Спосіб ідентифікації вірусної строкатості рослин

Спосіб ідентифікації вірусної строкатості рослин, який полягає в опроміненні листка рослини після темпової фази світлом в діапазоні довжин хвиль 400¸650 нм, прийомі, вимірюванні і реєстрації сигналів флуоресценції в діапазоні довжин хвиль 670¸770 нм, із значень яких будують індукційну криву, який відрізняється тим, що в ньому визначають значення стаціонарної флуоресценції в області листка FTC та між судинами того ж листка FTM і порівнюють ці значення, а по величині FTC³1,5FTM рослину вважають ураженою вірусною строкатістю. Спосіб належить до області дослідження матеріалів шляхом визначення фізичних властивостей, зокрема визначення ураженості рослин вірусною строкатістю, шляхом запису і аналізу кривої індукції флуоресценції нативного хлорофілу (індукційна крива, крива Каутського) рослинних об’єктів. Спосіб орієнтовано на застосування у сільському господарстві, зокрема рослинництві та селекційній роботі. Зовнішні ознаки ураженості листя вірусною строкатістю, карбонатним, хлорозом, хлоротичною плямистістю, тощо, схожі і розрізнити їх складно, навіть при явних ознаках, а окомірні визначення суб’єктивні. Відомо «Способ обнаружения вирусных инфекций растений» SU 1507253; A01G 67/00, G01N 21/35, який полягає у реєстрації інфрачервоного поглинання листа рослини у спектральній області 850-1750см у мінус першому ступені із швидкістю 160–400см у мінус першому ступені/хв. Ураженим вважають зразок з максимальною інтенсивністю інфрачервоного поглинання в порівняні із здоровою рослиною. Спільними рисами аналогу і запропонованого способу є опромінення рослини, прийом та вимірювання оптичного сигналу, що взаємодіє з опро міненою областю листа. Причиною, що заважає одержанню очікуваного технічного результату є те, що спосіб-аналог не дозволяє ідентифікувати вірусну строкатість рослин. Відомо спосіб запису, інтерпретації та використання індукції флуоресценції нативного хлорофілу представлений у роботі Корнєв Д.Ю. «Информационные возможности индукции флуоресценции хлорофилла», Киев, Альтерпрес, 2002г. Спосіб-аналог запису кривої індукції флуоресценції хлорофілу полягає в осві тлені листа рослини в діапазоні хвиль 400¸650нм після його темнової адаптації, прийому та вимірювані сигналів флуоресценції в діапазоні хвиль 670¸770нм та побудові індукційної кривої з поточних значень флуоресценції. Спільними рисами аналогу та запропонованого способу є вимірювання і реєстрація поточних значень флуоресценції з яких будують індукційну криву флуоресценції нативного хлорофілу. Причиною, що заважає одержанню очікуваного те хнічного результату є те, що у способі аналогу не визначені показники, які дозволяють ідентифікувати вір усну строкатість рослин. (19) UA (11) 83679 (13) C2 (21) a200603472 (22) 30.03.2006 (24) 11.08.2008 (46) 11.08.2008, Бюл.№ 15, 2008 р. (72) ВОЙТОВИЧ ІГОР ДАНИЛОВИЧ, UA, КИТАЄВ ОЛЕГ ІГОРЕВИЧ, UA, МІЩЕНКО ЛІДІЯ ТРОХИ МІВНА, UA, БУБЛИК МИКОЛА ОЛЕКСАНДРОВИЧ, UA, КЛОЧАН ПЕТРО СТЕП АНОВИЧ, UA, РОМАНОВ ВОЛОДИМИР ОЛЕКСАНДРОВИЧ, UA, ФЕДАК ВОЛОДИ МИР СЕМЕНОВИЧ, UA (73) ІНСТИТУТ КІБЕРНЕТИКИ ІМ. В.М. ГЛУШКОВА НАЦІОН АЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, U A, ІНСТИТУТ САДІВНИЦТВА УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ Н АУК, U A (56) SU 1768071 A1, 15.10.1992 UA 35033 A, 15.03.2001 FR 2837574, 26.09.2003 3 83679 4 Найближчим по суті до запропонованого споМ - хід індукційної кривої для міжсудинної обсобу є «Спосіб реєстрації та використання світлоласті; індукованих вимірювань флуоресценції хлорофіFTC -значення усталеної флуоресценції для лу», патент DD 300049, А7 GО1N 21/64. області судини; Спосіб прототип полягає в одержані і електроFTМ - значення усталеної флуоресценції для нній реєстрації індукційної кривої, визначені двох міжсудинної області. показників кривої, зокрема початкової F0 і максиНа Фіг.2 схематично зображено листок рослимальної Fm флуоресценції, та їх співвідношення, ни з точками вимірювань наведеної флуоресценпо якому і визначають стан рослини. Індукційну ції, де точки С і М відповідно області судин і між криву будують із поточних значень флуоресценції, судинами. одержаних при опромінені листка рослини світлом Відомо, що певні ділянки кривої індукції флуоресценції хлорофілу є індикаторами відповідних у діапазоні хвиль 400¸650нм, збуджуючим флуоресценцію хлорофілу, після попереднього опроміфізиологічних процесів у ланцюгу фотосинтезу. Тому порушення окремих ланок фотосинтезу, винення коротким насичуючим спалахом, темнової кликані екзо та ендогенними чинниками проявляфази, наступного прийому, виділення і вимірюванються у характерних змінах відповідних ділянок ня сигналів флуоресценції у діапазоні хвиль індукційної кривої. Такі зміни індукційної кривої 670¸770нм. дослідної рослини, на яку діє збуджуючий чинник у Спільними рисами прототипу і запропонованопорівнянні з індукційною кривою контрольної росго способу є опромінені листка рослини після темлини на яку чинник не діє, свідчать про вплив чиннової фази світлом з довжиною хвилі 400¸650нм, ника. Ідентифікація дії чинника потребує вибору прийому, вимірювані і реєстрації сигналів флуореспецифічного показника індукційної кривої якому сценції з довжиною хвилі 670¸770нм, із значень відповідає дія саме цього чинника. Такими показяких будують криву індукції флуоресценції хлорониками в результаті експериментальних досліфіла. джень вибрано значення стаціонарної флуоресцеПричиною, що заважає одержаню очікуваного нції визначені в міжсудинній області листка FTМ, як технічного результату є те, що у способі прототипі контроль і в області судини FTC, як в зоні ураженне визначені показники індукційної кривої, які доня. Саме ці показники вибрано ідентифікаційною зволяють ідентифікувати вірусну строкатість росознакою ураженості вірусною строкатістю. лин. Запропонований спосіб реалізує наступний Задачею винаходу є вибір таких характерних порядок визначень: з допомогою хроиофлуоримеознак індукції флуоресценції хлорофілу, способу їх тра записують індукційну криву М (Фіг.1) для міжвизначення та інтерпретації, які дозволяють іденсудинної зони М листка (Фіг.2) рослини шляхом тифікува ти вірусн у строкатість рослин. опромінення міжсудинної зони листа рослини пісВирішення поставленої задачі досягається ля темнової фази, прийому, вимірювання та ретим, що запропонований спосіб включає опромієстрації сигналів флуоресценції. Листок рослини неня листка рослини після темнової фази світлом витримують без доступу світла від 2 до 15хв у конв діапазоні довжин хвиль 400¸650нм, прийому, верті з темного паперу, або з допомогою виносновимірювані і реєстрації сигналів флуоресценції в го оптоелектронного сенсора, який має зажим із діапазоні довжин хвиль 670¸770нм, із значень яких двома пластинами, між якими розміщують листок. будують криву індукції флуоресценції, а також виДалі міжсудинний фрагмент листка опромінюють значають значення стаціонарної флуоресценції в світлом, яке збуджує флуоресценцію хлорофілу. області судини листка FTC та між судинами тогож Частіше довжину хвилі опромінення вибирають у листка FTC і порівнюють ці значення, а по величині діапазоні поглинання хлорофілу 400¸650нм, який FTC>1,5FTM рослину вважають ураженою вірусною охоплює головні l=450нм, l=650нм та проміжні строкатістю. l=500нм, k=550нм максимуми поглинання нативВідмінними ознаками запропонованого спосоного хлорофілу. Інтенсивність опромінення актинібу є те, що в ньому визначають значення стаціочним світлом здійснюють у діапазоні нарної флуоресценції в області судини листка FTC 100¸2000мкмоль фотонів м -2 с-1, яка підгримує та між судинами токож листка FTC і порівнюють ці фотосинтез. Одночасно з освітленням здійснюють значення, а по величині FTC>1,5FTM вважають росприйом, виділення, вимірювання і реєстрацію сиглину ураженою вірусною строкатістю. налів флуоресценції з освітленої плями листка в Введення у відомий спосіб операцій виділення діапазоні довжин хвиль 670¸770нм. Цей діапазон значень стаціонарної флуоресценції, визначених в охоплює обидва максимуми флуоресценції нативобласті судини листка та між судинами і їх порівняння дозволить ідентифікувати ураженість росного хлорофілу на l=680нм та l=735нм. Із поточлини вірусною строкатістю по збільшенню величиних значень флуоресценції будують індукційну ни стаціонарної флуоресценції хлорофілу, криву флуоресценції і виділяють значення стаціовизначеної в області судини в порівнянні з велинарної флуоресценції (FTM, Фіг.1). чиною стаціонарної флуоресценції, визначеної в Аналогічно будують індукційну криву (С. Фіг.1) міжсудинній області листка. флуоресценції хлорофілу з поточних значень На Фіг.1 зображено загальний вид індукційної флуоресценції для області судини листка (С. Фіг.2) кривої (крива індукції флуоресценції хлорофілу, і виділяють значення стаціонарної флуоресценції крива Каутського) де значення флуоресценції (FTC, Фіг.1). Виділені значення FTC і FTM порівнюпредставлено у відносних одиницях: ють. Якщо FTC>1,5 FTM, то рослину вважають ураС - хід індукційної кривої для області судини; женою вірусною строкатістю. 5 83679 6 В залежності від конструкції сенсорної частини Спосіб реалізовано при тестуванні вірусної строприладу, яка включає джерело опромінення, світкатості злаків, зокрема ячменю (Hordeiun vulgare). лофільтр та фотоприймач, застосовують послідоЛисток неураженої (контрольної) яблуні розміщувне, при одноканальній конструкції сенсора, або вали між пластинами сенсора і витримували без паралельне, при двоканальній конструкції сенсосвітла 10хв. Для опромінення листка рослини було ра, вимірювання наведеної флуоресценції. При використано 2 синіх світаодіода NSPB500S (Nicbia) одноканальній конструкції оптичну вісь сенсора з довжиною хвилі випромінення 460нм±10нм. Діоспочатку орієнтують на міжсудинну область листка ди розміщені попарно на протилежних сторонах і записують індукційну криву, а потім переміщують каркаса, симетрично відносно фотоприймача і в сенсор, орієнтуючи його оптичну вісь на область межах полоски освітлення розміром 1,5х3мм ствосудини і знову записують індукційну криву. При рюють рівномірне освітлення. При інтенсивності застосуванні двоканального сенсора оптичні вісі освітлення 450мкмоль м -2 с-1 і більше сигнал індуканалів орієнтовані паралельно відповідно на обкованої флуоресценції надійно фіксується. Для ласті судин і між судинами. Перевагами паралельвиділення сигналу флуоресценції нами застосованого вимірювання флуоресценції при двоканальній но червоний світлофільтр з майларової плівки, конструкції сенсора є однакові темнові фази та який забезпечує надійне відсікання випромінення умови вимірювань. евітлодіодів і пропускання сигналів флуоресценції Запропонований спосіб ідентифікації ураженов. У якості фотоприймача використано монолітний сті рослини вірусною строкатістю, як видно з його з підсилювачем світлодіод ОРТ301М (Вurr-Brown), опису, може бути реалізований у виробних умовах, у якого максимум чутливості в діапазоні хвиль так як для його реалізації використовують серійні 650¸800нм. Для вимірювання і реєстрації сигналів хронофлуорометри, які дозволяють записувати використано мікро контролер ADuC 842 (Analog індукційну криву. При реалізації способу був заDevieces). Спеціалізовані програми роботи контстосований одноканальний переносний флуороролера дозволяють визначити FTC та FTM. При метр «Флоратест» виробництва державного НауFTC³1,5FTM дослідну рослину вважають ураженою ково-інженерного центру мікроелектроніки вірусною строкатістю. Запропонований спосіб доІнституту кібернетики HAH України, але можна зволяє ідентифікувати вірусн у строкатість на ранвикористати інші прилади, наприклад, портативніх стадіях ураження при масових експресних виний хлорофіл-флуорометр РАМ-2100 німецької значеннях. фірми Heinz Walz GmbH, або хлорофілфлуорометр OS-30р фірми OPTI-Sciences, USA. Комп’ютерна в ерстка Г. Паяльніков Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601