Спосіб моделювання реакції лейкоцитів на хімічний подразник

Спосіб моделювання реакції лейкоцитів на хімічний подразник, що включає змішування та 3 36339 лу клітин, зокрема еритроцитів і лейкоцитів в межах окремої краплини в напрямку обмеження впливу сил міжклітинної взаємодії, то внесення актовегіну до дослідної проби крові на предметному склі забезпечить оптимальне зосередження лейкоцитів з краплини крові для подальшого дослідження. Тим більше, що за результатами попередніх досліджень методом поляризаційної флуоресценції, актовегін не вносить суттєви х помітних змін у біоенергетику клітин, що важливо для забезпечення точності та інформативності аналізу в цілому. З огляду на притаманну лейкоцитам властивість у ході реакції на хімічний подразник змінювати внутрішньоклітинний гомеостаз, на рівні ядрових нуклеїнових кислот супроводжується зміною параметрів їх флуоресценції [3,4], вказаний методичний прийом забезпечуватиме високий рівень точності та інформативності дослідження в цілому. Виходячи з наведених міркувань і даних попередніх досліджень, у відомому способі моделювання реакції лейкоцитів на хімічний подразник, що включає змішування та інкубацію на предметному склі ізольованих лейкоцитів з хімічним інгредієнтом і наступний візуальний аналіз реакції в полі зору люмінесцентного мікроскопа, відповідно до корисної моделі, на предметне скло наносять 50мкл розведеної у співвідношенні 1:1 актовегіном нативної крові у формі краплини, витримують при 18-20°С впродовж 6-8хв і визначають під мікроскопом межі утвореного по зовнішньому краю краплини лейкоцитарного кільця, на окремі ділянки якого наносять по 5-7мкл інгредієнтів реакцій і досліджують характер поляризаційної флуоресценції лейкоцитів. Фіг.1. Лейкоцитарне кільце нативної нерозведеної актовегіном крові. Поляризаційна флуоресценція. Люмам 8-3М: об.х9; ок.х20. Фіг.2. Лейкоцитарне кільце попередньо розведеної актовегіном нативної крові у співвідношенні 1:3. Поляризаційна флуоресценція. Люмам 8-3М: об.х9; ок. х20. Фіг.3. Спектральний склад випромінювання лейкоцитів у поляризованому світлі в мікропрепараті нерозведеної (а) і розведеної актовегіном (б) крові. Поляризаційна флуоресценція. Люмам 83М: об. х9; ок.х20. Фотоелектронна насадка ФМЭЛ1. Фіг.4. Короткочасне посилення яскравості світіння ядер лейкоцитів під впливом інсуліну в мікропрепараті - на першій хвилині. Поляризаційна флуоресценція. Люмам 8-3М: об.х9; ок. х20. Фіг.5. Гасіння флуоресценції ядер лейкоцитів під впливом інсуліну - на п'ятій хвилині. Поляризаційна флуоресценція. Люмам 8-3М: об. х9; ок. х20. Фіг.6. Динаміка гасіння поляризаційної флуоресценції лейкоцитів під впливом інсуліну за показником інтенсивності впродовж 5хв. Люмам 8-3М: об.х9; ок. х20. Фотоелектронна насадка ФМЭЛ-1. Спосіб здійснюють наступним чином. У мікропробірці змішують 0,2мл крові з 0,1мл актовегіну, після чого на чисте знежирене предметне скло наносять 50мкл розведеної крові у формі краплини, витримують при 18-20°С впродовж 5-7хв до висихання та визначають під мікроскопом межі утвореного по зовнішньому краю краплини лейко 4 цитарного кільця. На окремі ділянки утвореного лейкоцитарного кільця наносять по 5-8мкл вибраного для дослідження принаймні одного інгредієнта, після чого мікропрепарат досліджують під мікроскопом методом поляризаційної флуоресценції. При цьому реєструють характер світіння ядерної субстанції лейкоцитів, відмічають колір та яскравість. При потребі мікропрепарат фотодокументують, а зміни інтенсивності флуоресценції клітин та спектральний склад їх випромінювання реєструють фотометричним способом, наприклад, з використанням фотоелектронної насадки ФМЭЛ-1. Приклад 1. Із хвостової вени білого щура піпеткою з попередньо набраним актовегіном у кількості 0,1мл відібрали 0,2мл крові, обережно змішали і на чисте знежирене предметне скло нанесли у вигляді краплини 50мкл отриманої розведеної крові. Після 6-хвилинного підсушування при 20°С у мікропрепараті під мікроскопом визначили межі утвореного по зовнішньому краю краплини лейкоцитарного кільця. Як видно з фігур 1 і 2, внесення до нативної крові актовегіну викликало утворення на предметному склі значно ширшого кільця лейкоцитів довкола центрально розміщеної в краплині еритроцитарної маси. При цьому спектральний аналіз (Фіг.3) лейкоцитів виявився ідентичним у контрольному і дослідному (з актовегіном) препаратах (Фіг.3, 1-2), що засвідчило відсутність впливу актовегіну на метаболічні процеси в лейкоцитах, забезпечивши оптимальне для цілей і завдань дослідження їх розміщення по периферії краплини в мікропрепараті. Далі на ділянку лейкоцитарного кільця обережно наслоїли 5мкл інсуліну як дослідного інгредієнта реакції - хімічного подразника. Візуально спостерігали миттєве зростання яскравості флуоресценції лейкоцитів, які зазнали впливу інсуліну (Фіг.4). Проте вже через 20-30с яскравість флуоресцентного світіння стимульованих інсуліном клітин почала різко падати (Фіг.5). Фотометричним аналізом за допомогою фотоелектронної насадки ФМЭЛ-1 зареєстровано швидке зниження інтенсивності флуоресценції лейкоцитів під впливом інсуліну: на 90% упродовж 5 хвилин (Фіг.6). Не торкаючись аналізу конкретних механізмів диференціації лейкоцитів на інсуліночутливі і інсулінорезистентні форми, варто зазначити, що отримані результати вказують на досягнення поставленого завдання високоточного відтворення реакції лейкоцитів на дію хімічного чинника, у даному випадку - інсулін у. Приклад 2. Аналогічним чином були проведені дослідження реакцій лейкоцитів на інші хімічні подразники, зокрема, реамберін, глутаргін, водну витяжку з консервованої ліофільним способом ксеногенної шкіри, тіотриазолін. В усіх випадках були зареєстровані відповідні реакції лейкоцитів у вигляді зміни структури клітин, їх функціональної активності, наприклад, у вигляді реакцій негативного або позитивного хемотаксису, якісних та кількісних змін характеру поляризаційної флуоресценції та ін. З наведених у табл. даних видно, що лейоцитам одного й того ж організму притаманна неоднакова реакція на різні хімічні чинники, показники реакції в кожному випадку можуть мати якісний і кількісний характер. 5 36339 6 Таблиця Характер реакцій лейкоцитів в одній краплині на предметному склі на різні хімічні подразники Хімічний подразСтруктуральні зміни ник Реакція хемотаксису цитоліз глутаргін реамберін консервована ксеношкіра тіотриазолін набряк позитивний негативний ++ ± +++ ++++ +++ + +++ ± Запропонований спосіб забезпечує встановлення і оцінку феномена, який проявляється короткочасним збуренням і наступним виснаженням біоенергетичного потенціалу внутрішньоклітинного метаболізму більшості клітин з однієї проби крові, які слід віднести до індуцибельних, а також в існуванні незначної кількості клітин, резистентних до дії хімічного подразника - індукторезистентних. Важливо при цьому зазначити, що можливість дослідження реакції лейкоцитів в одній краплині на предметному склі не на один подразник, а на декілька суттєво підвищує методичність способу та точність його результатів. Таким чином, запропонований спосіб забезпечує ви щий, ніж за відомим способом-найближчим аналогом, рівень технологічності і точності аналізу, і може знайти використання в широкій клініко Флуоресцентний аналіз Фазність зміни Зміни спектрального інтенсивності складу зплеск-спад ++++ Не визначені +++ ++ +++ ++ ++ лабораторній та науково-експериментальній практиці. Джерела інформації: 1. Методи дослідження ендогенної інтоксикації організму (методичні рекомендації) //Андрейчин М.А., Бе х М.Д., Дем'яненко В.В., Ничик А.З., Ничик Н.А.- Київ, 1998.-С.23-28. 2. Данусевич И.К. Фармакология для хирургов.- Мн: 1985.- 256с. 3. Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки.- М: Наука,-1978.-209с. 4. Дем'яненко В.В., Г удима А.А. Асиметрія поляризаційної флуоресценції ядерної ДНК лейкоцитів як прояв її анізотропії. //Здобутки клінічної та експериментальної медицини. К: Укрмедкнига.2006, №1. –С.38-41. 7 Комп’ютерна в ерстка Л.Литв иненко 36339 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601