Фармацевтична композиція на основі фітохімічних препаратів із echinacea та commiphora і спосіб лікування інфекційних захворювань

Даний винахід стосується вірусу імунодефіциту людини та, більш конкретно, способів лікування та профілактики вірусу імунодефіциту людини та інших бактеріальних інфекцій. Відомо, що у цілому світі 22 мільйони людей заражено вірусом імунодефіциту людини(ВІЛ). Останнім часом найбільшу кількість випадків зараження ВІЛ виявлено в Африці та на Карибських островах. Типовий розвиток зараження ВІЛ поділяється на окремі стадії: 1) передавання вірусу, 2) гострий ретровірусний синдром, 3) сероконверсія; 4) клінічний латентний період зі стійкою генералізованою лімфаденопатією або без неї(СГЛ); 5) рання симптоматична інфекція ВІЛ, колись відома як пов'язаний із СНІД комплекс або ARC, і пізніше названа "симптоми В"(згідно з класифікацією CDC 1993 року); 6) синдром набутого імунодефіциту(СНІД)(стан, що вказує на СНІД згідно з критеріями CDC 1987 року й переглянутими критеріями CDC 1993 року, що включає підрахунок CD4 клітин < 200/мм 3) і 7) розвинута інфекція ВІЛ, що характеризується кількістю CD4 клітин < 50/мм 3. Клітини CD4 — це лімфоцити, що уражені вірусом ВІЛ. У 1993 році CDC змінила визначення СНІД із включенням усіх хворих з кількістю CD4 < 200/мм 3; це визначення охоплює хворих на стадіях 4-7 незалежно від симптомів. Початкова фаза гострого ретровірусного синдрому супроводжується різким зменшенням кількості клітин CD4, високою віремією культивованої плазми й високими концентраціями РНК ВІЛ у плазмі. З розвитком реакцій цитотоксичних Т-лімфоцитів(CPL) відбувається клінічне одужання і зменшується високий рівень віремії РНК ВІЛ у плазмі. Кількість клітин CD4 поступово зменшується протягом кількох років і після цього зменшується у прискореному темпі протягом 1,5—2 років перед встановленням діагнозу з визначенням СНІД. Концентрації РНК ВІЛ у плазмі є відносно стабільними доти, доки не настає пізня стадія ВІЛ, коли кількість CD4 становить < 200/мм 3 і перебіг захворювання характеризується інфекціями, певними пухлинами, виснаженням та неврологічними ускладненнями. Зазвичай у 10% хворих встановлюють діагноз СНІД до того, як кількість CD4 зменшується до 200/мм 3. Середній час до прояву ускладнень, що свідчать про СНІД, після зменшення кількості CD4 до 200/мм 3 становить 12-18 місяців. За відсутності способів лікування, спрямованих проти ВІЛ або на профілактику РСР, середній час від передавання вірусу до встановлення діагнозу СНІД становить близько 10 років, а термін доживання після появи ускладнень, пов'язаних із СНІД, становить приблизно один рік. Повний перебіг подій для середньостатистичного хворого за умов відсутності лікування ВІЛ становить близько десяти років від сероконверсії до смерті. Відомо, що середній час перебігу захворювання від сероконверсії ВІЛ до СНІД становить близько 7 років для заражених через кров реципієнтів, 10 років для хворих на гемофілію, 10 років для наркоманів і 8-12 років для гомосексуалістів. За умов належної якості догляду швидкість прогресування є, очевидно, однаковою для категорій хворих за ознаками статі, національності та ризику. Для хворих віком 16-24 років на момент сероконверсії середній час становив 15 років; для тих, хто мав 35 років на момент сероконверсії, він становив 6 років. Зараження ВІЛ може відбуватися через статеві стосунки, попадання в кров під час введення ліків із зараженою кров'ю, під час приймання наркотиків через заражені голки або передавання під час пологів. Відомо, що первинні симптоми зараження ВІЛ, які називають також "гострий ретровірусний синдром", спостерігаються у перелічених ви ще категорій ризику в 50-90% випадків. Цей синдром виявлено у семи з кожних восьми медичних працівників, в організм яких ВІЛ потрапив внаслідок випадкового передавання. Час від випадкового передавання до прояву симптомів зазвичай становить 2-4 тижні, але інкубаційний період може тривати до 6 тижнів. До типових симптомів належать: лихоманка, аденопатія, фарингіт, висип, включаючи еритематозний макульозно-папульозний висип із 5-10-міліметровими ураженнями на обличчі та тулубі, іноді на кінцівках, включаючи долоні та підошви, або виразки слизистої оболонки ротової порожнини, стравоходу або геніталій, міалгія або артралгія, діарея, головний біль, гепатоспленомегалія, пліснявка, нудота та блювання. До неврологічних симптомів належать: менінгоенцефаліт, периферійна нейропатія, параліч обличчя, синдром Гіллен-Барре, невралгія плечового сплетення, радикулопатія, порушення розумової діяльності та психоз. Загострення захворювання зазвичай супроводжується високим рівнем віремії ВІЛ із антигенемією р24, віремією плазми та високими титрами ВІЛ в моноцитах периферійної крові. Відповідь цитотоксичних Т-лімфоцитів спочатку і практично завжди передує гуморальній відповіді на кілька тижнів. Відповідь ЦТЛ супроводжується зменшенням у 3-5 рази(логарифм) концентрації ВІЛ у периферійній крові. Висока концентрація віремії під час цієї фази загострення хвороби пов'язується із розповсюдженням вірусу в тканинах центральної нервової системи і лімфатичній тканині. Лімфатична тканина є головним місцем перебування та реплікації ВІЛ. Зараження нелімфоїдних органів ВІЛ у високих концентраціях виявляють на пізніх стадіях захворювання ВІЛ. Виявлено, що наявність симптомів у більшій мірі, ніж розвиток безсимптомної сероконверсії, а також тривалість хвороби більш ніж 14 діб, корелює із більш швидким розвитком СНІД. Сероконверсія із позитивною серологією ВІЛ зазвичай має місце на 6-12 тиждень після передавання, наприклад, шляхом трансфузії або ураження медичного працівника голками. Середній проміжок часу становить 63 доби. Відповідь ЦТЛ пов'язують з різким зменшенням кількості вірусів у крові, клінічним одужанням від гострого ретровірусного синдрому і поверненням кількості клітин CD4 до більш високих рівнів, які в більшості лабораторій приймаються за нормальні. Хворий на ВІЛ стає клінічно безсимптомним і зазвичай не має виявів захворювання, за винятком стійкої генералізованої лімфаденопатії(СГЛ), що полягає у збільшенні лімфатичних вузлів. Дослідження лімфатичних вузлів виявляють високі концентрації ВІЛ як позаклітинного вірусу, за хоплюваного фолікулярними дендритними клітинами в місцях проліферації, і як внутрішньоклітинного вірусу переважно в латентній формі. Лімфатична тканина є головним місцем перебування ВІЛ, фолікулярні дендритні клітини фільтрують і захоплюють вільний вірус і заражені клітини CD4, і кількість вірусів у моноцитах периферійної крові є відносно низькою. Протягом розвитку захворювання ВІЛ змінює морфологію лімфатичного вузла. Дослідження вірусів в організмі хворих з безсимптомною інфекцією ВІЛ підтверджують високу швидкість реплікації ВІЛ зі створенням у середньому 109 віріонів щодня. Реплікація вірусів супроводжується масовою деструкцією та створенням 109 клітин CD4 щодня. Оновлення клітин CD4 становить 6-7% від загальної кількості клітин CD4 в організмі, отже, повне оновлення відновлюється через кожні 15 діб. СНІД розглядають як наслідок тривалої і масової реплікації ВІЛ-1, що призводить до опосередкованого імунною системою та безпосередньо вірусом винищування популяції лімфоцитів CD4. Поширена інфекція ВІЛ має місце в організмі хворих із кількістю клітин CD4 1:16 Таблиця 3 Ліки - №3 ВПГ 2 Результати тестів Конц. бляшки бляшки Середнє Нерозведена. 46 токсич 49 токсич 48 1:2 Токсич. Токсич. 1:4 1:8 22* 21* 1:16 32** 28** 22 30 ІС501:8 * слабка токсичність **дуже малі бляшки Коментарі: Тестування лікувального препарату(Ліки №3) дало відмінні результати. Клітини мали гарний вигляд без забруднення. При нижчих розведеннях препарат може бути токсичним для деяких з клітин. Цей препарат був неочікувано успішним в його інгібіторній активності. ПРИКЛАДИ 18-20 Три 24-лункові планшети засівали фібробластами і наступними ліками. Тестові ліки №1А = Сур фактант хлорид бензалконію у водному розчині. Сурфактант хлорид бензалконію готували, створюючи 1:375 розведення у воді(32мкл у 12,0мл стерильної води). Його фільтрували перед використанням і розводили в еквівалентному об'ємі 2Х МНС, щоб створити 1:750 розведення у 1 Х МНС. Розведення було зроблене для того, щоб підтримати співвідношення. Тестові ліки №2А = порошок Echinacea purpurea(фітохімічні препарати) у водному розчині. Цей препарат був 50мг/мл розчином(300мг у 6,0мл води) порошку Echinacea purpurea у стерильній воді. Суміш перемішували і о холоджували протягом чотирьох годин. Порошок препарату Echinacea центрифугували при 3500об/хв протягом 15 хвилин при 10°С, фільтрували перед використанням і потім розводили в еквівалентному об'ємі 2Х МНС, щоб створити нерозведении препарат у 1 ХМНС. Тестові ліки №3А = порошок Echinacea purpurea(фітохімічні препарати) розчиняли у сур фактанті хлориду бензалконію. Цей препарат був 50мг/мл розчином(300мг у 6,0мл хлориду бензалконію 1:375). Суміш перемішували і охолоджували протягом чотирьох годин. Суміш фіто хімічного препарату і сур фактанту центрифугували при 3500об/хв протягом 15 хвилин при 10°С і фільтрували перед використанням, а потім розводили в еквівалентному об'ємі 2Х МНС, щоб створити нерозведении препарат у 1 X МНС. 1. Три планшети використовували для скринінгу трьох препаратів ліків. Концентрації, необхідні для скринінгу на антивірусну активність, були 1:2, 1:4, 1:8 і 1:16 у 1Х МНС. Використовували чотири контрольні лунки на кожний планшет, що містив МНС без ліків. 2. Середовище для росту видаляли з лунок і 200мкл HSV-1 додавали до кожної лунки верхньої половини кожного планшета. ВПГ-1 розводили 1:5000(2,0мкл маточного ВПГ-1 у 10мл МНС). Вірусний титр складав 3 x 106 на мл. 3. Планшети інкубували при 37°С протягом чотирьох годин. 4. Посівне середовище видаляли і один мл ліків №1А - 3А, що містили МНС, додавали до чотирьох лунок. Таблиця 4 Конц. Ліки(мкл) МНС(мкл) Нерозвед. 4000 1:2 2000 2000 1:4 1000 3000 1:8 500 3500 1:16 250 3750 5 Результати: ВПГ-1, рідкий поверхневий шар, композицію додавали відразу після абсорбції вірусу. Таблиця 5 Ліки №1 А - ВПГ 1 Результати тестів Концентрація бляшки бляшки бляшки бляшки Г.йпйлня 70 68 58 74 7П 1:2 Токсич. 1:4 Токсич. 1:8 Токсич. 1:16 Токсич. 1:32 Токсич. ІC50 Коментарі: Ці лунки мали густий осад над клітинами. Хлорид бензалконію імовірно осаджує білок у середовищі Таблиця 6 Ліки №2А - ВПГ 1 Результати тестів Конц. бляшки бляшки бляшки бляшки Середнє 72 74 79 71 70 1:2 1:4 1:8 ІС50>1:32 1:16 9* 7 4 7 1:32 12* 8 12 11 Коментарі: Хоча існувало кілька бляшок, вони були дуже малі. Таблиця 7 Ліки №3 А - ВПГ 1 Результати тестів Концентр. бляшки бляшки бляшки бляшки Середнє 72 68 67 70 70 1:2 Токсич. 1:4 Токсич. 1:8 Токсич. 1:16 Токсич. 1:32 -* ІС50>1:32 Коментарі: Хоча й спостерігалася деяка токсичність, ці ліки виявили себе успішно при інгібуванні вірусу, бо жодної бляшки не спостерігалося. ПРИКЛАДИ 21 - 24 Чотири 24-лункові планшети засівали фібробластами. Тестові ліки №1В = Сурфактант хлорид бензалконію у водному розчиннику. Хлорид бензалконію готували створенням 1:1000 розведення у воді(10мкл у 10,0мл стерильної води). Його фільтрували перед використанням і розводили в еквівалентному об'ємі 2Х МНС, щоб створити 1:2000 розведення у 1 Х МНС.(500мкл ліків плюс 500мкл 2Х МНС). Тестові ліки №2В = Порошок Echinacea purpurea(фітохімічні препарати) у водному розчині. Цей препарат був 50мг/мл розчином(250мг у 5,0мл води) порошку Echinacea purpurea у стерильній воді. Суміш перемішували і о холоджували протягом чотирьох годин. Цей порошок препарату Echinacea центрифугували при 3500об/хв протягом 15 хвилин при 10° С, фільтрували перед використанням і розводили в еквівалентному об'ємі 2ХМНС, щоб створити нерозведений препарат у 1 Х МНС.(500мкл ліків плюс 500мкл 2Х МНС). Тестові ліки №3В = Порошок Echinacea purpurea(фітохімічні препарати) розчиняли у сур фактанті хлориду бензалконію. Цей препарат був 50мг/мл розчином(250мг у 5,0мл хлориду бензалконію, 1:1000). Суміш перемішували і охолоджували протягом чотирьох годин. Фіто хімічні препарати Echinacea і сур фактанти центрифугували при 3500об/хв протягом 15 хвилин при 10°С, фільтрували перед використанням і потім розводили в еквівалентному об'ємі 2Х МНС, щоб створити препарат у 1Х МНС(500мкл ліків плюс 500мкл 2Х МНС) Тестові ліки №4В = Порошок Echinacea purpurea(фітохімічні препарати) у водному розчині(розчинник) і потім змішували з сур фактантом хлоридом бензалконію при співвідношенні 1:1000. Цей препарат був 50мг/мл розчином(250мг у 5,0мл у 5,0мл води) порошку Echinacea purpurea у стерильній воді. Суміш перемішували і о холоджували протягом чотирьох годин. Водні фітохімічні препарати центрифугували при 3500об/хв протягом 15 хвилин при 10°С, фільтрували перед використанням. Цей препарат розводили в еквівалентному об'ємі хлориду бензалконію при співвідношенні 1:1000 для одержання суміші Echinacea хлорид бензалконію. Цю суміш розводили еквівалентним об'ємом 2Х МНС, щоб створити 1:4 препарат у 1 Х МНС(500мкл ліків №1 і 250мкл ліків №2 плюс 500мкл 2Х МНС). 1. Чотири планшети використовували для скринінгу чотирьох лікарських препаратів. Концентрації, необхідні для скринінгу на антивірусну активність, були 1:20, 1:40,1:80 і 1:160 і 1:320 у 1ХМНС. Використовували чотири контрольні лунки на кожний планшет, що містив МНС без ліків. 2. Середовище для росту видаляли з лунок і 200мкл HSV-1 додавали до кожної лунки верхніх двох рядків кожного планшета. ВПГ-1 розводили 1:5000(2,0мкл маточного ВПГ-1 у 10мл МНС). Титр вірусу складав 3 x 106 на мл. Також 200мкл HSV-2 додавали до кожної лунки нижньої половини кожного планшета. ВПГ-2 розводили 1:2000(5,0мкл маточного ВПГ-2 у 10мл МНС). Титр вірусу складав 6 x 105 на мл. 3. Планшети інкубували при 37°С протягом чотирьох годин. 4. Посівне середовище видаляли і один мл ліків №1-4, що містили МНС, додавали до чотирьох лунок. Таблиця 8 Концентрат Ліки(мкл) МНС(мкл) 1:20 400 3600 1:40 200 3800 1:80 100 3900 1:160 50 3950 1:320 25 3975 5. Результати: ВПГ-1, рідкий поверхневий шар, ліки додавали відразу після абсорбції вірусу. Таблиця 9 Ліки Afe1B - ВПГ 1 Результати тестів Конц. бляшки бляшки Середнє 37 45 41 1:20 Токсич. 1:40 Токсич. 1:80 Токсич. коментарі: Cлабка токсичність, тест важкий для інтерпретації. 1:160 Токсич. ІС50 1:320 15?* 18?* ВПГ-2, рідкий поверхневий шар, ліки додавали відразу після абсорбції вірусу. Таблиця 10 Ліки №1В - ВПГ 2 Результати тестів Концентра бляшки бляшки Середнє 38 42 40 1:20 Токсич. 1:40 Токсич. 1:80 Токсич. 1:160 Токсич. 1:320 21 17 19 ІС50> 1:320 Коментарі: Тест був занадто токсичним, щоб створити достатні умови для його інтерпретації. Таблиця 11 Ліки №2В - ВПГ 1 Результати тестів Конц. Бляшки Бляшки Середнє 39 40 40 1:20 2* 3 3 1:40 8* 18 13 1:80 23* 11 17 1:160 24 28 26 1:320 44 38 ІС50>1:80 Коментарі: Малі бляшки. Таблиця 12 Ліки #2В - ВПГ 2 Результати тестів Конц. бляшки бляшки Середнє 48 52 50 1:20 21 22 21,5 1:40 33 38 35,5 1:80 1:160 1:320 ІС50>1:20 Таблиця 13 Ліки №3В - ВПГ 1 Результати тестів Конц. Бляшки 44 Бляшки 46 Середнє 1:20 1* 45 1:40 17 16 1:80 31 28 17 1:160 37 27 30 32 1:320 ІС50>1:40 Коментарі: Хоча й спостерігалася деяка токсичність, не утворилося жодної бляшки. Таблиця 14 Ліки №3В - ВПГ 2 Результати тестів Конц. Кілька комірок Бляшки Середнє 1:20 11* 44 10 44 11 1:40 27 32 29,5 1:80 30 1:160 35 1:320 ІС50>1:20 Коментарі: Важкий тест для одержання по-справжньому гарних для інтерпретації результатів. Проте ліки мали успішну інгібіторну активність. Таблиця 15 Ліки №4В - ВПГ 1 Результати тестів Конц. Бляшки Бляшки Середнє 47 48 48 1:40 Токсич. 1:80 Токсич. 1:160 Токсич. 28 30 1:320 33 1:640 ІС50> 1:320 Коментарі: Занадто токсичні при високих концентраціях. Проте, ніякої інгібіторної активності при 1:320 не спостерігалося. Таблиця 16 Ліки №4В - ВПГ 2 Результати тестів Конц. бляшки бляшки Середнє 38 40 39 1:40 Токсич. 1:80 Токсич. 1:160 Токсич. 1:320 2* 4 3 1:640 16 20 18 ІС50> 1:640 Коментарі: Токсичність імовірно завдяки хлориду бензалконію. Ліки при 1:320 розведенні виявляли дуже сильну інгібіторну активність. В теста х in vitro прикладів 21-24 використовували сирі матеріали, які не були очищені. Проте тести виявили на диво добру вірусну інгібіторну активність і ймовірно синергізм між складовими компонентами. У попередніх тестах in vitro, де ліками №3, 3А і 3В були фітохімічні препарати Echinacea purpurea, екстраговані й змішані з сурфактантом хлоридом бензалконію, створений препарат виявив більшу антивірусну активність і значно більше продемонстрував синергізм між компонентами: Echinacea purpurea і хлорид бензалконію. Це можна пояснити розподіленою стабільністю і підвищенною реактивністю між двома компонентами. Хлорид бензалконію у синргетичній суміші виявив менший ступінь токсичності й синергетична суміш(препарат) виявила більший ступінь антивірусної активності, зокрема з ВПГ-2. ТЕСТИ ВІЛ Вірацея-1 і Вірацея-2 тестували на анти-ВІЛ активність у модельних системах гострої інфекції. Додаткові дослідження виконували для визначення діапазону і механізму дії дво х сполук. Сполуки Вірацея-1 і Вірацея-2 були надані як розчини. Приготування композиції включало фільтрацію розчину і центрифугування. Висока тестова концентрація, яку використовували в кожному тесті, змінювалась від 1:5 розведення до 1:100 розведення у середовищі для культивування тканини. Кожну сполуку зберігали при 70°С перед використанням. У ций тестах використовували наступні ліки(композицію). Вірацея 1 = Вірацея 2 = Розмноження і підрахунок клітинних ліній і вірусних маточних розчинів Клітини, що використовували в тестах на скринінг сполук, мали назву CEM-SS клітинна лінія. Ці клітини є занадто чутливими до інфекції ВІЛ, швидко утворюють багатоядерний синцитій і зрештою гинуть від ВІЛ. Ці клітини легко зберігаються(2-7 х 103 клітин на мл) у середовищі для культивування тканин RPMI 1640 з 10% сироваткою плоду бика, глутаміном і антибіотиками. Клітини пересаджують двічі щотижня при розведенні 1:20. Кількість пересаджувань реєструють кожний тиждень, клітини видаляють після двадцяти тижнів пересівань і свіжі клітини CEM-SS виділяють і використовують у тесті. Маточні розчини CEM-SS клітин заморожували у рідкому азоті у 1мл NUNC пляшечках у 90% сироватці плоду теляти і 10% диметилсульфоксиді(ДМСО). Після розтавання CEM-SS клітини готові до використання у тесті на первинний скринінг після двох тижнів культивування. Перед заміщенням клітинної лінії останнього пересівання нові CEM-SS клітини тестують у скринінговому аналізі, використовуючи маточний розчин інфекційного вірусу і AZT. Якщо інфекційність вірусу значно відрізняється на нових клітинах, або якщо AZT є менш активним, ніж очікувалось, нові клітини не братимуть участь у скринінгу. Тестування на мікоплазми звичайно виконують на всіх клітинних лініях(див. вище). Вірусні маточні розчини готують і титрують у СЕМ-SS клітинах, поділених на 5мл аліквоти, і заморожують при -135°С. Після розтавання невикористані віруси видаляються для уникнення змін в інфекційному титрі. Аналізи оптимізації зафіксували однологарифмічне зменшення у титрі вірусу на першому циклі заморожування-розтавання і менше сильних зменшень титру з наступними циклами заморожування-розтавання. Вірусні маточні розчини готують за допомогою гострої інфекції ВІЛ 5 х 10 3 СЕМ-SS клітин у об'ємі 200мкл при розмноженні визначеної інфекції, щоб створити повну загибель клітин на 7 день після інфекції(приблизно 0,05 для ІІІв ізоляту ВІЛ-1 і 0,01 для RF ізоляту ВІЛ-1). Інфікування продовжується протягом однієї години при 37°С і потім клітини переносять до колби Т25 і об'єм збільшують до 2мл. В перший день після інфекції об'єм збільшують до 5мл і на другий день об'єм збільшують до 10мл. Починаючи з 4 дня клітини осаджують, супернатант зберігають і клітини ресуспендують у свіжій 10мл аліквоті середовища для культивування тканин. Щодня середовище повністю замінювали, щоб не дозволити клітинам рости у середовищі протягом довгого часу, та вірусний інокулюм, що використовували у первинному скринінгу, залишали відносно не бідним на поживні речовини при використанні для інфікування клітин. Використовувана забарвлююча реакція(ХТТ) потребує, щоб концентрація глюкози залишалася високою. Лунки, що містили недостатньо глюкози завдяки росту клітин, не дозволяли метаболічного перетворення тетразолієвого барвника на формазан. Безклітинні супернатанти з гостроінфікованих клітин зберігали на 4, 5, 6 і 7 день. Аліквоту супернатанту кожного дня зберігали окремо для використання у визначенні титру. Визначення титру включало визначення активності ЗТ, титрування кінцевої точки або тест на бляшки(СЕМ-SS), підрахування інфекційних часток і визначення кінетики загибелі клітин. Було визначено, що піки інфекції вірусу виникають у гостроінфікованих культура х, оскільки життєздатність клітин падає через 50% рівень. Оскільки первинний скринінг визначає захисний вплив сполуки по її здатності інгібувати ВІЛ-індукований цитопатологічний вплив, кількість вірусу, необхідна для загибелі СЕМ-SS клітин за 6 днів, зазвичай використовується для визначення кількості вірусу, необхідного на лунку при первинному скринінгу. Кожні проби щодня титруються при первинному скринінгу ХТТ, використовуючи двократне розведення вірусу, починаючи з найвищої тестової концентрації 50мкл вірусу на лунку. Метод забарвлення ХТТ тетразолієвим барвником використовують для визначення точної кількості вірусу, необхідної для загибелі усіх СЕМ-SS клітин у кожній лунці, і цю мінімальну кількість вірусу використовують для виконання всіх первинних тестувань. Ідентичні методи використовують для приготування усі х вір усних ізолятів, що використовували в лабораторії, включаючи лабораторні штами ВІЛ-1, ВІЛ-2 і STV. Клінічні ізоляти, що використовували, пересували у свіжі клітини людини, і методи вирощування цих клітин та утворення вірусних маточних розчинів описано нижче. Мікротирувальний тест ХТТ антивірусної активності Приготування клітин СЕМ-SS клітини або інші клітинні лінії, що постійно ростуть, використовувані в цих експериментах, пересівали у Т-150 колби для використання у тесті. За день до тесту клітини розводили 1:2, щоб впевнитись, що вони будуть у фазі експоненційного росту під час інфекції. В день тестування клітини промивали двічі середовищем для культивування тканин і ресуспендували у свіжому середовищі для культивування тканин. Визначення загальної кількості клітин і життєздатності виконували, використовуючи гемацитометр і виключення по барвнику трипановому блакитному. Життєздатність клітин була більшою, ніж 95% для клітин, що використовувались у тесті. Клітини осаджували і ресуспендували при 2,5 х 10 4 клітин на мл у середовищі для культивування тканин. Клітини додавали до планшетів, що містили ліки, у об'ємі 50мкл. Приготування вірусу Попередньо титровану аліквоту вір усу видаляли з холодильника(-80°С) і залишали для повільного розтавання до кімнатної температури у біологічно безпечному кабінеті. Вірус ресуспендували і розводили у середовищі для культивування тканин так, що кількість вірусу, що додавали до кожної лунки у об'ємі 50мкл, дорівнювала тій визначеній, що створює повну загибель клітин за 6 днів після інфекції. У загальних маточних розчинах вірусів, одержаних з ІІІВ ізоляту ВІЛ, додавали 5мкл вірусу на лунку. Маточні розчини RF вірусу були в 5-10 разів міцнішими, що потребувало 0,5-1мкл на лунку. Визначення ТСID50 титруванням кінцевої точки СЕМ-SS клітин показало, що діапазон інфікування в цих теста х становив 0,005-2.5. Формат планшетів Формат тестови х планшетів був стандартний і містив контрольні лунки клітин(лише клітини), вірусні контрольні лунки(клітини плюс вірус), контрольні лунки на токсичність ліків(клітини плюс лише ліки), лунки для колориметричного контролю ліків(лише ліки) та експериментальні лунки(ліки плюс клітини плюс вірус). ПРИКЛАДИ 25-48 ХТТ забарвлення планшетів для скринінгу За 6 днів інкубації при 37°С у 5% СO2 в інкубаторі тестові планшети перевіряли забарвленням тетразолієвим барвником ХТТ. ХТТ-тетразолій перетворюється мітохондріальними ферментами метаболічно активних клітин на розчинний формазан, що дозволяє зробити швидкий кількісний аналіз інгібування ВІЛ-індукованої загибелі клітин анті-ВІЛ тестовими речовинами. За 6 днів після інфекції планшети видаляли з інкубатора та перевіряли. Використання мікротитрувальних планшетів з круглим дном дозволяє швидко виконувати аналіз активності певної тестової сполуки вимірюванням розміру осаду. Результати макроскопічних досліджень підтверджували і уточнювали подальшим мікроскопічним аналізом. Розчин ХТТ готували ли ше як маточний розчин 1мг/мл у PBS. Розчин метасульфату феназину(МСФ) готували як 15мг/мл у PBS і зберігали в темряві при -20°С, маточний розчин ХТТ/МСФ го тували відразу перед використанням, розводячи МСФ 1:100 в PBS і додаючи 40мкл на мл розчину ХТТ. П'ятдесят мікролітрів ХТТ/МСФ додавали до кожної лунки планшету і планшет знов інкубували протягом 4 годин при 37°С. Адгезивні планшетні закупорювачі використовували замість кришок, закритий планшет кілька разів перегортали для перемішування розчинного формазану і планшет зчитували спектрофотометрично при 450нм пристроєм "Molecular Devices Vmax plate reader". Підраховували наступні показники:% зменшення CPE,% життєздатності клітин, IС 25,50 i 95 , ТС25. 50 i 95 та інші індекси. ПРИКЛАДИ 49-54 Тест на Зворотну Активність Транскриптази Використовували реакцію ЗТ у мікротитрувальних планшетах. Тимідинтрифосфорна кислота, що містила мітку тритію(NEN)(ТТФ) ресуспендували у дистильованій Н 2О при 5Кі/мл. Полі rА і оліго дТ готували як маточний розчин, який зберігали при -20°С. Реакційний буфер для ЗТ готували свіжим щодня; він містив 125мкл 1 MEGTA, 125мкл дН 2О, 125мкл Тритон X-100, 50мкл 1М Трис(pH 7,4), 50мкл 1MDTT і 40мкл 1MMgCl2. Ці три розчини змішували разом у співвідношенні 1 частина ТТФ, 2,5 частини полі rА: оліго дТ, 2,5 частини реакційного буфера і 4 частини дистильованої води. Десять мікролітрів цієї реакційної суміші переносили у мікротитрувальний планшет з круглим дном, додавали 15мкл супернатанту, що містив вірус, і змішували. Планшет інкубували 60 хвилин при 37°С. Після реакції реакційний об'єм переносили по краплинах на фільтрувальні основи, промивали 6 разів протягом 5 хвилин кожну у 5% натрій-фосфатному буфері, 2 рази протягом 1 хвилини кожну у дистильованій воді, 2 рази протягом 1 хвилини кожну у 70% етанолі і потім висушували. Висушен у фільтрувальну основу поміщали у пластикову посудину. Додавали сцинтиляційну рідину і посудину нагрівали закритою. Радіоактивність всередині посудини підраховували, використовуючи пристрій "Wallac Microbeta scintillation counter". ТВЕРДОФАЗНИЙ ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АН АЛІЗ Набори з твердофазного імуноферментного аналізу(ТІА) купували у Coulter. Аналіз виконували згідно з рекомендаціями виробника. Перед застосуванням ТІА визначали активність ЗТ і значення використовували для радіоактивності у тесті на визначення активності ЗТ для визначення розведення зразків, необхідних для ТІА. Будували контрольні криві у кожному аналізі для акуратного визначення кількості капсидного білку у кожному зразку. Дані одержували спектрофотометричним аналізом при 450нм, використовуючи пристрій "Molecular Devices Vmax Plate reader". Концентрації Р24 підраховували по значеннях оптичної густини, використовуючи програмне забезпечення "Soft Ма х" від Molecular Devices. Інфекційні частки Інфекційні вірусні частки підраховували, використовуючи тест по підрахунку СЕМ-SS бляшок і тест по визначенню ефективності ВІЛ-1 і ВІЛ-2. Плоскодонні 96-лункові мікротитрувальні планшети вкривали 50мкл полі-L-лізину при 50мкг/мл протягом 2 годин при 37°С. Лунки потім промивали PBS і 2,5 х 105 клітин СЕМSS переносили у мікротитрувальні лунки, де вони прикріплювались до дна планшета. Достатньо клітин додавали, щоб створити моношар СЕМ-SS клітин у кожній лунці. Супернатант, що містив вірус, додавали з кожної лунки ХТТ фази, включаючи вірусні і клітинні контролі й кожне послідовне розведення тестової речовини. Кількість синцитію підраховували у плоскодонних 96-лункових мікротитрувальних планшетах за допомогою інвертованого мікроскопа "Olympus CK2" на 4 день після інфекції. Кожний синцитій утворювався з одного інфекційного віріону ВІЛ. Анти-ВІЛ активність у свіжих клітинах людини: тестування з Т-лімфоцитами Лімфоцити зі свіжої периферійної крові людини(ЛПКЛ) одержували у добровольців Червоного Хреста, серонегативних на ВІЛ і HBV. Піддану лейкофорезу кров розводили 1:1 фосфатним буфером Дульбекко(Dulbecco)(ФБД) та нашаровували на 14мл градієнт густини Фіколь-Ппак(Ficoll-Hypaque) у 50мл центрифугувальні пробірки. Пробірки потім центрифугували протягом 30 хвилин при 600g. Полоси ЛПКЛ обережно відсмоктували з прошарку, що утворився, і потім промивали 2X ФБД низькошвидкістним центрифугуванням. Після останнього промивання клітини перераховували за допомогою методу виключення барвника трипанового блакитного і ресуспендували при 1 х 107мл у RPMI 1640 з 15% сироваткою плоду бика(СПБ), 2мм L-глутаміном, 4мкг/мл РНА-Р і інкубували протягом 48 - 72 годин при 37°С. Після інкубації, ЛПКЛ центрифугували і вставляли у RPMI 1640 з 15% СПБ, 2мм L-глутаміном, 100Од/мл пеніциліном, 100мкг/мл стрептоміцином, 10мкг/мл гентаміцином і 20Од/мл рекомбінантного ІЛ-2 людини. ЛПКЛ зберігали у цьому середовищі при концентрації 1-2 х 106/мл зі змінами середовища двічі на тиждень доти, доки не використовували у тестовому протоколі. Для тестування ЛПКЛ були зібрані РНА-Р стимульовані клітини з як мінімум двох нормальних донорів, перенесені у свіже середовище при 2 х 10 6/мл і висаджені у внутрішні лунки 96-лункового мікропланшету з круглим дном при об'ємі 50мкл/лунку. Розведення тестових ліків готували при 2Х концентрації у мікротитрувальних пробірках і 100мкл кожної концентрації переносили до певних лунок стандартного формату. 50мкл маточного розчину попередньо визначеного розведеного вірусу переносили у кожну тестову лунку. Лунки лише з клітинами і лише вірусом використовували для вірусного контролю. Окремі планшети були так само тестовані, але без вірусу на вивчення цитотоксичності ліків, використовуючи тестову систему ХТТ. У стандартному тесті ЛПКЛ(МОI: 0,2) тест припиняли на 7 день після збирання зразків супернатантів, що не містили клітин, на визначення активності ЗТ. У низькому МОI ЛПКЛ тесті(МОI: 0,02), зразки супернатанту збирали на 6, 11 і 14 день після інфекції і аналізували на активність ЗТ. Тимідинтрифосфорну кислоту(NEN)(ТТФ), мічену тритієм, ресуспендували у дистильованій Н 2О при 5Кі/мл. Полі rА і оліго дТ готували як маточний розчин, який зберігали при -20°С. Реакційний буфер ЗТ готували свіжим щодня; він містив 125мкл 1MEGTA, 125мкл дН2O, 110мкл 10% ДСН, 50мкл 1М Трис(pH 7,4), 50мкл 1М DTT і 40мкл 1М МgСІ2. Ці три розчини змішували разом у співвідношенні 2 частини ТТФ, 1 частина полі rА: оліго дТ і 1 частина реакційного буфера. Десять мікролітрів цієї реакційної суміші переносили у мікротитрувальний планшет з круглим дном і додавали 15мкл супернатанту, що містив вір ус, і суміш перемішували. Планшет інкубували при 37°С у водяній бані з твердою основою для запобігання потоплення планшета і інкубували протягом 60 хвилин. Після реакції реакційний об'єм розподіляли краплинами на папір DE81, промивали 5 разів протягом 5 хвилин кожну в 5% натрій- фосфатному буфері, 2 рази протягом 1 хвилини кожну в дистильованій воді, 2 рази протягом 1 хвилини кожну в 70% етанолі й потім висушували. До кожного зразка додавали Opti-Fluor О і визначали включення радіоактивності, використовуючи рідинний сцинтиляційний лічильник "Wallac 1450 Microbetaplus". Включення тимідину, що містить тритієву мітку, вимірювали у паралельних культурах на 7 день. Кожна лунка мала 1мкКі тимідину, що містить тритієву мітку, і клітини збирали 18 годин пізніше за допомогою пристрою "Skatron cell harvester" на фільтрувальний папір зі скляного волокна. Фільтрувальний папір висушували, переносили в сцинтиляційні пробірки, що містили 1мл сцинтиляційного коктейлю, і підраховували включену радіоактивність на рідинному сцинтиляційному лічильнику "Packard Tri-Carbh 1900 TR". ПРИКЛАДИ 55-78 Анти-ВІЛ активність у свіжих клітинах людини: тестування з моноцитами й макрофагами людини Для виділення зчеплених клітин 3 х 106 не-РНА стимульовані клітини периферійної крові ресуспендували у буферному розчині Ханкс(Hanks) з кальцієм та магнієм з 10% сироваткою AB людини. Клітини розміщували у 24-лункові мікротитрувальні планшети при 37°С протягом 2 годин. Клітини, що не піддались осадженню, видаляли енергійним промиванням шість разів. Зчеплені клітини культивували протягом 7 днів у середовищі для культивування тканин RPMI 1640 з 15% сироваткою плоду бика. Культури обережно досліджували на злиття під час цього інкубаційного періоду. Зараження клітин виконували моноцитотропними штамами ВІЛ-1 - BaL або ADA, і придатною парою AZT-чутливи х і AZTрезистентних вірусних ізолятів. Кожний з цих вірусних ізолятів одержували з NLAID AIDS Research and Reference Reagent Program. Маточні розчини з високим титром кожного з цих вірусів були зібрані з інфікованих культур зчеплених клітин периферийної крові й заморожені у 1,0мл аліквоти при -80°С. Моношари моноцитів-макрофагів інфікували при МОI = 0,1. Сполуки, які малися бути визначеними у моношарах, інфікували при МОI = 0,1. Сполуки, які повинні бути визначені у моноцит-макрофагному тесті, додавали до моношарів відразу перед інфекцією для того, щоб збільшити потенціал для ідентифікації активних сполук. За два дні після інфекції середовище декантували і культури промивали двічі повним середовищем для того, щоб видалити надлишок вірусу. Додавали лише свіже середовище або середовище, що містило належні концентрації ліків, і інкубацію продовжували протягом ще 5 днів. Були виконані тести з ХТТтетразолієм або з трипановим блакитним на життєздатність клітин і ВІЛ р24 ТІА на утворення р24 корового антигену на 7 день після інфекції. Набори ТІА придбали у Coulter. Контрольні криві будували в кожному тесті для того, щоб акуратно підрахува ти кількість білка капсиду в кожному зразку. Дані одержували спектрофотометричним аналізом при 450нм, використовуючи пристрій "Molecular Devices Vmax plate reader". Концентрації Р24 підраховували по значенням оптичної густини з використанням програмного забезпечення "Soft Ма х" від Molecular Device. ПРИКЛАДИ 79-90 Тести на інгібування прикріплення і злиття Ці тести, що використовували НеІа-СО4-LТР-b-галактозидазні клітини, які використовують tat білокіндуковану трансактивацію гена b-галактозидази, що знаходиться під контролем промотора ВІЛ-1 з довгим кінцевим повтором(ДКП). Тест використовували для підрахунку як прикріплення інфекційних віріонів до клітин, так і прикріплення клітини до клітини. Інфіковані клітини утворюють синцитій, який можна легко підрахувати мікроскопічно після інкубації з X-gal. Тест на інгібування прикріплення ВІЛ складався з висадження 1 х 104 HeLa-CD4-ДКП-b-галактозидазних клітин у 200мкл 96-лунковий мікротитровочний планшет з плоским дном. Клітини інкубували протягом ночі, середовище видаляли і заміщували 100мкл різними концентраціями ISIS 5320 або контрольної сполуки. За годину 100мкл середовища з вірусом додавали до кожної лунки. Клітини інкубували протягом ще однієї години і моношар рясно промивали для видалення неприкріпленого вірусу і зовнішньоклітинних сполук. На 48 годину клітини фіксували і забарвлювали X-gal. Потім підраховували блакитні багатоядерні клітини на інвертованому мікроскопі. Тест на інгібування злиття клітин також виконували у 96-лунковому мікротитрувальному планшеті. HeLa-СD4ДКП-b-галактозидазні клітини(5 х 103) додавали до кожної лунки й інкубували з тестовою сполукою протягом 1 години перед додаванням 5 х 103 HL2/3 клітин(28). Клітини інкубували протягом ще 48 годин, фіксували і забарвлювали X-gal. Блакитний синцитій підраховували за допомогою мікроскопа. Забарвлення клітин виконували фіксуванням клітин розчином 1% формальдегіду і 0,2% глутаральдегіду і забарвленням фіксованих клітин 4мкМ фероціанідом. калію, 4мкМ феріціанідом калію, 2мкМ МgСІ2 і 0,4% Х-gаІ у ФБД. Трансактивацію експресії ß-галактозидази також спостерігали за допомогою ТІА. Клі тинні екстракти готували заморожуванням-розтаванням і перевіряли на ß-галактозидазну активність згідно з інструкціями виробника. Результати ТІА підраховували спектрофотометрично при 405нм, використовуючи пристрій "Molecular Devices Vmax microtiter plate reader". Тест на місцевий бактерицидний вплив Шийні епітеліальні клітини МЕІ 180 висаджували на внутрішні стінки 96-лункового мікротитрувального планшету з плоским дном при густині 5 X 10 клітин на лунку й інкубували протягом ночі. Хронічно інфіковані Н9 клітини піддавали дії 200мкг/мл мітоміцину С у повному середовищі протягом однієї години, рясно промивали і ресуспендували при 4 х 105 на мл. Концентрація мітоміцину С призводила до загибелі хронічно інфікованих клітин протягом 48 годин лікування, створюючи достатньо часу для передавання вірусу між клітинами до МЕ-180 клітин, гарантуючи, що кінцева точка підрахунку вір усу не буде враховувати вклад від хронічно інфікованих клітин. Антивірусні сполуки і хронічно інфіковані клітини(2 х 104) додавали до кожної лунки, що містила ME 180 клітини, і інкубували протягом 6 годин. Після кокультивації моношар рясно промивали і додавали свіже середовище. Середовище видаляли і свіже середовище додавали через 24 і 48 години після інфікування для видалення мертвих лімфоцитів. На 6 день після інфекції зразки супернатанту видаляли і аналізували на вміст вірусів за допомогою р24 ТІА. Аналіз експресії CD4 Вплив Вірацеї на експресію CD4 вивчали, використовуючи стандартні методи цитометрії у потоці. Клітини обробляли Вірацеєю протягом однієї години при 37°С у середовищі для культивування тканин. 106 СЕМ-SS клітин інкубували з або без сполуки протягом 60 хвилин при кімнатній температурі. Додавали антіCD4 моноклональне антитіло(20мкл, 3мкг/мл)(Becton-Dickinson, San Jose, CA) і клітини інкубували при 4°С від 40 хвилин. Клітини потім промивали двічі ФБД, ресуспендували у ГС параформальдегіді й аналізували, використовуючи проточний цитометр "Becton-Dickinson FACSort". Синтез макромолекул СЕМ-SS клітини культивували в трьох екземплярах в присутності або відсутності сполуки протягом 24 годин при 37°С у інкубаторі з атмосферою СО2. Через 24 години в культуру додавали 1 мкКі [метил-3Н]тимідин, [5-3Н]-уридин або [3, 4, 5-3Н]-лейцин і інкубували ще 8 годин. Клітини переносили на фільтрувальний папір зі скляного волокна, використовуючи збирач клітин "Skatron". Скляні волокна промивали дистильованою водою, переносили до сцинтиляційної пробірки і підраховували кількість включеної радіоактивності сцинтиляційним лічильником "Packard Tri-Carb" Результати тестів на ВІЛ Вірацею-1 і Вірацею-2 визначали у мікротитрувальному анті-ВІЛ тесті, де визначається здатність тестової сполуки інгібувати реплікацію ВІЛ і ВІЛ-індукованого руйнування клітини. Дві сполуки виявилися активними проти штаму RF ВІЛ-1 у СЕМ-SS клітинах. Вірацея-1 інгібувала ВІЛ-індукований цитопатологічний вплив(ІС 30,) при 1:400 розведенні, тоді як Вірацея-2 виявила ІС25 при 1:900 розведенні й не досягла 50% інгібіторного значення. Як Вірацея-1, так і Вірацея-2 виявили токсичність(ТС30) до СЕМ-SS клітин при розведеннях приблизно 1:20 і 1:250, відповідно. Сполука для позитивного контролю, ddC, виявила неочікуваний рівень активності проти вірусу RF. Вірацею-1 і Вірацею-2 перевіряли на активність у свіжих РВМС людини, інфікованих клінічним ізолятом ВІЛ ROJO. Цей низькопересівний ізолят був визначений як чутливий до ліків(AZT, ddC, невірапін) синцитійвикликаючий вірусний ізолят. Ні Вірацея-1, ні Вірацея-2 не інгібували реплікацію цього ізоляту при нетоксичних концентраціях. Виконували подальше вивчення сполук у РМВС, інфікованих ROJO, переважніше використовуючи IL-2 стимуляцію РВМС, ніж РНА бластогенез. І знову ніякої активності не було зафіксовано нижче концентрацій, які інгібували ріст РВМС. AZT виявив очікуваний рівень активності в цих тестах. Досліджували дію Вірацеї-1 і Вірацеї-2 на свіжих моноцитах-макрофагах людини, інфікованих низькопересівними клінічними ізолятами ADA. У цих теста х обидві сполуки виявили високі рівні активності, де Вірацея-2 мала найвищу. 50% ефективна концентрація Вірацеї-1 і Вірацеї-2 була 1:4000 і 1:10000, відповідно. Токсичність не було зафіксовано у моноцит-макрофаговому моношарі при морфологічному