Спосіб визначення хронічної токсичності водних розчинів

1. Спосіб визначення хронічної токсичності водних розчинів, який полягає в тому, що вводять в досліджуване середовище тест-організм і визначають негативний вплив водного середовища на його життєдіяльність, який відрізняється тим, що для дослідження токсичності водного зразка використовують показники виживання і темпів розмноження безхребетних тварин гідр, після того, як визначено відсутність гострої токсичності зразка за стандартним методом, дослід проводять спочатку протягом двох термінів, які відповідають за своєю тривалістю терміну визначення гострої токсичнос C2 2 (19) 1 3 74934 4 Сутність способу полягає у наступному. Тест 19-21 добу, проводять визначення показників лена хронічну токсичність триває 7 діб. Дослід тального та сублетального ефектів у дослідних починається із дорослими самками Daphnia тварин, що проявляються в смертності тварин, magna, як продовження експериментів із визнапослідовній зміні параметрів морфології організму, чення гострої токсичності водного розчину, якщо темпах розмноження гідр і за різницею між темпаостанній не виявив токсичних ефектів після 48 ми розмноження тварин, показниками летальності годинної експозиції. У хронічному експерименті та сублетальності в дослідних і контрольних зразтварин годують через день, температуру води ках визначають наявність хронічної токсичності підтримують на рівні 25°С, заміну води проводять водного зразка. на 2-ий день. Темпи розмноження тест організмів визначаНаприкінці тестування проводять кількісний ються за формулою: аналіз дорослих самок і молоді, що народилась, за CAP =NX - N0/N0*100%, його результатами визначають розходження по де CAP - це темп розмноження гідр, NX кількості самок і відтворенної молоді між конкількість тварин (за числом вінчиків із щупальцятрольним і дослідним розчинами. Дані, узагальнені ми) на 8-му, 12-ту і 19-21-у добу експозиції, No на основі тесту на хронічну токсичність, характекількість тварин (за числом вінчиків із щупальцяризують довгостроковий ефект щодо низьких ми) на початку експерименту, концентрацій токсичних речовин на виживання і Приклади виконання способу за винаходом, відтворення організмів. Результати аналізують що заявляється. статистичне для того, щоб визначити Приклад 1 концентрацію без негативного ефекту (NOEC), У якості тест організму використовували гідру найнижчу ефективну концентрацію зразка (LOEC) і Hydra attenuata. ЕС50 або LC50 (концентрацію, що приводить до Як зразки водного середовища для аналізу зниження кількості дорослих самок і/або молоді на були використані 12 видів питних столових бу50% у порівнянні з контролем). тильованих вод, вироблених як українськими, так і До недоліків способу відноситься його недосзакордонними фірмами. Кожний зразок має свій татня чутливість, оскільки використання Daphnia порядковий номер. Попередньо проведений аналіз magna у якості тест об'єкта дає можливість визнана фізико-хімічні показники досліджуваних вод чати довгостроковий ефект низьких концентрацій стандартною методикою показав, що за своїми токсичних речовин щодо смертності тварин і вихарактеристиками вони можуть бути використані в значення кількості молоді в результаті експериментах із використанням тваринних і росживородіння, що не завжди повністю відображає линних біотестів. Зокрема, загальна мінералізація реальну картину хронічної токсичності і знижує усіх вод була менше 1 г/л. чутливість способу. Стандартне середовище для культивування Винахід направлено на створення способу вигідр використовували як контрольний зразок. значення хронічної токсичності водного середоТварин утримували в кристалізаторах вища за допомогою біотестування, що має низьку діаметром 20 см, заповнених на 1/3-2/3 середовисобівартість, технічну простоту при збережені щем для гідр при кімнатній температурі (20-24°С) і високої інформативності щодо оцінки якості воднофотоперіоді 16/8 годин. Гідру годували щодня го зразка з низьким рівнем забруднення свіже вилупленими артеміями Artemia. органічними і неорганічними речовинами, і Тварин не годували, починаючи за 24 години підвищення чутливості способу за рахунок визнадо початку експерименту, а також під час тестучення хронічної токсичності за більшою кількістю вання на гостру токсичність (96 годин). Кожну показників. досліджувану пробу розподіляли по 6 лункам Розроблений спосіб визначення хронічної (об'ємом 5 мл) у спеціальних планшетках для токсичності водного середовища, заснований на експериментів із гідрами; у кожну лунку поміщали визначенні темпів відтворення представника безпо 5 гідр, тобто загальне число тварин, що хребетних тварин гідр, куди входить і визначення досліджували, дорівнювало 30 на одну пробу. кількості нових гідр, що з'явилися в результаті За відсутності результатів щодо гострої брунькування, а також летальних та сублетальних токсичності, проводили тест на визначення ефектів, що виявляються в послідовній зміні хронічної токсичності. Після 96 годин експозиції параметрів морфології організму. гідр годували свіже вилупленими артеміями, через Спосіб здійснюється наступним чином. Для 2-3 години розчин із залишками їжі (мертвими визначення хронічної токсичності використовують артеміями) змінювали на свіжу порцію безхребетних тварин гідр, після визначення, за досліджуваної проби. По закінченні наступних 96 технологією способу аналогу (1), відсутності годин (тобто на 8-му добу експерименту) гострої токсичності зразка, спочатку на протязі підрахували число тварин за кількістю вінчиків; двох термінів, які дорівнюють за своєю тривалістю після цього процедуру годівлі гідр і зміну терміну визначення гострої токсичності (96 годин), досліджуваного розчину повторювали. Ще через проводиться дослід зразка, при цьому тварин го96 годин (тобто на 12-ту добу експерименту) ще дують після кожного терміну і проводять раз підраховували число тварин за кількістю підрахунок кількості нових гідр, що з'явилися в вінчиків. Далі дослід продовжили без годівлі гідр. результаті брунькування, з метою визначення Додатково проведені нами дослідження показали, темпів розмноження тест організмів, потім на що гідри можуть виживати після останньої годівлі протязі наступних 11-13 діб гідр не годують і по протягом щонайменше 14 діб; тому експеримент закінченню всього терміну досліду, який складає продовжували саме цей термін без годівлі випро 5 74934 6 буваних тварин. Останній підрахунок кількості гідр біологічних характеристиках за темпами розмнопроводили через 13 днів після останньої годівлі, ження тест організмів. Загалом, 10 із 12 зразків тобто на 21 добу проведення експерименту. Таким виявили хронічну токсичність відповідно до запрочином, підрахунок тварин протягом хронічного понованого нами способу досліджень. експерименту провадили тричі: на 8-му, 12-ту і 21Приклад 2 ту добу їхньої експозиції в досліджуваному Для аналізу використані 9 зразків питних розчині. артезіанських вод, відібраних із юрського і сеноРезультати порівнювали з тими, що отримані в манского геологічних горизонтів. контрольному середовищі. Токсичним вважають Підготовка проб і проведення тестування такий зразок, що протягом певного часу впливає аналогічно до прикладу 1. на 50 відсотків тест організмів (показник ЕС5о або Результати цього дослідження представлені в LC5o), із довірчим інтервалом 95%. Токсичність Таблиці 2. зразка розраховують, виходячи із кількості гідр, що Тільки одна проба (свердловина на вул. Попроявили сублетальний або летальний ефекти. чайнинська) виявила гостру токсичність для гідр Для підрахунку LC50 і ЕС50, а також їхніх довірчих після 96 годин експозиції у відповідності зі станінтервалів використовують різні комп'ютерні продартним методом (1). Слідуючи технології спосограми (наприклад, Probit analysis, US ЕРА). бу, що заявляється, тварин годували з інтервалом Показники токсичності за смертністю тварин у 4 і 8 діб (після годівлі досліджуваний розчин (летальність) або змінами морфології їх організму міняли на свіжий); на 8 і 12 добу підраховували (сублетальність) були основним в досліді. У виприріст знову утворених тварин, а на 21 добу падку відсутності летальності і/або сублетальності після 13 денного голодування - відсоток сублеу досліджуваного зразка, оцінювали ступінь тальних і летальних ефектів. активності розмноження тварин за відсотком приЩе одна проба (із свердловини на вул. Тиморосту гідр, використовуючи наступну формулу: шенко) виявляла хронічну токсичність після 3 тижCAP=NX-N0/N0*100%, невого досліду. Отже, артезіанські води були наде CAP - це ступінь активності (темп) розмнобагато безпечніше за токсикологічними ження гідр, NX - кількість тварин (за числом показниками для гідр у порівнянні з такими ж вінчиків із щупальцями) на 8-му, 12-ту і 19-21-шу критеріями для бутильованих вод. Відповідно до добу експозиції. N0 - кількість тварин (за числом запропонованого нами способу досліджень вінчиків із щупальцями) на початку експерименту. артезіанські води розрізнялися за темпами розмРезультати цього дослідження представлені в ноження гідр у період їхнього інтенсивного розвитТаблиці 1. ку (після годівлі), а також після періоду голодуванЗ даних, наведених у таблиці 1, видно, що ня. після 96 годин експозиції всі 12 марок питних буТаким чином, спосіб, що заявляється, тильованих вод не виявили як летальних, так і характеризується сукупністю істотних ознак визнасублетальних ефектів для гідр, тобто показали чення хронічної токсичності водних зразків, а саме відсутність гострої токсичності у відповідності зі реєстрацією негативних ефектів на тест організмі стандартним методом (1). Слідуючи за гідри, які визначаються темпами їхнього розмнотехнологією способу, що заявляється, тварин гоження і показниками летального та сублетального дували з інтервалом у 4 і 8 діб, після годівлі ефектів у дослідних тварин, що проявляються в досліджуваний розчин замінявся на свіжий, на 8 і послідовній зміні параметрів морфології організму, 12 добу в них підраховували приріст знову утвореє необхідним і достатнім для досягнення забезпених тварин, а на 21 добу - після 13 денного голочуваного винаходом технічного результату - стводування - відсоток сублетальних і летальних рення способу визначення хронічної токсичності за ефектів. допомогою біотестування, що має низьку Наведені в таблиці 1 данні показують, що собівартість, технічну простоту при збережені досліджені бутильовані води розрізнялися за темвисокої інформативності щодо оцінки якості воднопами розмноження гідр у період їхнього го зразка з низьким рівнем забруднення інтенсивного розвитку (після годівлі), а також виорганічними і неорганічними речовинами, і являли різні сублетальні і летальні ефекти після підвищення чутливості способу за рахунок визнаперіоду голодування. Іншими словами, за чення хронічної токсичності за більшою кількістю відсутності гострої токсичності, всі 12 досліджених показників. бутильованих вод диференціювалися щодо їх 7 74934 8 Таблиця 1 Оцінка токсичності бутильованих вод різних фірм-виробників із використанням гідр в якості біотесту Nп/п бутильованої води 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Контроль (середовище культивування гідр) Стартова кількість гідр 35 33 38 30 37 32 31 33 33 34 42 42 Гостра токсичність Сублетальні/летальні ефекти, % (96 годин)* ВТЕ ВТЕ ВТЕ ВТЕ ВТЕ ВТЕ ВТЕ ВТЕ ВТЕ ВТЕ ВТЕ ВТЕ 30 Хронічна токсичність Приріст, % Приріст, % Сублетальні/летальні (8 діб)* (12 діб) ефекти, % (21 діб) 62,9 100,0 70/0 81,8 160,6 44/41 57,9 73,7 91/9 26,7 73,3 12/88 27,0 94,6 23/57 6,3 6,3 21/79 35,5 64,5 47/33 39,4 96,7 0/ 100 51,5 112,1 36/64 32,4 105,9 24/76 35,7 61,9 18/0 40,5 69,0 22/0 ВТЕ 93,0 153,0 0/10 №№ 1-7 - води виробництва українських фірм; №№ 8-10 - води виробництва закордонних фірм; №№ 1112 - води, призначені для дитячого харчування; ВТЕ- відсутність токсичного ефекту; * - годівля гідр Таблиця 2 Оцінка токсичності артезіанських вод (бювети м. Києва) із використанням гідр в якості біотесту N Місцезнаходження п/п кювета 1 2 3 4 5 6 вул.Закревського, 85 вул. Почайнінська вул. Туполева/Стеценко вул. Артема/Кудрявська вул. Сабурова, 3 пр. Тимошенко, 11 Гостра токсичність Хронічна токсичність Стартова Сублетальні/летальні кількість Сублетальні/летальні Приріст, % Приріст, % ефекти, % = гідр ефекти, % (96 годин)* (8 діб)* (12 діб) приріст,%** (19 діб) Сеноманський 30 ВТЕ 56,7 86,7 33,9/50,0 Геологічний горизонт Сеноманський Сеноманський 30 30 53,3/46,7 ВТЕ 40,0 120,0 0/0=120,0 Юрський 30 ВТЕ 60,0 166,7 0/0-173,3 Юрський Юрський 30 30 70,0 26,7 146,7 46,7 0/0=146,7 0/100,0 30 ВТЕ 100/0 (48 годин) і ВТЕ (96 годин) ВТЕ 90,0 126,7 0/0=126,7 30 ВТЕ 53,3 93,3 0/0=93,3 30 ВТЕ 66,7 146,7 0/0=153,3 30 ВТЕ 63,3 153,3 0/0=183,3 Сеноманський / Юрський 8 вул. Бальзака, 80 Юрський/ Сеноманський 9 вул. Приречная, 19 Юрський/ Сеноманський 10 Контроль (середовище культивуваннягідр) 7 парк ім. Шевченка ВТЕ - відсутність токсичного ефекту; * - годівля гідр; ** - підрахунок робили за відсутності хронічної токсичності. Комп’ютерна верстка М. Клюкін Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601