Спосіб детекції генотипів соняшника, стійких до вовчка

Спосіб детекції стійких до вовчка генотипів соняшника, що включає оцінку стійкості інбредних ліній і гібридів соняшника до вовчка, який відрізняється тим, що здійснюється за допомогою електрофоретичного аналізу продуктів ампліфікації ДНК за мікросателітним локусом геному соняшника ORS 1036 та ідентифікації тестованого генотипу як стійкого до вовчка рас А, В, С при наявності в спектрі ДНК алеля розміром 242 пари нуклеотидів, тобто маркера ORS 1036_242. (19) (21) u201007894 (22) 24.06.2010 (24) 25.01.2011 (46) 25.01.2011, Бюл.№ 2, 2011 р. (72) СОЛОДЕНКО АНЖЕЛЛА ЄВГЕНІВНА, ТРОЯНОВСЬКА АЛІНА В'ЯЧЕСЛАВІВНА, СИВОЛАП ЮРІЙ МИХАЙЛОВИЧ (73) ПІВДЕННИЙ БІОТЕХНОЛОГІЧНИЙ ЦЕНТР В РОСЛИННИЦТВІ УААН 3 56691 В основу винаходу поставлено задачу оцінки стійкості інбредних ліній і гібридів соняшника до вовчка шляхом аналізу спектрів ДНК, ампліфікованої за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, за мікросателітним локусом ORS 1036, що дозволить встановлювати наявність генів стійкості у генотипів соняшника у скорочений термін незалежно від стадії розвитку рослини. Поставлена задача вирішується за допомогою електрофорезу в 10 % поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації ДНК мікросателітного локуса генома соняшника ORS 1036 та ідентифікації аналізуємого генотипа як стійкого до вовчка рас А, В, С при наявності в спектрі ДНК алеля розміром 242 пари нуклеотидів - ORS 1036 242. Відмінними від прототипів ознаками в корисній моделі, що заявляється, є: - можливість проводити оцінку стійкості генотипа на будь-якій стадії онтогенезу рослини, - показник, що дозволяє детектувати стійкі генотипи. Спосіб забезпечує високу точність, надійність та об'єктивність детекції стійких генотипів. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак та досягнутим результатом (підвищення точності, надійності та об'єктивності оцінки стійкості) можна пояснити так. ПЛР-аналіз мікросателітного локусу ORS 1036, який є зчепленим в геномі соняшника з локусами Or, що контролюють стійкість до різних рас вовчка, дозволяє отримувати кодомінантний ДНК-маркер. Алель розміром 242 пари нуклеотидів (маркер ORS 1036_242) є характерним для стійких генотипів, тобто є зчепленим з домінантними алелями локусу Or3. При наявності в спектрі ампліфікації за мікросателітним локусом ORS 1036 хоча б одного алеля розміром 242 пари 4 нуклеотидів (тобто при детекції маркера ORS 1036_242) аналізуємий генотип соняшника можливо ідентифікувати як стійкий до вовчка рас А, В, С. Спосіб здійснюється таким чином. 1. Виділення ДНК. Сегменти насіння, паростків, листків або коріння соняшника гомогенізувати в 1.5 мл-пробірках в лізуючому буфері (20.0 мМ Na3EDTA, 0.1 М тріс-НСl рН 8.5 при 25 °С, 1.4 М NaCl, 2.0 % СТАВ) до повної мацерації тканин. Лізат інкубувати 45 хв. при 60 °С. Додати рівний об'єм суміші хлороформізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішати до утворення білої емульсії. Центрифугувати 5 хв. при 14000 об./хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415", водну фазу перенести в чисті пробірки та додати рівний об'єм ізопропілового спирту, перемішати, осадити ДНК центрифугуванням при 10000 об./хв. протягом 4 хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осадок промити двічі 0.5 мл 70 % етанола, центрифугувати при 10000 об./хв. протягом 4 хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осадок ДНК підсушити при кімнатній температурі 15 хв. та розчинити в 0.3 мл ТЕ-буферу (10.0 мМ трис-НСl, 1.0 мМ ЕДТА). 2. Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР проводити на приладі "Терцик" ("ДНК-технологія", Росія). Вміст реакційної суміші для проведення ПЛР об'ємом 20 мкл: 50 мМ КСl, 20 мМ тріс-НСl (рН 8,4 при 25 °С), 0,01 % Tween20, 2 мМ MgCl2, 0,2 мкМ кожного праймеру, 200 мкМ кожного dNTP, 10 нг геномної ДНК, 1 одиниця активності ДНК-полімерази Taq. Ампліфікація (35 циклів): денатурація при 94 °С на першому циклі 2 хв., далі - 40 с.; відпал при 55 °С 30 с.; синтез при 72 °С 2 хв.; остання елонгація 5 хв. В таблиці наведено інформацію про послідовності праймерів для ампліфікації ДНК за мікросателітним локусом ORS 1036. Таблиця Праймери для аналізу алельного складу за мікросателітним локусом ORS 1036 П З Послідовність прямого (П) та зворотнього (З) праймерів (5'-3') СССТТТСАСТТССТАТТТТСТАТТСА CTAAGAGGGGTCGGTATGATTTC 3. Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Оцінювати продукти ампліфікації (10 мкл-аліквоту ПЛР-суміші) у 10 % денатуруючому поліакриламідному гелі. Склад гелю: 10 % акриламід, 7 М мочевина, 1 х ТВЕ-буфер (50 мМ тріс-Н3ВО3, 2 мМ ЕДТА, рН 8.0). Умови електрофорезу: напруга 500 V протягом 120 хв. при 65 °С. Для приготування одного гелю необхідно змішати 12.5 мл 8 М сечовини, 12.5 мл розчину 30 % поліакриламіду з 8 М сечовиной, 2.5 мл 10 х ТВЕбуферу, 25 мкл ТМЕД, 50 мкл 10 % ПСА. Для контролю за просуванням фрагментів ДНК в гелі зразок змішати з 1 мкл денатуруючого буфера для нанесення (98 % формамід, 10 мМ ЕДТА рН 8.0, 0.2 % (w/v) бромфеноловий синій, 0.2 % (w/v) ксиленціанол) та денатурувати протягом 1.5 хв. при 95 °С, після чого швидко охолодити на льодяній бані та за допомогою шприця нанести в лунку гелю. Одна доріжка гелю повинна містити зразок ДНК з відомою молекулярною вагою. Як стандарт молекулярної маси використовувати ДНК pUC 19, рестриктовану Msp I. 4. Візуалізація продуктів ампліфікації. Поліакриламідний гель фарбувати відповідно до методики: гель покласти на 5 хв. у 10 % етанол, перенести у 1 % HNO3 на 3 хв. Гель промити кілька разів дистильованою водою. Витримати 20 хв. у 0.012 М AgNO3 у темряві, промити кілька разів дистильованою водою. Інкубувати гель у відновлюючому розчині (0.28 М Na2CO3 (безводний), 0.019 % формалін), змінюючи розчин у кожному разі його потемніння, до появи забарвлення фрагментів ампліфікації. Промити кілька разів бідистильованою водою. Гелі зберігати між двома листами прозорої поліетиленової плівки. 5. Документування отриманнях електрофореграм. Документувати отримані електрофореграми відеосистемою VDS ("Amersham Pharmacia 5 56691 Biotech"). Розміри апелів мікросателітного локусу ORS 1036 встановлювати за допомогою комп'ютерної програми "Image Master ID Elite" згідно стандарта молекулярної ваги. 6. Оцінка стійкості генотипу соняшника до вовчка. За результатами ПЛР-аналізу мікросателітного локуса ORS 1036 встановити характерний для тестуємого генотипу набір апелів. Наявність хоча б одного апеля розміром 242 пари нуклеотидів (тобто маркера ORS 1036_242) буде свідчити про те, що даний генотип соняшника можливо ідентифікувати як стійкий до вовчка рас А, В, С. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1. Оцінка стійкості інбредної лінії соняшника Одеська 3369 до вовчка. Для дослідження брали насіння інбредної лінії Одеська 3369, виділяли ДНК, проводили електрофорез у 10 % поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації за мікросателітним локусом ORS 1036. Інбредна лінія Од1036 є гомозиготною за даним локусом, в ДНК-спектрі виявлено один фрагмент розміром 242 пари нуклеотидів, тобто маркер ORS 1036_242 (рис. 1: доріжка 1 - ДНК інбредної лінії соняшника Одеська 3369, М - маркер молекулярної ваги). Висновок: інбредна лінія соняшника Одеська 3369 містить в своєму генотипі домінантні алелі гена Or та є стійкою до вовчка рас А, В, С. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 6 Приклад 2. Оцінка стійкості інбредної лінії соняшника Одеська 7В до вовчка. Для дослідження брали насіння інбредної лінії Одеська 7В, виділяли ДНК, проводили електрофорез у 10 % поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації за мікросателітним локусом ORS 1036. Інбредна лінія Одеська 7В є гомозиготною за даним локусом, в ДНК-спектрі виявлено один фрагмент розміром 252 пари нуклеотидів, тобто маркер ORS 1036_252 (рис. 1: доріжка 2 - ДНК інбредної лінії соняшника Одеська 7В, М - маркер молекулярної ваги). Висновок: інбредна лінія соняшника Одеська 7В містить в своєму генотипі рецесивні алелі гена Or та є нестійкою до вовчка. Приклад 3. Оцінка стійкості гібриду соняшника З года до вовчка. Для дослідження брали насіння гібриду соняшника Згода, виділяли ДНК, проводили електрофорез у 10 % поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації за мікросателітним локусом ORS 1036. Гібрид Згода є гетерозиготним за даним локусом, в ДНК-спектрі виявлено два фрагмента розмірами 242 пари нуклеотидів та 252 пари нуклеотидів, тобто маркер ORS 1036_242 та маркер ORS 1036_252 (рис. 1: доріжка 3 - ДНК гібриду соняшника Згода, М - маркер молекулярної ваги). Висновок: гібрид соняшника Згода містить в своєму генотипі домінантний та рецесивний алелі гена Or та є стійким до вовчка рас А, В, С. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601