Спосіб оцінки реперфузійного ушкодження ішемізованої нижньої кінцівки

1. Спосіб оцінки реперфузійного ушкодження ішемізованої нижньої кінцівки, згідно з яким реєструють показник оксидативного стресу по забору досліджуваної крові, з урахуванням якого оцінюють реперфузійне ушкодження ішемізованої нижньої кінцівки, який відрізняється тим, що як показник оксидативного стресу реєструють C2 2 (19) 1 3 81880 мітохондриальних мембран в умовах цілісного організму було неможливо. Відомий найбільш близький за своєю суттю до пропонованого спосіб оцінки відкриття мітохондриальної пори, як показника розвитку оксидативного стресу [див. Brookes P.S., DarleyUsmar V.M. Role of calcium and superoxide dismutase in sensitizing mitochondria to peroxynitriteinduced permeability transition // Am. J. Physiol Heart Circ.Physiol. - 2004. - Vol. 286, №1. - p. H39-H46]. Цей спосіб дає змогу оцінити утворення МП за допомогою реєстрації набухання мітохондрій, які одержують з органів забитих тварин. Можливий тільки в умовах in vitro, вимагає великої кількості реактивів, крім того він довготривалий і потребує додаткового обладнання на проведення дослідження. В основу винаходу покладено завдання такого вдосконалення способу розвитку оксидативного стресу в ішемізованій нижній кінцівці, при якому за рахунок визначення стабільного мітохондриального фактору (СМФ), що є маркером відкриття мітохондриальної пори в клітинах тканин, що гинуть, і визначення його в крові, що відтікає від нижньої кінцівки, що була у стані ішемії реперфузії, забезпечується підвищення ефективності лікування з одночасним спрощенням процесу, зменшенням кількості реактивів і часу оцінки. Для вирішення цього завдання у способі оцінки розвитку оксидативного стресу в ішемізованій нижній кінцівці, згідно з яким реєструють показник оксидативного стресу по забору досліджуваної крові, з урахуванням якого оцінюють розвиток оксидативного стресу в ішемізованній нижній кінцівці, згідно винаходу як показник оксидативного стресу реєструють стабільний мітохондріаьний фактор (СМФ), при цьому піля забору досліджуваної крові, одержують сироватку з випробуваної крові, повне осадження білків сироватки, одержання надосадової рідини (супернатанта), спектрофотометричне дослідження отриманої надосадової рідини, реєстрацію даних в ультрафіолетовому спектрі, будують графік залежності оптичної щільності поглинання надосадової рідини від довжини хвилі, за яким реєструють СМФ, оптимальним є, коли одержання сироватки з випробуваної крові здійснюють шляхом центрифугування,одержання надосадової рідини (супернатанта) здійснюють шляхом центрифугування осадженої сироватки, а спектрофотометричне дослідження отриманої надосадової рідини і реєстрацію даних в ультрафіолетовому спектрі проводять у діапазоні хвиль 230-260нм. У результаті досліджень останніх років нами виявлений СМФ, що був зареєстрований спектрофотометрично в ультрафіолетовому спектрі, у діапазоні хвиль 230-260нм із максимумом 240-250нм, який вивільняється в кровоток при відкритті МП, і, внаслідок цього, може служити маркером оксидативних ушкоджень клітки, ініційованих відкриттям МП. Відкриття МП здійснюється під впливом вільних радикалів. 4 Більшість досліджень, у яких вивчалася роль СМФ як маркера відкриття МП, проведені in vitro. Проведені нами клінічні дослідження показали, що методика реєстрації СМФ за допомогою спектрофотометрії в сироватці крові, що відтікає від реперфузованної нижньої кінцівки, корелює із розвитком оксидативного стресу в ушкодженній кінцівці. Запропонована методика може використовува тися в клінічній практиці для оцінки реперфузійного ушкодження ішемізованої нижньої кінцівки. Визначення СМФ може бути використане для діагностики розвитку реперфузі йного синдрому, оцінки ефективності лікування та попередження розвитку реперфузійного синдрому при ішемії нижньої кінцівки. Приклад конкретної реалізації способу оцінки розвитку оксидативного стреса в ішемізованій нижній кінцівці. Хворий Г., історія хвороби №13086, був прооперований 20.06.2006 з приводу гострого артеріального тромбозу стегно-підколінного сегменту справа. Під час операції згідно запропонованого способу була набрана кров хворого до і після відновлення кровотоку у враженій кінцівці. Кров була підготовлена та було проведено дослідження. Методика одержання сироватки крові: відбиралася проба крові інтраопераційно, через 10 хв після реканалізації обтурированого артеріального сосуда із супровідної до артерії вени. Пробу крові центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хв. В отриману сироватку додавали 50% трихлороцтову кислоту з розрахунку 0,1 мол трихлороцтової кислоти на 1 мол сироватки для повного осадження білків. Розчин ретельно перемішували й залишали на 10 хв. Далі центрифугували при 3000 об/хв протягом 15 хв. Після цього збирали надосадову рідину і проводили спектрофотометричне дослідження останньої. Оптичну щільність поглинання розчинів вимірювали за допомогою спектрофотометра Specord 200M. Для виміру використовували кварцові 10-ти міліметрові кювети, що дозволяють працювати в області ультрафіолетового спектра. В одну кювету заливали контрольний розчин, а в іншу - досліджуваний зразок. Зразки містилися в спектрофотометрі, де проводилось вимірювання співвідношень між двома світловими потоками монохроматичного світла: тим, що пройшов крізь кювету з рідиною, і потоком, що падав на неї. Виміри проводилися в ультрафіолетовій ділянці спектра при довжині хвилі від 230 до 260нм. Функціональну залежність оптичної щільності поглинання від довжини хвилі будували за допомогою Microsoft Office Excel 2003. Отриманні результати були представлені у вигляді графіка (додається), на якому представлена залежність оптичної щільності поглинання сироватки крові з ішемізованної кінцівки після реперфузії від довжини хвилі. Величину СМФ оцінювали за показником різниці між значенням його оптичної густини при l=245 і 235нм. Дослідження проводились неоднарозово у хворих з гострою ішемією нижніх кінцівок. 5 Отримані результати дозволяють використовувати вказаний спосіб для діагностики реперфузійного синдрома при гострій ішемії нижніх кінцівок. 81880 6