій була у формі бібліотеки М2, одержаної з мутагенізованного етилметансульфонатом (EMS) насіння (придбаного у Lehie, Round Rock, TX), a інша - у формі популяції Т-ДНК, яку одержували з насіння, придбаного в Центрі біологічних ресурсів родини Arabidopsis Університету штату Огайо (Колумбус, штат Огайо).

Основою селекції мутантів з природженим імунітетом (nim1) був відбір мутагенізованих рослинних популяцій для рослин, в яких опірність до вірулентного патогену індукують за допомогою ΙΝΑ (2,6-дихлороізонікотинова кислота; Metraux, et al., 1991, В: Advances in Molecular Genetics of Plant.-Microbe Interactions. Vol 1, 432-439. Hennecke and Verma, eds.; Kessmann et al. 1993 в: Mode of action of agrochemicals. Υ Honma, ed.; Vernooij et. al, 1995, Molec. PI. Microbe Interaction 8, 228-234).

Рослини з мутантних популяцій вирощували з високою щільністю у великих планшетах у сільськогосподарських гібридах. Коли рослини досягали віку 2 тижнів, планшети обприскували розчином ΙΝΑ з концентрацією 0,25 мг/мл. Через чотири дні рослини обприскували суспензією, яка містила спори Peronospora parasitica, ізолят (штам) EmWa (EmWa), з концентрацією від 5x104 до 1x104 спор/мл. Ці грибки є вірулентними щодо екотипу Arabidopsis Ws-O, за винятком тих випадків, коли у цих рослин за допомогою ΙΝΑ або аналогічних сполук перше індукується опірність до них.

Після інкубації в умовах високої вологості виявляли рослини з видимими симптомами хвороби, зазвичай через 7 днів після зараження. У цих рослин не проявлялася опірність до грибків, незважаючи на застосування хімікатів, що індукують опірність, і, таким чином, ці рослини розглядалися як потенційні nim-(з природженим імунітетом) мутантні рослини. З 360000 рослин було виявлено 75 потенційних nim-мутантів.

Ці потенційно мутантні рослини, виділяли з планшету, поміщали в умови низької вологості, і давали насінню відстоятися. Рослини, одержані з цього насіння, відбирали аналогічним способом за ознакою сприйнятливості до грибків EmWa, знов після попередньої обробки ΙΝΑ. Потомство рослин, в яких проявилися симптоми зараження, визначали як nim -мутанти. Отже, було виявлено шість nim - ліній. Одну лінію (nim 1 ) виділили з популяції Т-ДНК, а п'ять - з популяції EMS.

2. Підрахунок реакцій рослин на ΙΝΑ та інші хімічні індуктори опірності до захворювань,

і. Фенотипний аналіз nim 1.

Саліцилова кислота (SA) та S-метиловий естер бензо(1,2,3)тіадіазол-7-карботіокислоти (ВТН) є тими двома хімікатами, які подібно до ΙΝΑ індукують опірність до широкого спектра захворювань, яку назвали системною набутою опірністю (SAR), у природних рослин. Оскільки ΙΝΑ не викликала опірності у nim1-рослий, ці рослини також піддавали кількісній оцінці на предмет її реакції опірності після попередньої обробки SA та ВТН (як це частково описано у Delaney et al, 1995, PNAS 92,6602-6606).

Рослини обприскували 1, 5 або 15 мМ SA, або 0,25 мг/мл ВТН і через 5 днів штучно заражали EmWa (як описано у Прикладі 1 вище у тексті). Ні SA, ані ВТН виявилися неспроможними захистити nim-рослини від грибкового зараження, що підтверджувалося наявністю симптомів хвороби та ростом грибкової колонії на цих рослинах. Отже, nim 1 - рослини не реагували на жодний з SAR-індукуючих хімікатів, з чого можна зробити припущення, що процес мутації знаходиться нижче за "точку (точки) початку дії" цих хімікатів на кривій шляху індукції опірності.

Nim1 також оцінювали на предмет його хворобливої реакції на зараження 2-ма несумісними ізолятами P. parasitica, Wela та Noco (тобто чи не викликають ці грибкові штами захворювання природних Ws-O-рослин). Рослини з nim 1 обприскували конідіальними суспензіями в концентраціях 5-10x104 спор/мл штамів Wela чи Noco та інкубували в умовах високої вологості протягом 7 днів. На відміну від природних рослин, у л//7?7-рослинах розвивалися хворобливі симптоми у відповідь на зараження як Wela, так і на Noco. Симптоми проявлялися у вигляді некротичної плямистості та волочинні, з деякою споруляцією. Після забарвлювання у голубий колір за допомогою лактофенолу грибкові гіфи досить легко виявлялися в листках nim 1 - рослин. Отже, nim 1 -рослини сприйнятливіші за нормальні несумісні ізоляти P. Parasitica. З цього можна зробити висновок, що nim 1 - рослини є дефективними не лише з точки зору хімічно індукованої опірності до захворювань, але й з точки зору природної опірності до мікроорганізмів, які не є патогенними.

іі. Біохімічний аналіз nim1.

SA, ΙΝΑ і ВТН індукують SAR і експресію SAR-генів, до яких належать пов'язані з патогенезом гени PR-1, PR-2 та PR-5 in Arabidopsis. Оскільки ці сполуки не індукують опірність до захворювання в nim1 (як описано у Прикладі 1.2 вище у тексті), цю мутантну лінію аналізували напредмет експресії SAR-генів після обробки SA, INA або ВТН.

Після обробки nim 1 -рослин SA, INA або ВТН рослинну тканину збирали та аналізували на предмет акумулювання РНК з генів PR-1, PR-2 та PR-5. Для цього сумарну РНК виділяли з оброблених тканин і піддавали електрофорезу на агарозному гелі. Приготовляли потрійні гелеві блоти, і кожний з них гібридизували за допомогою зонда на предмет отримання одного з цих 3 SAR-генів, як це описано у Delaney et al, 1995, PNAS 32, 6602-6606. На відміну від цього, в природних рослинах хімікати не індукують акумулювання РНК з жодного з цих 3 SAR-генів у піші - рослинах, як це відображено на Фігурі 1. Разом ці результати свідчать про те, що хімікати не індукують в nim1 - рослинах ні SAR, ані експресію SAR-генів.

Оскільки хімікати не індукують SAR чи експресію SAR-гена в nim1-рослинах, постає питання про дослідження того, чи здатне зараження патогеном індукувати експресію SAR-гена у цих рослинах, так само, як у природних рослинах. Ws-O- та nim1- рослини обприскували спорами EmWa spores (як це було описано), і тканину збирали на аналіз РНК через різні інтервали часу. Зараження патогеном (EmWa) природних Ws-O-рослин індукувало експресію PR-1-гена в межах 4 днів після зараження, як це відображено на Фігурі 2. Проте у nim 1 -рослинах експресія PR-1-гена не індукується аж до 6 дня після зараження, і у той самий час рівень відносно природних рослин зменшується. Отже, після зараження патогеном експресія PR-1-гена в nim 1 -рослинах відносно природних рослин затримується та зменшується.

Зараження природних рослин патогенами, що викликає некротичну реакцію, призводить до акумулювання SA в заражених тканинах. Доведено, що ця ендогенна SA є необхідною для трансдукції сигналу в шляху SAR, тобто розпад ендогенної SA призводить до зменшення опірності до захворювання. Це визначає акумулювання SA як маркер на шляху SAR (Gaffney et al, 1993, Science 261, 754-756).

NIM1 - рослини випробували на їх здатність акумулювати SA після зараження патогеном. Штам томата Pseudomonas syringae DC 3000, що містить ген avrRpt2, вводили в тканину листя nim1- рослини віком 4 тижні. Через 2 дні листки збирали для аналізу вмісту SA, як описано у Delaney et al, 1995, PNAS 92, 6602-6606. Цей аналіз показав, що nim1- рослини акумулювали SA у високих концентраціях у заражених листках, як видно на Фігурі 3. В незаражених листках також накопичувалася SA, але не у таких концентраціях, як у заражених, аналогічно тому, що було виявлено у природних Arabidopsis. Звідси можна зробити висновок про те, що карти мутації nim нижче характеристики маркера SA в шляху трансдукції сигналу. Це передбачалося, оскільки відомо, що ΙΝΑ та ВТН (неактивні у nim 1 - рослинах) стимулюють компонент в шляху SAR нижче за SA (Vernooij et аі„ 1995, Molec. PI. Microbe Interaction 8. 228-234: Friedrich, et al., 1996, The Plant Journal 9_, в публікації; Lawton, et al., 1996, The Plant Journal 9, в публікації). Крім того, як описано у Прикладі 1.2, застосована ззовні SA не захищає nim1 від EmWa infection.

3. Генетичний аналіз nim.

NIM1 - рослини зворотно схрещували з природними Ws-O-рослинами, і потомство F1 тестували на опірність до EmWa після обробки ΙΝΑ, як описано у Прикладі 1.1 вище у тексті. Жодна з попередньо оброблених ΙΝΑ F1 -рослин не мала симптомів зараження, у той час як в контрольних рослинах nim 1 зараження було виявлено. Отже, було виявлено, що мутація nim1 є рецесивною.

Схрещування популяції F2 з Ws-Ο з мутантом nim1 також випробовували на її опірність до захворювання після обробки ΙΝΑ. Приблизно у 1/4 цієї популяції (32 зі 130 рослин) було виявлено симптоми захворювання після обробки EmWa попередньо обприсканих ΙΝΑ рослин, а у приблизно 3/4 популяції (98 зі 130 рослин) не було виявлено жодних симптомів захворювання. З цих результатів можна зробити висновок, що мутація nim ідентифікує єдиний генетичний локус та підтверджує дані про F1, які свідчать про рецесивну природу мутації.

4. Ідентифікація маркерів у локусі ΝΙΜ та його генетичне картування.

Для стандартного клонування ΝΙΜ - гена на основі картування необхідно було ідентифікувати маркери, генетично тісно зв'язані з мутацією. Це виконували у 2 стадії. По-перше, nim 1 -рослини схрещували з іншим генотипом Arabidopsis, а саме Landsberg erecta (Ler), і після цього ідентифікували ті F2-рослини з цього гібриду, які мали фенотип nim1 (тобто рослини, які є гомозиготними nim/nim в локусі NIM ). Серед них за допомогою молекулярного аналізу виявляли рослини, що мали генотип Ler поблизу маркера ДНК. Ці рослини за ідентифікаційними критеріями є рекомбінантними між маркером та локусом NIM. Частота рекомбінантів визначає генетичну відстань між маркером та локусом NIM.

Другою необхідною попередньою умовою для клонування на основі картування є те, що ідентифкуються маркери, генетично дуже близькі до локусу NIM, тобто маркери, з яких можна одержати зовсім мало рекомбінантів. Якщо ідентифікують генетичні маркери як більш близькі, ніж це необхідно для їх використання з метою виділення клонів геномної ДНК, то вони близькі до локусу NIM. Локус NIM у такому разі можна клонувати за допомогою скринінгу (способом "прогулянки"), якщо його іще немає на клонованій ДНК. Скринінг ("прогулянку") розпочинають з обох боків гена. Це грунтується на одержанні клонів, що перекриваються, які є, таким чином, послідовно ближчими до потрібного гена. Якщо одинарний маркер ДНК одержують з "прогулянки", яка розпочинається, наприклад, з "північного" кінця, і між цим маркером та шуканим геном не виявлено жодних рекомбінантів, він повинен бути дуже близьким до цього гена. Однак, якщо маркер ідентифікує рекомбінант (рекомбінанти) з "південного" кінця, клон, з якого одержували маркер, повинен схрестити ген. Отже, за визначенням клонується саме шуканий ген. Він повинен розташовуватися між розглянутим маркером і останнім маркером з "північного" кінця, який ідентифікує найменше число рекомбінантів з "північного" кінця.

На першій стадії шляхом генетичного схрещування створюють велике число рекомбінантів. На другій стадії рекомбінанти, що є близькими до ММ-гена, ідентифікують за допомогою молекулярних маркерів. Численні маркери описані у спеціальній літературі, існує кілька способів створення додаткових маркерів. Підхід авторів до проблеми грунтується на певній кількості систем маркерів, включаючи системи SSLP та AFLP (див. нижче у тексті).

і. Генетичні перехрещення.

Для того, щоб закартувати хромосомне положення NIM- гена відносно маркерів SSLP та AFLP, nim1 схрещували з Ler для створення популяції картування. Р2-рослини з цього схрещування вирощували до певної стадії, і листки збирали для майбутніх екстрагувань ДНК. Далі Р2-рослини кількісно характеризували на вміст фенотипу піші, як це описано в Прикладі 1.1 вище у тексті. Крім того, вирощували популяції F3, одержані від конкретних Р2-рослин, і проводили підрахунок вмісту фенотипу nim. ДНК екстрагували з акумульованої тканини рослин F2 та F3 з фенотипом nim 1 способом СТаb, як описано в публікації (Rogers and Bendich, 1988, Plant Molecular Biology Manual, A6, 1 -10). Цю ДНК використовували для картування nim -гена, як це описано нижче у тексті.

іі. Маркери поліморфізму довжини простої послідовності. Маркери поліморфізму довжини простої послідовності (SSLP), ATHGENEA та nga111, описані в публікації (Bell and Ecker, 1994, Genomics 19, 137-144). Праймери, що їх використовують для детектування маркерів SSLP, наведені у Таблиці 1

Генетичне картування NIM -генів відносно маркера ATHGENEA.

Використовуючи праймери ATHGENEA (1) для ПЦЛР-ампліфікації геномної ДНК Ler, очікували одержання зони розміром у 205 пар нуклеотидів (п.н.), у той час як з використанням геномної ДНК Ws-0 прогнозувалося одержання зони розміром 211 п.н. (Bell and Ecker, 1994, Genomics 19, 137-144). Стало очевидним, що продукти ампліфікації тяжко відділити на звичайних агарозних гелях. Отже, було розроблено два альтернативні способи відділення та детектування цих фрагментів ПЦЛР.

У першому з цих способів праймерний ряд ATHGENEA (1) (Таблиця 1) використовували для ампліфікування геномної ДНК у присутності мічених 6-карбоксиродаміном UTP (dUTP-RHO, придбаних у АВІ), одержуючи на виході мічені родаміном фрагменти ПЦЛР. Результати реакцій ПЦЛР аналізували на секвенаторі ДНК, який детектує фрагменти ДНК з роздільною здатністю в один нуклеотид.

Для цього застосовували такі реагенти: буфер 1хПЦЛР, МдСІ2 (2 мМ), dNTP (по 200 мМ), dUTP-R110 (2 мМ), праймери ATHGENEA (1) (0,75 мМ), 10 нг ДНК і 0,75 одиниць полімерази Taq в реакційному об'ємі 20 мл. Умови ампліфікації були такими: 3 хвилини при 94°С, після чого - 35 циклів по 15 секунд при 94°С, 15 секунд при 55°С і 30 секунд при 72°С. Ці зразки аналізували на секвенаторі ДНК АВІ 377, який може детектувати мічені флуоресцентом фрагменти ДНК з роздільною здатністю в один нуклеотид (nt). Завдяки цьому зразки рослин можна розділити по генотипах: фрагмент ДНК розміром у 205 нуклеотидів одержували з ДНК Ler і зони розміром у 211 нуклеотидів з ДНК Ws-О. Отже, фрагменти ДНК, що відрізняються по довжині на 6 нуклеотидів, легко розпізнаються, що дозволяє легко розділяти зразки на такі генотипи, як гомозиготна Ws-O, гомозиготна Ler та гетерозиготна Ws-0/Ler в локусі ATHGENEA.

Для збільшення пропускної здатності цієї системи використовували схему мультиплексування. Деякі зразки ДНК ампліфікували з використанням ПЦЛР, як описано вище у тексті, праймерним рядом ATHGENEA (1), у той час як інші зразки аналізували праймерним рядом ATHGENEA (2) (показаним у Таблиці 2), в обох випадках у присутності мічених 6-карбоксиродаміном dUTP. Праймерний ряд ATHGENEA (2) створювали на основі відомої в галузі послідовності ATHGENEA (Simoens et al., 1988, Gene 67, 1-11). Цей праймерний ряд ампліфікував фрагмент ДНК розміром 139 п.н. з ДНК Ler і зону розміром 145 п.н. з ДНК Ws-O. Умови реакції ампліфікації праймерного ряду ATHGENEA (2) були ідентичні умовам, описаним для праймерного ряду ATHGENEA (1) вище у тексті.

Окремі реакції з використанням праймерного ряду ATHGENEA (1) і окремі реакції з використанням праймерного ряду ATHGENEA (2) змішували разом перед електрофорезом на секвенаторі ДНК АВІ 377. Такий підхід з використанням мультиплексування дозволив розділити на генотипи 2 зразки уокремому відділенні секвенатора, один у положеннях 145/139 nt., а другий - у положеннях 211/205 nt. на секвенаторі.

Згідно з другим способом, фрагменти ПЦЛР мітили з використанням праймера, міченого флуоресцентним барвником FAM-6 (6-карбоксифлуорсцеїн) (Integrated DNA Technologies, Inc.)· Передні праймери ATHGENEA праймерних рядів ATHGENEA (1) та (2) є ідентичними у послідовності (див. Таблицю 1). Цей праймер мітили барвником FAM-6 і використовували в реакції ампліфікації з ПЦЛР з такими реагентами (Perkin Elmer): буфер 1xXL, MgCI2 (1мМ), dNTP (кожний по 200 мМ), праймери (кожний по 0,50 мМ) (передній праймер мічений барвником FAM-6), 10 нг [10-9 грама - прим, перекл,] геномної ДНК і 0,5 одиниці полімерази XL у реакційному об'ємі 20 мл. Умови реакції були такими: 3 хвилини при 94°С, далі 35 циклів по 15 секунд при 94°С, 15 секунд при 59°С і 30 секунд при 72°С. Знову окремі реакції з використанням праймерного ряду ATHGENEA (1) і окремі реакції з використанням праймерного ряду ATHGENEA (2) змішували разом перед електрофорезом на секвенаторі ДНК АВІ 377. Такий підхід з використанням мультиплексування дозволив виділити генотипи у 2 зразках у окремому відділенні секвенатора, один у положеннях 145/139 nt., а другий - у положеннях 211/205 nt.

Усі зразки F2 та F3 з рослин фенотипу nim 1 кількісно характеризували на предмет їхнього генотипу в локусі ATHGENEA, як описано вище у тексті. Усі зразки, які були гетерозиготними у цьому локусі, вказували на рослини, які були рекомбінантними між локусом nim 1 та локусом ATHGENEA. У популяції 1144 рослин F2 фенотипу nim1 і популяціях F3 фенотипу nim1, що їх було кількісно описано у такий спосіб, 98 рослин виявилися гетерозиготними в локусі ATHGENEA, що дозволили оцінити генетичну відстань між цим локусом SSLP та локусом nim1 в 4,3 сМ. Цим підтверджується, що локус NIM1 знаходився на хромосомі 1, поруч із маркером ATHGENEA.

Генетичне картування nim 1- гена відносно маркера nga 111,

Два праймерні ряди для маркера SSLP nga111 (описані у Bell and Ecker, 1994,

Genomics 19, 137-144) використовували для ампліфікування геномної ДНК рослин F2 та F3 з фенотипом nim1 і контрольних рослин (Ws-Ο та Ler). Праймерний ряд nga111 (1) (описано у Bell and Ecker, 1994, Genomics 19, 137-144 та перелічено у Таблиці 1) використовували за таких умов: буфер 1хПЦЛР, МдСІ2 (2 мМ), dNTPs кожен по 200 мМ, праймери по 0,75 мМ, ДНК (10 нг) і 0,75 одиниці полімерази Taq у реакційному об'ємі 20 мл. Праймерний ряд пдаШ (2) (перелічено у Таблиці 1, а також похідна праймерного ряду пдаШ (1)) використовували при інших умовах: буфер 1хПЦЛР, МgСІ2 (1,5 мМ), dNTP (кожний по 200 мМ), праймери (1 мМ), ДНК (10 нг) і 1 одиниця полімерази Taq у реакційному об'ємі 20 мл. Обидві реакції ампліфікували шляхом інкубування при 94°С протягом 1 хвилини, після чого реакція проходила 40 циклів по 15 секунд при 94°С, 15 секунд при 55°С і 30 секунд при 72°С.

Зразки аналізували на 3-5%-их агарозних гелях. Довжина зони, одержаної внаслідок ампліфікації ДНК Ws-Ο будь-яким з праймерних рядів, складала 146 п.н., у той час як ампліфікування ДНК Ler дало зону завдовжки 162п.н. Рослинні зразки, які виявилися гетерозиготними в локусі nga111, вказували на рослини, що були рекомбінантними між цим маркером SSLP та локусом ММ. Серед популяцій 1144 рослин F2 фенотипу nim1 та рослин F3 фенотипу nim 1 239 було ідентифіковано як гетерозиготні для маркера пдаШ, що дозволяє оцінити генетичну відстань між маркером SSLP та локусом nim у 0,4 сМ. Цим підтверджується, що локус nim1 знаходився на хромосомі 1. Оскільки лише кілька рослин фенотипу nim1 виявилися гетерозиготними як в ATHGENEA, так і в nga111, було визначено, що локус NIM1 знаходився між цими 2 маркерами, при цьому ATHGENEA був розташований "на північ" від гена nim 1, a nga111 був розташований "на південь" від гена nim 1. Через це ген NIM1 був розташований приблизно на 10 сМ "на північ" від nga111, приблизно у положенні 85 на хромосомі 1 (Lister and Dean, 1993, Plant. J. 4, 745-750; Bell and Ecker, 1994, Genomics 19, 137-144).

iiі. Маркери поліморфізму довжини ампліфікованого фрагмента.

Для клонування гена NIM1 на основі картування необхідно ідентифікувати молекулярні маркери, розташовані у безпосередній близькості до цього гена. Для цього маркери поліморфізму довжини ампліфікованого фрагмента (AFLP) створювали способом ампліфікації фрагмента з вибірковим обмеженням, описаним у Zabeau and Vos (1993, European Patent Application EP 0534858) and Vos et al. (1995, Nucleic Acid Research 23, 4407-4414).

Головні принципи технології AFLP.

Використання технології AFLP для картування грунтується на вибірковому ампліфікуванні ряду зон ДНК у 2 зразках, що генетично відрізняються один від одного. Відкриття того факту, що будь-яка з одержаних зон є чимось таким, що відрізняється серед 2 генотипів, вказує на те, що такі зони можна розглядати як маркери для одного зі згаданих генотипів. Якщо такий маркер при високій концентрації розщеплюється сумісно з шуканим геном (мутаційним), такий маркер є близьким до генетичного локусу.

Вибіркова ампліфікація малого ряду фрагментів ДНК у комплексному зразку ДНК виконується у 2 стадії. По-перше, фрагменти ДНК створюють шляхом розщеплення ДНК рестрикційними ферментами, після чого до кінців лігують адаптери. По-друге, праймери, що складаються з послідовності, комплементарні до адаптерів плюс видовження 3і (зазвичай нуклеотиди 0-3) використовують для ампліфікування лише тих фрагментів ДНК, в яких кінці є комплементарними до згаданих праймерів. Якщо використовують видовження з одного нуклеотиду, тоді теоретично кожний праймер буде "припасованим" приблизно до 1/4 усіх фрагментів, при цьому 1/16 усіх фрагментів матиме праймер, "припасований" на обох кінцях. Отже, цими праймерами ампліфікується обмежений ряд фрагментів ДНК. Надалі шляхом радіоактивного мічення одного праймера можна одержати навіть менший ряд видимих зон .

Аналіз AFLP.

Для проведення аналізу AFLP зразків ДНК 50 нг ДНК розщепляли відповідними ферментами (зазвичай EcoRI та Msel; див. нижче у тексті), і адаптери (перелічено у Таблиці 2 нижче за текстом) лігували до рестрикційних фрагментів (зазвичай EcoRI та Msel). Послідовності праймерів і YAC, PI and ВАС клонів описані детально нижче у тексті. Для проведення реакцій ампліфікації використовували матриці (приблизно 0,5 нг ДНК на реакцію), застосовуючи праймери, які були комплементарними до адаптерів, з короткими видовженнями З' (2 або 3 нуклеотида; праймерні послідовності перелічено нижче у тексті). Оскільки один з праймерів є радіоактивно міченим (зазвичай праймер EcoRI), після проведення авторадіографічного аналізу гелю, використованого для окремих зон видимим є лише ряд ампліфікованих фрагментів.

Умови ампліфікації для клонованих ДНК (YAC, PI, косміда) були такими: 36 циклів по 30cек. при 94°С (денатурація), 30сек.- відновлення структури і 1 хв. -розтягнення при 72°С. Температура відновлення структури у першому циклі дорівнювала 65°С, знижувалася на 0,7°С за кожний цикл протягом наступних 12 циклів, після чого утримувалася при температурі 56°C. Для геномної ДНК рослин Arabidopsis ампліфікацію виконували у 2 стадії: у першій стадії (попередня ампліфікація), ДНК ампліфікували праймерами, що мають видовження у один нуклеотид (жодний з праймерів не був мічений). Умови цієї реакції ампліфікації були такими: 20 циклів по 30сек. - денатурація (94°С), 1 хв. -відпалювання (відновлення структури) (56°С) і 1 хв. - розтягнення (72°C). У другій стадії продукти попередньої реакції ампліфікації розбавляли у 10 разів і повторно ампліфікували за 36 циклів праймерами, що містили повнорозмірні видовження (з використанням одного міченого праймера), при таких умовах: 30сек. при 94°С (денатурація), 30сек. - відпалювання (відновлення структури) і 1 хв. -розтягнення при 72°С. Температура відновлення структури у першому циклі була 65Ό, знижувалася на 0,7°С за кожний цикл протягом наступних 12 циклів і, після чого утримувалася 56°С. Кінцеві продукти реакції були розподілені на 31 поліакриламідному гелі, гель знімали на плівку, що дозволяло візуалізувати мічені радіоактивними ізотопами зони ПЦЛР. Коли цю процедуру застосовували до ДНК з 2 генотипів одночасно, то виявляли зони AFLP, що дозволяли діагнозувати той чи інший генотип. Такі зони називають інформативними зонами AFLP, або маркерами AFLP. У Таблиці 2 показано адаптери, які використовують для проведення аналізу AFLP.

Створення маркерів AFLP і детальне картування локусу NIM1.

Для скринінгу маркера AFLP використовували популяцію рекомбінантних інбредних ліній, одержаних від схрещення таких екотипів Arabidopsis, як Landsberg erecta (Ler) та Columbia (Col) (Lister and Dean, 1993, Plant J. 4, 745-750). Для скринінгу AFLP використовували такі праймери, як:

праймери EcoRI: 5'-GACTGCGTACCAATTCWN-3'

праймери Msel: 5'-GATGAGTCCTGAGTAAXWN-3'

Літера "Ν" у праймерах вказує на те, що ця частина була змінною (А, С, G або Т), літера "W" означає А або Т, а літера "X" означає С Усі 8 можливих праймерів використовували як EcoRI-, так і Msel-праймер. Це дало в сумі 64 (8 χ 8) комбінацій праймерів (PC), які використовували для ампліфікування ДНК з рекомбінантної інбредної лінії і батьківських генотипів, Ler та Сої, як описано вище у тексті. Реакції ампліфікації проводили на денатуруючому поліакриламідному гелі, розділяючи фрагменти AFLP за розміром, і гель знімали на плівку. Плівку досліджували на предмет виявлення зон, які були присутніми лише в одному генотипі, тобто досліджували на наявність маркерів AFLP.

Маркери AFLP, тобто, фрагменти ДНК, які є поліморфними між рекомбінантними інбредними лініями обох батьків, використовували для створення генетичної карти популяції рекомбінантних інбредних ліній. У Прикладі 1.5і нижче у тексті описано картування nim1- гена на хромосомі 1 в Arabidopsis, приблизно у положенні 85. Ті з маркерів AFLP, що їх було закартовано (з використанням рекомбінантної інбредної лінії) між положеннями 81 та 88 хромосоми 1 в Arabidopsis, вибирали для аналізу рекомбінантних рослин на наявність згаданих маркерів AFLP і, таким чином, для більш точного картування NIM1-гена. Сім маркерів AFLP з цієї ділянки було визначено як інформативні; вони виявилися поліморфними між обома батьками схрещення nimіх Ler. Шість маркерів AFLP виявилися Ler-специфічними, тобто цих маркерів AFLP не було у Ws (а також у Сої). Один маркер AFLP виявився Ws-специфічним, тобто СоІ-специфічний маркер AFLP (якого не було у Ler) також був присутній у Ws. До цих маркерів AFLP належать: L81.1, L81.2, W83.1, L84, L85, L87 та L88 (L-маркер є специфічним для екотипу Ler, a W-маркер є специфічним для обох екотипів Сої та Ws; число вказує на положення в карті). Ці маркери AFLP використовували для аналізу рекомбінантних рослин зі схрещення nimixLer (див. нижче у тексті). Крім того, маркер AFLP C86 (рекомбінантний маркер, одержаний від інбредної лінії, специфічний для Сої) використовували для виділення клонів ДНК (див. нижче у тексті). У Таблиці 3 перераховано праймерні послідовності, які використовували для одержання згаданих маркерів AFLP.

У Таблиці 3 показані комбінації праймерів маркерів AFLP, одержані від популяції рекомбінантної інбредної лінії.

"EcoRI-" стосується послідовності 5'-GACTGCGTACCAATTC-3' і

"Msel-" стосується послідовності 5?-GATGAGTCCTGAGTAA-3'.

Таблиця 3

Маркер

Відповідні

комбінації

AFLP

праймерів

L8-1.1

EcoRI-CA

Msel-CCG

L81.2

EcoRI-AA

Msel-CAA

W83.1

EcoRI-

Msel-CTC

L84

CA

Msel-CAA

L85

EcoRi-AAT

Msel-CCT

L87

EcoRI-CA

Msel-CTT

L88

EcoRI-CA

Msel-СТА

С86

EcoRI-AG

Msel-CCT

EcoRI-AG

Детальну генетичну карту ділянки будували з використанням маркерів AFLP, описаних вище у тексті шляхом скринінгу рекомбінантів. Придатними для цього виявилися всього 337 рекомбінантних рослин з 1144 nim1 - рослин F2. Ці рекомбінанти спочатку піддавали скринінгу нозерн-фланкуючими маркерами AFLP L81.2 та ATHGENEA і саузерн-фланкуючими маркерами L88 та пдаШ. Сорок вісім рослин виявилися гомозиготними nim 1/ nim 1 і гетерозиготними при ATHGENEA та L81.2, а 21 рослина виявилася гомозиготною nim1/nim1 і гетерозиготною при пда111 та L88. Ці рекомбінантні рослини далі аналізували 9-ма маркерами AFLP в ділянці nim, у тому числі 4-ма маркерами AFLP, одержаними від картованої популяції рекомбінантних інбредних ліній, (W83.1, L84, L85 та L87), і 5-ма маркерами AFLP, одержаними від аналізу клонів YAC (W83.3/W84.1, W84.2, W85.1, W86.1 та L86, див. нижче у тексті).

Генетичну карту гена nim1, побудовану на основі цього аналізу, зображено на Фігурі 4. На ній видно, що 27 рекомбінантів було виявлено між маркером W84.2 та NIM1, і 14 рекомбінантів було виявлено між W85.1 та NIM1. Маркер L85 приєднується безпосередньо до nim 1, але цей маркер не можна було закартувати на клонах YAC, ВАС чи РІ (див. нижче ), і він, таким чином, не міг бути використаним для ідентифікації nim 1- гена.

5. Фізичне картування ділянки NIM1.

і. Виділення клонів YAC з використанням маркерів AFLP, безпосередньо приєднаних до NIM1.

Бібліотеку СІС, тобто бібліотеку YAC екотипу Arabidopsis Columbia (Bouchez et al, 1995, 6th Int. Conf on Arabidopsis Research, Медисон, штат Вайомінг), піддавали скринінгу на предмет клонів YAC у ділянці NIM. Ця бібліотека містить близько 2,5 ядерних геномних еквівалента і має середній об'єм інсерції 450 т.п.н. Бібліотеку YAC піддавали скринінгу двома маркерами AFLP: W83.1 та С86. Маркер W83.1 є найбільш безпосередньо приєднаним рекомбінантним, одержаним від інбредної лінії маркером AFLP "на північ" від nim1, а маркер С86 є рекомбінантним, одержаним від інбредної лінії маркером AFLP, специфічним для Сої (якого не було у Ler та Ws). Маркер С86 закартований "на південь" від nim 1- гена на карті популяції рекомбінантної інбредної лінії. Цей маркер AFLP Col застосували замість безпосередньо приєднаних маркерів AFLP Ler (Фігура 4), оскільки ці щойно згадані маркери AFLP детектували лише екотип Landsberg erecta і, таким чином, не можуть застосовуватись для скринінгу бібліотеки Columbia YAC.

Бібліотеку YAC піддавали скринінгу у дві стадії. Спочатку клітини клонів YAC з кожного планшету дванадцяти 96-коміркових мікротитрувальних планшетних установок групували (планшетний пул) та використовували для виділення ДНК, як описано у Ross et al (1991, Nucleic Acids Res. 19, 6053). Пули піддавали скринінгу обома маркерами AFLP. Після цього з кожного позитивного планшетного пула зразки ДНК з кожного ряду (пул з 8 клонів) і з кожної колонки (пул з 12 клонів) піддавали скринінгу маркером AFLP, для якого планшетний пул був позитивний. Таким чином, стало можливим ідентифікувати окремі позитивні клони YAC. Після скринінгу одержували всього 4 клони YAC: YAC 12F04 та YAC 12Н07 виділяли за допомогою "нозерн"-маркера AFLP W83.1, a YAC 10G07 та YAC 7E03 - з використанням "саузерн"-маркера AFLP C86 (для упорядкування номенклатури клонів YAC використовували нумерацію СІС). З маркерів YAC було взято "відбитки" за допомогою AFLP, з одержанням YAC-специфічних фрагментів AFLP. Відбитки клонів YAC співставляли між собою та використовували для оцінки перекриття між клонами YAC, див. також Таблиці 5 та 6). Як видно з відбитків AFLP, клон 7Е03 в значній мірі перекритий клоном 10G07 (див. також Табл. 5), а клон 12Н07 аналогічним чином у значній мірі перекритий клоном 12F04 (див. також Табл. 6).

іі. Створення маркерів AFLP з клонів YAC.

Оскільки маркери AFLP, описані вище у тексті, виявилися генетично відносно далекими від nim 1 -гена (див. Фігуру 3), з метою пошуку маркерів, ближчих до nim- гена, створювали додаткові маркери AFLP.

Скринінг на предмет додаткових похідних від YAC маркерів AFLP проводили на таких зразках ДНК, як: ДНК виділених клонів YAC (4 клони YAC було ідентифіковано, як це описано вище у тексті), штам дріжджів без YAC, a також три екотипи Arabidopsis - Col, Ler та Ws. Таким чином, фрагменти, специфічні для клонів YAC (яких не було у штамі дріжджів і які були присутніми у Сої), можна було тестувати на поліморфізм у Ler та Ws (батьки рекомбінантних рослин ідентифікували у Прикладі 1.5 нижче у тексті). Усі ідентифіковані поліморфні фрагменти, таким чином, можуть бути додатковими маркерами AFLP. У першому скринінгу AFLP використовували ферментну комбінацію (EC) EcoRI/Msel. У цьому скринінгу тестували два клони YAC, 10G07 та 7Е03 (детектовані маркером AFLP C86, див. нижче), штам дріжджів без YAC та три екотипи Arabidopsis - Col, Ler та Ws. Комбінації праймерів з вибірковими видовженнями стало можливо підрозділити на три групи, як показано у Таблиці 4. Всього піддавали скринінгу 256 (64+96+ 96) комбінацій праймерів.

В Таблиці 4 нижче у тексті наведено характеристику праймерних послідовностей, що їх застосовували у скринінгу AFLP двох клонів YAC, 10G07 та 7Е03, штаму дріжджів без YAC, а також трьох екотипів Arabidopsis - Col, Ler та Ws. Було використано три групи комбінацій праймерів. Літера "N" у праймерах вказує на те, що ця частина є змінною (А, С, G або Т), літера "S" вказує на С або G, літера "W" вказує на А або Т, а літера "Y" вказує на С або Т.

Всього було створено 83 Col-специфічних фрагмента, з яких 62 були розподілені на два клони YAC. Три фрагменти були маркерами AFLP, поліморфними між Ws та Ler, з яких два були маркерами AFLP Ws (фрагмент Сої також присутній Ws і відсутній у Ler), а один маркером AFLP Ler (фрагмент Col також присутній у Ler і відсутній у Ws). Ці результати наведено у Таблиці 5 нижче у тексті.

У Таблиці 5 наведено кілька розподілених та унікальних фрагментів AFLP, детектованих в клонах YAC 10G07 та 7Е03, і кілька інформативних маркерів AFLP серед цих фрагментів у генотипах Ws та Ler.

Таблиця 5

Фрагменти

AFLPy

клонах YAC

Маркер

AFLP

10G07

7Е03

Ws

Ler

розподіл

62

62

2

1

унікал.

21

0

0

0

Отже, внаслідок цього аналізу AFLP було одержано 3 нові маркери AFLP (див. Фігуру 4 і опис нижче у тексті). їхні положення одне відносно одного та відносно рекомбінанта, одержані від інбредної лінії маркера AFLP, було визначено за допомогою аналізу рекомбінантів згаданими маркерами AFLP.

Другий скринінг маркерів AFLP проводили за допомогою тестування усіх чотирьох ідентифікованих клонів YAC (див. нижче у тексті) і з використанням комбінації ферментів Pstl/Msel. Використовували такі праймери:

Літера "N" у праймерах вказує на те, що ця частина є змінною (А, С, G або Т), а літера "W" у праймерах вказує на те, що це було А або Т. Всього було піддано скринінгу 144 (12 x 12) комбінації праймерів на усіх чотирьох виділених клонах YAC, 12F04, 12Н07, 10G07 та 7Е03; штам дріжджів без YAC; а також три екотипу Arabidopsis - Col, Ler та Ws. Разом було створено 219 фрагментів AFLP, з яких 144 були присутні у клонах YAC 12F04 та 12Н07 (72 були унікальними для клону 12F04, а 72 були розподіленими між обома клонами YAC), і з яких 75 були присутні у клонах YAC 10G07 та 7Е03 (33 були унікальними для клону 10G07, а 42 були розподіленими між 2 клонами YAC). Три фрагменти, одержані від першого ряду клонів YAC, були поліморфними (маркери AFLP Ws). Ці результати наведено у Таблиці 6 нижче у тексті.

У Таблиці 6 перераховано кілька розподілених та унікальних фрагментів AFLP, детектованих у клонах YAC, а також кілька інформативних маркерів AFLP серед цих фрагментів у генотипах Ws та Ler.

Таблиця 6

ряд фрагментів AFLP у клонах

YAC

Маркери

AFLP

12F04

12Н07

10G07

7Е03

Ws

Ler

розподіл.

72

72

0

0

1

0

унікал.

72

0

0

0

2

0

розподіл.

0

0

42

42

0

0

унікал.

0

0

33

0

0

0

Результати свідчать про те, що клон YAC 12H07 є частиною більшого клону YAC 12F04, а також про те, що клон YAC 7E03 є частиною більшого клону YAC 10G07. З цього можна зробити висновок, що більші клони YAC, 12F04 та 10G07 не перекриваються. Це виключає розміщення NIM1 -гена на будь-якому з цих клонів YAC. Внаслідок повного скринінгу, включаючи 400 комбінацій праймерів, що створюють 302 фрагмента AFLP у ділянці NIM, одержували 5 корисних маркерів AFLP, з яких 4 виявилися Ws-специфічним, а один Ler-специфічним. Ці 5 додаткових маркера AFLP було закартовано за допомогою аналізу рекомбінантних рослин (див. Фігуру 4 и опис нижче у тексті), після чого їх було названо W84.1 (також відомий як W83.3), W84.2, W85.1, W86.1 і L86.

У Таблиці 7 перераховано праймерні послідовності, що їх використовують для одержання згаданих маркерів AFLP. За рахунок цих 5 додаткових маркерів AFLP сумарна кількість маркерів AFLP зросла до 12 у ділянці від L81.1 до L88 (див. Фігуру 4 і опис нижче у тексті).

У Таблиці 7 наведено комбінації праймерів маркерів AFLP, що їх було одержано від клонів YAC.

"EcoRI-" означає послідовність 5'-GACTGCGTACCAATTC-3

"Msel-" означає послідовність 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3' і

"Pstl-" означає послідовність 5'-GACTGCGTACATGCAG-3'.

Таблиця 7

Маркер AFLP

Комбінація праймерів

із вибірковими

видовженнями

W84.1

Pstl-AT

Msel-TT

W84.2

Psn-AA

Msel-TT

W85.1

EcoRI-CT

Msel-GTA

W86.1

EcoRI-GT

Msel-CTT

L86

EcoRI-GT

Msel-CTT

Цю інформацію використовували для побудови фізичної карти ділянки, як показано на Фігурі 5, з приблизними положеннями клонів YAC відносно генетичної карти. На цій карті показано, що ділянка, яка містить локус NIM1, між маркерами W83.1 та W85.1, є частково перекритою 3 клонами YAC: 12F04 і 10G07/7E03.

ііі. Створення контигуму Р1/ВАС, що містить NIM1 - ген.

У попередніх розділах було описано, яким чином виділяли маркери AFLP, приєднані до ділянки NIM1, і яким чином ідентифікували так картували клони YAC, що відповідають цим маркерам. Результати, що їх одержували під час локалізування NIM1 -гена до хромосомного фрагмента, не були достатніми для того, щоб визначити специфічний сегмент ДНК, що містить NIM1- ген: фланкуючі маркери AFLP картували до різних клонів YAC, що не перекривалися. Таким чином, було неможливо визначити точне фізичне положення NIM1 - гена; він міг розташуватися або на якому-небудь з двох клонів YAC, або в інтервалі між клонами YAC. Для замкнення фізичного інтервалу між фланкуючими маркерами було вибрано альтернативний підхід: для перекриття проміжку між фланкуючими маркерами AFLP було застосовано Р1 та бібліотеку ВАС.

Бібліотеки, що їх застосовували для закриття згаданого проміжку, були такими: бібліотека екотипу Arabidopsis Columbia Р1 .описана у Liu et al (The Plant J. 7, 351-358, 1995), і бібліотека екотипу Columbia ВАС, описана Choi et al (http/genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/wwVol2/ choi.html). Бібліотека Р1 складається з приблизно 10.000 клонів зі середнім розміром вставки 80 т.п.н., а бібліотека ВАС складається з приблизно 4.000 клонів зі середнім розміром вставки 100 т.п.н. Теоретично у цих бібліотеках представлено близько 10 ядерних геномних еквівалентів (з того розрахунку, що розмір галоїдного генома для Arabidopsis складає 120 млн.п.н.).

iv. Ідентифікація клонів Р1, що відповідають фланкуючим маркерам.

Фланкуючі маркери Ws84.2 та Ws85.1 використовували для скринінгу пулів клонів Р1 з використанням технології, аналогічної тій технології, що що її раніше було описано у випадку скринінгу бібліотеки YAC (див. Приклад 1.5І). Відбирали клони Р1 з фрагментами маркера і виділяли "плазмідну" ДНК. Робили "відбитки" з різних клонів ДНК Р1, використовуючи такі ЕС, як EcoRI/Msel та Hindlll/Msel, a також праймери без вибраних нуклеотидів. Будували фізичну карту, а саме карту з розмірами та перекриттям клонів, співставляючи "відбитки" AFLP. Число унікальних фрагментів AFLP і число фрагментів AFLP, спільних між клонами, показували ступінь перекриття. Цю карту представлено на Фігурі 6. "Зняття відбитків" з AFLP свідчило про те, що було створено два ряди Р1-контигумів, що не перекривалися між собою, кожний з яких містив один з фланкуючих маркерів: маркер Ws84.2, що містив Р1-1 та Р1-2; маркер W85.1, що містив Р1-3 та Р1-4. Відповідно, інтервал між фланкуючими маркерами не був перекритий (Фігура 6).

Положення Р1-контигумів відносно контигума YAC визначали за допомогою "зняття відбитків" AFLP клонів YAC та клонів Р1 з використанням деяких YAC-специфічних PC, описаних вище у тексті. Виявилося, що Р1 клони Р1-1 та Р1-2 повністю перекривалися YAC CIC12F04, але лише частково - YAC CIC12H07. Таким чином згадані клони Р1 можна розміщати на контигумі YAC CIC12H07/12F04 (Фігура 6). Р1 клони Р1-3 та Р1-4 повністю перекривалися обома клонами YAC CIC7E03 та CIC10G07, і виявилося, що AFLP-маркер W86.1, подібно маркеру W85.1, картували до цього контигума Р1 (Фігура 6).

Крім того, для ідентифікації відповідних Р1 та ВАС клонів використовували маркер L85. L85 є специфічним маркером до екотипу Landsberg, отже, застосовували гібридизацію колонії мічених радіоактивним ізотопом ДНК L85 з фільтрами Р1 та ВАС. Окремої гібридизації клону Р1 або ВАС з L85 не було виявлено. Це підтверджує попередні відкриття авторів стосовно того, що послідовність L85 є неповною в геномі екотипу Arabidopsis Columbia і, таким чином, це є найбільш прийнятним поясненням того факту, що відповідні клони не було ідентифіковано.

ν. Видовження NIM1 - фланкуючих контигумів Р1.

Для видовження з фланкуючих контигумів Р1 було застосовано різні підходи:

Фрагменти YAC (AFLP), специфічні до "південного" закінчення YAC CIC12F04 (унікального відносно CIC12F04, не присутнього у СІС 12Н07), використовували для ідентифікації клонів Р1 шляхом скринінгу AFLP пулів бібліотеки.

1. Фрагменти YAC (AFLP) з YAC 10G07, що перекриваються з Р1-4, використовували для ідентифікації клонів Р1 шляхом скринінгу (APLP) пулів бібліотеки Р1.

2. Рестрикційні фрагменти EcoRI з клону Р1 Р1-6 (одержані внаслідок скринінгу бібліотеки Р1 на основі AFLP, стадія 1) використовували зонди для гібридизації на фільтрах бібліотеки ВАС. Внаслідок цього скринінгу одержували різні клони Р1 та ВАС, і з усіх цих клонів було "взято відбитки" (AFLP) за допомогою ECs EcoRI/Msel та Hindlll/Msel і з використанням праймерів без вибіркового нуклеотида. Нову карту будували так само, як описано вище у тексті і зображено на Фігурі 7.

У Таблиці 8 наведено різні клони PC (AFLP) з фрагментами AFLP, закартованими до фланкуючого клону YAC і використаними для скринінгу бібліотеки Р1 на відповідні клони Р1.

У Таблиці 8 представлені різні клони PC (AFLP), що їх використовували для скринінгу бібліотеки Р1. У верхній частині Таблиці показані клони PC, специфічні для "північних" клонів YAC, а у нижній частині - клони PC, специфічні для "південного" клону YAC. Показано також клони YAC та клони Р1, в яких детектували фрагменти AFLP.

Було одержано контигум Р1/ВАС розміром близько 250 т.п.н., що перекриває "південний" кінець YAC CIC12F04 (не продовжується з цього клону YAC) і містить маркер W84.2. Було одержано контигум Р1 близько 150 т.п.н., що містить маркери W85.1 та W86.1; цей контигум повністю міститься у межах YAC СІС7Е03.

Аналіз створення контигуму Р1/ВАС, що перекриває маркер AFLP NIM1 -гена, на рекомбінантах з маркерами з "південного" кінця "північного" контигума Р1/ВАС (WL84.4 and WL84.5, див. нижче і Таблицю 11), показав, що попередні стадії "прогулянки" виявилися безуспішними з очки зору побудови такого контигума, який би містив NIM1 - ген (див. наступний розділ). Таким чином, існуючий "північний" контигум Р1/ВАС видовжували "на південь" з метою "прогулянки" вздовж NIM1 - гена, завдяки чому стало можливим визначення та виділення специфічного сегмента ДНК, що містить NIM1 - ген. Було застосовано підхід, що має за основу гібридизацію, згідно з яким клони Р1 або ВАС, розташовані на "південному" закінченні "північного" контигума Р1/ВАС використовували для ідентифікації клонів, розміщених ближче до NIM1 ("південний" зв'язок). Нові клони, одержані після стадії «прогулянки», картували відносно існуючих контигумів з використанням "зняття відбитків" AFLP за допомогою ECs EcoRI/Msel та Hindlll/Msel, як це описано вище у тексті. Виявилося, що для того, щоб "перейти" по NIM1 - гену, потрібно здійснити 5 послідовних стадій "прогулянки". У Таблиці 9 наведено клони, одержані на різних стадіях "прогулянки".

Таблиця 9 являє собою огляд різних стадій "прогулянки" із вказанням зонду гібридизації, що його використовували для скринінгу бібліотек Р1 та ВАС, а також вибраних клонів, що гібридизуються до зондів та продовжуються у "південному" напрямку.

Таблиця 9

Зонд

Нові клони, що продовжуються на

"південь"

Стадія 1:

Р1-7

ВАС-02

Стадія 2:

ВАС-02

Р1-16, ВАС-03

Стадія 3:

ВАС-03

Р1-17, Р1-18

Стадія 4:

Р1-18

Р1-21, Р1-20, ВАС-04

Стадія 5:

ВАС-04

Р1-22, Р1-23, Р1-24, ВАС-06, ВАС-05

Фізичну карту різних клонів, яку одержали з цих "прогулянок", зображено на Фігурі 8. Всього перекрито відрізок близько 600 т.п.н., починаючи з маркера першої точки "прогулянки" W84.2. Виявилося, що "південне" закінчення контигума, представленого на Фігурі 8, містить NIM1 - ген (див. наступний розділ). Контигум продовжується більш ніж на 300 т.п.н. "на південь" від YAC CIC-12F04, і виявилося, що він не перекривається клонами YAC CIC10G07 та СІС7Е03, з чого можна зробити висновок, що NIM1 - ген знаходиться в інтервалі між фланкуючими контигумами YAC, і що цей інтервал має розмір щонайменше 300 т.п.н..

vi. Створення Інтегральної генетичної та фізичної карти ділянки NIM1.

У попередніх розділах було описано, яким чином виділяли маркери AFLP, зв'язані з ділянкою NIM1, як ідентифікували клони YAC, що відповідають фланкуючим маркерам, а також яким чином створювали контигум Р1/ВАС, що продовжується приблизно на 550 т.п.н. "на південь" від найближчого "північного" фланкуючого маркера AFLP W84.2. У цьому розділі описано створення нових маркерів AFLP з контигума Р1/ВАС, фізичне картування цих маркерів на згаданому контигумі, а також генетичне картування цих маркерів з використанням доступних рекомбінантів.

1. Створення нових маркерів AFLP з контигума Р1/ВАС.

Як описано у попередньому розділі, клони Р1 та ВАС продовження контигума оцінювали за допомогою "зняття відбитків" AFLP з використанням ECs EcoRI/Msel та Hindlll/Msel. Це дозволило досить точно визначити ступінь перекриття між різними клонами Р1 та ВАС і, крім того, створити низку фрагментів AFLP, специфічних для згаданих клонів. Для "зняття відбитків" очищеної плазмідної ДНК клонів Р1 або ВАС використовували AFLP праймери без вибіркового нуклеотида. Однак вибіркові нуклеотиди знадобляться для того, щоб мати можливість використовувати ці Р1- або ВАС-специфічні фрагменти AFLP для детектування в Arabidopsls. За допомогою визначення кінцевих послідовностей ампліфікованих рестрикційних фрагментів, можна створити AFLP праймери, що мають відповідні вибіркові основи, для ампліфікування Р1- або ВАС-специфічного фрагмента AFLP в Arabidopsis. Усі фрагменти AFLP походять з екотипу Columbia (Col) і, таким чином, слід також визначати, чи несуть маркери AFLP (Columbia) інформацію в рекомбінантах NIM1, одержаних від схрещення екотипів Landsberg erecta (Ler) та мутанта NIM1 екотипу Wassilewskija (Ws-n/m). Загалом існують 4 типи фрагментів AFLP, два з яких є корисними маркерами, що видно з Таблиці 10 нижче у тексті:

В Таблиці 10 наведено типи винайдених маркерів AFLP. Позначки (+) або (-) вказують на присутність або відсутність фрагмента AFLP..

Таблиця 10

Соl

Ler

Ws-мМ

Тип маркера

+

+

+

не інформативн.

+

+

-

маркер Ler

+

-

+

маркер Ws

+

-

+

не інформативн

В цілому спосіб "зняття відбитків" клонів Р1 та ВАС дозволив створити від 30 до 40 фрагментів AFLP EcoRI/Msel і від 60 до 80 фрагментів AFLP Hindlll/Msel для кожного окремого клону. Кінцеві послідовності окремих фрагментів визначали за допомогою стандартної технології секвенування. Після цього випробовували специфічні ряди праймерів AFLP з вибірковими видовженнями з З нуклеотидів як для праймера EcoRI або Hindlll, так і для праймера Msel, на такій панелі ДНК:

1. Клон Р1/ВАС, з якого одержували маркер AFLP

2а. Дріжджовий матеріал

26.Клон YAC CIC12F04 (лише для фрагментів AFLP з Р1-7)

2в. Клон YACCIC10G07

За. Сої, початок бібліотек Р1 та ВАС

3б. Ler, батьківський маркер 1 рекомбінантів nim

Зв. Ws-nim, батьківський маркер 2 рекомбінантів nim

Шість клонів вибирали для аналізу послідовності їхніх клонів EcoRI/Msel та фрагментів Hindlll/Msel (AFLP): ВАС-01/Р1-7, Р1-17/Р1-18, ВАС-04/ВАС-06. Усі фрагменти AFLP з клону Р1-7 виявляли в YAC CIC12F04, з чого можна зробити висновок про те, що цей клон повністю міститься в межах згаданого YAC. Жодного з Р1/ВАС-специфічних фрагментів AFLP не було виявлено в клоні YAC CIC10G07, з чого можна зробити висновок про те, що контигум Р1/ВАС не перекриває інтервал між двома фланкуючими контигумами YAC. Маркери AFLP, вибрані для аналізу рекомбінанти nim, зображено у Таблиці 11.

У Таблиці 11 наведено маркери AFLP з клонів PC (AFLP), специфічних для різних клонів Р1 та ВАС. Маркер "WL" являє собою маркер, що походить з того ж самого PC і відповідає двом маркерам AFLP, маркерам Ws та Ler, які виявилися повністю зв'язаними у фазі відштовхування після аналізу рекомбінантів nim.

2. Фізичне картування нових маркерів AFLP.

Маркери AFLP, описані вище у тексті, фізично картували за допомогою детектування їх присутності в різних клонах Р1 та ВАС. Результати представлено на Фігурах 9-11.

3. Генетичне картування нових маркерів AFLP.

Маркери AFLP аналізували на вибраному ряді рекомбінантів. Підсумкові одержані результати наведено у Таблицях 12а, 126 та 12в.

Таблиця 12а

РЕКОМБІНАНТИ NIM "НА ПІВНІЧ" ОТ WL84.4&5

Nr.

Росл.

PR-

Ler

Ws

WL

Ler

Ler

Ler

Ler

nim

Ler

Ler

Ler

Ler

Ler

Ws

Ws

Ler

1

84

84.

84.

84.

84.

84.

84.

85

84.

84.

84.

84.

85.

86.

86

дет./

2

4&

6a

6b

6c

7

8

9b

9a

9c

1

1

недт.

5

N1

А-74

недт.

(Η)

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N2

А-113

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

N3

В-023

недт.

Η

Η

W

W

w

W

W

W

W

W

W

W

Rnim

N4

В-297

вкл.

W

W

Η

(Η)

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

без nim

N5

В-292

недт.

Η

Η

W

W

w

W

W

W

W

W

W

W

nim

N6

D-269

недт.

Η

Η

W

W

w

W

W

W

W

W

W

W

Rnim

N7

D-306

недт.

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N8

E-086

недт.

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N9

F-049

недт.

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Rnim

N10

G-002

недт.

Η

Η

W

W

W

(Η)

W

W

nim

N11

G-009

недт.

(Η)

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Rnim

N12

G-064

недт.

Η

Η

W

W

W

(W)

W

W

W

W

W

W

W

(nim)

N13

G-072

недт.

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N14

H-037

недт.

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N15

Η-047

недт.

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Rnim

N16

H-097 (nim)

недт.

Η

Η

W

W

W

(W)

W

W

W

W

W

W

W: генотип Ws, Η: гетерозиготи.; ( ): не на 100% надійне, або розрахунки зроблено на підставі сусідн.; nim та Rnim: рослини, в яких визначено наявність фенотипу nim; без nim: рослини, в яких визначено відсутність фенотипу nim; PR-1 дет/недет.: стосується експресії гена PR-1 після індукції ΙΝΑ за визначенням на підставі нозерн-блотинга (дет.: PR-1 мРНК -детектовано).

Таблиця 126

РЕКОМБІНАНТИ NIM "НА ПІВДЕНЬ" ВІД Ler84.9c

№.

Росл.

PR-

Ler

Ws

WL

Ler

Ler

Ler

Ler

nim

Ler

Ler

Ler

Ler

Ler

Ws

Ws

Ler

1

84

84.

84.

84.

84.

84.

84.

85

84.

84.

84.

84.

85.

86.

86

дет./

2

4&

6a

6b

6c

7

8

9b

9a

9c

1

1

недт.

5

S6

А-116

недт.

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Η

Η

Η

Rnim

S7

В-111

недт.

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Η

Η

Η

nim

S8

В-165

пром

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

W

W

W

без nim

S9

В-182

пром

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

W

W

W

без nim

S10

В-190

недт.

W

W

W

W

w

(W)

W

W

W

W

W

Η

Η

Η

segWT

S11

B-243

недт.

W

W

W

w

w

w

w

w

w

w

w

Η

Η

Η

nim

S12

С-036

недт.

W

W

W

w

w

w

w

w

w

w

w

Η

Η

Η

nim

S13

С-088

недт.

W

W

W

w

w

w

w

w

w

w

w

Η

Η

Η

Rnim

S14

D-249

недт.

W

W

W

w

w

w

w

w

w

w

w

Η

Η

Η

nim

S15

E-050

недт.

W

W

W

W

W

w

w

w

w

w

w

w

w

Η

Η

Η

nim

S16

G-058

W

W

W

W

W

w

w

w

w

w

w

w

w

Η

Η

Η

nim

S17

C-017

W

W

w

w

w

w

w

w

w

w

W

Η

(Η)

Rnim?

S18

H-083

W

W

w

w

w

w

w

w

w

W

Η

(Η)

Rnim

Умовні позначення див. Табл. 12а.

Таблиця 12 в

РЕКОМБІНАНТИ NIM МІЖ WL84.4&5 ТА Lег84.9с

№

Росл.

PR-

Ler

Ws

WL

Ler

Ler

Ler

Ler

nim

Ler

Ler

Ler

Ler

Ler

Ws

Ws

Ler

1

84

84.

84.

84.

84.

84.

84.

85

84.

84.

84.

84.

85.

86.

86

дет./

2

4&

6a

6b

6c

7

8

9b

9a

9c

1

1

недт.

5

N17

В-304

Η

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N18

С-111

недт.

Η

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N19

Е-093

недт.

Η

Η

Η

W

W

W

w

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N20

Е-110

недт.

Η

Η

Η

W

W

W

w

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Rnim

N21

G-014

недт.

Η

Η

Η

W

W

Η

w

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N22

A-019

пром

W

W

W

W

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

без nim

N23

C-074

недт.

Η

Η

Η

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Rnim

N24

C-074

недт.

Η

Η

Η

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N25

E-103

недт.

Η

Η

Η

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

S1

C-105

недт.

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

nim

S2

H-039

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Η

Η

Η

Η

Η

Η

nim

S3

B-052

недт.

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Η

Η

Η

Η

Η

nim

S4

B-142

недт.

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Η

Η

Η

Η

nim

S5

B-110

недт.

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Η

Η

Η

Rnim

]Виявилося, що маркери AFLP Ler84.8, Ler84.9a, Ler64.9b та Ler84.9c картуються в з "південного" боку NIM1. Було виявлено рекомбінанти, які мали фенотип nim1 (гомозиготні, генотип Ws-nim1/\Ns-nim1) і були гетерозиготними для згаданих маркерів AFLP (було детектовано Ler-специфічний маркер AFLP, генотип його був \Ns-nim1/ Ler). З'ясувалося, що маркер AFLP Ler84.8 був найближчим до NIM1: лише окремий рекомбінант (С-105) виявився гетерозиготним \Ns-nim1 /Ler та гомозиготним \Ns-nlm1 /\Ns-nim1. Було виявлено також, що маркери AFLP Ler84.7 та Ler84.6c однаково розщеплюються з NIM1: усі рекомбінанти мали ідентичний генотип NIM1 та маркера AFLP. "На північ" від NIM1 маркер L84.6b виявився найближчим до NIM1: було визначено, що три рекомбінантні рослини з фенотипом nim1 - С-074, D-169 та Е-103 (Таблиця12в) - є гетерозиготними \Ns-nim1 /Ler при цьому маркері. За допомогою космідного контигуму, створеного з Р1-18, ВАС-04 та ВАС-06, маркери AFLP Ler84.6b та Ler84.8 картували відповідно в Р1-18 та ВАС-04 і виявили, що вони мають фізичну відстань близько 110 т.п.н.. Звідси було визначено, що nim1 має розташовуватися на сегменті ДНК, довжина якого оцінюється у 110 т.п.н. На підставі цього аналізу встановлено, що NIM1 - ген міститься в клоні ВАС-04 або Р1-18. Клони ВАС-04 та Р1-18 було відібрано до колекції АТСС; їм було присвоєно колекційні коди АТСС 97543 та АТСС 97606, відповідно.

vii. Детальне генетичне та фізичне картування гена NIM1.

У попередньому розділіописано, як сегмент ДНК, що містить ген NIM, трансдиференціювали за допомогою фізичного картування фланкуючих маркерів AFLP (Ler84.6b та Ler84.8) на контигумі Р1/ВАС. Виявилося, що фланкуючі маркери картувалися на двох клонах, що перекриваються, Р1-18 та ВАС-04. У цьому розділі описується, як утворювали додаткові ВАС-04-специфічні та РІ-18-специфічні маркери AFLP, з метою підвищення роздільної здатності генетичної та фізичної карти у ділянці, що містить NIM1 - ген.

viii. Створення додаткових Маркерів AFLP з космідної матриці.

Для створення додаткових маркерів AFLP з метою детального картування NIM1 вибрали чотири EC; Pstl/Msel, Xbal/Msel, BstYI/Msel та Taql/Msel. Фрагменти AFLP Pstl/Msel та Xbal/Msel утворювали на клоні Р1-18 та ВАС-04 і визначали вибіркові послідовності, необхідні для детектування в Arabidopsis. Аналогічним чином визначали фрагменти AFLP вибіркові послідовності для BstYI/Msel та Taql/Msel; проте у цьому випадку процедуру виконували з використанням космідних ДНК: А11, С7, Е1 та Е8 - для BstYI/Msel (повна ділянка NIM1), і D7, Е8 та Е6 - для Taql/Msel ("південний" бік ділянки NIM1 ). Інформативні маркери AFLP, вибрані для подальшого генетичного та фізичного картування, наведено у Таблиці 13. Додаткові адаптери, застосовані у цій праці, показано у Таблиці 14.

У Таблиці 13 показано маркери AFLP, що їх використовують для детального генетичного та фізичного картування NIM1. "BstYI(T)" означає, що сайт рестрикції та відповідним праймером був або AGATCT, або GGATCT.

У Таблиці 14 наведено ті ж самі додаткові адаптери, які було застосовано для визначення нових маркерів AFLP.

іх. Фізичне картування нових маркерів AFLP до космідного контигуму.

Зазначені вище маркери фізично картували на космідній матриці шляхом визначення їх присутності у різних космідних клонах (Фігура 11).

1. Генетичне картування нових маркерів AFLP.

Нові маркери AFLP генетично картували за допомогою аналізу AFLP найближчого "північного" та "південного" рекомбінантів. Картували найближчу "північну" (рекомбінант D169) та найближчу "південну" (рекомбінант С105) точки рекомбінації (див. Таблицю 15). Аналіз AFLP показав, що рекомбінант D169 мав рекомбінацію " на південь" від маркера L84.Y1, але "на північ" від маркера W84.Y2. Точку рекомбінації в рекомбінанті С105 картували між маркерами L84.T2 та L84.8. З використанням можливого ряду рекомбінантів стало можливим подальше трансдиференціювання хромосомного інтервалу, що містить NIM1; виявилося, що відстань між фланкуючими точками рекомбінації становить 60-90 т.п.н. (Фігура 12).

ТАБЛИЦЯ 15

РЕКОМБІНАНТИ МІЖ AFLP МАРКЕРАМИ WL844&5 ТА LER 84.9C

№

Plait

PR-1

Ler

Ws

WL

Ler

Ler

Ler

Ws

Ler

Lsr

Ler

Ws

Ler

Ler

Lsr

Mm

Ler

Ler

Ler

Ler

Ws

Ws

Ler

деr/

84

84.2

84.

84.6а

84.6b

84. Y1

84 .Y2

84.7

84.6c

84. Y3

84. Y4

84. T1

84. T2

85

84.8

84.9b

84.9a

84.9c

85.1

86.1

86

недт

4&5

N17

B-304

Η

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N18

C-111

нєдт.

Η

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N19

E-093

недт.

Η

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N20

E-110

недт.

Η

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Rnim

N21

G-014

недт.

Η

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N22

A-019

пром

W

W

W

W

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

notnim

N23

C-074

недт.

Η

Η

Η

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Rnim

N24

E-103

недт.

Η

Η

Η

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

N25

D-169

недт.

Η

Η

Η

Η

Η

Η

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

nim

S1

C-105

недт.

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Η

Η

Η

Η

Η

Η

Η

nim

S2

H-039

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

H

Η

Η

Η

Η

Η

nim

S3

B-052

недт

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Η

Η

Η

Η

Η

nim

S4

B-142

пром

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Η

Η

Η

Η

nim

S5

B-110

Rmin

пром

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

W

Η

Η

Η

Rnim

Таблиця 15. Рекомбінанти між AFLP маркерами WL84.4&5 та Ler 84.9с. Маркери не обов'язково показано у тому порядку, який відповідає їх фізичному положенню. Для більш детального ознайомлення див. Таблицю 12.

63 2. Створення космідного контигума.

Для комплементації рослинного фенотипу з nim1 потрібна трансформація nim 1 - рослин природним геном NIM1. Це можна виконати за допомогою трансформування цих рослин космідою, що містить ген. Для цього створюють космідний контигум ділянки NIM1. Оскільки Arabidopsis трансформували з використанням Agrobacterium, використаний космідний вектор являє собою бінарний вектор.

ДНК виділяли з ВАС-04, ВАС-06 та Р1-18 і застосовували для часткового розщеплення з використанням рестрикційного ферменту Sau3AI. Виділяли фрагменти розміром 20-25 т.п.н., з використанням градієнту сахарози, зливали та заповнювали дАТФ та дГТФ. Бінарний вектор (04541 ) розщеплювали Xhol та заповнювали дЦТФ та дТТФ. Фрагменти далі лігували у вектор. Суміш після лігування пакували та трансдукували в Е.соїі.

Цю космідну бібліотеку піддавали скринінгу з використанням клонів ВАС-04, ВАС-06 та Р1-18, і виділяли позитивні клони. Ці косміди далі піддавали процедурі зняття відбитків (AFLP) та упорядковували в контигум клонів, що перекриваються, охоплюючи ділянку NIM1. Визначали розміри вставок космід, і проводили обмежене рестрикційне картування. Результати наведено на Фігурі 10.

Приклад 2

Ідентифікація клона, що містить ген NIM1. 1. Комлементація через стабільну трансформацію

Косміди, що їх утворювали з клонів, які охоплюють ділянку NIM1 (описано вище у тексті), переміщали до Agrobacterium за допомогою трибатьківського схрещування. Ці косміди використовували для трансформування Arabidopsis з nim1 способом вакуумної інфільтрації (Mindrinos et al., 1994, Ce_U 78, 1089-1099) або стандартної кореневої трансформації. Насіння цих рослин збирали і давали прорости на агарових планшетах з канаміцином (або іншим відповідним антибіотиком) як агентом селекції. Лише ті рослини, що були трансформовані космідною ДНК, були здатними знешкодити агент селекції та вижити. Паростки,

що пережили селекцію, переносили до грунту і тестували на фенотип nim, або їхнє потомство тестували на фенотип nim. Трансформовані рослини, які більш не мали фенотипу nim, ідентифікували косміди, що містили функціональний ген NIM1.

2. Комплементації у Тимчасових Системах Експресії.

Здатність клонів ДНК комплементувати мутацію nim1 тестували у 2 тимчасових системах експресії.

У першій системі рослини Arabidopsis з nim1, що містять трансген люциферази PR1 (PR1-lux), використовують як приймальний матеріал для бомбардування. Ці рослини створювали шляхом трансформування рослин екотипу Columbia структурою PR1-lux за допомогою вакуумної інфільтрації, після чого з використанням канаміцину проводили селекцію зібраного насіння, як описано вище у тексті. Трансформовані рослини, що експресували дію люциферази, після індукції за допомогою ΙΝΑ схрещували, і створювали гомозиготні рослини. Ці рослини схрещували з nim 1 - рослинами. У проміжному тесті потомство рослин з цього перехрещення, які є гомозиготними для nim 1 і для PRI-lux, використовують для ідентифікації клонів ДНК, здатних комплементувати фенотип nim1. У цьому випадку рослини спершу обробляли ΙΝΑ, як описано у Прикладі 1.1 вище у тексті. Через два дні рослини збирали, поверхню стерилізували і поміщали їх на GM-агарове середовище. Тканину листків після цього бомбардували космідою, клонами Р1 або ВАС (або субклонами) з ділянки nim1, а через один день вимірювали люциферазну активність листків. Клони, які індукували люциферазну активність, містили ген ΝΙΜ1.

У другій системі nim 1 -рослини обробляли ΙΝΑ (як описано у Прикладі 1.1 вище у тексті) і через 2 два дні бомбардували клонованою ДНК (космідою, Р1, ВАС та/або клонами YAC чи субклонами) з ділянки локусу nim 1 і плазміди-репортера. Плазміда-репортер містить ген люциферази, який спрямовується промотором Arabi&opsis PR1 (PR1-lux). В рослинах з nim1 ΙΝΑ не стимулює промотор PR1 (як описано у Прикладі 1.2 вище у тексті), і таким чином, не може індукувати люциферазну активність з плазіміди -репортера. Проте, коли співтрансформований клон ДНК містить комплектуючий ген ΝΙΜ1, ΙΝΑ індукує промотор PR1, що підтверджується індукцією люциферазної активності. Через день після сумісного бомбардування вимірювали люциферазну активність у цілій рослині. Клони ДНК (косміди, клони Р1 або ВАС чи субклони), що індукують люциферазну активність, значно вищу за фонові рівні, містить ген ΝΙΜ1.

3. Зміни транскриптів у лініях фенотипу nim 1.

Оскільки рослини фенотипу nim 1 мають мутації гена ΝΙΜ1, можна , припустити, що у деяких лініях ген змінюється у такий спосіб, що у ньому немає транскрибованої мРНК, або утворюється мРНК, яка відхиляється від норми (за розміром). Для того, щоб перевірити таке припущення, проводять блотинг-аналіз РНК на лінях nim 1.

РНК виділяють з рослин Ws та Ler цих ліній, (після обробки водою абоΙΝΑ чи ВТН), після чого її використовують для приготування компонентів нозерн-блотингу. Ці компоненти гібридизують з фрагментами ДНК, виділеними з клонів контигума ДНК локусу ΝΙΜ1. Фрагменти ДНК, які ідентифікують лінії nim 1 з ненормальною експресією РНК (ненормальною за розміром чи концентрацією), так само ідентифікують (частину) ген ΝΙΜ1. Фрагмент ДНК та оточуючу ДНК секвенують і використовують для виділення кДНК (шляхом скринування бібліотеки або ПЦЛР зі зворотною транскрипцією), яку також секвенують. Той клон, з якого виділяли фрагмент або використовували виділену кДНК, повинен відзначатися комплементацією фенотипу nim1 у стабільних та тимчасових системах експресії.

Приклад 3 Визначення послідовності ДНК гена NIM1.

1. Геномне секвенування.

Геномні клони, які можуть містити ген NIM1, секвенують відомими у галузі способами. До цих клонів належать ВАС-04, Р1-18 і косміди з ділянки NIM1. Наприклад, косміди розщеплюють рестрикційними ферментами, і фрагменти, які одержують від вставки, клонують в основний вектор, наприклад, pUC18 чи Bluescript. Більші клони Р1 та ВАС "розрізають" способом випадкової вибірки, і фрагменти клонують в основний вектор. Фрагменти в таких векторах секвенують стандартними способами (наприклад, способом "праймерної прогулянки" або створення делецій вставок). Одержані послідовності збирають у єдину послідовність.

Послідовність вставки комплементуючого клону містить ген NIM1. Приблизне положення початку та кінця nim 1 - гена виявляють на основі послідовності ДНК, мотивів послідовності, таких як боксів ТАТА, відкритих рамок зчитування, присутніх у послідовності, використання кодону, даних про комплементацію косміди, відносного розташування маркерів AFLP, а також додатково зібраних даних (див. Приклад 4 нижче у тексті).

2. Секвенування кДНК.

Для виділення кДНК використовують косміда(-и) або більші клони, що містять ген NIM1 (як описано у Прикладі 2 вище у тексті). Це досягається з використанням клонів (або фрагментів ДНК) як зондів у скринуванні бібліотеки кДНК природних рослин Arabidopsis. кДНК, що їх виділяють, таким чином, секвенують аналогічно описаному процесу секвенування косміди і використовують для тестування комплементації. Отже, повнорозмірні кДНК клонують у вектор експресії відповідної рослини, за визначальним промотором. Такі структури використовують у описаних вище тимчасових тестах. Як варіант, кДНК клонують у бінарний вектор експресії, сприяючи експресії у рослинних тканинах і опосередкованій Agrobacterium трансформації рослини, як описано в Прикладі 2 вище у тексті. кДНК, що містить ген NIM1 (визначений шляхом комплементації, виділення безпосередньо зв'язаним маркером AFLP, виділення космідним фрагментом або іншими способами), секвенують.

Гени з Ws-0 та nim 1 - рослин виділяють і секвенують. Гени одержують з косміди бібліотеки кДНК, з використанням фрагменту виділеного гена NIM1 як зонда. Як варіант, гени або кДНК виділяють за допомогою ПЦЛР, з використанням специфічних до гена NIM1 праймерів та геномної ДНК чи кДНК як шаблона (матриці). Аналогічним чином виділяють алелі nim 1 з інших ліній nim 1 (див. Приклад 1.1 вище у тексті), які секвенують у такий самий спосіб.

Приклад 4 Description of NIM1 гена and deduced protein послідовність

Послідовність ДНК MM 7-гена або кДНК визначають способом, який описано вище у Прикладі 3. Цю послідовність аналізують за допомогою програм аналізу ДНК, що їх можна знайти у пакеті Genetics Computer Group (GCG), у пакетах Sequencer або Staden packages, або у будь-якому аналогічному пакеті програм.

Якщо більш конкретно, початок та кінець гена визначають на основі аналізу відкритої рамки зчитування, наявності термінуючого та потенційного ініціюючого кодонів, наявності мотивів потенційного промотора (такого, як бокс ТАТА), наявності сигналів поліаденілювання тощо. Крім того, виявляють прогнозні амінокислоти з відкритої рамки зчитування. Як ДНК, так і послідовність білків використовують для пошуку та створення бази даних для послідовностей з гомологіями, такими як фактори транскрипції, ферменти або мотиви згаданих генів або білків.

Приклад 5 Виділення гомологів NIM1

Ген NIM1 Arabidopsis використовують як зонд під час скринінгу (з низькою інтенсивністю гібридизації) геномної бібліотеки або бібліотеки кДНК, з метою виділення гомологів NIM1 з інших видів рослин. Як варіант, це виконують за допомогою ПЦЛР-ампліфікації, з використанням праймерів, створених на основі послідовності nim1 - гена Arabidopsis і з використанням геномної ДНК або кДНК як шаблона. NIM1 - ген виділяють з кукурудзи, пшениці, рису, ячменя, насіння рапсу, цукрових буряків, картоплі, томатів, соєвих, огірків, винограду, тютюну та інших корисних культурних рослин, після чого його секвенують. Маючи у своєму розпорядженні набір послідовностей з гомологів гена NIM1, зі збережених частин гена можна створити нові праймери з метою виділення гомологів NIM1 з більш далеких за походженням рослинних видів, використовуючи ПЦЛР-ампліфікацію.

Приклад 6 Комплементація гена nim1-1 геномними фрагментами.

1. Створення космідного контигума.

Космідний контигум ділянки NIM1 будували з використанням CsCI-очищеної ДНК з ВАС04, ВАС06 та Р1-18. ДНК трьох клонів перемішували у еквімолярних кількостях та частково розщеплювали рестрикційним ферментом Sau3A. Фрагменти розміром 20-25 т.п.н. виділяли з використанням градієнта сахарози, збирали і заповнювали дАТФ та дГТФ. Плазміду pCLD04541 використовували як космідний вектор Т-ДНК. Ця плазміда містить реплікон на базі pRK290 з широким діапазоном "хазяїв", гена опірності до тетрацикліну для селекції бактерій і ген nptll для селекції рослин. Вектор розщеплювали Xhol і заповнювали дЦТФ та дТТФ. Приготовані фрагменти після цього лігували у вектор. Суміш після лігування пакували і трансдукували у штам Е. coli XL1-голубий MR (Stratagene). Одержані трансформанти піддавали скринінгу за допомогою гібридизації з клонами ВАС04, ВАС06 та Р1-18 і виділяли позитивні клони. З цих клонів виділяли космідну ДНК, і готували шаблон ДНК з використанням клонів EC EcoRI/Msel та Hindlll/Msel. Одержані характеристики "відбитків" (AFLP) аналізували для того, щоб визначити порядок космідних клонів. Селектували ряд з 15 космід, що перекривалися наполовину, охоплюючи ділянку nim (Фігура 13). Космідні ДНК також обмежували EcoRI, Pstl, BssHII та SgrAI. Це підходить для розрахунку розмірів косміди, що вставляється, та верифікації перекриття між різними космідми, яке визначено шляхом "зняття відбитків" AFLP.

2. Ідентифікація клону, що містить ген NIM.

Косміди, створені з клонів ділянки NIM1, переміщували в AGL-1 Agrobacterium tumefaciens за допомогою безпосереднього переносу у три-батьківському схрещуванні штамом-помічником НВ101 (pRK2013). Ці косміди після цього використовували для трансформування чутливої до канаміцину лінії Arabidopsis з nim 1 за допомогою вакуумної інфільтрації (Mindrinos et al., 1994, Cell 78, 1089-1099). Насіння з інфільтрованих рослин збирали и пророщували на агарових (GM) планшетах, що містили 50 мг/мл канаміцину як агента селекції. Лише ті бляшки рослинної культури, що їх трансформували космідою ДНК, виявилися спроможними знешкодити агент селекції та вижили. Насінини, що пережили селекцію, приблизно через два тижні після обробки в планшетах переносили до грунту і тестували на фенотип nim 1, як описано нижче у тексті. Трансформовані рослини, які більш не мали фенотипу nim1, ідентифікували косміду(-и), що містила функціональний ген NIM1.

3. Тестування трансформантів на фенотип nim1

Рослини, перенесені до грунту, вирощували у фітотроні приблизно один тиждень після перенесення. Для повного покриття рослин застосовували 300 мкм ΙΝΑ (як активне середовище з дуже дрібними розсіяними частинками), за допомогою спеціального пристрою (chromister). Через два дні листки збирали для проведення аналізу на предмет екстрагування РНК і експресії PR-1. Після цього рослини обприскували Peronospora parasitica (ізолят EmWa) і вирощували в умовах високої вологості у вирощувальній камері при температурах 19°С вдень/17°С вночі, цикл освітлення становив 8 год. світлого часу/16 год. Темного часу. Через вісім-десять днів після зараження грибками рослини досліджували і кількісно характеризували з точки зору росту грибків. Рослини з Ws та nim1 обробляли однаковим способом, що гарантувало об'єктивність виконання кожного з дослідів.

Сумарні РНК екстрагували із зібраної тканини з використанням екстрагувального буфера LiCI/фенол (Verwoerd, et al. NAR 17:2362). Зразки РНК поміщали на формальдегід-агарозний гель і блотували до мембран GeneScreen Plus (DuPont). Блоти (одержані плями) гібридизували з міченим 32 Ρ зондом PR-1 кДНК. Результативні блоти знімали на плівку, встановлюючи, які трансформанти виявилися здатними індукувати експресію PR-1 після обробки ΙΝΑ. Підсумкові результати наведено у Таблиці 16.

У Таблиці 16 відображено комплементацію фенотипу nim1 космідними клонами.

Таблиця 16

Назва клону

Кількість трансформантів

Кількість рослин з індукованою ΙΝΑ PR-1/сумарна кількість; кількість тестованих рослин (%)

А8

3

0/3 (0%)

А11

8

4/18 (22%)

С2

10

1/10(10%)

С7

33

1/32 (3%)

D2

81

4/49 (8%)

D5

6

5/6 (83%)

Е1

10

10/10 (100%)

D7

129

36/36 (100%)

Е8

9

0/9 (0%)

F12

6

0/6 (0%)

Е6

1

0/1 (0%)

Е7

34

0/4 (0%)

WS-контр. (природи.)

NA

28/28 (100%)

Фенотип nim1-1 NA - Не застосовувал

NA

0/34 (0%)

Приклад 7

Секвенування ділянки ΝΙΜ1 - гена довжиною 9,9 т.п.н.

ВАС04 ДНК (25 мкг, отримано від KeyGene) була джерелом ДНК, яку використовували для аналізу послідовності. Цей ВАС виявився клоном, який повністю охоплював ділянку, що комплементувала гени-мутанти nim1. ДНК фрагментували способом довільної вибірки з використанням підходу, прийнятого у лабораторіях Коулд Спринг Харбор. Якщо описувати це стисло, ВАС ДНК фрагментували у розпилювачі до середньої молекулярної маси приблизно 2 т.п.н. Кінці одержаних фрагментів відновлювали за допомогою двохстадійного протоколу з використанням dNTPS, полімерази ДНК Т4 та фрагменту Кленова (Boehringer). ДНК з відновленими кінцями розподіляли в 1%-му низькоплавкому агарозному гелі, і ділянку між 1,3 т.п.н. та 2,0 т.п.н. вирізали з цього гелю. ДНК виділяли з гелевого фрагменту способом "замерзання та відтаювання". Після цього ДНК змішували з розщепленим за допомогою EcoRV pBRKanF4 і лігували протягом доби при температурі 4°С. pBRKanF4 є похідною від pBRKanFI, яку отримав Колаві Бхат у Вандербільтському Університеті (Bhat, K.S., Gene 134(1), 83-87 (1993)). Ε-Штам СоН DH5a трансформували сумішшю після лігування, і суміш після трансформування поміщали на планшети, що містили канаміцин та X-gal. Для виділення плазміди відбирали 1600 білих або світло-голубих колоній KanR. Окремі колонії поміщали в 96-коміркові планшети з глибокими комірками (Polyfiltronics, #11508), що містили 1,5 мл ТВ+Кап (50 мкг/мл). Планшети закривали і поміщали на платформу ротаційного шейкера при 37°С на 16 годин. Плазміду ДНК виділяли за допомогою системи Wizard Plus 9600 Miniprep (Promega, #A7000) з дотриманням рекомендацій виробника.

Плазміди секвенували з використанням хімічної технології Dye Terminator (Термінатор забарвлення) (Applied Biosystems PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, P/N 402078) і праймерів, створених для секвенування обох ланцюжків плазміди. Дані збирали на секвенаторах ДНК АВІ 377. Приблизно 75% цих реакцій давали на виході корисну інформацію про послідовності. Послідовності коригували і з'єднували у контигуми з використанням пристроїв Sequencher 3.0 (Gene Codes Corporation), Staden gap4 (Roger Staden, адреса e-mail: rs@mrc-lmb.cam.ac.uk) і PHRED (Phil Green, адреса e-mail: phg@u.Washington.edu). Найбільший контигум (приблизно 76 т.п.н.) охоплював комплементуючу ділянку в середньому до глибини 7 незалежних елементів на основу.

Ділянку розміром приблизно 9,9 т.п.н., обмежену перекриттям космід Е1 та D7, ідентифікували шляхом комплементаційного аналізу на вміст ділянки nim 1. Праймери, що фланкували сайт інсерції вектора і специфічні до космідного остову, створювали з використанням програми аналізу праймера Oligo 5.0 (National Biosciences, Inc.). ДНК виділяли з космід D7 та Е1 з використанням модифікованої амонійацетатної технології (Traynor, P.L, 1990, BioTechniques 9(6): 676.) Цю ДНК безпосередньо секвенували з використанням зазначеної вище хімічної технології Dye Terminator. Одержана послідовність дозволила визначити кінцеві точки комплементуючої ділянки.

"Зрізану" модель фрагменту BamHI-EcoRV також створювали, одержуючи структуру, що не містить жодної з ділянки "Ген 3" (Фігура 13). Підхід, який описано нижче, був необхідним через присутність сайтів Hindlll у ділянці Ват-Spe ДНК. Структуру BamHI-EcoRV повністю розщеплювали Spel, після чого розділяли і піддавали двом окремим реакціям для подвійного розщеплення. Одну аліквотну пробу розщеплювали ВатНІ, другу - Hindlll. Фрагмент ВатНІ-Spel розміром 2816 п.н. і фрагмент Hindlll-Spel розміром 1588 п.н. виділяли з агарозних гелів (комплект QiaQuick Gel) і лігували до розщепленого з використанням BamHI-Hindlll pSGCGOI. DH5a трансформували сумішшю лігування. Результативні колонії піддавали скринінгу на предмет коректності вставки за допомогою розщеплення Hindlll та подальшого приготування ДНК з використанням Wizard Magic MiniPreps (Promega). Клон, що містить правильну структуру, піддавали електропорації в штам Agrobacterium GV3101 з метою трансформації рослин Arabidopsis.

Приклад 8 Ідентифікація ділянки NIM1 - гена за допомогою секвенування алелі.

Таблиця 17

Генетична сегрегація мутантів з природженим імунітетом

Фенотип

Генерація мутантів

Жіноч.

Чоловій. Природи.

nim 1

nim 1-1а

F1

природнь

nim 1-І

24

0

F2

98

32

nim 1-2

F1

nim 1-2

Природи.

3

0

nim 1-3

F1

nim 1-3

Природи.

3

0

nim 1-4

F1

nim 1-4

Природи.

3

0

nim1 -5

F1

nim 1-5

Природи.

0

35

nim 1-6

F1

nim 1-6

Природи.

3

0

nim 1-І

F1

nim 1-2

nim 1-1

0

15

nim 1-3

F1

nim }-3

nim 1-1

0

10

nim 1-4

F1

nim 1-4

nim 1-1

0

15

nim 1-5

F1

nim 1-5

nim 1-1

0

14

F2

9

85

nim 1-6 F1

nim 1-6

nim 1-1

0

12

Дані від Delaney et al. (1995) PNAS 92,6602-6606. ь "Природи." означає природний штам Ws-O.

1. Генетичні аналізи

Для того, щоб визначити домінантність різних мутантів, які мали фенотип nim 1, пилок природних рослин переносили до приймочки рослин л/ті-1, -2, -3, -4, -5, -6. Якщо мутація є домінантною, тоді фенотип nim 1 виявиться у результативних рослинах F1. Якщо мутація є рецесивною, тоді у результуючих рослин F1 спостерігатиметься природний фенотип.

Дані, представлені у Таблиці 17, показують, що коли рослини з nim 1-1, -2, -З, -4 та -6 є схрещеними з природними, результуюча рослина F1 має природний фенотип. Отже, такі мутації є рецесивними. Навпаки, усе потомство природної рослини F1 з nim 1-5 X відзначається фенотипом nim 1, з чого видно, що це є домінантна мутація. Після обробки ΙΝΑ споруляція P. Parasitica не була виявлена на природних рослинах, у той час як рослини F1 підтримували ріст та у деякій мірі споруляцію P. parasitica. Проте фенотип nim1 в цих рослинах F1 був менш виразним, ніж виявлений тоді, коли nim1-5 був гомозиготним.

Для того, щоб визначити алельність, пилок з опірних до канаміцину мутантних п/т7-7-рослин переносили до приймочок рослин nim 1-2, -З, -4, -5, -6. Насінини, одержані внаслідок схрещення, поміщали на планшети В5 (Murashige-Skoog), які містили канаміцин в концентрації 25 мкг/мл, для того, щоб переконатися у гібридному походженні насіння. Опірні до канаміцину рослини (F1) переносили до грунту і тестували на предмет фенотипу nim 1. Через те, що потомство F1 від схрещення мутанта nim 1-5 з природним Ws відзначалося наявністю фенотипу nim 1, проводили також аналіз nim1-5 X nim1-1 F2.

Як видно з Таблиці 17. Усі одержані рослини F1 відзначалися наявністю фенотипу nim 1-1. Отже, мутація nim 1-2, -3,-4,-5,-6 не комплементувалася nim1-1; усі ці рослини потрапили в ту ж саму групу комплементації і є, таким чином, алельними. Аналіз потомства F2 зі схрещення nim 1-5 X nim 1-1 також довів наявність фенотипу nim1, підтверджуючи той факт, що nim 1-5 являє собою апель nim 1.

2. Аналіз та субклонування послідовності ділянки NIM1.

Ділянку довжиною 9,9 т.п.н., що містить ділянку NIM1, аналізували на присутність відкритих рамок зчитування у всіх шести рамках, використовуючи для цього пристрій Sequencher 3.0 та пакет GCG. Чотири ділянки з великими ВРЗ ідентифікували як можливі гени (Ділянки гена 1-4). Ці чотири ділянки ампліфікували (ПЦЛР) з ДНК природної батьківської рослини і шести різних варіантів алелей nim1. Праймери для цієї ампліфікації вибирали за допомогою Oligo 5.0 (National Bioscienves, Inc.) і синтезували з використанням Integrated DNA Technogies, Inc. Продукти ПЦЛР розділяли на 1,0%-их агарозних гелях і очищали за допомогою комплекту QIAquick Gel Extraction Kit. Очищені геномні продукти ПЦЛР безпосередньо секвенували за допомогою праймерів, що їх використовували для початкової ампліфікації, а також за допомогою додаткових праймерів, створених для секвенування через будь-які ділянки, не покриті початковими праймерами. Середня величина покриття для таких генів становила близько 3,5 зчитувань/пару нуклеотидів.

Послідовності коригували і збирали у потрібному порядку за допомогою пристрою Sequencher 3.0. Зміни в розташуванні пар нуклеотидів, специфічні для різних алелей nim1, ідентифікували лише у ділянці, яка одержала назву Ділянка гена 2.

Положення, що їх перелічено у Таблиці 18, і які стосуються Фігури 14, тобто відповідають верхньому ланцюгу ділянки розміром 9,9 т.п.н., зображеної на Фігурі 13. Відкриті рамки зчитування з ділянок гену, показані на Фігурі 13 цифрами 1,2,3 та 4, піддавали секвенуванню; зміни у різних алелях nim1 показано у згаданій Таблиці. Описані зміни присутні на верхньому ланцюгу, від 5сс до Зсг, як позначено на Фігурі 13.

Можна зробити висновок, що був клонований NIM1 - ген і що він розташований у межах Ділянки гена 2, оскільки амінокислоти послідовності в межах відкритої рамки зчитування Ділянки гена 2 у всіх 6 алелях nim1. У той самий час принаймні одна з алелей nim1 не мала змін у відкритих рамках зчитування в Ділянках гена 1, 3 та 4. Таким чином, єдиний ген в межах ділянки розміром 9,9 т.п.н., який міг би бути NIM1, це Ділянка гена 2, тобто ген NIM1.

У розділі Ws Таблиці 18 показано зміни екотипу Ws Arabidopsis відносно екотипу Columbia Arabidopsis. Фігури 13, 14, 15 та всі інші, де показана послідовність, стосуються екотипу Columbia Arabidopsis, що містить природний ген у проведених експериментах. Зміни наведено у вигляді змін амінокислот в межах гена 2 або ділянки NIM1, а також показано у вигляді змін пар нуклеотидів у інших ділянках.

На Фігурі 13 показано 4 чотири різні панелі, що відображають клонування NIM1 - гена і розкривають характеристику цілої ділянки 9,9 т.п.н. На Фігурі 14 зображено послідовність цілої ділянки 9.9 т.п.н. у тих самих координатах, як і на Фігурі 13. На Фігурі 15 показано послідовність специфічної ділянки NIM1 - гена, яка відповідає ділянці гена 2, зображеної на Фігурі 13; послідовність Фігури 15 містить ген NIM1. На Фігурі 15 показано амінокислотну послідовність у єдиному літерному коді, а також показано повну довжину кДНК та одержаного продукту RACE - великими літерами у послідовності ДНК. Деякі з виявлених мутацій алелей показано вище послідовності ДНК; вказано також на конкретну алель nim 1, що мала таку зміну.

Аналіз послідовності ділянки та секвенування різних алелей nim1 (див. нижче у тексті) дало можливість ідентифікувати ділянку косміди, що містить nim 1 - ген. Цю ділянку трансдиференціювали за допомогою рестрикційного фрагмента BamHI-EcoRV розміром 5.3 т.п.н. Косміду ДНК з D7 і плазміду ДНК з pBlueScriptll(pBSII) розщеплювали з використанням Ват НІ і EcoRV (NEB). Фрагмент 5,3 т.п.н. з D7 виділяли з агарозних гелів і очищали з використанням комплекту для гель-екстрагування QIAquick (# 28796, Qiagen). Фрагмент лігували протягом доби до розщепленого з використанням Bam-EcoRV pBSII, і суміш після лігування трансформували у штам Ε Coli DH5a. Колонії, що містили вставку, відбирали, виділяли ДНК, для підтвердження потрібного результату піддавали розщеплюванню Hindlll. Фрагмент Bam-EcoRV вставляли в бінарний вектор (pSGCGOl) для трансформування в Arabldopsis.

3. Нозерн-аналіз (нозерн-блотинг) чотирьох ділянок гена.

Ідентичні нозерн-блоти створювали зі зразків РНК, виділених з води-, оброблених SA-, ВТН- та ΙΝΑ Ws і ліній nim1, як це було описано раніше (Delaney et al, 1995, PNAS 92, 6602-6606). Ці блоти гібридизували з продуктами ПЦЛР, створеними з чотирьох ділянок гена та ідентифікованими у ділянці 9.9 т.п.н. nim 1 - гена. Лише ділянка гена, що містила ген NIM1 (Ділянка гена 2), мала детектовану гібридизацію зі зразками РНК, звідки видно, що лише ділянка NIM1 містить детектований транскрибований ген (Фігура 16 і Таблиця 18).

У Таблиці 18 показані зміни послідовності алелей nim 1.

Таблиця 18

Ділянка гена

Алель/

1

2 (MM 7)

3

4

екотип

(п.н 590-1090)

(п.н. 1380-4100)

(п.н.

5870-

6840)

(п.н. 8140-

9210)

nim 1-1

змін немає

t, вставлене в 2981: зміна 7АА

ЗМІН

немає

змін немає

і передчасне термінування

білка.

nim 1-2

змін немає

від g до а в 2799

від His до

ЗМІН

немає

змін немає

Туг

nim 1-3

змін немає

делеція t в 3261:

зміна 10АА і

змін

немає

змін немає

передчасне термінування

білка.

nim 1-4

змін немає

від с до t в 2402:

від Arg до lys

змін

немає

змін немає

nim 1-5

змін немає

від с до t в 2402:

від Arg до lys

змін

немає

змін немає

nim 1-6

від g до а в

від g до а в 2670

від Gin до

ЗМІН

немає

змін немає

734: від asp

Stop

до lys

WS

змін немає

від а до g в 1607

від Не до Leu

від t

до а в

5746

від t до g в

порівнянні

від а до с в 2344

інтрон

від а

до t в

5751

8705

3

від g до t в

Columbia)

8729

від t до g в 2480:

від Gin до

Biflt

до а в

5754

від g до t в

Pro

8739

від g до с в 2894

Ser to Trp

від с

flot в

6728

від g до t в

8784

ggc, делетований

в 3449:

від а

flot в

6815

від с до t в

втрата Ala

8789

від с до t в 3490:

від Ala до Thr

Biflt

до с в

6816

від с до t в

8812

від с до t в 3498:

від Ser до

від адодв

Asn

8829

від а до t в 3873: некодуюч.

від t до g в

8856

від g до а в 3992: некодуюч.

від а до с в

9004

від g до а в 4026: некодуюч.

від а до t в

9011

від g до а в 4061: некодуюч.

від а до g в

8461

Детектов.

Hi

Так

Ні

Ні

РНК

Положення, наведені у Таблиці, стосуються Фігури 14, на якій показана послідовність 9.9 т.п.н. Усі алелі від nim1-1 до nim 1-6 являють собою штам WS. Columbia-Ο представлені природними рослинами.

Авторами також показано, що ділянка гена 2 (Фіг.13) містить функціональний ген nim1, для чого знадобилося проведення додаткових дослідів щодо комплементації. Фрагмент геномної ДНК BamHI/Hindlil, що містить ділянку гена 2, виділяли з косміди D7 і клонували у бінарний вектор pSGCGOl, який містить ген опірності до канаміцину (Фіг.13; Steve Goff, особисте контактування). Одержану плазміду трансформували в штам Agrobacterium GV3101, і деякі колонії з позитивною реакцією відбирали на підставі обробки канаміцином. Для підтвердження наявності у відібраній колонії плазміди використовували ПЦЛР. Чутливі до канаміцину рослини nim1-1 інфільтрували цими бактеріями (описано у попередніх працях). Одержане насіння збирали і пророщували на GM-arapi, що містив 50мкг/мл канаміцину. Рослини, що пережили селекцію, переносили до грунту і тестували на предмет комплементації. Трансформовані рослини і контрольні рослини Ws та nim1 обприскували ЗООмкм ΙΝΑ. Через дві доби листки збирали для аналізу екстрагування РНК і експресії PR-1. Після цього рослини обприскували Peronospora parasltica (ізолят EmWa) і вирощували так само, як і у описаних раніше дослідах. Через десять днів після зараження грибками рослини піддавали кількісному аналізу з розрахунком позитивного або негативного розвитку грибкових організмів. Усі 15 трансформованих рослин, так само, як і рослини з контрольної групи (Ws), мали негативну реакцію щодо росту грибків після обробки ΙΝΑ, у той час як рослини з другої контрольної групи (nim1 ) -позитивну реакцію. РНК екстрагували та аналізували так само, як описано вище у тексті для подібних трансформантів і контрольних рослин. У контрольних рослин Ws і у всіх 15 трансформантів після обробки ΙΝΑ виявилася індукція гена PR-1, у той час як в контрольних рослинах nim 1 індукція PR-1 після обробки ΙΝΑ не спостерігалася.

4. Виділення кДНК ΝΙΜ1.

Бібліотеку кДНК Arabidopsis, створену у векторі експресії IYES (Elledge et al, 1991, PNAS 88, 1731-1735), поміщали до планшетів, після чого проводили аналіз утворення бляшок. Фільтри гібридизували з міченим ізотопом 32Р продуктом ПЦЛР створеним з ділянки гена, що містить nim-1. Ідентифікували 14 позитивів, одержаних від скринінгу приблизно 150.000 бляшок. Кожну бляшку очищали, і плазміда ДНК відновлювалась. Вставки кДНК відщепляли з вектора з використанням EcoRI, очищали на агарозному гелі і секвенували. Послідовність, одержана з найдовшої кДНК, показана на Фігурі 15. Для того, щоб переконатися у одержанні кінця 5g кДНК, використовували комплект Gibco BRL 5' RACE, суворо дотримуючись рекомендацій виробника. Одержані продукти RACE секвенували і досліджували на предмет включення додаткових пар нуклеотидів, показаних на Фігурі 15. Транскрибована ділянка, присутня в обох клонах кДНК і детектована в RACE, показана великими літерами на Фігурі 15. Зміни в алелях показані над ланцюгом ДНК. Великими літерами позначено наявність послідовності в клоні кДНК, або послідовність, детектована після ПЦЛР RACE.

Приклад 9

Характеристика гена nim 1

Ряд з кількох послідовностей будували з за допомогою програми Clustal V (Higgins, Desmond G. and Paul M. Sharp (1989), Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer, CAB I OS 5:151-153), що є частиною ДНК* (1228 South Park Street, Madison Wisconsin, 53715) Lasergene Biocomputing Software package for the Macintosh (1994).

Було визначено, що певні ділянки білка nim1 є гомологічними в амінокислотній послідовності до 4 різних білкових продуктів кДНК рису. Гомологи ідентифікували з використанням послідовностей NIM1 за програмою досліджень Gen Bank BLAST. Порівняння ділянок гомології в NIM1 і продуктах кДНК рису наведено на Фігурі 19. У фрагментах білка NIM1 відзначається від 36 до 48% амінокислотних послідовностей, ідентичних 4 продуктам рису.

Приклад 10 Фенотипна характеристика різних алелей nim1.

1. Аналіз хімічної реактивності в алелях nim1.

Автори проаналізували відмінності між різними алелями nim1 з точки зору хімічної індукції експресії гена PR і опірності до Peronospora parasitica (див. Фігури 17 та 18).

Мутантні рослини обробляли хімічними індукторами і далі досліджували на предмет експресії гена PR і опірності до захворювань.

2.Ріст рослини та хімічна обробка.

Природне насіння і зразки насіння з кожної алелі nim 1 (nim 1-1, -2, -3, -4, -5, -6 ) висівали на вирощувальне середовище MetroMix 300, накрите прозорим пластиковим ковпаком, і поміщали в темряву при 4°С на 3 доби. Через 3 доби витримування при 4°С рослини переносили у фітотрон на 2 тижні. Приблизно через 2 тижні після висаджування насіння проросло і дало 4 листки. Далі рослини обробляли Н2О, 5мМ SA, 300 мкм ВТН або 300 мкм ΙΝΑ. Хімікати застосовували у вигляді дрібнодисперсного аерозолю, що дозволило повністю покрити поверхню насінин, використовуючи хромістер. Рослини, що їх поливали лише водою, повертали до вирощувального фітотрону, у той час, як хімічно оброблені рослини витримували у окремому, але ідентичному фітотроні. Через 3 доби рослини розділяли на 2 групи. Рослини з одної групи збирали для екстрагування РНК і аналізу. Рослини другої групи піддавали інокуляції Р. parasitica.

3. Інокуляція Peronospora parasitica і аналіз результатів.

Ізолят P. parasifica 'EmWa' являє собою такий ізолят P.p., який є сумісним у екотипі Ws. Сумісними називають такі ізоляти, які здатні викликати захворювання конкретної рослини-хазяїна. Ізолят P. parasitica 'NoCo' є несумісним з екотипом Ws, але сумісним з екотипом Columbia. Несумісні патогени розпізнаються потенційним хазяїном, виявляючи реакцію цього хазяїна, яка запобігає розвитку захворювання. Через 3 доби після застосування хімікатів рослини, що поливалися водою і хімічно оброблювалися, інокулювали сумісним ізолятом 'EmWa'. Інокуляцію 'NoCo' проводили лише з рослинами, що поливалися водою. Після інокуляції рослини закривали прозорим пластиковим ковпаком, зберігаючи високу вологість, необхідну для успішного зараження Р. Parasitica, і поміщали у вирощувальну камеру при температурах удень 19°С і уночі 17°С (цикл - 8 год світлого часу/16 год. темного часу).

У різні моменти часу після інокуляції рослини аналізували під мікроскопом, оцінюючи розвиток симптомів захворювання. У збільшеному зображені споруляцію грибків можна виявити на дуже ранніх стадіях розвитку хвороби. Визначали відношення кількості рослини/горщик у відсотках, яке ілюструє споруляцію на 5, 6, 7, 11 і 14 день після інокуляції, а також фіксували густину споруляції.

На Фігурі 18 відображено оцінку ступеня захворювання різних алелей nim1 після інокуляції P. parasitica. Найбільш значними моментами часу виявилися 5 та 6 дні після інокуляції. Через 5 діб після інокуляції у nim 1-4 виявилися приблизно 80% заражених рослин при виконанні усіх передбачених видів індукуючої хімічної обробки, звідки ясно видно, що ця алель/генотип відрізняється більш високим ступенем сприйнятливості до захворювань. Через 6 діб після інокуляції у nim 1, -2, -3, -4 та -6 при виконанні усіх передбачених видів індукуючої хімічної обробки виявилися істотні симптоми захворювання. Однак nim1-5 через 6 днів виявився зараженим меншою мірою, ніж природний Ws при виконанні усіх видів обробки. Таким чином, nim1-5 має найбільш високу опірність до захворювань серед різних алелей nim 1. У nim 1-2 було виявлено середні показники сприйнятливості до хвороби після обробки ВТН, але без обробки іншими хімічними індукторами.

Експресія гена PR вказує на те, що nim1-4 найменше реагує на тестовані хімікати-індуктори (Фігура 17), у той час як в nim 1-5 виявлено підвищені рівні експресії PR-1 при відсутності індукторів. Такі результати експресії PR-1-гена узгоджуються з оцінкою ступеня захворювання, проведеною з P. parasitica (Фігура 18), і свідчать про те, що алелі nim 1 можуть викликати опірність або сприйнятливість.

Одержані зразки, що їх описано вище у тексті, використовували для аналізу експресії гена NIM1 (Фігура 17). У природних рослинах з мРНК nim 1 була присутньою у необроблених контрольних зразках. Після обробки SA, ΙΝΑ, ВТН або зараження сумісним патогеном мРНК ΝΙΜ1 акумулювалася до більш високих рівнів концентрації. Різницю вмісту матричної РНК (мРНК) ΝΙΜ1 досліджували в алелях nim 1 у порівнянні з природними рослинами. Вміст мРНК ΝΙΜ1 у необроблених мутантних рослинах виявився меншим, ніж у природних рослинах, за винятком nim 1-2 та -5, в яких значення вмісту були практично однаковими. nim 1-1, -3 та -4 мали низькі рівні вмісту інформаційної РНК ΝΙΜ1, у той час як в nim 1-6 спостерігався дуже низький рівень акумуляції мРНК ΝΙΜ1. Зростання вмісту мРНК nim1 після SA, ΙΝΑ або ВТН виявили у nim 1-1, -2, -3, але не у nim1-5 або -6. Проте це зростання було меншим, ніж те, що виявили у природних рослин. Після зараження патогеном було виявлено додаткові ділянки, що гібридизуються із зондом кДНК ΝΙΜ1, як у природних рослинах, так і в мутантах, а рівень мРНК NIM1 був підвищений відносно рівня в необроблених контрольних рослинах, за винятком nim 1-6.

На Фігурі 18 показано оцінку опірності до захворювання через коефіцієнт зараження різних алелей nim1, а також рослин NahG у різні моменти часу після інокуляції Peronospora parasitica. WsWT вказує на природну батьківську лінію Ws, в якій було виявлено алелі nim1. В таблиці показані різні алелі літі, а також характеристики рослин NahG. Про рослини NahG відомо з попередніх публікацій. (Delaney et al. Science 266, pp. 1247-1250 (1994)). Arabidopsis NahG також описано у WO 95/19443.

Ген NahG являє собою ген з Pseudomonas putida, який перетворює саліцилову кислоту на катехол, таким чином не допускаючи акумулювання саліцилової кислоти, необхідного компоненту сигнальної трансдукції для SAR в рослинах. Отже, у рослин NahG Arabidopsis не виявлено нормальної SAR. Крім того, в них було виявлено набагато більшу загальну сприйнятливість до патогенів. Таким чином, NahG-рослини служать для своєрідного універсального контролювання сприйнятливості. Крім того, NahG-рослини все ж реагують на хімічні індуктори ΙΝΑ та ВТН; це видно на двох нижніх панелях, зображених на Фігурі 17.

На Фігурі 18 можна побачити, що алелі nim 1-4 та nim 1-6 ніби є більш виразними; це найлегше перевірити у ранні моменти часу, про що говориться у розділі, присвяченому результатам дослідів, і про що свідчать результати, наведені у панелі EmWa ВТН, найнижчій панелі на цій Фігурі. Крім того, алель nim1-5 відзначається найбільш виразною реакцією як на ΙΝΑ, так і на ВТН, і, таким чином, це є найслабкіша алель nim1.

NahG-рослини відзначаються дуже доброю чутливістю як до ΙΝΑ, так і для ВТН, і, цілком ймовірно, до алелі nim 1-5. Проте у більш пізні моменти часу, а саме на 11 день (див. фігуру) опірність до захворювання, індукована в NahG-рослинах, починає затухати, і суттєва різниця між ΙΝΑ та ВТН полягає саме у тому, що індукована ΙΝΑ опірність затухає значно швидше і більш виразно, ніж опірність, індукована в NahG-рослинах ВТН. З цих експериментів також видно, що ΙΝΑ та ВТН індукували дуже добру опірність у Ws до EmWa, а nim 1-1, nim 1-2 та інші алелі nim 1 практично не реагували на SA чи ΙΝΑ стосовно опірності до захворювань.

На Фігурі 18 наведено кількість рослин (у відсотках), в яких спостерігалася споруляція після зараження штамом (расою) EmWa P. parasitica, а на гістограмі вказано кількість днів після зараження, протягом яких виконували розрахунки опірності до захворювання.

На тих самих зразках також виконували нозерн-блотинговий аналіз експресії гена SAR PR1, що відображено на Фігурі 17. На Фігурі 17 показано, що природна рослина відзначається дуже доброю опірністю до саліцилату, ΙΝΑ, ВТН, а також до зараження патогеном, що проявляється у посиленій експресії гена PR1. Алель nim 1-1, з другого боку, відзначається лише досить поміркованою реакцією на всі хімічні індуктори, включаючи патоген.

Індукція патогену є принаймні у кілька разів нижчою у алелі nim 1-1, ніж у природній рослині. Алелі nim 1-2, nim 1-3 та nim 1-6 відзначаються такою ж реакцією, як у алелі nim 1-1 на різні види обробки. Проте алель nim 1-4 практично не має експресії у відповідь на будь-який з використовуваних індукторів. Загалом спостерігалися лише фонові рівні. Алель nim 1-5 відзначалася дуже високим базовим рівнем відносно контрольних рослин, які лише поливали водою, і такий базовий рівень залишався високим для всіх видів обробки; проте хімічні індуктори створювали вельми обмежену індукцію, або не створювали її зовсім.

NahG-рослини служили вагомим контролюючим фактором, оскільки вони неспроможні індукувати PR-1 у присутності SA; з другого боку, як ΙΝΑ, так і ВТН індукують дуже сильну експресію PR-1 з високим рівнем. Ефект зараження патогеном аналогічний тому, що спостерігається у випадку з SA: експресія PR-1 NahG-рослинах, оброблених EmWa, не спостерігається.

Ці ж самі зразки РНК, продуковані при дослідженні індукції, зондували також NIM1 -геном з використанням як проби клону повнорозмірної кДНК. На Фігурі 16 можна побачити, що ΙΝΑ індукує ген ΝΙΜ1 у природному алелі Ws. Проте алель мутації nim1-1 відзначається нижчим базовим рівнем експресії nim 1-гена та не індукується ΙΝΑ. Це аналогічно тому, що спостерігається в алелі nim 1-3 і алелі nim 1-6. Алель nim -2 у необробленому зразку відзначається рівнями, близькими до нормальних, і характером індукції, аналогічним тому, який спостерігається у природному зразку, для алелі nim 1-4. Алель nim 1-5, скоріше за все, відзначається експресією гена ΝΙΜ1 з вищим базовим рівнем і значно сильнішою експресією у разі обробки хімічними індукторами.

Індукція ΝΙΜ1 хімічними індукторами опірності та іншими індукторами відповідає його ролі захисті від патогенів і є також додатковим доказом того, що автори одержали саме правильний ген в ділянці 9,9 т.п.н.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

(1) ЗАГАЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ: (і) ЗАЯВНИК:

(А) НАЗВА: Novartis AG

(Б) ВУЛИЦЯ: Шварцвальдапее 215

(В) МІСТО: Базель

(Д) КРАЇНА: Швейцарія

(Е) ПОШТОВИЙ КОД (ZIP): 4002

(Ж) ТЕЛЕФОН: +41 61 69 11 11 (3) ТЕЛЕФАКС: + 41 61 696 79 76 (І) ТЕЛЕКС: 962 991

(іі) НАЗВА ВИНАХОДУ: ГЕН, ЩО ВІДПОВІДАЄ ЗА ОПІРНІСТЬ ДО ЗАХВОРЮВАННЯ В РОСЛИНАХ, ТА СПОСОБИ ЙОГО ВИКОРИСТАННЯ (Ні) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 11

(V) ФОРМА ЗЧИТУВАННЯ НА КОМП'ЮТЕРІ:

(A) ТИП НОСІЯ: Гнучкий диск

(Б) КОМП'ЮТЕР: сумісний з IBM PC

(B) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS

(Г) ПРОГРАМНЕ ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ: Patentin Release #1,0, Version #3-.30

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛ. ІД №:1:

(І) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ:

(A) ДОВЖИНА: 9919 пар нуклеотидів

(Б) ТИП: нуклеїнова

(B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинарна

(Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна

(iі) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна)

(ІІІ) ГІПОТЕТИЧНА МОДЕЛЬ: НЕМАЄ (iv) АНТИСМИСЛ: НЕМАЄ

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛ. ІД №:2:

(і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ:

(A) ДОВЖИНА: 5655 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота

(B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинарна (Г) топологія: лінійна

(іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ііі) ГІПОТЕТИЧНА МОДЕЛЬ: НЕМАЄ (iv) АНТИСМИСЛ: НЕМАЄ

ОЗНАКИ:

(А) ІМ'Я/КЛЮЧ: екзон

(Б) РОЗТАШУВАННЯ: 2787. .3347

(Г) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: /продукт= "1-ший екзон NIM1"

(be) ОЗНАКИ:

(А) ІМ'Я/КЛЮЧ: екзон

(Б) РОЗТАШУВАННЯ: 3427..4162

(Г) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: /продукт^ "2-ий екзон NIM1"

(іх) ОЗНАКИ:

(А) ІМ'Я/КЛЮЧ: екзон

(Б) РОЗТАШУВАННЯ: 4271,.4474

(Г) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: /продукт^ "3-й екзон NIM1"

(be) ОЗНАКИ:

(А) ІМ'Я/КЛЮЧ: екзон

(Б) РОЗТАШУВАННЯ: 4586 - .4866 -

(Г) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: /продукт= "4-ий екзон NIM1"

(іх) ОЗНАКИ:

(А) ІМ'Я/КЛЮЧ: ЦДС

(Б) РОЗТАШУВАННЯ: сумісн.(2787. .3347, 3427. .4162, 4271. .4474, 4586 ..4866}

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛ. ІД №:3:

(і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ:

(А) ДОВЖИНА: 594 амінокислот

(Б) ТИП: амінокислота

(Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна

(іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: білок

(хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ПОСЛ. ІД №:3:

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛ. ІД №:4:

(і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ:

(A) ДОВЖИНА: 41 амінокислотаа

(Б) ТИП: амінокислота

(B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: HEMAet relevant

(Γ) ТОПОЛОГІЯ: нерелевантна

(іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛ. ІД №:5:

(і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ:

(A) ДОВЖИНА: 38 амінокислот

(Б) ТИП: амінокислота

(B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: нерелевантна

(Г) ТОПОЛОГІЯ: нерелевантна

(іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛ. ІД №:6:

(і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ:

(A) ДОВЖИНА: 41 амінокислота

(Б) ТИП: амінокислота

(B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: нерелевантна

 (Г) ТОПОЛОГІЯ: нерелевантна

(іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛ. ІД №:7:

(і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ:

(A) ДОВЖИНА: 27 амінокислот

 (Б) ТИП: амінокислота

(B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: нерелевантна

(Г) ТОПОЛОГІЯ: нерелевантна

(іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛ. ІД №:8:

(і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ:

(A) ДОВЖИНА: 41 амінокислота

 (Б) ТИП: амінокислота

(B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: нерелевантна

(Г) ТОПОЛОГІЯ: нерелевантна

(іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛ. ІД №:9:

(і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ:

(A) ДОВЖИНА: 27 амінокислот

 (Б) ТИП: амінокислота

(B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: нерелевантна

 (Г) ТОПОЛОГІЯ: нерелевантна

(іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛ. ІД № 10:

(і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ:

(A) ДОВЖИНА: 41 амінокислота

 (Б) ТИП: амінокислота

(B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: нерелевантн

(Г) ТОПОЛОГІЯ: нерелевантна

(іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛ. ІД № 11:

(і) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ:

(A) ДОВЖИНА: 19 амінокислот

 (Б) ТИП: амінокислота

(B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: нерелевантна

(Г) ТОПОЛОГІЯ: нерелевантна

(іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид