Спосіб превентивної профілактики експериментального гепатиту

Спосіб превентивної профілактики експериментального гепатиту у білих щурів, що включає введення інгібітора індуцибельної синтази оксиду азоту (iNOS), який відрізняється тим, що як інгібітор iNOS застосовують N-(3-(амінометил)бензил) ацетамідину (1400W), який вводять одноразово внутрішньоочеревинно в дозі 1,5мг/кг за 30хв. до дії гепатотоксином - аліловим спиртом, введеним у дозі 30мкл/кг маси в ізотонічному розчині натрію хлориду. Винахід стосується медицини, зокрема експериментальної патології, і може бути використаний при вивченні ролі оксиду азоту як поліпотентного месенджера регуляторного спрямування в патогенезі токсичного ураження печінки. Відомий спосіб превентивної профілактики експериментального гепатиту у білих щурів, який включає введення інгібітора індуцибельної синтази оксиду азоту [1]. За відомим способом, як інгібітор індуцибельної синтази оксиду азоту (iNOS) використовують аміногуанідин. Недоліком відомого способу є недостатня ефективність, що випливає з недостатнього рівня селективності застосованого інгібітора iNOS, який завдяки неселективній дії його як на печінкову, тобто зосереджену в купферовських клітинах, iNOS, так і конституційну NO-синтазу (eNOS) , що знаходиться переважно в клітинах ендотелію капілярів, призводить до надмірного вивільнення оксиду азоту (N0) і потенціювання, внаслідок патогенетичних механізмів токсичного гепатиту. В основу винаходу поставлено завдання вдосконалити відомий спосіб, в якому шляхом застосування інгібітора iNOS з високим рівнем селективності щодо субстрату L-аргініну досягають підвищення рівня ефективності превентивної профілактики експериментального токсичного гепатиту. При вирішенні технічного завдання було взято до уваги те, що інгібітором з високим рівнем селективності відносно субстрату L-аргініну є N-(3(амінометил)бензил) ацетамідину (1400W скорочена назва), якому притаманна властивість гальмувати процес посиленої експресії iNOS і, відповідної гіперпродукції N0 при токсичному ураженні печінки, що має негативну роль. Тоді як NO, що синтезується eNOS (зосереджена в оновному в ендотелії капілярів) проявляє захисну функцію, покращуючи мікроциркуляцію в паренхімі і, тим самим, мінімізуючи печінкове ураження [2]. Виходячи з наведених міркувань у відомому способі превентивної профілактики експериментального гепатиту у білих щурів, який включає введення інгібітора індуцибельної синтази оксиду азоту (iNOS), відповідно до винаходу як інгібітор iNOS застосовують N-(3-амінометил)бензил) ацетамідину (1400W скорочена назва), який вводять одноразово внутріпшьоочеревинно в дозі 1,5мг/кг за 30хв. до дії гепатотоксину алілового спирту, введеного у (19) UA (11) 81857 (13) C2 (21) a200606215 (22) 05.06.2006 (24) 11.02.2008 (72) КОРДА МИХАЙЛО МИХАЙЛОВИЧ, UA, ЯРОШЕНКО ТЕТЯНА ЯРОСЛАВІВНА, UA (73) ТЕРНОПІЛЬСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ І.Я.ГОРБАЧЕВСЬКОГО, UA (56) Gastrc damage and granulocyte infiltration induced by indomethacin in tumour necrosis factor receptor (TNF-R1) or inducible nitric oxide synthase (iNOS) deficient mice // Souza M.H., Lemos P. H, OUveira R. В., Cunha F. Q. // Gut -2004. -№ 53. -P. 791-796. О.М.Олещук, К.А.Посохова, Л.Й.Плосканич // Вплив селективного блокатора індуцибельної NOсинтази аміногуанідину на стан печінки при її іше 3 дозі 30мкл/кг маси на ізотонічному розчині натрію хлориду. Спосіб здійснюють наступним чином. Після визначення маси тварини за 30хв. перед моделюванням токсичного гепатиту білому щуру одноразово внутрішньоочеревинно вводять розчин 1400W, в дозі 1,5мг/кг, після чого на лабораторній тварині виконують експериментальне моделювання токсичного гепатиту. Для цього внутрішньоочеревинно їй вводять аліловий спирт у дозі 30мкл на 1кг маси тіла на Ізотонічному розчині натрію хлориду. Через 24год. тварину декапітують під тіопенталовим наркозом. Висновок про ефективність превентивної профілактики токсичного гепатиту роблять за показником біологічної активності N0 в тканині печінки електрохімічним методом. Для цього після евтаназії тварин печінку негайно видаляють, вміщують у холодний розчин Хенкса, розрізають на декілька шматочків і відразу переносять до рідкого азоту, де тканину печінки зберігають не більше 20 днів перед її використанням. Безпосередньо перед визначенням NО шматочок печінки вміщують у холодний розчин Хенкса. Тканину нарізають тоненькими смужками довжиною 7-8мм і шириною 4-5мм і кожну з них вносять до термостатованої кювети (37°С), заповненої фосфатним буфером. Платиновий і каломельний електроди розміщують у кюветі в безпосередній близькості від тканини печінки, а активний кінець робочого наносенсора прикладають до поверхні тканини за допомогою мікроманіпулятора. Для оцінки максимальної продукції NО 10мкл кальційіонофору А23187 впорскують на поверхню тканини печінки за допомогою наноінджектора (кінцева концентрація іонофору в середовищі 1 мкмоль/л), після чого реєструють електричний струм, що виникає внаслідок окиснення N0 на робочому електроді. Концентрацію NО вираховують за допомогою калібрувальної кривої, виготовленої попередньо за допомогою стандартних розчинів. Висновок про ефективність способу роблять за функціональним станом конституційної NО синтази. Приклад 1. Білому щуру масою 200г попередньо внутрішньоочеревинно ввели розчин інгібітора iNOS, а саме 0,3мг 1400W в 1мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Через 30хв. цій тварині внутрішньоочеревинно ввели 6 мкл алілового спирту, розведеного в 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, що відповідало дозі 30мкл/кг. Паралельно контрольній тварині з аналогічною масою (200г) також внутрішньоочеревинно ввели 6мкл алілового спирту в 1мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Додатковим - другим контролем була інтактна тварина, якій внутрішньоочеревинно ввели 1мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Через 1 добу трьом тваринам - інтактній, контрольній і дослідній - здійснили евтаназію, після чого у кожної негайно видалили печінку, розрізали на декілька шматочків і поміщали в холодний розчин Хенкса (4°С). Отримані тканинні взірці поміщали на дно термостатованої кювети (37°С), заповненої фосфатним буфером. Платиновий і каломельний електроди розміщували в кюветі близько до тканини печінки, а активний кінець робочого наносенсора опускали 81857 4 на поверхню тканини. Для оцінки максимальної продукції NО 10мкл кальцій-іонофору А23187 наноінджектором впорскували на поверхню тканини печінки і записували величину струму, користуючись потенціометром фірми EG&G Princeton Applied Research. Отримані дані обробляли за комп'ютерною програмою (Research Electrochemistry Software, Ver. 4.30; EG&G Princeton Applied Research) і аналізували за допомогою програми Origin 6.0. Рівень NО розраховували за допомогою калібрувальної кривої. Сумарну активність NO-синтази печінки визначали колориметричне за кількістю утворених нітратів і нітритів в інкубаційному середовищі, що містило 40мМ тріс НСl буфер, рН 7,9; гомогенат печінки (1мг білка/мл); 4 m рМ ФАД; 4 m М Н4 біоптерин; 3тМ дітіотреїтол і 1мМ L-аргінін. Реакцію ініціювали НАДФН (2mM) при 37°С. Отримані результати занесеш до робочої таблиці (табл.1). З наведених у ній даних видно, що в результаті превентивного введення щуру інгібітора iNOS токсична дія алілового спирту на печінку була суттєво знижена, і становила 82,1нмоль/л. У той же час, без застосування інгібітора рівень максимальної концентрації NO був дещо вищим, і становив 85,5нмоль/л. Аліловий спирт призводив до максимальних деструктивних змін у гепатоцитах. Сумарна активність синтази оксиду азоту приблизно вдвічі зросла після інтоксикації (контроль) у порівнянні з інтактною твариною (табл.1), тоді як, загальна активність NOS дослідної тварини наближалася до норми, що й свідчить про високу ефективність інгібітора як профілактичного засобу. Таблиця 1 Результати визначення рівня максимальної концентрації NО і загальної активності NО синтази в печінці Лабораторна тварина І Контрольна (АС) II Контрольна (норма) Дослідна (1400W+AC) Сmax, нмоль/л 85,5 160,0 82,1 NО синтаза, нмоль/(мг . білка хв.) 1,35 0,75 0,70 Приклад 2. Запропонований спосіб профілактики був перевірений в експериментах на ЗО щурах. В усіх випадках, як свідчать наведені у табл. 2 дані, введення тваринам високоселективного інгібітора iNOS 1400W забезпечило виражений профілактичний ефект. Як випливає із результатів дослідження, в період формування гострих некротичних змін загальна активність синтази оксиду азоту печінки (eNOS + iNOS) зростала в 1,8 рази. Оскільки, як було показано вище, eNOS під впливом АС зазнає пригнічення, то можна стверджувати, що таке збільшення загальної активності фермента відбувалося завдяки стимуляції його індуцибельної форми: 1400W значно знижував загальну активність NOS (табл. 2). Так, за умов посилення активності вільнорадикального окислення у печінковому гомогенаті у контрольних тварин, що завдяки токсичній дії алілового спирту майже втричі була ви 5 81857 щою, ніж у інтактних тварин, інгібітор 1400W достовірно пригнічує згубну дію вільнорадикального процесу в гепатоцитах, про що свідчить наближення інтенсивності хемілюмінесції до норми. На 6 профілактичну спроможність інгібітора 1400W вказує понижена активність маркерних ферментів АлАТ та АсАТ у сироватці крові дослідних тварин з блокуванням у такий спосіб цитолізу гепатоцитів. Таблиця 2 Вплив N-(3-(Амінометил)бензил)ацетамідину на рівень NO, показники сумарної активності синтази оксиду азоту, амінотрансфераз у плазмі крові, отруєних аліловим спиртом тварин (М+m; n=10) Група тварин Cmax, нмоль/л Інтактні Контрольні (АС) Дослідні 1400W+АС 160.0±12.2 85.5±8.88* 82.07±10.5 Показники АлАТ, Ммоль/л год. 0.46±0.02 4.1б±0.28* 1.90±0.15** NО синтаза, . нмоль/(мг білка хв..) 0.75±0.08 1.35±0.20* 0.70±0.06** АсАТ, моль/л год. 0,38±0,03 2,90±0,22* 1,58±0,13** Спонтанна ХЛ, імп./10с 34.90±1.18 98.60±9.75* 56.50±5.23** Примітка. * - зміни достовірні порівняно з показниками інтактних тварин; ** - зміни достовірні порівняно з показниками контрольних тварин. Таким чином, запропонований спосіб забезпечує надійнішу і ефективнішу, ніж за способомпрототипом, превентивну профілактику токсичного ураження печінки, ініційованого некрозогенним гепатотоксином аліловим спиртом, і може бути використаний в дослідженнях ролі оксиду азоту в патогенезі токсичного ураження печінки і формуванні механізмів саногнезу. Джерела інформації, які слід взяти до уваги: 1. О.М.Олещук, К.А.Посохова, Л.Й.Плосканич // Вплив селективного блокатора індуцибельної Комп’ютерна верстка Н. Лисенко NO-синтази аміногуанідину на стан печінки при її ішемії-репрфузії // Здобутки клінічної і експериментальної медицини: матеріали XLVIII підсумкової науково-практичної конференції // Тернопіль. „Укрмедкнига”. - 2005. - С.201-202. 2. Gastrc damage and granulocyte infiltration induced by indomethacin in tumour necrosis factor receptor (TNF-R1) or inducible nitric oxide synthase (iNOS) deficient mice // Souza M.H., Lemos P.H, Olivera R.В., Cunha F.Q. // Gut -2004. -№53. -P.791796. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601