Спосіб визначення в кормах мікотоксинів із групи 12,13-епокси-d9-трихотеценів

Спосіб визначення в кормах мікотоксинів із групи 12,13-епокси-D9 -трихотеценів, що включає екстракцію досліджуваної проби, тонкошарову хроматографію екстракту, нанесення на хроматографічну пластинку агаризованого поживного середовища та біоавтографічне виявлення мікотоксинів за допомогою штаму Candida pseudotropicalis 44 пк, який відрізняється тим, що в поживне середовище для тесторганізму вносять α-нафтил ацетат у концентрації 0,16 г/л середовища. Винахід відноситься до методів визначення токсичних речовин з використанням чутливи х тесторганізмів. З метою визначення токсичних речовин у різних субстратах використовують біологічні, імунологічні, хімічні та фізико-хімічні методи аналізу. Біологічні методи аналізу, на відміну від інших, дають змогу безпосередньо оцінити рівень токсичності досліджуваного зразка. Недоліком біологічних методів є порівняно низька чутли вість. Мікотоксини з групи 12,13-епокси-D9-трихотеценів відносяться до сполук, що істотно забруднюють зерно і продукти його переробки. Одними із найбільш поширених трихотеценових мікотоксинів типу А на території України є Т-2 токсин та його метаболіт НТ-2 токсин [2, 3]. На сьогодні відома досить велика кількість біологічних методів оцінювання загальної токсичності та вмісту трихо теценових мікотоксинів у харчових та кормових субстрата х [4, 5, 6, 7, 8]. У нашій країні довгий час головним арбітражним методом залишалася шкіряна проба на кролях. Методи з використанням чутливи х до трихотеценових мікотоксинів дріжджів активно розроблюються та широко використовуються за кордоном [5, 6]. Недоліком більшості з цих методів є неспроможність до якісного визначення токсичного фактору. Тому виникло питання про вдосконалення біоавтографічного методу визначення трихотеценових мікотоксинів типу А, що дає змогу виявляти ці сполуки як кількісно, так і якісно. Найближчим аналогом є спосіб визначення у кормах мікотоксинів із групи 12.13-епокси-D9трихотеценів [1]. За вказаним способом мікотоксини з групи 12,13-епокси-D9-трихотеценів визначають шляхом нанесення екстракту досліджуваної проби на хроматографічну пластинку, з подальшим розділенням компонентів проби у системі розчинників, нанесенням на пластинку агарного поживного середовища та виявленням мікотоксинів за допомогою чутливого штаму Candida pseudotropicalis 44 пк. Якісним показником служить хроматографічна рухливість (Rf), а кількісним - діаметр зони затримки росту. Метод є простим, економічним та інформативним. Недоліком методу є його недостатня чутливість у порівнянні з імунологічними та фізико-хімічними методами, що використовуються для аналізу 12,13-епокси-D9-трихотеценів. Внаслідок цього не завжди є можливим визначення мікотоксинів, (19) UA (11) 80629 (13) C2 (21) a200601201 (22) 07.02.2006 (24) 10.10.2007 (72) ТРУФАНОВ ОЛЕГ ВІКТОРОВИЧ, U A (73) ІНСТИТУТ ПТАХІВНИЦТВА УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ Н АУК, U A (56) SU A 1 1424494, 15.08.1989. SU A2 660653, 05.05.1979. SU A1 1508574, 07.01.1991. Binder J. A yeast bioassay for trichothecenes. Nat Toxins. 1999; 7(6):401-6 (ABSTRACT). Kathryn H. Engler et al.: "A colorimetric technique for detecting trichothecenes and assessing relative potencies", Applied and environmental microbiology, Ma y 1999, p. 1854-1857. Widestrand J. et al.: "A rapid and sensitive cytoto xicity screening assay for trichothecenes in cereal 3 80629 4 присутніх у зразках зерна у кількостях, що спостерігаються при вирощуванні дріжджів С. спричиняють погіршення його якості. pseudotropicalis 44пк на звичайному середовищі та Мета винаходу - підвищення чутливості середовищі, що містить 0,16г/л a-нафтил ацетату. методу визначення мікотоксинів із групи 12,131 - лінія регресії для НТ-2 токсину, звичайне епокси-D9-трихотеценів. середовище; Поставлена мета досягається модифікацією рівняння регресії: у = 490,6e0,11x; коефіцієнт апроксимації: R2 = 0,99. поживного середовища шляхом внесення a2 - лінія регресії для НТ-2 токсину, нафтил ацетату, що знижує стійкість тесторганізму Candida pseudotropicalis 44 пк до 12,13середовище з a-нафтил ацетатом; рівняння регресії: у = 48, Se 0,17x; епокси-D9-трихотецешв. коефіцієнт апроксимації: R = 0,98. Спосіб здійснюється таким чином. 1. Екстракція та очищення екстракту. Беруть 3 - лінія регресії для Т-2 токсину, звичайне середовище; 25г розмеленого зерна або комбікорму, вносять у рівняння регресії: у = 21,6e0,15x; конічну колбу ємністю 500мл, добавляють 20мл 10 коефіцієнт апроксимації: R2 = 0,99. %-ного розчину Nad і перемішують. Потім додають 4 - лінія регресії для Т-2 токсину, середовище 120мл ацетону і суміш струшують протягом 1год., після чого фільтрують через паперовий фільтр. До з а-нафтил ацетатом; рівняння регресії: у = 4,0e 0,16x; 100мл фільтрату додають 20мл 15 %-ного розчину коефіцієнт апроксимації: R2 = 0,97. ацетату свинцю і 30мл води, перемішують і Числовий коефіцієнт, що міститься у рівнянні витримують протягом 10хв. Потім фільтрують, регресії біля числа е, вказує на зміщення точок та 120мл фільтрату вносять у ділильну лійку, додають 40мл гексану, струшують і після лінії тренду відносно осі Y (вертикальної): чим менше значення цього коефіцієнту, тим меншою є розподілу фаз відділяють нижній водномаса токсину, що потрібна для затримки росту ацетоновий шар. До водно-ацетонового шару тест-організму, тобто тим вище чутли вість методу. додають двічі по 20мл гексану, кожен раз Шляхом знаходження числового значення струшуючи, і після розподілу фаз вилучають верхній шар (гексан). Потім до водно-ацетонового відношення цього коефіцієнту у рівнянні лінії регресії, що відображує діаметри зон на екстракту у ділильну лійку двічі додають по 40мл звичайному середовищі, до відповідного хлороформу; кожного разу стр ушують і для коефіцієнту на модифікованому середовищі, подальшого аналізу після розподілу фаз знаходять у скільки разів підвищується чутливість відбирають нижній шар (хлороформ). Хлороформові екстракти об'єднують, додають 5-7г методу: по відношенню до Т-2 токсину у - 5,4 рази (21,6 : 4,0 = 5,4), а до НТ-2 токсину - приблизно у безводного сірчанокислого натрію, струшують і залишають на 10хв. Розчин фільтрують, фільтрат 10,1 рази (490,6 : 48,8 » 10,1). впарюють. Сухий залишок розчиняють в 1-2 мл 4. Визначення концентрації Т-2 та НТ-2 бензолу, впарюють, а залишок розчиняють в токсинів у досліджуваному субстраті. Кількість Т-2 100мкл бензолу. чи НТ-2 токсину в пробі визначають за формулою: 2. Хроматографія та біоавтографічне 2 ´ 100 ´ B X= , де виявлення Т-2 та НТ-2 токсинів. У розплавлене 25 ´ A агарне поживне середовище додають розчин аХ - концентрація Т-2 чи НТ-2 токсину в пробі нафтил ацетату у такій кількості, щоб кінцева його (мкг/кг); концентрація у середовищі становила 0,16г/л. А - кількість екстракту, нанесеного на На хроматографічні пластинки наносять 5пластинку (мкл); 50мкл екстракту досліджуваних зразків та 10нг Т-2 В - кількість Т-2 або НТ-2 токсину (нг), що і 100нг НТ-2 токсину (у якості речовин-свідків). Далі відповідає величині зони відсутності росту тестпластинки хроматографують у системі розчинників мікроорганізму; етилацетат-толуол 3:1 та висушують. Після цього 100 - об'єм екстракту (мкл); на контрольні пластинки наносять звичайне агарне 25 - маса проби (г); поживне середовище, вільне від а-нафтил 2 - коефіцієнт, що вра ховує втрати ацетату, а на дослідні - середовище, що містить aмікотоксинів у процесі екстракції і очищення. нафтил ацетат у концентрації 0,16г/л. На При наявності 2-х або більше повторних зон пластинки наносять водну емульсію клітин відсутності росту тест-мікроорганізму, розрахунок дріжджів штаму Candida pseudotropicalis 44пк та проводять окремо по кожній зоні, а потім витримують 18-20 годин при температурі 32°С, обчислюють середньоарифметичне значення. після чого реєструють характер росту тестДжерела інформації: організму, замірюючи діаметр зон затримки росту, 1. Авторское свидетельство СССР № 660653, що спостерігається за наявності Т-2 або НТ-2 кл. А23К1/00, G 0 IN 33/02, 1979. токсину. 2. Труфанова В. А. Частота контамінації 3. Визначення маси Т-2 та НТ-2 токсинів, що мікотоксинами кормів для птиці //Ветеринарна були нанесені на пластинку для хроматографії. медицина України. - 2004. - № 9. - с. 26-28. Масу Т-2 чи НТ-2 токсину, що викликає зону 3. Труфанов О. В. НТ-2 токсин затримки росту, визначають за формулами ліній распространенный фактор загрязнения зерна в регресії, що виражають залежність між масою Т-2 Украине // Птахівництво: Міжвід. темат. наук. зб. чи НТ-2 токсину та діаметром відповідних зон. На ЛП УААН. - Харків, 2005. - Вип. 57. - С. 500. малюнку наведено лінії та рівняння регресії для цих мікотоксинів та діаметрів зон, що 5 80629 4. Babich H., Borenfreund E.. Cytotoxicity of T-2 Toxin and Its Metabolites Determined with the Neutral Red Cell Viability Assay //Applied and environmental microbiology. - 1991. -Vol. 57. - P. 2101-2103. 5. Binder J. A yeast bioassay for trichothecenes //Natural Toxins. - 2000. -Vol. 7.-P. 401-406. 6. Engler К. H., Coker R. D., Evans I. H. A colorimetric technique for detecting trichothecenes and assessing relative potencies //Applied and environmental microbiology. - 1999. -Vol. 65. -P. 1854-1857. 7. Widestrand J., Lundh Т., Pettersson H., Lindberg J. E.. A rapid and sensitive cytoto xicity screening assay for trichothecenes in cereal samples //Food and Chemical Toxicology. - 2003 - Vol. 41 - P. 1307-1313. 8. Yike I., Allan Т., Sorenson W. G., Dearborn D. G. Highly sensitive protein translation assay for trichothecene toxicity in airborne particulates: comparison with cytotoxicity assays //Applied and environmental microbiology - 1999. - Vol. 65.-P. 8894. 6