Спосіб попередження відторгнення ало- та ксенотрансплантантів шкіри

Винахід відноситься до галузі біології і медицини і може бути використаним для ало- і ксенотрансплантації шкіри при пластичних операціях, у хвори х з опіками та скальпованими ранами. Молекулярною основою реакції відторгнення трансплантату є взаємодія між рецепторами Т-лімфоцитів і молекулами МНС (HLA), переважно HLA-DR [Ройт Α., Бросто фф Дж., Мейл Д. Иммунология. / Пер. с англ. В.И.Кандрора, А.Н.Маца, Л.А.Певницкого, М.А.Серовой. - М.: Мир, 2000. - 592с.]. Тому в практичній трансплантологи застосовуються такі способи попередження відторгнення трансплантату як неспецифічна і специфічна імуносупресія, індукція ареактивності до трансплантату шля хом спрямованого впливу на цитокінову регуляцію імунної відповіді, моделювання співвідношення між Th-лімфоцитами 1 і 2 типів, використання антитіл проти СD3+-клітин та ін [WO 9930730 А 1. Tremblay, Jacques, P. Способы и композиции для трансплантации клеток хозяину. -Изобретения стран мира. - 2000. - Вып.8, №12. - С.70; US 5914314 А. Falk, Rudolf Edgar, Asculai, Samuel S. Форма гиалуроновой кислоты и лекарственное средство, применяемые для уменьшения реакции отторжения трансплантированных органов у млекопитающих. Изобретения стран мира. - 2000. - Вып.8, №12. - С.50; US 5916559 А. Strom, Terry В. Применение агентов, специфичных в отношении рецептора интерлейкина-2, для лечения отторжения трансплантата. - Изобретения стран мира. 2000. - Вып.8, №12. - С.54; 6 А61К39/385. Карпов И.А., Копыльцов В.Н., Скалецкий Н.Н. Способ трансплантации органов и тканей. - 1998. - RU БИ №32. - С.340; WO 6А61К31/70. Simon, Paul Μ.; Mequire, Edward, J. Способы и олигосахариды для ослабления отторжения трансплантата. - Изобретения стран мира. 2000. - Вып.8, №1. - С.71]. Мета винаходу. Розробити спосіб ало- і ксенотрансплантації шкіри без застосування імунодепресантів та інших фармакологічних препаратів. Поставлена мета досягається тим, що перед ало- або ксенотрансплантацією шкіри внутрішньовенно вводяться мегадози ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин (ЕППК) при одночасному внутрішньочеревному введенні антигену шкіри, що трансплантується. Результати експериментальних досліджень. Для отримання вагітних самок відібрано 6 самців білих щурів і 30 статевозрілих самок [сертифікат розпліднику Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України]. Тварин розмішували в окремих клітках (1 самець + 5 самок). Три вагітних самки на певному етапі розвитку ембріону вводили в наркоз (натрію етамінал 40мг на кг маси тіла). Після асептичної обробки операційного поля (96° етиловий спирт, йод) проводили серединну лапаротомію по linea alba. Обидва роги вагітної матки виводили в операційну рану і розрізали стерільними ножицями поперек (біля ембріонів). Останні вилущували в стерильну чашку Петрі з охолодженим до 4°С середовищем Хенкса з гентаміціном (кінцева концентрація - 0,001%). Після потрійної промивки з ембріонів виділяли БППК за розробленою нами методикою. Суспензію ЕППК фільтрували через капроновий фільтр (175мкм). До фільтрату додавали рівний об'єм 5% розчину димексиду (попередньо профільтрованого через клітинний фільтр з розміром пор 0,20мкм). Перед трансплантацією шкіри дослідним щурам внутрішньовенно вводили суспензію ЕППК (контроль життєздатності здійснювали шляхом світлової мікроскопії при забарвленні клітин трипановим синім) у визначеній нами дозі. Контрольним тваринам вводили відповідний об'єм суміші 5% розчину димексиду у середовищі Хенкса. Всім тваринам в черевну порожнину вводили по 1,0мл антигену трансплантованої шкіри: наважку шкіри (10мг) обробляли ацетоном для видалення ліпідів, висушували, гомогенізували і додавали 1,0мл розчину Хенкса). Протокол операції парної алотрансплантації шкіри. По дві тварини одночасно вводили в наркоз (натрію етамінал - 40мг на кг маси тіла). Ножицями ретельно видаляли шерсть на шкірі спіни. Шкіру обробляли 96° спиртом та спиртовим розчином йоду. По шаблону (діаметр - 5см) концентрованим йодом відмічали межі шкірних ділянок. Ділянки шкіри відсепаровували і проводили алотрансплантацію шкіри з ушиванням шкірних країв вузловими однорядними швами. Щурів переносили в асептично оброблену післяопераційну кімнату. Протокол операції ксенотрансплантації шкіри. Донором шкіри були статевозрілі морські свинки. Під нембуталовим наркозом ножицями ретельно видаляли шерсть на шкірі спіни. Шкіру обробляли 96° спиртом та спиртовим розчином йоду. По шаблону (діаметр - 5см) концентрованим йодом відмічали межі шкірних ділянок. Ділянки шкіри відсепаровували і проводили ксенотрансплантацію шкіри морських свинок щурам з ушиванням шкірних країв вузловими однорядними швами. Щурів переносили в асептично оброблену післяопераційну кімнату. Результати оцінювали через 12, 15 і 90 днів після операції. На фото 1 (контроль), 2 (дослід) - тварини через 12 днів після алотрансплантації шкіри. У контрольного щура алотрансплантат перетворився в струп і відторгнувся через 15 днів (фото 3), а в дослідній тварини шкіра залишалася живою впродовж 3міс. спостереження (фото 4). Введення щурам мегадоз ЕППК, отриманих з ембріонів самок щурів, сприяло приживленню ксеногенної шкіри. Про успішну ксенотрансплантацію шкіри морської свинки щурам свідчило її приживлення, що спостерігалось до кінця експерименту - протягом 90 днів (фото 5-6). Висновок Результати дослідження підтверджують ефективність застосування мегадоз ЕППК для досягнення імунологічної толерантності при експериментальній ало- і ксенотрансплантації шкіри. Відповідність критерію "новизна" даного способу забезпечує те, що імунологічна толерантність при ало- і ксенотрансплантації шкіри досягається без використання імунодепресантів та інших фармакологічних впливів на імунну систему, за допомогою ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин. Відповідність критерію "суттєві відмінності" даного способу забезпечує те, що на відміну від відомих раніше способів попередження реакції відторгнення трансплантату, імунологічна толерантність досягається шляхом внутрішньовенного введення ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин на тлі внутрішньочеревного введення в організм антигенів алотрансплантованої шкіри. Відповідність даного винаходу критерію "позитивний ефект" забезпечується результатами експериментальних досліджень, які впродовж 3 міс. спостереження засвідчують відсутність реакції відторгнення ало- і ксенотрансплантатів шкіри при одночасному введенні в організм алоантигенів шкіри і ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин.