Антитіло, яке специфічно зв’язується з інтерлейкіном 25 (il-25)

Реферат: Винахід належить до антитіла, яке специфічно зв’язується з IL-25 (антитіла, позначеного як 2С3) або його антигензв’язуючого фрагмента, виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що його кодує, експресуючого вектора, способу одержання антитіла. Винахід також належить до застосування даного антитіла у виготовленні медикаменту для лікування або попередження астми у суб’єкта, який потребує лікування, та композиції, яка містить дане антитіло. UA 100377 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки Даний винахід стосується антитіл, включаючи їх зв'язувальні фрагменти, спрямованих проти інтерлейкіну 25 (IL-25). Кращі варіанти здійснення даного винаходу використовують VH та/або VL домени антитіла 2С3. В своєму іншому аспекті цей винахід стосується однієї чи більше описаних тут ділянок CDR VH та VL доменів, трансплантованих в каркасні ділянки VH та VL людини, відповідно. Рівень знань Астма є поширеним хронічним запальним розладом дихальних шляхів. Впродовж останніх десятиліть чисельність астматиків невпинно зростає, і за оцінкою Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я зараз у світі біля 300 мільйонів людей страждають від астми. Алергічна астма характеризується неконтрольованою гіперреактивністю дихальних шляхів (ГРДШ), що викликається широким колом провокуючих подразників, і асоціюється із запальними інфільтратами типу 2 в легенях. Цитокіни типу 2 відіграють важливу роль в опосередкуванні захисного імунітету проти паразитарної гельмінтної інфекції, регуляції ефекторних функцій, таких як ріст В клітин і секреція IgE, спричиненні гіперплазії келихоподібних клітин і асоційованої продукції слизу, еозинофілії, мастоцитозу і фіброзу (1). Саме центральні ролі цих цитокінів в регуляції згаданих ефекторних функцій зробили їх ключовими терапевтичними мішенями при астмі. Дійсно, моделі на мишах, у яких ці цитокіни експресуються у надлишку, демонструють всі суттєві характеристики астми. З огляду на це видається дивним, що зусилля пом'якшити експериментальну астму шляхом блокування специфічних цитокінів типу 2 виявились, за винятком пригнічення IL-13, безуспішними. Пригнічення IL-13 гасить і ГРДШ, і запалення дихальних шляхів, хоча механізм цієї дії залишається нез'ясованим (2,3). Однак, враховуючи складну патофізіологію і погано зрозумілу етіологію астми, неясно чи виявиться терапевтично успішним націлювання на індивідуальні провідні шляхи. Недавно було показано, що надекспресія IL-25/IL-17E, представника структурно спорідненої родини цитокінів IL-17 (8), індукує реакції типу 2 in vivo (4-6) і підвищує реактивність до агоністів -/дихальних шляхів (7). Миші IL25 не могли позбавитись від гельмінтних паразитів, що є ключовим показником неефективної реакції типу 2 (9,10). Базова структура антитіла є добре відомою спеціалістам в цій галузі. Антитіло природного походження має чотири поліпептидні ланцюги: два ідентичні важкі ланцюги і два ідентичні легкі ланцюги, сполучені дисульфідними зв'язками. Кожний важкий і легкий ланцюг має постійну ділянку і варіабельну ділянку (або домен). Варіабельні ділянки є відповідальними головним чином за зв'язування антигену. В межах кожної варіабельної ділянки три субділянки, відомі як ділянки, що визначають комплементарність (CDR), вступають в контакт з антигеном. В кожному варіабельному домені ці ділянки CDR нумеруються в напрямку від N-кінця до С-кінця як CDR1, CDR2 і CDR3. Між N- і С-кінцем та ділянками CDR знаходяться чотири так звані каркасні ділянки, які здійснюють мало, якщо взагалі здійснюють їх, контактів з антигеном. Більш докладно структура антитіл описана в багатьох документах, які цитуються далі і які включено в даний опис за посиланням. Опис винаходу Автори цього винаходу отримали антитіла проти IL-25 та ідентифікували молекулу антитіла, яка зв'язується з IL-25 з високою афінністю і специфічністю. Оскільки IL-25 людини і миші поділяють 80 % нуклеотидних послідовностей, то генерування корисних анти-IL-25 антитіл шляхом звичайної імунізації мишей чи щурів вважається малоймовірним, оскільки такий ступінь подібності зменшив би кількість імуногенних епітопів. Більш того, існувала ймовірність того, що поверхня поділу рецептор-ліганд буде демонструвати найбільший ступінь збереження, тим самим унеможливлюючи генерацію антитіл, здатних блокувати взаємодію IL-25 з його рецептором. З метою подолання цих проблем автори даного винаходу імунізували мишей з генетично визначеною відсутністю експресії IL-25 (IL-25 -/-) – такий підхід мав збільшити ймовірність отримання антитіл, спрямованих проти поверхні поділу IL-25/ IL-25R. Цей підхід був дуже успішним у створенні антитіл проти IL-25, ймовірно тому, що сам IL-25 посилює гуморальну імунну реакцію. Однак, навіть при застосуванні такого підходу, з сімдесяти відібраних антитіл було ідентифіковано тільки два блокуючих антитіла, з яких виділити вдалось тільки одне. Подолавши проблему подібності між мишачим і людським IL-25, яка, як вважалось, перешкоджала генерації ефективних блокуючих антитіл звичайними засобами, ми стали думати, що така подібність послідовностей може дозволити отримання антитіла, яке буде 1 UA 100377 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 однаково ефективним у відношенні блокування взаємодії мишачого і людського IL-25 з їх рецепторами. Даний винахід тепер показує, що це дійсно так і є. Хоча існують і інші антитіла проти IL-25, думається, що даний винахід є першою демонстрацією таких антитіл, здатних блокувати біоактивність IL-25. Зокрема, даний опис містить тест, який виконується на мишачих моделях астми і який показує, що антитіло за цим винаходом має корисні і неочікувані властивості, включаючи здатність попереджати чи зменшувати гіперреактивність дихальних шляхів in vivo – ключовий симптом астми. Повідомлення про те, що введення розчинного пептидильованого білку IL-25R-Fc (з пришитими на N- і С-кінцях пептидами) також знижує запалення дихальних шляхів типу 2, були, проте ці ефекти були менш вираженими, ніж ті, про які йдеться тут, і ГРДШ не оцінювалась серйозно (11). Ми тепер демонструємо, що IL-25 відіграє вирішальну роль в запаленні дихальних шляхів і ГРДШ, діючи початково в напрямку посилення опосередкованого цитокінами типу 2 запалення, але має важливе значення також для індукції ГРДШ незалежно від класичних цитокінів типу 2. Виявлення залежної від IL-25 ГРДШ відкриває можливість винайдення нових терапевтичних мішеней, які залягають в руслі дії IL-25. На даний час ми не знаємо, діє IL-25 безпосередньо на гладенькі м'язи дихальних шляхів, викликаючи бронхоконстрикцію, чи його ефекти опосередковуються шляхом індукції відомих бронхоконстрикторів, таких як лейкотрієни. Однак двофазна активність IL-25 робить його відмінною терапевтичною мішенню для пригнічення запалення дихальних шляхів і гальмування гіперреактивності дихальних шляхів in vivo. Відповідно, даний винахід стосується нового антитіла, а в більш загальному плані – елементів для зв'язування мішені, які являють собою послідовності ділянки CDR антитіла, а також використання елементів для зв'язування мішені в лікуванні таких станів, як астма. В одному варіанті здійснення даний винахід стосується елементу для зв'язування мішені, який зв'язує IL-25 і який являє собою домен VH антитіла, що містить VH CDR3 з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 7. Це і є послідовність VH CDR3 антитіла 2С3 за цим винаходом. В більш характерних варіантах здійснення елементом для зв'язування мішені за цим винаходом є VH домен, який включає VH CDR3 послідовності SEQ ID NO: 7 разом з CDR1 послідовності SEQ ID NO: 5 і CDR2 послідовності SEQ ID NO: 6. Такий VH домен може мати каркасні ділянки людини або каркасні ділянки, показані в SEQ ID NO: 2. VH домени можуть бути спареними з VL доменом за цим винаходом, наприклад VL доменом з CDR1 послідовності SEQ ID NO: 8, CDR2 послідовності SEQ ID NO: 9 і CDR3 послідовності SEQ ID NO: 10. Ці ділянки CDR можуть знаходитись у VL домені, що має каркасні ділянки людини, чи у VL домені послідовності SEQ ID NO: 4. Отже, в одному своєму аспекті даний винахід стосується елементу для зв'язування мішені, який зв'язує IL-25 і який являє собою 2С3 VH домен (SEQ ID NO: 2) та/або 2С3 VL домен (SEQ ID NO: 4). Даний винахід стосується також виділеної нуклеїнової кислоти, яка кодує елементи для зв'язування мішені за цим винаходом, векторів, які містять цю нуклеїнову кислоту, і способів забезпечення експресії цієї нуклеїнової кислоти в клітині-хазяїні для отримання елементів для зв'язування мішені за цим винаходом. Даний винахід стосується також застосування елементів для зв'язування мішені за цим винаходом, наприклад у вигляді фармацевтичної композиції, для лікування хвороб, астми включно. Ці та інші аспекти даного винаходу більш докладно будуть описані далі з посиланням на супроводжуючі приклади. Опис малюнків На Фіг. 1 показана нейтралізація IL-25 до сенсибілізації, а також під час викликаної астми. (А) Чутливість до метахоліну мишей, сенсибілізованих яйцями гельмінту, визначалась через день після останнього введення антигену у вигляді аерозолю. Дані двох експериментів об'єднувались і представлялись як середнє значення ± стандартна похибка середнього значення для 14-18 мишей/групу (*р