Спосіб отримання мутантних генотипів соняшника

Спосіб отримання мутантних генотипів соняшника, який включає виділення незрілих сім'янок з суцвіть лінійних зразків, їх обробку хімічним мутагеном, виділення з сім'янок і посадку незрілих зародків на поживне середовище для їх подальшого розвитку, висадку одержаних з незрілих зародків рослин М1 у ґрунт, одержання насіння з рослин покоління М1, посів цього насіння для одержання покоління М2, оцінку та добір рослин зі зміненими або новими ознаками в поколінні М2, ізоляцію виділених в поколінні М2 мутантних рослин та одержання з них насіння, який відрізняється тим, що з суцвіть лінійних зразків виділяють сім'янки через 915 днів після запліднення, обробляють їх при температурі 18-25 °С хімічним мутагеном етилметансульфонатом у концентрації 0,02 % впродовж 16 годин, промивають водою, а виділені з сім'янок незрілі зародки 9-15-денного віку культивують на модифікованому поживному середовищі МурасігеСкуга до стадії рослин, при цьому поживне середовище має половинний вміст неорганічних солей та підвищений в два рази вміст вітамінів. (19) UA (11) (21) a200910096 (22) 05.10.2009 (24) 25.07.2011 (46) 25.07.2011, Бюл.№ 14, 2011 р. (72) СОРОКА АНАТОЛІЙ ІВАНОВИЧ, ЛЯХ ВІКТОР ОЛЕКСІЙОВИЧ (73) ІНСТИТУТ ОЛІЙНИХ КУЛЬТУР УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК, СОРОКА АНАТОЛІЙ ІВАНОВИЧ (56) Моргун В. В., Логвиненко В. Ф. Мутационная селекция пшеницы. - ред. С. М. Гершензон. - Киев: Наукова думка, 1995. - 628 с. Lyakh V., Soroka A., Vasin V. Influence of mature and immature sunflower seed treatment with ethylmethanesulphonate on mutation spectrum and frequency // Helia. - 2005. - 28, № 43. – С. 87-98 Taregyan M. R., Mortimer A. M., Putwain P. D., Collin H. A. Selection for resistance to the herbicide imazethapyr in somaclones of soyabean // Weed Res. - 2001. - 41, № 2. - C. 143-154. Murashige J., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. - 1962. - 15, - С. 473-497. Васін В. А. Генетична мінливість соняшника при обробці етилметансульфонатом зрілого та незрілого насіння, Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук, Київ 2008 Васін В. А. та ін. Відмінності у будові епідерми листка вихідної та мутантної ліній соняшника, ВІС C2 2 95344 1 3 віку. Недоліком даного способу є те, що він дозволяє лише добирати гетерозиготні генотипи бекросних рослин на ранніх стадіях дозрівання насіння [4]. Для одержання нового селекційного матеріалу соняшника використовують також біотехнологічні методи. Зокрема, можливо отримувати новий вихідний матеріал за рахунок використання явища сомаклональної мінливості. Однак цей метод поки що не знайшов широкого застосування в зв'язку з нестабільністю одержання позитивного результату та складністю регенерації цілісних рослин з генетично змінених клітин в культурі in vitro [5]. Для одержання нових генотипів використовують біотехнологічний метод культури пиляків, недоліком якого є те, що він потребує спеціального обладнання та реактивів високої вартості, є досить трудомістким та малоефективним [6]. Відомі методи розширення генетичної мінливості з використанням міжвидової та міжродової гібридизації. Однак широке застосування методів в цьому випадку стримується високим ступенем стерильності міжвидових та міжродових гібридів, а також досить тривалим часом одержання константного матеріалу [7]. Відоме штучне поживне середовище МурасігеСкуга (МС), яке широко використовується для культури тканин і клітин in vitro. Проте дане середовище мало придатне для культивування зародків рослин, оскільки містить занадто високий вміст мінеральних солей та недостатню кількість вітамінів [8]. Метою винаходу є одержання мутантних генотипів соняшника з новими ознаками. Поставлена задача досягається тим, що в способі отримання мутантних генотипів соняшника, який включає виділення незрілих сім'янок з суцвіть лінійних зразків, їх обробку хімічним мутагеном, виділення з сім'янок і посадку незрілих зародків на поживне середовище для їх подальшого розвитку, висадку одержаних з незрілих зародків рослин М1 у ґрунт, одержання насіння з рослин покоління М1, посів цього насіння для одержання покоління М2, оцінку та добір рослин зі зміненими або новими ознаками в поколінні М2, ізоляцію виділених в поколінні М2 мутантних рослин та одержання з них насіння, відповідно до винаходу, з суцвіть лінійних зразків виділяють сім'янки через 915 днів після запліднення, обробляють їх при температурі 18-25 °C хімічним мутагеном етилметансульфонатом у концентрації 0,02 % впродовж 16 годин, промивають водою, а виділені з сім'янок незрілі зародки 9-15 - денного віку культивують на модифікованому поживному середовищі МС до 95344 4 стадії рослин, при цьому поживне середовище має половинний вміст неорганічних солей та підвищений в два рази вміст вітамінів. Спосіб здійснюють таким чином. З суцвіть лінійного матеріалу соняшника виділяють сім'янки через 9-15 днів після самозапліднення, вміщують їх в марлеві мішечки та опускають у водний 0,02 % розчин етилметансульфонату (ЕМС) при кімнатній температурі, періодично помішуючи. Через 16 годин сім'янки в мішечках виймають з розчину мутагену, промивають у проточній воді та поверхнево стерилізують. Звільнені від насіннєвої оболонки незрілі зародки 9-15-денного віку асептично культивують на штучному поживному середовищі МС з половинним вмістом неорганічних солей та підвищеним в два рази вмістом вітамінів за стандартними умовами. Після формування повноцінних рослин покоління М1 їх пересаджують у ґрунт, провівши попередню акліматизацію. Перед цвітінням рослини ізолюють для наступного самозапилення, під час цвітіння їх при необхідності доопилюють вручну. Після настання фізіологічної стиглості проводять збір насіння з кожної рослини М1 індивідуально. Насіння кожної рослини М1 висівають посімейно для отримання покоління М2. Під час вегетації, починаючи зі стадії сходів, проводять ретельну оцінку рослин М2, відмічаючи рослини зі зміненими або новими ознаками та ізолюють їх перед цвітінням з метою отримання насіння. Після настання фізіологічної стиглості проводять збір насіння з цих рослин. Отримане насіння буде представляти собою мутантний матеріал з новими ознаками. З метою демонстрації ефективності запропонованого методу в Інституті олійних культур УААН в 2006-2008 рр. були проведені наступні дослідження. Рослини двох ліній соняшника - ЗЛ-809 та ЗЛ-95 вирощували до стадії цвітіння. Після самозапилення незрілі сім'янки двох варіантів - 9-10 та 14-15-денного віку обробляли етилметансульфонатом в концентрації 0,02 %, промивали, виділяли зародки та висаджували їх на модифіковане штучне поживне середовище, де і пророщували. В контролі сім'янки 9-10 та 14-15денного віку перед посадкою на середовище мутагенами не обробляли. Після одержання рослин покоління М2 виявляли частоту морфологічних мутацій за стандартними методиками. Як видно з таблиці, обробка незрілих зародків 9-15-денного віку призводила до появи значної кількості морфологічних змін, яка варіювала від 15,4 до 46,7 % у різних генотипів. При цьому різниця у віці зародків між 9-10 та 14-15 днів не була суттєвою. 5 95344 6 Таблиця Частота морфологічних мутацій в М2 після обробки етилметансульфонатом (ЕМС) у концентрації 0,02 % незрілих зародків соняшника Лінія ЗЛ-95 ЗЛ-809 Варіант Контроль (зародки 9-10-денного віку без обробки ЕМС) Контроль (зародки 14-15-денного віку без обробки ЕМС) Обробка ЕМС (зародки 9-10-денного віку) Обробка ЕМС (зародки 14-15-денного віку Контроль (зародки 14-15-денного віку без обробки ЕМС) Обробка ЕМС (зародки 14-15-денного віку Обробка незрілих зародків етилметансульфонатом призвела до появи досить широкого спектра нових ознак, відсутніх в контролі. Так, були виділені мутації сім'ядолей, листків, стебла, кошика, насіння. Наприклад, у варіантах обробки з'являлися рослини з листком-трубкою, зміненим габітусом та інші. Отримані дані свідчать про суттєвий вплив мутагену при обробці ним незрілих зародків на частоту морфологічних змін в М2 у соняшника, що суттєво збільшує генетичну мінливість цієї культури. Це може бути пов'язано з тим, що на стадії незрілих зародків активність генів значно вища ніж на стадії зрілого насіння. Отже вперше на селекційно-цінному матеріалі соняшника встановлено суттєвий вплив мутагену ЕМС при обробці ним незрілих зародків 9-15денного віку на частоту мутацій в М2. Даний спосіб дозволяє отримувати генотипи рослин з новими ознаками, й тим самим збільшувати генетичну мінливість, зокрема у соняшника. Джерела інформації: 1. Моргун В. В., Логвиненко В. Ф. Мутационная селекция пшеницы. - ред. С. М. Гершензон. - Киев: Наукова думка, 1995.-628 с. 2. Jambhulkar, S. G., Joshua, D. С, 1999. Induction of plant injury, chimera, chlorophyll and Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Частота мутацій, % 0 0 46,7 43,7 0 15,4 morphological mutations in sunflower using gamma rays. Недіа 31:63-74. 3. Lyakh V., Soroka A., Vasin V. Influence of mature and immature sunflower seed treatment with ethylmethanesulphonate on mutation spectrum and frequency // Helia.-2005.-28, № 43. - С 87-98. 4. Патент РФ RU 2151494 С1 / Клас А01Н 1/00, 2000. Ефименко С. Г. Способ получения изогенной линии по доминантному признаку семени у растений. 5. Taregyan M. R., Mortimer A. M., Putwain P. D., Collin H. A. Selection for resistance to the herbicide imazethapyr in somaclones of soyabean // Weed Res.-2001.-41, № 2. - C. 143-154. 6. Vasic D., Skoric D., Jocic S. Anther culture of sunflower cultivars // 15th International Sunflower Conference, Toulouse - France, 2000: Actes proceedings. - V. 2. 7. Christov M., Vassilevska-Ivanova R., Cekova Z., Lidansky T. Interspecific hybridization between cultivated sunflower H. annuus L. and some H. smithii // Докл. Бълг. AH.-1999.-52, № 5-6. - С 97-100. 8. Murashige J., Skoog F. A revised medium for rapid growthand bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant.-1962.-15, - С 473-497. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601