Набір для визначення еластазоінгібіторної активності a-1-інгібітора протеїназ в біологічних рідинах

Винахід відноситься до біохімії і може бути використано у біології та медицині для наукових досліджень і клінічній практиці. Відомий Набір реактивів для визначення первинних ароматичних амінів у розчинах і біологічних рідинах (див. Пат. РФ N2097762, G01N33/48, А61В19/02), який містить у відповідних упаковках наважку трихлороцтової кислоти, яка при розчиненні у 50мл дистильованої води дає розчин, що приводить до осаду білків, смужки паперу із натрієм азотнокислим, які пристосовані до утворення розчину для діазотування безпосередньо перед аналізом (ex tempore), наважку амонію сульфамінокислого, котра при розчиненні у 25мл дистильованої води дає розчин для зв'язування залишку натрію азотнокислого, розчин N-(1)нафтилетилендіамінодигідрохлориду для утворення забарвленої азосполуки, смужки паперу, що містять 0.018мкмоль стандартного аміну, який аналізують. Використання набору дозволяє спростити проведення аналізу і підвищити його точність, але він призначений тільки для визначення ароматичних амінів. Відомий спосіб визначення активності протеїназ або їх інгібіторів в біологічних рідинах (див. Пат. РФ N1655991, С12Q1/37), прототип, який містить полістироловий планшет, що імобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язано із субстратом протеолітичної реакції, препарат протеїнази, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, цитратний буфер, ортофенілендіамін і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту. Чутливість способу становить -10-9-10-10г. Недоліком відомого способу є складність здійснення етапу підготовки: приготування комплексу маркерного ферменту та субстратного білка і його імобілізація на поверхні полістиролових плашок, що потребує використання спеціальних реагентів, обладнання, високої кваліфікації оператора. Крім того, відомий спосіб не передбачає визначення еластазоінгібіторної активності a-1-інгібітору протеїназ (a-1-lП), визначення якої може бути використано в якості критерію прогнозу розвитку, перебігу захворювань різного походження та контролю ефективності лікування. В основу винаходу поставлена задача розробки набору, за допомогою якого можна було б специфічно та простим способом визначати активність хімази в біологічних рідинах. Поставлена задача вирішується у наборі для визначення еластазоінгібіторної активності a-1-ІП в біологічних рідинах, який містить полістироловий планшет, що імобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язаний із субстратом протеолітичної реакції, препарат протеїнази, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, цитратний буфер, ортофенілендіамін і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту. Згідно з винаходом відрізняючими ознаками є те, що: - препаратом протеїнази є еластаза, - усі компоненти надані у окремих упаковках при наступному складі компонентів: препарат протеїнази (еластаза - 2-6мкл), фосфатний буфер - 12.5мл, детергент - 0.75мл, цитратний буфер - 6мл, ортофенілендіамін - 2мг або 1 таблетка, гідроперит - 1 таблетка. Вміст та певна кількість компонентів у наборі забезпечує оптимальні умови для здійснення способу визначення еластазоінгібіторної активності a-1-ІП у біологічних рідинах (40 зразків у дублікаті). Виконання любого методу складається з 2-х основних етапів: приготування реагентів, які необхідні для проведення аналізу і серії послідовних операцій здійснення методики. Від якості виконання 1-го етапу роботи в значній мірі залежить кінцевий результат аналізу. Необхідна точність вимірювань, спеціальне обладнання, висока кваліфікація оператора. З метою підвищення точності і порівнянності результатів для багатьох методів, які передбачають масові дослідження, виготовляють відповідні реагенти в спеціалізованих лабораторіях і реалізують у вигляді наборів. Придбаній повного комплекту реагентів у наборі звільняє від пошуку необхідних компонентів по каталогах різних фірм-виробників та постачальників. Крім того, придбання окремих компонентів у необхідній лімітованій кількості для проведення серії аналізів потребує надлишкових фінансових витрат. Дослідження по запропонованому набору були проведені в Інституті терапії АМН України. В результаті проведення експериментальних досліджень підібрані оптимальні умови проведення аналізу. Показано можливість зберігання імобілізованих плашок до 2-х років. Підібрані умови здійснення повного зв'язування a-1ІП еластазою. Розрахунки комплектування наборів перевірено лабораторними іспитами. Використання запропонованого рішення забезпечує спрощення способу, зменшення витрат на придбання реагентів, розширення області застосування, високу відтвореність способу (не менш 95%). Набір складається із наступних компонентів: - Плашка, яка імобілізована маркерним ферментом, що комплексно пов'язано із субстратом білкової природи. - Флакон N 1 - детергент, твін-20 (0.75мл). - Флакон N 2 - фосфатний буфер (10-15мл). - Флакон N 3 - цитратний буфер (6мл). - Флакон N 4 - ортофенілендіамін (2мг або 1 таблетка). - Флакон N 5 - препарат протеїнази (2-6мкл еластази). - Гідроперит (1 таблетка). Аналіз здійснюють за інструкцією, яка надається до набору. Приготування реагентів із набору: 1. Готують миючу рідину: 0.5мл детергенту із флакону N 1 додають до 1л дистильованої води. 2. Готують фосфатний буфер: рідину із флакону N 2 доводять до 250мл дистильованою водою і додають 0.25мкл детергенту із флакона N 1. 3. Відмивають плашку 2-3 рази дистильованою водою, яка містить детергент. 4. Готують вихідний розчин протеїнази та контрольний матеріал (на льоду): Препарат протеїнази (еластаза) готують за наступною схемою: Таблиця. №№ Концентрація, Протеїназа, Розведення Буфер, мл стандартів мкг/мл мл 1 0 1,0 2 0,005 1:9 N 4 1,8 0,2 N 4 3 0,01 1:9 N 5 1,8 0,2 N 5 4 0,05 1:3 N 6 1,2 0,4 N 6 5 0,1 1:9 N 7 1,8 0,2 N 7 6 0,2 1:19 N 8 1,9 0,1 N 8 7 1,0 1:7 вихідного розчину 1,4 0,2 вихідного розчину 8 4,0 1:1 вихідного розчину 0,75 0,75 вихідного розчину Примітка: Вихідний розчин еластази готують додачею 10.8мл фосфатного буферу, який приготовлено раніше із флакону N 2. 5. Готують суміш для виявлення залишкової активності маркерного ферменту: цитратаий буфер із флакону N 3 розводять у 2 рази дистильованою водою, додають ортофенілендіамін із флакону N 4 або таблетку, потім - гідроперит (готується суміш перед використанням). Проведення аналізу: 1. Окремо на титрувальній дошці готують дослідні зразки (n=40): зразки плазми/сироватки крові людини розводять у 250 разів фосфатним буфером, наприклад, шляхом послідовного розведення у 25 та 10 разів (до 960мкл буферу додають 40мкл сироватки, потім до 180мкл буферу - 20мкл 1-го розведення сироватки). Зразки слини людини, сироватки крові та цитозолю тканин щурів розведення не потребують. 2. Вносять у лунки титрувальної дошки контрольний матеріал. 3. Проводять реакцію утворення комплексу протеїназа-інгібітор протеїназ додачею до дослідних зразків 1:1 вихідного розчину протеїнази (еластази). 4. Проводять протеолітичну реакцію розщеплення імобілізованого маркерного ферменту, який комплексно пов'язано із білковим субстратом: вносять у лунки полістиролових плашок (по 100мкл) контрольний матеріал та дослідні зразки, що приготовлені за пп.3, 4 або 5, та інкубують 15 хвилин при 37°С. 5. Усувають реакційну суміш шляхом відмивання плашки як вказано раніше. 6. Готують 50% сірчану кислоту (у набір не входить). 7. Визначають залишкову активність імобілізованого маркерного ферменту додачею суміші, що приготовлена з нитратного буферу, ортофенілендіаміну та гідропериту. Інкубують протягом 3-5 хвилин. 8. Зупиняють реакцію додачею по 50мкл у лунку 50% сірчаної кислоти. 9. Визначають оптичну щільність розчинів при 490нм за допомогою мікроспектрофотометра. 10. Будують калібровану криву за результатами вимірювань контрольних зразків та розраховують еластазоінгібіторну активність a-1-ІП за формулою (показано у прикладі). Можливість здійснення аналізу з використанням запропонованого набору підтверджується прикладом. Приклад. Визначення еластазоінгібіторної активності a-1-ІП у сироватці крові та цитозолі тканин щурів. Приготування реагентів із набору: 1. Готують миючу рідину: 0.5мл детергенту із флакону N 1 додають до 1л дистильованої води. 2. Готують фосфатний буфер: рідину із флакону N 2 доводять до 250мл дистильованою водою і додають 0.25мкл детергенту із флакона N 1. 3. Відмивають плашку 2-3 рази дистильованою водою, яка містить детергент. 4. Готують вихідний розчин протеїнази та контрольний матеріал (на льоду): Вихідний розчин еластази готують додачею 10.8мл фосфатного буферу, що приготовлено раніше із флакону N 2. Контрольний матеріал готують за схемою, яка надана у таблиці. 5. Готують суміш для виявлення залишкової активності маркерного ферменту: цитратний буфер із флакону N 3 розводять у 2 рази дистильованою водою, додають ортофенілендіамін із флакону N 4 або таблетку, потім - гідроперит (готується суміш перед використанням). Проведення аналізу: 1. Окремо на титрувальній дошці готують дослідні зразки. 2. Вносять у лунки титрувальної дошки контрольний матеріал. 3. Проводять реакцію утворення комплексу еластаза-інгібітор протеїназ додаванням до дослідних зразків 1:1 вихідного розчину, інкубують 15 хвилин при 20°С. 4. Проводять протеолітичну реакцію розщеплення імобілізованого маркерного ферменту, який комплексно пов'язаний із білковим субстратом: вносять у лунки полістиролових плашок (по 100мкл) контрольний матеріал та дослідні зразки, що приготовлені згідно п.3 та інкубують 15 хвилин при 37°С. 7. Усувають реакційну суміш шляхом відмивання плашки як вказано раніше. 8. Готують 50% сірчану кислоту (у набір не входить). 9. Визначають залишкову активність імобілізованого маркерного ферменту додачею суміші, що приготовлена з цитратного буферу, ортофенілендіаміну та гідропериту. Інкубують протягом 3-5 хвилин. 10. Зупиняють реакцію додачею по 50мкл у лунку 50% сірчаної кислоти. 11. Визначають оптичну щільність розчинів при 490нм за допомогою мікроспектрофотометра. 12. Будують калібровану криву за результатами вимірювань контрольних зразків та розраховують еластазоінгібіторну активність a-1-ІП за формулою: А=(0.5-Азал.) 2 (Од./мл), де: 0.5 - активність еластази, яку добавляли до зразків для зв"язування з Інгібіторами протеїназ, Азал. - залишкова активність еластази, що визначена за каліброваною кривою, Од./мл, 2 - розведення зразків під час проведення реакції зв'язування еластази з інгібіторами протеїназ дослідних зразків (1:1). Висновок: Вказаний приклад підтверджує можливість спрощення постановки аналізу еластазоінгібіторної активності a-1-ІП у біологічних рідинах. Технічний результат: Використання винаходу у порівнянні з прототипом забезпечує спрощення проведення біохімічного аналізу, зменшення витрат на придбання реагентів у 250 разів, розширення області застосування. Відтвореність способу не менш 95%.