Застосування методу тонкошарової хроматографії для визначення ефективності сорбентів для мікотоксинів за умов, наближених до умов травного тракту

1. Застосування методу тонкошарової хроматографії для визначення е фек ти вно сті сор бен ті в для міко токсин і в за умо в, н аближени х до умо в тра вно го тракту, що включа є проведення рідинної хроматогра фії мікотоксинів у тонкому шарі досліджуваного сорбенту, проявлення хроматограми, замір показників хроматографічної рухли вості мікотоксинів та обчислення фактора ємності сорбенту, коефіцієнту розподілення та концентрації мікотоксинів у рідкій фазі після досягнення сорбційної рівноваги. 2. Спосіб за п. 1, в якому як рідку фазу використовують розчини зі значеннями рівня кислотності від 2,0 до 9,0, а хроматографію проводять за температури 35-42°С. Винахід відноситься до методів вивчення фізико-хімічних властивостей сорбентів, що використовуються як засоби профілактики отруєнь токсичними речовинами. Не зважаючи на значні досягнення у створенні засобів попередження контамінації зерна та продуктів його переробки мікотоксинами - токсичними метаболітами мікроскопічних грибів - проблема мікотоксикозів сільськогосподарських тварин залишається актуальною і потребує пошуків доступних шля хів її вирішення. В останні роки у плані профілактики мікотоксикозів особлива увага приділяється пошуку, розробці та впровадженню у практику тваринництва сорбентів - матеріалів, яким притаманна здатність зв'язувати (або поглинати), утримувати та виводити з кишкового тракту мікотоксини. Однією з найважливіших вимог до сорбентів є висока адсорбційна активність по відношенню до мікотоксинів та низька - до корисних сполук (вітамінів, амінокислот тощо). Головним показником, що відображує придатність сорбенту до використання, є його здатність поліпшува ти стан тварин при токсикозі [Avantaggiato G., 2005]. Але випробуванням на тваринах повинні передувати випробування in vitro, метою яких є визначення адсорбційної активності сорбенту відносно сорбатів (речовин, що сорбуються). Єдиним відомим способом оцінювання сорбентів in vitro є вимірювання відсотку адсорбції [Spotti Μ., 2005; Dakovic A., 2005; Desheng Q., 2005; Scheideler S. E., 1993; Dvorak Μ., 1989]. Для знаходження відсотку адсорбції до розчину з певною концентрацією сорбату додають сорбент та через деякий час визначають залишкову концентрацію сорбату. Цей спосіб має два недоліки. Поперше, відсоток адсорбції залежить від концентрації сорбату, що можна надати у вигляді ізотерми адсорбції Фрейндліха, для побудови якої необхідно провести ряд досліджень з різними співвідношеннями сорбенту та сорбату. По-друге, для визначення відсотку сорбції для декількох сполук необхідно використовувати методи кількісного визначення цих сполук у розчині після завершення процесу адсорбції. Для багатьох речовин, які можуть бути об'єктами адсорбції, методи кількісного (19) UA (11) 84894 (13) C2 (21) a200607271 (22) 30.06.2006 (24) 10.12.2008 (46) 10.12.2008, Бюл.№ 23, 2008 р. (72) ТРУФАНОВ ОЛЕГ ВІКТОРОВИЧ, UA, КОТИК АН АТОЛІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, UA (73) ІНСТИТУТ ПТАХІВНИЦТВА УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ Н АУК, U A (56) SU 660653, 05.05.79. UA 4794 U, 15.02.05. Вяхирев Д.А.. Шушунова А.Ф. Руководство по газовой хроматографии. М.: Высшая школа, 1975. UA 80629 C2, 15.06.06. Иванов А.В. и соавт. Нисходящие индуцированные градиенты рН в жидкостной хроматографии со свободной неподвижной фазой. Вестн.Моск.унта, Сер.2. Химия, Т.45, № 4, С.240-245. Зеленкова Н.Ф, и соавт. Анализ вторичных метаболитов микроскопических грибов рода хроматог 3 84894 визначення є складними та мають високу собівартість. Тому актуальним питанням є пошук нових шляхів для оцінювання ефективності сорбентів. Мета винаходу полягає у створенні інформативного та простого у використанні способу для оцінювання спорідненості досліджуваного сорбенту до широкого спектру сорбатів, серед яких можуть бути як шкідливі (токсини), так і корисні сполуки (поживні речовини, лікарські засоби тощо), а також для порівняння здатності різних сорбентів до адсорбції певної речовини. Поставлена мета досягається проведенням рідинної хроматографії досліджуваних сполук у тонкому шарі досліджуваного сорбенту, замірювання хроматографічної рухливості цих сполук та вираховування фактору ємності сорбенту k' і коефіцієнту розподілення К. На відміну від відсотку адсорбції, фактор ємності та коефіцієнт розподілення не залежать від концентрацій сорбату та сорбенту. Знаходження цих показників не потребує застосування методів кількісного визначення досліджуваних сполук, а здійснюється шляхом хроматографії. Спосіб ґрунтується лише на якісному проявленні хроматографічних пластинок. У якості рідкої фази використовують водний розчин, близький за складом та властивостями до середовища, у якому має відбува тися адсорбція. Хід роботи 1. Приготування тонкого шару сорбенту. На скляну пластинку розміром 10х15см наносять певну кількість сухого досліджуваного сорбенту та рівномірно розподіляють по поверхні за допомогою шпателя або скляної палички. Товщина шару може бути від 0,25 до 1мм в залежності від діаметру частинок сорбенту. По краях скляної пластинки лишають вільні від сорбенту смужки шириною 57мм. 2. Хроматографія досліджуваних сорбатів. Розчини стандартів досліджуваних сорбатів наносять на стартову лінію на відстані 15мм від нижнього краю. Об'єм та концентрацію досліджуваного сорбату для нанесення на пластинку визначають експериментальне, керуючись літературними даними щодо межі виявлення даної сполуки. Пластинку розміщують у камері для хроматографії під кутом 10-15° до поверхні рідкої фази таким чином, щоб нижній край пластинки був занурений у неї, але контакту зразків безпосередньо з рідкою фазою було уникнуто. Для моделювання умов, у яких відбуватиметься адсорбція у травному тракті, у якості рідкої фази доцільно використовувати буферні розчини з певним рівнем кислотності (від 2,0 до 9,0), та проводити хроматографію за температури 35-42°С. 3. Якісне виявлення досліджуваних сполук. Після досягнення фронтом рідкої фази лінії фінішу (5-10мм від верхнього краю пластинки), пластинку з сорбентом висушують та проявляють. 4. Замірювання хроматографічної рухливості та обчислення результатів. Замірюють відстань від лінії старту до лінії фінішу (L) та відстань від точки нанесення зразку до центру зони (l). Хрома 4 тографічну р ухливість (Rf) розраховують за формулою: l Rf = . L Фактор ємності k та коефіцієнт розподілення К розраховують за формулами [Snyder L. R., 1968]: 1 - Rf k' k' = та K = , де Rf c/ e c - частка об'єму сорбенту, яка припадає власне на сорбент; e - частка об'єму сорбенту, яка припадає на пустоти. Значення c та e знаходять експериментальне шляхом вимірювання об'єму рідкої фази, що поглинається кількістю сорбенту, який займає відомий об'єм. Знаючи коефіцієнт розподілення К та початкову концентрацію сорбату у рідкій фазі С 0, знаходять концентрацію сорбату у рідкій фазі С після досягнення процесом сорбції стану рівноваги за формулою [Сакодынский Е.И., Бражников В.В., 1993]: C0 C= 1+ K Таким чином, застосування техніки тонкошарової хроматографії для оцінювання сорбентів дає змогу змоделювати процес сорбції досліджуваної речовини у кишковому тракті для широкого діапазону значень її початкової концентрації, не застосовуючи методів кількісного визначення. Література: 1. Сакодынский Е.И., Бражников В.В., Волков С.А., Зельвенский В.Ю., Ганкина Э.С., Шатц В.Д. Аналитическая хроматография. - М.: Химия, 1993. - 464 с. 2. Avantaggiato G., Solfrizzo Μ., Visconti A. Recent advances on the use of adsorbent materials for detoxification of Fusarium mycotoxins. Food Addit Contam. 2005 Apr; 22 (4):379-88. 3. Dakovic A., Tomasevic-Canovic М., Dondur V., Rottinghaus G. Е., Medakovic V., Zaric S. Adsorption of mycotoxins by organozeolites. Colloids Surf В Biointerfaces. 2005 Nov 25;46(1):20-5. Epub 2005 Sep 28. 4. Desheng Q., Fan L., Yanhu Y., Niya Z.. Adsorption of aflatoxin Bl on montmorillonite. Poult Sci. 2005 Jun; 84(6):959-61. 5. Dvorak М. Ability ofbentonite and natural zeolite to adsorb aflatoxin from liquid media. Vet Med (Praha). 1989 May;34(5):307-16. 6. Scheideler SE. Effects of various types of aluminosilicates and aflatoxin В 1 on aflatoxin toxicity, chick performance, and mineral status. Poult Sci. 1993 Feb;72(2):282-8. 7. Snyder L.R. Principles of adsorption chromatography. Dekker: New York. 1968. 8. Spotti Μ., Fracchiolla Μ.L., Arioli F., Caloni F., Pompa G. Aflato xin Bl binding to sorbents in bovine ruminal fluid. Vet Res Commun. 2005 Aug; 29 (6):507-15. 5 Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 84894 6 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601