Спосіб кріоконсервування цільної кордової крові

Спосіб кріоконсервування цільної кордової крові, що включає поступове дозоване додавання при температурі 0-4 °С 30%-го розчину кріопротектора поліетиленоксиду молекулярної маси 1500, виготовленого на фізіологічному розчині, до кінцевої концентрації 15% і заморожування до температури -196 °С шляхом занурення у рідкий азот, який відрізняє ться тим, що перед зануренням у рідкий азот кров охолоджують до температури -40...-45 °С зі швидкістю 60-70 °С/хв. (19) (21) a200602122 (22) 27.02.2006 (24) 10.08.2007 (46) 10.08.2007, Бюл. № 12, 2007 р. (72) Бабійчук Любов Олександрівна, Грищенко Валентин Іванович, Гуріна Тетяна Михайлівна, Рязанцев Володимир Васильович, Зубова Оксана Леонідівна, Зубов Павло Михайлович (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ Н АУК УКРАЇНИ (56) UA A 60238, 15.09.2003. UA C1 2006, 20.12.94. UA A 31847, 15.12.2000. UA A 30888, 15.12.2000. RU C1 2051580, 10.01.96. 3 80062 1,2%, охолоджують до -27...-28°С зі швидкістю 14°С/хв, витримують при цій температурі впродовж 15-20 хвилин і далі занурюють в рідкий азот. Розморожування здійснюють на водяній бані при температурі 41°С. Кількість збережених ядерних клітин, що визначено за методом суправітального забарвлення трипановим синім, після розморожування становить 97,1%, кількість життєздатних кровотворних клітин - попередників (КУОк) в суспензіях нативних (контроль) і кріоконсервованих клітин, що визначено за методом культивування в агарі, складає 79,4%. Суттєвим недоліком даного способу є те, що його можна використовувати лише для кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові та її плазми, тому що повільні швидкості охолодження не придатні для заморожування еритроцитів. Найбільш близьким до заявленого є спосіб консервування еритроцитів [3], згідно з яким до еритроцитів донорської крові при 0-4°С дозовано по краплям з інтервалом 4-6 хвилин додають однаковими порціями 30%-ний розчин непроникаючого кріопротектора ПЕО-1500, який приготовлено на фізіологічному розчині хлористого натрію, до кінцевої концентрації 15%. Потім отриману еритрозавись переносять у контейнер і заморожують до -196°С шляхом занурення у рідкий азот. Відігрів здійснюють на водяній бані при температурі 4244°С. Після розморожування гемоліз еритроцитів становить 1,5%. Схоронність клітин після розморожування складає 98,5%. Осмотична крихкість складає 9,4%. Недоліком цього способу є те, що він може бути застосований лише для кріоконсервування еритроцитів. Використання у даному способі високих швидкостей охолодження не дає змоги застосовувати його для кріоконсервування цільної кордової крові, тому що не забезпечує високий рівень схоронності ядровмісних клітин, які заморожують переважно з повільними швидкостями. В основу винаходу поставлено задачу створити такий спосіб кріоконсервування цільної кордової крові, який би за рахунок зміни режиму охолодження забезпечив схоронність усіх компонентів кордової крові - як еритроцитів, так і ядровмісних клітин та плазми, на достатньо високому рівні, який потрібен для клінічних трансфузій. Ця задача вирішується тим, що у способі кріоконсервування, який включає поступове дозоване додавання при температурі 0-4°С 30%-го розчину кріопротектора ПЕО-1500, виготовленого на фізіологічному розчині, до кінцевої концентрації 15% і заморожування до температури -196°С шляхом занурення у рідкий азот, згідно з винаходом, перед зануренням у рідкий азот кров охолоджують до температури -40...-45°С зі швидкістю 60-70°С/хв. Спосіб кріоконсервування цільної кордової крові, що пропонується, дає можливість забезпечити схоронність усіх компонентів цільної кордової крові на достатньо високому рівні, який потрібен для практичного клінічного застосування. 4 Спосіб пояснюється наступними прикладами. Приклад 1. Для кріоконсервування брали 50мл кордової крові людини, яка була заготовлена на консерванті "Глюгицир" із вени, що пульсує, після нормальних пологів. До цільної кордової крові у співвідношенні 1:1 дозовано по 1/10 від загального об'єму додавали 30%-ний розчин кріопротектора ПЕО-1500, який було виготовлено на фізіологічному розчині NaCl та 0,01мМ фосфатном буфері. Дозоване додавання проводили при температурі 0-4°С з інтервалом 4-6 хвилин до кінцевої концентрації кріопротектора 15%. Завись, що отримали, розливали у кріопробірки і заморожували: від 0...4°С до температури -40...-45°С зі швидкістю 6070°С/хв з подальшим занурюванням у рідкий азот. Відігрівали на водяній бані при температурі 4244°С. Схоронність еритроцитів після розморожування оцінювали по рівню їх гемолізу. Після розморожування гемоліз еритроцитів був 3,85%, осмотична крихкість - 16%. Схоронність ядровмісних клітин визначали за допомогою метода проточної цитофлюориметрії на проточному цитометрі FACS Calibur з використанням реагентів Becton Dickinson згідно з міжнародним ISHAGE протоколом. Вона складала 82%. Якість плазми визначали за кількістю біологічно активних речовин різного генезу, що зберігалися після кріоконсервування, а саме, за допомогою метода ІФА у плазмі кордової крові вимірювали концентрації трийодтироніна (1,1нМоль/л), тироксина (61нМоль/л), тиреотропного гормона (4,6МЕ/л), тестостерона (4,8нМоль/л) та альфа-фетопротеїна (2950мг/л). Приклад 2. Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що о холодження до температури -40...-45°С проводили з різними швидкостями. Результати по схоронності еритроцитів та ядровмісних клітин наведено у таблиці 1, з якої видно, що оптимальною швидкістю охолодження є 60-70°С/хв. Кількість біологічно активних речовин різного генезу у плазмі кордової крові лишалося незмінним в незалежності від швидкості охолодження (таблиця 3). Приклад 3. Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що перед занурюванням у рідкий азот охолодження проводили до різної кінцевої температури. Результати по схоронності еритроцитів та ядровмісних клітин наведено у таблиці 2, з якої видно, що е фективними є температури -40°С та нижче, однак знижувати кінцеву температур у о холодження більш, ніж до 45°С не є доцільним, тому що на схоронність клітин це не впливає, але вимагає додаткового часу та збільшує ви трати рідкого азоту. Тому оптимальною кінцевою температурою охолодження перед занурюванням у рідкий азот є -40...-45°С. Кількість біологічно активних речовин різного генезу у плазмі кордової крові лишалося незмінним в незалежності від кінцевої температури охолодження перед занурюванням у рідкий азот (таблиця 3). 5 80062 6 Таблиця 1 Схоронність компонентів цільної кордової крові в залежності від швидкості охолодження Швидкість охолодження, °С/хв Гемоліз еритроцитів, % Схоронність ядровмісних клітин, % 50 6,0±0,95 81,0±2,4 60 3,85±0,71 82,0±1,5 70 4,0±0,56 80,5±2,3 80 2,74±0,28 58,1±4,2 Таблиця 2 Схоронність компонентів цільної кордової крові в залежності від кінцевої температури охолодження перед занурюванням у рідкий азот Кінцева температура охолодження, °С Гемоліз еритроцитів, % Схоронність ядровмісних клітин, % -20 2,5±0,17 65,4±5,1 -40 3,85±0,71 82,0±1,5 -45 4,0±0,56 80,5±2,3 -60 3,8±0,42 81,7±3,2 -70 3,6±0,68 82,1±1,4 Таблиця 3 Кількість біологічно активних речовин у плазмі кордової крові в залежності від швидкості охолодження та кінцевої температури охолодження перед занурюванням у рідкий азот Біологічно активні речовини Трийодтиронін, нМоль/л Тироксин, нМоль/л Тиреотропний гормон, МЕ/л Тестостерон, нМоль/л Альфа-фето-протеїн, мг/л Нативна кордова плазма 1,1 65 4,7 5,0 3300 Швидкість охолодження, °С/хв. Кінцева температура охолодження, °С 50 60 70 80 -20 -40 -45 -60 1,2 1,1 1,2 1,0 1,0 1,2 1,1 1,1 60 61 62 60 60 61 62 61 4,6 4,7 4,5 4,5 4,4 4,6 4,4 4,5 4,7 4,9 4,8 4,6 4,6 4,8 4,9 4,8 2900 2950 3000 2850 2880 2900 2950 2850 Джерела інформації 1. Липина О.В., Бредихина Л.П., Шраго М.И. Способ криоконсервирования эритроцитов. Патент Украины №2006, А01N1/02, 20.12.1994. 2. Цуцаєва А.О., Грищенко В.І., Кудокоцева О.В., Щеглов А.В., Тупчиєнко Г.С., Прокопюк О.С. Спосіб кріоконсервування кровотворних клітин кор Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко дової крові. Патент України №31847 А, А01N1/02, 15.12.2000. 3. Бабійчук Л.О., Грищенко В.І., Суміда С, Бондаренко В.А., Землянських Н.Г., Бондаренко Т.П. Спосіб консервування еритроцитів. Патент України №30888А , Α01N1/02, 15.12.2000. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601