Спосіб ідентифікації стійких до вовчка генотипів соняшника

Спосіб ідентифікації стійких до вовчка генотипів соняшника, що включає оцінку СТІЙКОСТІ інбред них ЛІНІЙ і гібридів соняшника до "молдавської" раси вовчка, який відрізняється тим, що спосіб здійснюють за допомогою електрофорезу в 10 % поліакриламщному гелі продуктів ампліфікації ДНК локусу генома соняшника RTS 29 та ідентифікації аналізованого генотипу як стійкого до вовчка при наявності в спектрі ДНК алеля з молекулярною вагою 320 пар нуклеотидів - RTS 29_320 Корисна модель належить до бютехнологи, а саме до використання ДНК-маркерів в селекції та насінництві соняшника Наявність ознаки СТІЙКОСТІ ДО вовчка (Orobanche cumana) є обов язковою при реєстрації гібридів соняшника На виробничіх посівах соняшника в Україні вовчок представлено, в основному, "молдавською" расою, СТІЙКІСТЬ ДО якої повязана зі специфічною захисною реакцією в сосудах коренів та контролюється одним домінантним геном Основним способом оцінки СТІЙКОСТІ соняшника до вовчка є метод ранньої діагностики [Панченко А Я Ранняя диагностика заразихоустойчивости при селекции и улучшающем семеноводстве подсолнечника // Вестник с-х науки - 1975 - №2 с 107-115] За даним способом рослини соняшника піддають зараженню вовчком в ящиках з пісочно-грунтівною сумішшю, вирощують 25 днів в умовах 16-годинного світлового періоду при середньодобовій температурі 23-24°С та оцінюють візуально по наявності-відсутності паразитних рослин вовчка на корінні рослин соняшника Даний спосіб вибрано як прототип До недоліків даного способу треба віднести слідуючі досить тривалий термін проведення оцінки та іі коштовність за рахунок штучного освітлення в зимовий період, а також неможливість встановити рівень СТІЙКОСТІ на різних стадіях онтогенезу рослини З метою усунення вказаних недоліків пропонується спосіб ідентифікації стійких до вовчка генотипів соняшника, що базується на встановленні алельного складу ЛІНІЙ та гібридів за локусом геному соняшника RTS 29,. що зчеплений з локусом Or 3, що контролює СТІЙКІСТЬ соняшника до 'молдавської" раси вовчка В основу корисної моделі поставлено задачу оцінки СТІЙКОСТІ інбредних ЛІНІЙ і гібридів соняшника до вовчка шляхом аналізу спектрів ДНК за результатами ПЛР-аналізу локуса RTS 29, що дозволить встановлювати наявність генетичних детермінант СТІЙКОСТІ у генотипів соняшника у скорочений термін незалежно від стадії розвитку рослини Поставлена задача вирішується за допомогою електрофорезу в 10% поліакриламщному гелі продуктів ампліфікації ДНК локуса геному соняшника RTS 29 та ідентифікації аналізуємого генотипа як стійкого до вовчка при наявності в спектрі ДНК алеля з молекулярною вагою 320 пар нуклеотидів - RTS 29_320 ВІДМІННИМИ ВІД прототипу ознаками в корисній моделі, що заявляється, є - можливість проводити оцінку СТІЙКОСТІ генотипа на всіх стадіях розвитку рослини, - спосіб підготовки зразків до аналізу, - показник, по якому ідентифікують СТІЙКІ генотипи Спосіб забезпечує високу точність, надійність та об'єктивність ідентифікації стійких генотипів Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак та досягнутим результатом (підвищення точності, надійності та об'єктивності оцінки СТІЙКОСТІ) можна пояснити так ПЛР-аналіз локусу геному соняшника RTS 29 дозволяє отримувати кодомінантний ДНК-маркер за умов використання будь-якої частини рослини со 10339 та на усякій стадії її розвитку. Локус RTS 29 є зченоловий синій, 0,2% (w/v) ксиленціанол) та денапленим в геномі соняшника з локусом Or 3, що турувати протягом 1,5хв при 95°С, після чого швиконтролює стійкість до "молдавської" раси вовчка, дко охолодити на льодяній бані та за допомогою при чому алель з молекулярною вагою 320 пар шприця нанести в лунку гелю. Одна доріжка гелю нуклеотидів (RTS 29_320) є характерним для стійповинна містити зразок ДНК з відомою молекулярких генотипів, тобто є зчепленим з домінантним ною вагою. Як стандарт молекулярної маси викоалелем локусу Or 3. При наявності в спектрі ампристовувати ДНК pUC19, рестриктовану Mspl. ліфікації за локусом RTS 29 одного алеля RTS 4. Візуалізація продуктів ампліфікації. Поліак29_320 аналізуємий генотип соняшника можливо риламідний гель фарбувати відповідно до методиідентифікувати як стійкий до "молдавської" раси ки: гель покласти на 5хв у 10% етанол, перенести вовчка. у 1% НІЧОз на Зхв. Гель промити кілька разів дистильованою водою. Витримати 20хв у 0,012М Спосіб здійснюється таким чином. АдЫОз у темряві, промити кілька разів дистильо1. Виділення ДНК. Сегменти насіння, паростваною водою. Інкубувати гель у відновлюючому ків, листків або коріння соняшника гомогенізувати розчині (0.28М Na2CO3 (безводний), 0,019% форв 1,5мл-пробірках в лізуючому буфері (20,0мМ малін), змінюючи розчин у кожному разі його поNa3EDTA, 0,1 М тріс-НСІ рН 8,5 при 25°С, 1,4М темніння, до появи забарвлення фрагментів ампNaCI, 2,0% СТАВ) до повної мацерації тканин. Ліліфікації. Промити кілька разів бідистильованою зат інкубувати 45хв при 60°С. Додати рівний об'єм водою. Гелі зберігати між двома листами прозорої суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'поліетиленової плівки. ємом), перемішати до утворення білої емульсії. Центрифугувати 5хв при 14000об./хв. на мікрофузі 5. Документування отриманню: електрофорег"Eppendorf 5415", водну фазу перенести в чисті рам. Документувати отримані електрофореграми пробірки та додати рівний об'єм ізопропілового відеосистемою VDS ("Amersham Pharmacia спирту, перемішати, осадити ДНК центрифугуванBiotech"). Молекулярну вагу алелів локусу RTS 29 ням при 10000об./хв. протягом 4хв на мікрофузі встановлювати за допомогою комп'ютерної про"Eppendorf 5415". Осадок промити двічі 0,5мл 70% грами "Image Master ID Elite" згідно стандарта моетанола, центрифугувати при 10000об./хв. протялекулярної ваги. гом 4хв на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осадок ДНК 6. Оцінка стійкості генотипу соняшника до "мопідсушити при кімнатній температурі 15хв та розлдавської" раси вовчка. За результатами ПЛРчинити в 0,3мл ТЕ-буферу (10,0мМ трис-НСІ, аналізу локуса RTS 29 встановити характерний 1,0мМ ЕДТА). для тестуємого генотипу набір алелів. Наявність 2. Проведення полімеразної ланцюгової реакхоча б одного алелю RTS 29_320 буде свідчити ції (ПЛР). ПЛР проводити на приладі "Терцик" про те, що даний генотип соняшника можливо іде("ДНК-технологія", Росія). Вміст реакційної суміші нтифікувати як стійкий до "молдавської" раси вовдля проведення ПЛР об'ємом 20мкл: 50мМ КСІ, чка. 20мМ тріс-НСІ (рН 8,4 при 25°С), 0,01% Tween-20, Приклади конкретного використання запропо2мМ МдСІ2, 0,2мкМ кожного праймеру, 200мкМ нованого способу. кожного dNTP, 20нг геномної ДНК, 1од. TaqПриклад 1 полімерази. Ампліфікація: денатурація - 94°С Оцінка стійкості інбредної лінії соняшника 2хв., далі - 40с; відпал - 55°С - 30с - 35 циклів; синОдЮЗб до "молдавської" раси вовчка. тез - 72°С - 2хв.; елонгація - 5хв. Для дослідження брали насіння лінії ОдЮЗб, В таблиці наведено інформацію про послідоввиділяли ДНК, проводили електрофорез у 10% ності праймерів для ампліфікації ДНК за локусом поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації за RTS 29. локусом RTS 29. Інбредна лінія ОдЮЗб є гомозиготною за даним локусом, в ДНК-спектрі виявлено один фрагмент з молекулярною вагою 320п.н., Таблиця. Праймери для аналізу алельного складу тобто алель RTS 29_320 (фіг. 1: доріжки 1-2 - ДНК за локусом RTS 29 інбредної лінії соняшника ОдЮЗб, М - маркер моПослідовність прямого (П) та зворотного (3) лекулярної ваги). Висновок: інбредна лінія соняшпраймерів (5'-3') ника ОдЮЗб містить в своєму генотипі домінантні GCTTCCCCTTAATGATCCGGAAGA алелі гена Or 3 та є стійкою до "молдавської" раси GCTTCCCCTTGGCTAGAAGATGAA вовчка. Приклад 2 3. Електрофоретичний розподіл продуктів амОцінка стійкості інбредної лінії соняшника пліфікації. Оцінювати продукти ампліфікації Од4В до "молдавської" раси вовчка. (Юмкл-аліквоту ПЛР-суміші) у 10% денатуруючому Для дослідження брали насіння Од4В, виділяполіакриламідному гелі. Склад гелю: 10% акрилали ДНК, проводили електрофорез у 10% поліакримід, 7М мочевина, 1х ТВЕ-буфер (50мМ трісламідному гелі продуктів ампліфікації за локусом Н3ВОз, 2мМ ЕДТА, рН 8,0). Умови електрофорезу: RTS 29. Інбредна лінія Од4В є гомозиготною за напруга 500V протягом 120хв. при 65°С. Для приданим локусом, в ДНК-спектрі виявлено один фраготування одного гелю необхідно змішати 12,5мл гмент з молекулярною вагою 338п.н., тобто алель 8М сечовини, 12,5мл розчину 30% поліакриламіду RTS 29_338 (рис. 1: доріжки 3,7 - ДНК інбредної з 8М сечовиной, 2,5мл 10х ТВЕ-буферу, 25мкл лінії соняшника Од4В, М - маркер молекулярної ТМЕД, 50мкл 10% ПСА. Для контролю за просуваги). Висновок: інбредна лінія соняшника Од4В ванням фрагментів ДНК в гелі зразок змішати з містить в своєму генотипі рецесивні алелі гена Or 1мкл денатуруючого буфера для нанесення (98% З та є нестійкою до "молдавської" раси вовчка. формамід, ЮмМ ЕДТА рН 8,0, 0,2% (w/v) бромфе 10339 молекулярною вагою 320п.н. та 338п.н., тобто Приклад 3 алелі RTS 29_320 та RTS 29_338 (фіг.1: доріжки 4Оцінка стійкості гібриду соняшника Од122 до 6 - ДНК гібриду соняшника Од4В, М — маркер мо"молдавської" раси вовчка. лекулярної ваги). Висновок: гібрид соняшника Для дослідження брали насіння Од122, видіОд4В містить в своєму генотипі домінантний та ляли ДНК, проводили електрофорез у 10% поліакрецесивний алелі гена Or 3 та є стійким до "молриламідному гелі продуктів ампліфікації за локудавської" раси вовчка. сом RTS 29. Гібрид Од122 є гетерозигим за даним локусом, в ДНК-спектрі виявлено два фрагмента з 7 3. Комп'ютерна верстка А. Рябко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 4 2 , 01601