Спосіб моделювання реакції лейкоцитолізу

Спосіб моделювання реакції лейкоцитолізу, що включає інкубацію суспензії ізольованих лейкоцитів у цитотоксичному середовищі і аналіз діагностичної реакції у вигляді лізису лейкоцитів у полі зору люмінесцентного мікроскопа, який відрізняється тим, що ізольовані лейкоцити периферійної крові людини інкубують із несумісною за критерієм групоспецифічності стандартною діагностичною сироваткою однієї з груп крові, причому лейкоцити А (II) групи інкубують із сироваткою І або III групи крові, лейкоцити В (III) гр упи інкубують із сироваткою І або II групи, а лейкоцити АВ (IV) гр упи інкубують із сироваткою І, II або III групи крові. (19) (21) a200611820 (22) 10.11.2006 (24) 25.11.2008 (46) 25.11.2008, Бюл.№ 22, 2008 р. (72) ПЕРЕПЕЛИЦЯ МИХАЙЛО ПЕТРОВИЧ, U A, САСКА ТЕТЯН А МИ ХАЙЛІВНА, U A, ДЕМ'ЯНЕНКО СВІТЛАН А МИХАЙЛІВН А, U A, ГЕРАСИМІВ АНДРІЙ ІГОРОВИЧ, U A (73) ПРИВАТНИЙ ВИЩИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД "МЕДИЧНИЙ КОЛЕДЖ", UA (56) UA A 55782 15.04.2003 UA A 55845 15.04.2003 UA A 66250 15.04.2004 3 84752 бражає мембранну резистентність власне клітин лейкоцитів, на фоні якої чітко проявлятиметься мембранопротекторний вплив різних чинників фізичної і біоорганічної природи, що сприятиме розширенню сфери застосування відомого способу. Поставлене завдання вирішують тим, що у відомому способі моделювання реакції лейкоцитолізу, який включає інкубацію суспензії ізольованих лейкоцитів у цитотоксичному середовищі і аналіз діагностичної реакції у полі зору люмінесцентного мікроскопу, відповідно до винаходу ізольовані лейкоцити периферійної крові людини інкубують із несумісною за критерієм групоспецифічності стандартною діагностичною сироваткою, причому лейкоцити А (II) групи інкубують із сироваткою І або III груп крові, лейкоцити В (III) групи інкубують із сироваткою І або II груп, а лейкоцити АВ (IV) гр упи інкубують із сироваткою І, II або III гр уп крові. Перелік фігур Фіг.1. Мікрофото. Реакція лейкоцитолізу при взаємодії ізольованих лейкоцитів донора з несумісною за критерієм групоспецифічності діагностичною сироваткою. Акридин оранжевий 1:10000. Люмінесцентна мікроскопія. Об. 20х ок. 15х Фіг.2. Мікрофото. Реакція взаємодії ізольованих лейкоцитів донора з одногрупною стандартною діагностичною сироваткою. Акридин оранжевий 1:10000. Люмінесцентна мікроскопія. Об. 20х ок. 15х Спосіб здійснюють наступним чином. На предметне скло наносять 20мкл суспензії лейкоцитів в ізотонічному розчині натрію хлориду і змішують з аналогічним об'ємом діагностичної групоспецифічної сироватки таким чином, щоб у мікропрепараті були сформовані умови для розвитку імуноконфліктного - лейкоцитолітичного процесу. Для цього лейкоцити змішують із стандартними групоспецифічними сироваткми за однією з наступних схем: лейкоцити А (II) групи інкубують із 4 сироваткою І або III груп крові, лейкоцити В (III) групи інкубують із сироваткою І або II груп, а лейкоцити АВ (IV) гр упи інкубують із сироваткою І, II або III гр уп крові. До суміші на предметному склі додають 20мкл флуорохромного барвника, наприклад, акридину оранжевого в розведенні 1:10000, накривають скельцем і витримують у затемненому місці при 18-22°С впродовж 60хв, після чого в полі зору люмінесцентного мікроскопу аналізують характер лейкоцитолітичного процесу. Приклад 1. Для моделювання реакції лейкоцитолізу з гарантованою можливістю надійного і точного відтворення лейкоцитолітичного процесу на 2 предметних скла нанесли по 20мкл суспензії лейкоцитів здорової дорослої людини А (II) групи в ізотонічному розчині натрію хлориду та змішали з рівним об'ємом несумісної у гр уповому відношенні стандартної групоспецифічної сироватки: до проби лейкоцитів в одному мікропрепараті внесли сироватку І групи, а до лейкоцитів в іншому мікропрепараті – сироватку III групи крові. До кожного з мікропрепаратів внесли по 20мкл розчину акридину оранжевого в розведенні 1:10000, накрили скельцем і витримували впродовж 60хв при 20°С у затемненому місці. Мікропрепарати досліджували в полі зору люмінесцентного мікроскопу, відзначаючи характер лейкоцитолітичного процесу. В результаті, в обох мікропрепаратах (мав місце помітний лейкоцитоліз, оскільки там відбулася імуноконфліктна взаємодія адсорбованих на мембранах лейкоцитів групоспецифічних антигенів – аглютиногенів А II групи з відповідними групоспецифічними антитілами (аглютинінами a), що містяться у сироватках І і III гр уп. Приклад 2. За наведеною методикою провели постановку реакцій лейкоцитолізу ізольованих лейкоцитів у 37 здорових дорослих людей, результати якої наведені у таблиці. Таблиця Результати взаємодії ізольованих лейкоцитів крові донорів з стандартними групоспецифічними діагностичними сироватками за наявністю (+) чи відсутністю (-) лейкоцитолізу Лейкоцити за груповою ознакою n А (II) В (III) AB(IV) 14 13 10 В усіх наведених (помічених знаком +) реакціях мав місце типовий цитолітичний процес, а саме лейкоцитоліз, сталий за якісними проявами і кількісними параметрами. При цьому спостерігали імунопатологічне набрякання клітин, фрагментація ядер нейтрофілів, порушення цілісності зовнішньої клітинної мембрани, розтікання цитоплазми (Фіг.1), тоді як в контрольних препаратах (помічені знаком -) з використанням імунологічно сумісних групоспецифічних стандартних сироваток лейкоцити зберігали притаманну їм форму і характер люмінесцентного світіння (Фіг.2). Характерною для запропонованого способу є відсутність суттєви х відмінностей якісних проявів та інтенсивності лізису Стандартні групоспецифічні сироватки поз) III (а) + + + + + + + лейкоцитів, отриманих для дослідження від різних здорових дорослих людей, що надає запропонованому способу високого рівня відтворності, а отже точності дослідження. Отже, запропонований спосіб забезпечує вищий, ніж за способом - V і прототипом, рівень точності та інформативності, що сприятиме розширенню сфери застосування і впровадженню способу в клініко-лабораторну практику. Джерела інформації, які слід взяти до уваги: 1. Пат. 55782 А, Україна. Богуславець О.Т., Дем'яненко В.В., Федорців О.Є. Спосіб визначення цитоактивних властивостей речовини в тестовій пробі in vitroю. 5 84752 2. Nadir R. Farid, Laura Sampson, Elke P. Noel, John M. Barnard, Robert Mandeville, Bodil Larsen, and William H. Marshall. A Stud y of Human Leukocyte D Locus Related Antigens in Graves' Disease. J Clin Invest. 1979 January; 3(1): 108-113. 3. Bucin D., Johansson S., Malm T., Jogi P., Johansson J., Westrin P., Lindberg L.O., Olsson A.K., Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 6 Gelberg J., Peres V., Harling S., Bennhagen R., Kornhall B., Ekmehag В., і Kurkus J, Otto G. Heart transplantation across the antibodies against HLA and ABO. Transpl Int. 2006 Mar; 19(3):239-44/ PMID: 16441774 [PubMed – indexed for MEDLINE]. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601