Спосіб визначення цитотоксичності водних розчинів за морфологічними змінами ядер і ядерець клітин тваринних тест-організмів

Спосіб визначення цитотоксичності водних розчинів, що включає введення в досліджуване середовище тест-організму і визначення токсичності водного середовища, який відрізняється тим, що використовують тваринний тест-організм, витримують його в досліджуваному середовищі протягом 30-90 хвилин, потім використовують клітини цього ж організму для цитогенетичного аналізу за кількісними характеристиками порушень в морфології ядер і ядерець, і на основі порівняльних узагальнених даних для дослідних і контрольних варіантів здійснюють оцінку цитотоксичності водного середовища. (19) (21) 20031212052 (22) 22.12.2003 (24) 15.11.2006 (46) 15.11.2006, Бюл. № 11, 2006 р. (72) Архипчук Віктор Володимирович, Гончарук Владислав Володимирович (73) ІНСТИТУТ КОЛОЇДНОЇ ХІМІЇ ТА ХІМІЇ ВОДИ ІМ. А.В. ДУМАНСЬКОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) Архипчук В.В. Использование ядрышковых характеристик в биотестировании // Цитология и генетика. - 1995. - т. 29, N 3 - с. 6-12 Ильинских Н.Н., Новицкий В.В., Варгунова Н.И., Ильинских И.Н. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность. - Томск: Изд-во Томск. Ун-та, 1991. 3 71783 4 характеристик в биотестировании// Цитология и компонентів ядра. Для порушень типу «частково генетика. -1995.-т. 29, Ν 3-с.6-12] (3). зруйноване ядро» характерне неповне руйнуванСутність способу полягає в тому, що для виня, деструктуризація ядра, у цьому випадку навкозначення токсичності використовується ядерцевий ло ядерця зберігаються фрагменти ядерного мабіомаркер, який оцінює ядерцеву активність клітин, теріалу. тобто характеризує функціональні зміни їх геномДля ядерець уперше виявлено 4 типи поруної активності. Ядерця являють собою комплекс шень їхньої морфології, організації: 1) тип «супутфункціонуючих рибосомних генів і їх продуктів, що ники», коли на препараті спостерігають основне обумовлює їх високу сприйнятливість до зовнішніх ядерце з декількома супутниками, уламками цього впливів. Найбільш інформативними показниками, або іншого ядерця; 2) тип "намисто", коли під мікщо застосовуються для оцінки впливу різних факроскопом не виявляється основне ядерце, а тільки торів на геном клітин рослин і тварин, є: розмір уламки, фрагменти ядерцевого матеріалу; 3) тип поодиноких ядерець і відсоток гетероморфних "рихлі", у цьому випадку ядерце не має цілісної парних ядерець (ГПЯ) - для клітин з малою кількісструктури, відбувається внутрішнє порушення його тю ядерець, і число ядерець - для багатоядерцеорганізації; 4) тип "вакуоль" визначається, якщо вих клітин. ядерце має усередині світлу пляму - вакуоль. Винахід направлено на розробку способу діагОбґрунтування того факту, що виявлені типи ностики якості водного середовища за допомогою ядерно-ядерцевих порушень відбивають реальні біотестування, що має порівняно низьку собіварзміни в структурі клітинних компонентів, а не є тість і технічну простоту, з одної сторони, і інфорартефактами експерименту, було проведено в мативність щодо комплексної оцінки зразка, з індекількох серіях експериментів. шої сторони, підвищення чутливості способу. Приклади реалізації способу. Для вирішення поставленої задачі запропоноПриклад 1 ваний спосіб визначення цитотоксичності водного В якості тест організмів використовували пріссередовища, що включає використання для тестуноводних безхребетних тварин - гідр Hydra вання тваринного тест організму, його експозицію attenuata. в досліджуваному водному середовищі протягом В якості об'єкта дослідження був використаний 30-180 хвилин, а також послідуючий цитогенетичрозчин, що містив іони металу -трьохвалентного ний аналіз клітин цього організму за кількістними алюмінію, в якості розчинника застосовували архарактеристиками порушень в морфології ядер і тезіанську воду. В якості контрольного зразка таядерець; на основі порівняльних узагальнених кож застосовували артезіанську воду. даних дослідних і контрольних варіантів отримуДля кожного біотеста використовували ємності ють оцінку цитотоксичності водного середовища. у відповідності із нормами біотестування. Сутність способу полягає в наступному. Для Частину гідр витримували в артезіанський воді оцінки якості водних зразків досліджують вплив протягом 90 хвилин (контроль негативний), другу токсичності на тваринні тест організми, представчастину в аналізуємому середовищі, розчині ником яких була прісноводна безхребетна гідра АІ(ОН)3 із концентрацією іонів АІ3+ 2мг/л (дослідHydra attenuata. Після витримування гідр в аналіний розчин), також протягом 90 хвилин. Потім твазованому середовищі протягом 30-90хв., тварин рин фіксували в спирт-оцтовій суміші. Проби твафіксують в спирт-оцтовій суміші. Проби тварин рин фіксували двічі, через 30 і 90 хв. експозиції. фіксують принаймні двічі, наприклад, через 30 і Для мікроскопічного аналізу готували повітряно180хв. експозиції гідр в досліджуваному середосухі цитологічні препарати, пофарбовані 50% водвищі. Потім готують повітряно-сухі цитологічні ним розчином азотнокислого срібла. Аналіз препрепарати, пофарбовані 50% водним розчином паратів проводили при максимальному збільшенні азотнокислого срібла. світлового мікроскопа (під імерсійним об'єктивом Аналіз препаратів виконується при максима100х). Отримані результати порівнювали в дослідльному збільшенні світлового мікроскопа (під імених і контрольних варіантах. Результати такого рсійним об'єктивом 100х). Результати порівнюють тестування приведені в Таблиці 1. в дослідних і контрольних варіантах. Як контроль Таблиця 1 використовують артезіанську воду, що є також розчинником у дослідних варіантах. При цьому Зміна морфології ядер і ядерець гідри, що витримуються в контролі, також фіксуу клітинах гідр, що витримувались в артезіанській воді і водному розчині іонів АІ3+ (концентрація 2мг/л) ються двічі в тому ж часовому інтервалі, що й у досліді. Контроль Розчин В ході експериментальний дослідів, де провонегативний іонів Аl3+ Тип ядерно-ядерцевих порушень дився аналіз токсичного впливу на тваринний ор0хв. 90хв. 30хв. 90хв. Цілком зруйноване ядро 3,3 0,9 9,6 33,7 ганом та його клітини, крім змін кількісних характеЧастково зруйноване ядро 4,4 1,8 21,8 10,0 ристик ядер і ядерець (число і розмір), були «Супутники» 2,4 3,9 4,1 7,4 вперше виявлені їх специфічні морфологічні по«Намисто» 0,5 1,7 0 2,0 рушення. «Рихлі» 2,9 2,8 11,3 1,9 Зокрема, для ядер виявлене їх повне (тип «ці«Вакуоль» 4,2 2,5 1,2 4,7 Сумарні порушення морфології ядер лком зруйноване ядро») або часткове (тип «част(% від числа досліджених клітин) 7,7 2,7 31,4 43,6 ково зруйноване ядро») руйнування, деструктуриСумарні порушення морфології ядезація. На цитологічних препаратах у випадку змін рець (% від числа досліджених клітин) 10,0 10,9 16,6 16,1 типу «цілком зруйноване ядро» спостерігається тільки «голе» ядерце, без будь-яких структурних Очевидно, що вплив іонів алюмінію на клітини 5 71783 6 тварини насамперед призводить до значного росПриклад 3. ту зруйнованих ядер: спочатку експозиції за рахуДослідження проводилось подібно із технолонок частково зруйнованих, а наприкінці експеригією, описаною в прикладі 2. Тільки в якості об'єкта менту - цілком зруйнованих ядер. Також незначно дослідження був використаний розчин лікарського збільшується частка клітин із морфологічно змінепрепарату - анальгіну (або метамизолу натрію). ними ядерцями: на 5,2-5,7%. Частину гідр культивували в артезіанській воді Приклад 2. протягом 90хв. (контроль негативний), іншу частиВ якості об'єкта досліджень був використаний ну - у водному розчині лікарського препарату, в розчин лікарського препарату -аспірину, із конценконцентрації 1,4мг/мл (дослідний розчин), також трацією, яка викликає летальний ефект (LC50) пропротягом 90хв. тягом 96 годин на організмовому рівні. Визначені в Результати дослідів наведені в таблиці 3. серії експериментів дані щодо LCso концентрації Таблиця 3 для гідр склали 4,2мг/мл для водного розчину аспірину (ацетилсаліцилової кислоти). Частину гідр Зміна морфології ядер і ядерець у клітках гідр, що витримувакультивували в артезіанській воді протягом 90хв. лись з артезіанській воді і у водному розчині анальгіну (метамизола натрію) в концентрації 1,4мг/мл (контроль негативний), іншу частину - у водному розчині лікарського препарату, в концентрації Контроль нега- Розчин метамиТип ядерно-ядерцевих пору4,2мг/мл (дослідний розчин), також протягом 90хв. тивний золу натрію шень Якість водного зразка визначалась аналогіч0хв. 90хв. 30хв. 90хв. Цілком зруйноване ядро 0 0 10,7 17,2 ною технологією, викладеною в прикладі 1. Частково зруйноване ядро 0,2 0 5,8 12,6 Результати цього тестування приведені в Таб«Супутники» 0,8 0,8 0,4 6,7 лиці 2. Таблиця 2 Зміна морфології ядер і ядерець у клітках гідр, що витримувались в артезіанській воді і у водному розчині аспірину (ацетилсаліцилової кислоти) в концентрації 4,2мг/мл Тип ядерно-ядерцевих порушень Контроль негативний 0хв. Цілком зруйноване ядро 0 Частково зруйноване ядро 0 «Супутники» 6,6 «Намисто» 0 «Рихлі» 1,0 «Вакуоль» 2,5 Сумарні порушення морфології ядер (% від числа досліджених клітин) 0 Сумарні порушення морфології ядерець (% від числа досліджених клітин) 10,1 90хв. 0 0 4,2 0,6 1,0 0,8 Розчин ацетил салі-цилової кислоти 30хв. 90хв. 0 0 0,3 0 1,0 6,6 0 6,6 7,2 14,4 2,6 3,9 0 0,3 0 6,6 10,8 31,5 Короткочасний вплив розчину ацетилсаліцилової кислоти в концентрації токсичної для тваринного організму (після 96 годинної експозиції) приводить на клітинному рівні (після 1,5 годинної експозиції) до істотного збільшення частки клітин з різними порушеннями в морфології ядерець: з 6,610,1% до 31,5%. Як у контролі, так і в досліді не знайдено клітин із порушеннями в структурі ядер. Комп’ютерна верстка Т. Чепелева «Намисто» 0,8 «Рихлі» 9,3 «Вакуоль» 4,9 Сумарні порушення морфології ядер (% від числа досліджених клітин) 0,2 Сумарні порушення морфології ядерець (% від числа досліджених клітин) 15,7 1,0 7,9 6,6 0,1 19,7 1,5 0,9 34,5 ІД 0 16,5 29,8 16,3 21,6 43,2 Протягом 30-90 хвилинної експозиції розчин анальгіну істотно збільшив частку клітин як з порушеннями в морфології ядерець (з 15,7-16,3% до 21,6-43,2%), так і з порушеннями в структурі ядер (з 0-0,2% до 16,5-29,8%). Таким чином, токсичний для тваринного тест-організму після 4 добові культивування розчин даної лікарської речовини виявився високо цитотоксичним для клітин цього ж тест-організму вже після 1,5 годинної інкубації. Таким чином, сукупність істотних ознак запропонованого способу визначення цитотоксичності водних зразків, а саме визначення токсичних ефектів на клітинному рівні у тваринного тесторганізму з використанням нового набору ядерноядерцевих морфологічних порушень, є необхідного і достатньою для досягнення забезпечуваного винаходом технічного результату - розробки нового методу для тестування токсичності водних зразків, що має порівняно низьку собівартість і технічну простоту, з одної сторони, і інформативність, комплексну оцінку негативного впливу, з іншої сторони, підвищення чутливості способу. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601