Лікарський засіб і спосіб профілактики інфікування віл, профілактики і лікування захворювань, що викликаються віл або асоційовані з віл, у тому числі сніду

Реферат: Винахід стосується лікарського засобу для профілактики інфікування ВІЛ, профілактики і лікування захворювань, що викликаються ВІЛ або асоційованих з ВІЛ, у тому числі СНІДу, який містить активовану потенційовану форму антитіл кроля до білка або пептиду імунної системи, який взаємодіє з ВІЛ, або вміст та/або функціональна активність якого змінюється у зв'язку з інфікуванням ВІЛ у суміші трьох гомеопатичних розведень - С12, С30 та С50, причому білок або пептид імунної системи вибрано з групи, що включає фактор некрозу пухлини-альфа, CD8 та інтерферон альфа, що мають антиретровірусну активність. UA 112747 C2 (12) UA 112747 C2 UA 112747 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки Винахід відноситься до області медицини і може бути використаний як для ефективної профілактики інфікування ВІЛ, профілактики і лікування захворювань, що викликаються ВІЛ або асоційованих з ВІЛ, у тому числі СНІДу. Рівень техніки З рівня техніки відомий лікарський засіб для лікування інфекційних захворювань, у тому числі вірусній етіології, на основі активованої форми наднизьких доз антитіл до інтерферону (RU 2192888 СІ, А61К39/395, 20.11.2002). Проте цей лікарський засіб може бути неефективним для профілактики інфікування ВІЛ, а також профілактики і лікування широкого спектру захворювань, що викликаються ВІЛ або асоційованих з ВІЛ, у тому числі СНІДу. Стисле розкриття винаходу Винахід спрямований на створення комплексного лікарського засобу без виражених побічних явищ, що забезпечує як ефективну профілактику інфікування ВІЛ, так і профілактику і ефективне лікування захворювань, що викликаються ВІЛ або асоційованих з ВІЛ, у тому числі що проявляються інфекційними та/або паразитарними хворобами, злоякісними утвореннями і СНІДом, у осіб, інфікованих ВІЛ. Рішення поставленої задачі забезпечується тим, що лікарський засіб для профілактики інфікування ВІЛ, профілактики і лікування захворювань, що викликаються ВІЛ або асоційованих з ВІЛ, у тому числі СНІДу, згідно з винаходом, містить активовану потенційовану форму антитіл до антигену - білку або пептиду імунної системи або, переважно, що виробляється імунною системою, який взаємодіє з ВІЛ, або вміст та/або функціональна активність якого змінюється у зв'язку з інфікуванням ВІЛ. При цьому можна використовувати активовану потенційовану форму антитіл, переважно, до розчиненого антигену (чи розчинного антигену, тобто антигену, не пов'язаного із зовнішньою мембраною клітин імунної системи). При цьому в якості розчиненого антигену можна використовувати цитокіни, за винятком гамма-інтерферону. Крім того, можна використовувати активовану потенційовану форму антитіл, переважно, до антигену, пов'язаного із зовнішньою мембраною клітин імунної системи. При цьому в якості антигену, пов'язаного із зовнішньою мембраною клітин імунної системи, використовують рецептори імунокомпетентних клітин. Крім того, в якості антигену, пов'язаного із зовнішньою мембраною клітин імунної системи можна використовувати кластери диференціювання, за винятком CD4 молекули Т-лімфоцитів. Активовану потенційовану форму антитіл до розчинених антигенів або активовану потенційовану форму антитіл до антигенів, пов'язаних із зовнішньою мембраною клітин імунної системи використовують у вигляді активованого потенційованого водного або водно-спиртового розчину, активність якого обумовлена процесом послідовного багатократного розведення матричного - початкового - розчину антитіл у водному або водно-спиртовому розчиннику в поєднанні із зовнішньою механічною дією - вертикальним струшуванням кожного розведення. При цьому заявлений лікарський засіб може бути виконаний в твердій лікарській формі у вигляді фармацевтичної композиції, яка містить технологічно необхідну (ефективну) кількість нейтрального носія, насиченого сумішшю водних або водно-спиртових розчинів активованої потенційованої форми антитіл до розчинених антигенів або активованої потенційованої форми антитіл до антигенів, пов'язаних із зовнішньою мембраною клітин імунної системи, і фармацевтично прийнятні добавки, які включають, наприклад, лактозу, целюлозу мікрокристалічну і магнію стеарат. Водні або водно-спиртові розчини активованих потенційованих форм антитіл до розчинених антигенів або до антигенів, пов'язаних із зовнішньою мембраною клітин імунної системи можуть бути отримані шляхом багатократного послідовного розведення матричного - початкового розчину антитіл у поєднанні із зовнішньою механічною дією - вертикальним струшуванням кожного розведення, при цьому концентрація матричного розчину складає 0,5 / 5,0 мг/мл. Активовану потенційовану форму антитіл можуть використовувати у вигляді суміші різних, переважно сотенних, розведень за гомеопатичною технологією. Рішення поставленої задачі забезпечується також тим, що в способі профілактики інфікування ВІЛ, профілактики і лікування захворювань, що викликаються ВІЛ або асоційованих з ВІЛ, у тому числі СНІДу, згідно з винаходом, використовують активовану потенційовану форму антитіл до антигену - білку або пептиду імунної системи або, переважно, що виробляється імунною системою, який взаємодіє з ВІЛ, або вміст та/або функціональна активність якого змінюється в зв'язку інфікуванням ВІЛ. 1 UA 112747 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Активовану потенційовану форму антитіл до розчинених антигенів або активовану потенційовану форму антитіл до антигенів, пов'язаних із зовнішньою мембраною клітин імунної системи, використовують у вигляді активованого потенційованого водного або водноспиртового розчину кожного компонента, активність якого обумовлена процесом багатократного розведення матричного - початкового - розчину антитіл у водному або водно-спиртовому розчиннику у поєднанні із зовнішньою механічною дією - вертикальним струшуванням кожного розведення. Переважно водні або водно-спиртові розчини активованих потенційованих форм антитіл до розчинених антигенів або до антигенів, пов'язаних із зовнішньою мембраною клітин імунної системи отримують шляхом багатократного послідовного розведення матричного - початкового - розчину антитіл у поєднанні із зовнішньою механічною дією - вертикальним струшуванням кожного розведення, при цьому концентрація матричного розчину складає 0,5 / 5,0 мг/мл. Згідно з винаходом активовано потенційована форма є формою антитіл, приготованою за гомеопатичною технологією потенціювання шляхом багатократного послідовного розведення матричного - початкового - розчину антитіл у поєднанні із зовнішньою дією - вертикальним струшуванням кожного розведення, яка має активність у фармакологічних моделях та/або клінічних методах профілактики інфікування ВІЛ, профілактики і лікування захворювань, що викликаються ВІЛ або асоційованих з ВІЛ, у тому числі СНІДу. Запропоноване використання активованої потенційованої форми антитіл до розчинених антигенів (наприклад, до фактора некрозу пухлини-альфа або альфа-інтерферону людини) або до антигенів, пов'язаних із зовнішньою мембраною клітин імунної системи (наприклад, до CD8 рецептору) забезпечує отримання несподіваного терапевтичного ефекту, який полягає у вищій ефективності лікарського засобу як при профілактиці інфікування ВІЛ, так і при профілактиці і лікуванні захворювань, що викликаються ВІЛ або асоційованих з ВІЛ, у тому числі СНІДу. Експериментально підтверджено, що заявлений лікарський засіб має високу профілактичну ефективність відносно ВІЛ, попереджаючи інфікування клітин вірусом імунодефіциту людини і його внутрішньоклітинну реплікацію і, внаслідок цього, може використовуватися як для ефективного лікування, так для профілактики вірусних захворювань, схильних до хронічного плину, у тому числі і для вторинної профілактики ВІЛ - інфекції. Можливе застосування заявленого лікарського засобу у поєднанні з антиретровірусними препаратами, у тому числі комплексними, у тому числі з інгібіторами зворотної транскриптази (наприклад, на основі зідовудина), що дозволяє понизити дози антиретровірусних препаратів при збереженні високої ефективності терапії, підвищує безпеку терапії, що проводиться, і скорочує кількість небажаних явищ. Варіанти здійснення винаходу Лікарський засіб готують, переважно, таким чином. Для приготування активованої потенційованої форми діючих компонентів використовують моноклональні або, переважно, поліклональні антитіла, які можуть бути отримані по відомих технологіях - методиках, описаних, наприклад, в книзі: Імунологічні методи / під ред. Г. Фрімеля, Μ.: "Медицина", 1987, - с. 9-33; чи, наприклад, в статті Laffly Ε., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol. 14. - N 1-2. - P.33-55. Моноклональні антитіла отримують, наприклад, за допомогою гібрідомної технології. Причому початкова стадія процесу включає імунізацію, засновану на принципах, вже розроблених при приготуванні поліклональних антисироваток. Подальші етапи роботи передбачають отримання гібридомних клітин, що продукують клони однакових по специфічності антитіл. їх виділення проводиться тими ж методами, що і у випадку поліклональних антисироваток. Поліклональні антитіла можуть бути отримані активною імунізацією тварин. Для цього за спеціально розробленою схемою тваринам роблять серію ін'єкцій потрібним відповідно до винаходу речовиною - антигеном або кон'югованим антигеном (білком або пептидом імунної системи або, переважно, що виробляється імунною системою, який взаємодіє з ВІЛ, або вміст та/або функціональна активність якого змінюється у зв'язку з інфікуванням ВІЛ). В результаті проведення такої процедури отримують моноспецифічну антисироватку з високим вмістом антитіл, яку і використовують для отримання активованої потенційованої форми. При необхідності проводять очищення антитіл, присутніх в антисироватці, наприклад, методом аффінної хроматографії, шляхом застосування фракціонування сольовим осадженням або іонообмінної хроматографії. Переважно, для приготування заявленого лікарського засобу можуть використовуватися поліклональні антитіла до фактора некрозу пухлини-альфа, які в якості матричного (первинного) 2 UA 112747 C2 5 10 розчину з концентрацією 0,5 / 5,0 мг/мл, використовують для наступного приготування активованої потенційованої форми. Переважним для приготування заявленого лікарського засобу є використання поліклональних антитіл, які можуть бути отримані імунізацією кроликів таким чином. Наприклад, поліклональні антитіла до фактора некрозу пухлини-альфа (ФНП-α) можуть бути отримані з використанням цілісної молекули фактора некрозу пухлини-альфа наступної послідовності: Можливе для отримання поліклональних антитіл до фактора некрозу пухлини-альфа (ФНПα) використання поліпептидного фрагмента фактора некрозу пухлини, обраного, наприклад, з наступних послідовностей: 3 UA 112747 C2 5 10 15 20 25 30 Перед відбором крові за 7-9 днів проводять 1-3 внутрішньовенних ін'єкції для підвищення рівня антитіл. В процесі імунізації у кроликів відбирають невеликі проби крові для оцінки кількості антитіл. Максимальний рівень імунної відповіді на введення більшості антигенів досягається через 40-60 днів після першої ін'єкції. Після закінчення першого циклу імунізації кроликам протягом ЗО днів дають відновити здоров'я і проводять реімунізацію, що включає 1-3 внутрішньовенних ін'єкції. Для отримання антисироватки з імунізованих кроликів збирають кров в центрифужну пробірку об'ємом 50 мл. За допомогою дерев'яного шпателя видаляють із стінок пробірки згустки, що утворилися, і поміщають паличку в згусток, що утворився в центрі пробірки. Кров поміщають в холодильник (температура 4 °C) на ніч. Наступного дня видаляють згусток, що прикріпляється до шпателя, і центрифугують рідину, що залишилася, при 13000g протягом 10 хв. Супернатант (надосадкова рідина) є антисироваткою. Отримана антисироватка має бути жовтого кольору. Можна додавати до антисироватки 20 % NaN3 до кінцевої концентрації 0,02 % і зберігати до використання в замороженому стані при температурі - 20 °C (з чи без додавання NaN3 - при температурі - 70 °C). Виділення з антисироватки антитіл до фактора некрозу пухлини-альфа можливе таким чином: 10 мл антисироватки кролика розбавляють в 2 рази 0,15 Μ NaCI додають 6,26 г Na2S04, перемішують і інкубують 12-16 г при 4 °C; осад, що випав, видаляють центрифугуванням, розчиняють в 10 мл фосфатного буфера і потім діалізують проти того ж буфера протягом ночі при кімнатній температурі; після видалення осаду центрифугуванням розчин наносять на колонку з ДЕАЕ-целюлозою, урівноважену фосфатним буфером; фракцію антитіл визначають, вимірюючи оптичну щільність елюату при 280 нм. Очищення антитіл виробляють методом аффінної хроматографії на колонці з антигеном, шляхом зв'язування антитіл до фактора некрозу пухлини-альфа з антигеном (фактором некрозу пухлини-альфа), прикріпленого до нерозчинного матриксу колонки, з наступним елююванням антитіл концентрованими розчинами солі. Отриманий таким чином буферний розчин поліклональних антитіл до фактора некрозу пухлини-альфа з концентрацією 0,5 / 5,0 мг/мл, переважно 2,0 / 3,0 мг/мл використовують в 4 UA 112747 C2 5 якості матричного (початкового) розчину для наступного приготування активованої потенційованої форми антитіл. Поліклональні антитіла до альфа-інтерферону людини отримують за вищезгаданим способом, використовуючи в якості імуногену (антигену) для імунізації кроликів ад'ювант і цілісну молекулу альфа-інтерферону людини однієї з наступних послідовностей: 5 UA 112747 C2 6 UA 112747 C2 7 UA 112747 C2 5 10 15 Можливе для отримання поліклональних антитіл до альфа-інтерферону людини в якості імуногену (антигену) для імунізації кроликів використанняад'юванта і, наприклад, одного поліпептидного фрагмента альфа-інтерферону людини. Поліклональні антитіла до CD8 рецептору отримують за вищезгаданим) способом, використовуючи в якості імуногену (антигену) для імунізації кроликів ад'ювант і цілісну молекулу CD8 рецептора наступної амінокислотної послідовності: Можливе для отримання поліклональних антитіл до CD8 рецептору в якості імуногену (антигену) для імунізації кроликів використання ад'юванта і, наприклад, одного поліпептидного фрагмента CD8 рецептора, обраного з наступних послідовностей: Переважним для приготування лікарського засобу є використання суміші трьох водно12 спиртових розведень первинного матричного розчину антитіл, розводять, відповідно, в 100 , 30 200 100 , і 100 разів, що відповідає сотенним розведенням С12, СЗО і С 200, приготованим за гомеопатичною технологією. При виконанні заявленого лікарського засобу в твердій лікарській формі на нейтральний носій наноситься суміш вказаних компонентів. 8 UA 112747 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Активовану потенційовану форму кожного компонента готують шляхом рівномірного зменшення концентрації в результаті послідовного розведення 1 частини кожного розчину, що піддається розведенню, починаючи із згаданого матричного розчину, в 9 частинах (для десяткового розведення D) або в 99 частинах (для сотенного розведення С) або в 999 частинах (для тисячного розведення М) нейтрального розчинника у поєднанні з багатократним вертикальним струшуванням (потенціюванням, або "динамізацією") кожного отриманого розведення і використанням окремих ємностей для кожного наступного розведення до отримання необхідної потенції - кратності розведення по гомеопатичному методу (В. Швабе Гомеопатичні лікарські засоби / В.Швабе - М., 1967 р., - с. 14-29). Зовнішню обробку в процесі зменшення концентрації також можна здійснювати ультразвуком, електромагнітною або іншою фізичною дією. Наприклад, для приготування 12-го сотенного розведення С12 одну частину матричного (початкового) розчину антитіл, наприклад до фактором некрозу пухлини-альфа з концентрацією 2,5 мг/мл розводять в 99 частинах нейтрального водного або водно-спиртового розчинника і багаторазово (10 і більше разів) вертикально струшують - потенціюють, отримуючи 1-е сотенне розведення С1. З 1-го сотенного розведення С1 готують 2-е сотенне розведення С2. Цю операцію повторюють 11 разів, отримуючи 12-е сотенне розведення С12. Таким чином, 12-е сотенне розведення С12 є розчином, отриманим розбавленням послідовно 12 разів в різних ємностях 1-ої частини початкового матричного розчину антитіл до гамма-інтерферону людини з концентрацією 2,5 мг/мл в 99-ти частинах нейтрального розчинника, тобто розчин, отриманий 12 розведенням матричного розчину в 100 разів. Аналогічні операції з відповідною кратністю розведення проводять для отримання розведень СЗО і С50. При використанні, наприклад, активованої потенційованої форми антитіл до фактора некрозу пухлини-альфа у вигляді суміші різних, переважно сотенних, розведень кожне розведення (наприклад, С12, СЗО, С50) готують окремо за описаною вище технологією до розведення на 3 розведення менше, ніж кінцеве (відповідно, до отримання С9, С27, С47), і потім вносять відповідно до складу суміші до однієї ємності по одній частині кожного компонента і змішують з необхідною кількістю розчинника (відповідно, з 97 частинами для сотенного розведення). Далі отриману суміш послідовно двічі розводять в співвідношенні 1 до 100, потенціюючи отриманий розчин після кожного розведення. При цьому отримують активовану потенційовану форму антитіл, наприклад, до гамма-інтерферону людини у наднизькій дозі, 12 30 200 отриманій розведенням матричного розчину в 100 , 100 , і 100 разів, еквівалентній суміші сотенних розведень С12, СЗО, С50. Можливе використання кожного компонента у вигляді суміші інших різних, розведень, наприклад, десяткових і або сотенних, (D20, С3О, С100 або С12, СЗО, С200 і так далі), приготованих за гомеопатичною технологією, ефективність яких визначають експериментально. Для отримання твердої оральної форми заявленого лікарського засобу виробляють в установці киплячого шару (наприклад, типу "Huttlin Pilotlab" виробництва компанії Huttlin GmbH) зрошування до насичення гранул, що вводяться в псевдозріджений-киплячий шар, нейтральної речовини - лактози (молочного цукру) з розміром часток 50/500 мкм, заздалегідь отриманим водним або водно-спиртовим розчином активованої потенційованої форми антитіл до CD4 рецептору, переважно, в співвідношенні 1 кг розчину антитіл на 5 або 10 кг лактози (1:5 - 1:10) з одночасною сушкою в потоці нагрітого повітря, що подається під грати, при температурі не вище 40 °C. Розрахункова кількість лактози (10/91 % від маси таблетки), насиченої активованою потенційованою формою антитіл за вищезгаданою методикою, завантажують в змішувач і змішують з лактозою, зволоженою активованою потенційованою формою антитіл, у кількості 3/10 % маси таблетки і з чистою лактозою в кількості не більше 84 % від маси (для зниження вартості і деякого спрощення і прискорення технологічного процесу без зниження ефективності лікувальної дії) таблетки. Потім в цю суміш додають мікрокристалічну целюлозу у кількості 5/10 % від маси таблетки і стеарат магнію у кількості 1 % від маси таблетки. Отриману масу таблетки рівномірно перемішують і таблетують прямим сухим пресуванням (наприклад, в таблет-пресі Korsch-XL 400). Після таблетування отримують таблетки масою 300 мг, просочені водно-спиртовим розчином активованої потенційованої форми антитіл до фактора некрозу пухлини-альфа у наднизькій дозі кожного компонента, приготованій з матричного розчину, 12 30 50 розведеного в 100 , 100 , і 100 , що еквівалентно суміші сотенних розведень С12, СЗО і С50, приготованих за гомеопатичною технологією. Переважно заявлений лікарський засіб рекомендується приймати по 1-2 таблетці 2-4 рази в день. Приклад 1. 9 UA 112747 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Антиретровірусну дію заявленого лікарського препарату вивчали, інгібуючи реплікацію ВІЛ в культурі мононуклеарних клітин периферичної крові людини, заражених in vitro штамом ВІЛ-1LAI. Ефективність інгібування реплікації ВІЛ оцінювали за вмістом основного нуклеокапсидного білку р24 ВІЛ в супернатантах. Для проведення експериментальних досліджень були використані аффінно очищені кролячі поліклональні антитіла до фактора некрозу пухлини-альфа, приготовані за замовленням спеціалізованою біотехнологічною фірмою, на основі яких була приготована активована потенційована форма водних розведень антитіл до фактора некрозу пухлини-альфа у наднизькій дозі, отриманих за гомеопатичною технологією надрозведенням початкового 12 30 50 матричного розчину (концентрацією 2,5 мг/мл) в 100 , 100 , 100 разів, еквівалентних суміші сотенних гомеопатичних розведень С12, СЗО, С50 (далі - ННД AT до ФНП альфа). Оцінка противірусної активності комплексного препарату проводилася з використанням мононуклеарних клітин периферичної крові людини, заражених in vitro штамом ВІЛ-1-LAI. Мононуклеари периферичної крові людини були виділені з крові здорових серонегативних донорів за допомогою центрифугування в градієнті щільності фіколла-гіпака. Клітини активували протягом 3 днів з використанням 1 мкг/мл фітогеммаглютину Ρ і 5 МЕ/мл рекомбінантного інтерлейкіну-2 людини. Для оцінки антиретровірусної активності препарати вносили до лунки, що містить 100 мкл активованих мононуклеарів периферичної крові людини, за 24 години або через 15 хвилин після зараження клітин штамом ВІЛ-1-LAI в дозі 100 TCID50 (50 мкл інокуляту штаму ВІЛ-1-LAI). Перед внесенням до лунки, ННД AT до ФНП альфа (12,5 мкл) або азидотимідин (діюча речовина - зидовудин) в дозі 1000 нМ (препарат порівняння) змішували з середовищем RPMI1640 (DIFCO) до досягнення кінцевого об'єму в 50 мкл. Супернатанти культури клітин були зібрані на 7 день після зараження. Ефективність препаратів визначали по інгібуванню реплікації ВІЛ, яка оцінювалася за вмістом основного нуклеокапсидного білку р24 ВІЛ в супернатантах клітин методом ІФА (Retrotek Elisa kit). Показано, що ННД AT до ФНП альфа інгібують реплікацію ВІЛ на 92±3 % при внесенні до лунки за 24 години до, і на 13±13 % при внесенні до лунки через 15 хвилин після зараження клітин штамом BIJ1-1-LAI, відповідно. Азидотимідин в дозі 1000 нМ інгібував реплікацію ВІЛ на 99±0 і 99±1 % при внесенні до лунки за 24 години до і через 15 хвилин після зараження клітин штамом ВІЛ-1-LAI, відповідно. Таким чином, в in vitro дослідженні показана висока антиретровірусна активність заявленого препарату на основі активованої потенційованої форми кролячих поліклональних антитіл до ФНП альфа. Примітка: TCID50 - доза, що інфікує 50 % клітин культури тканини. Приклад 2. Антиретровірусну дію заявленого лікарського препарату вивчали, інгібуючи реплікацію ВІЛ в культурі мононуклеарних клітин периферичної крові людини, заражених in vitro штамом ВІЛ-1LAI. Ефективність інгібування реплікації ВІЛ оцінювали за вмістом основного нуклеокапсидного білку р24 ВІЛ в супернатантах. Для проведення експериментальних досліджень були використані аффінно очищені кролячі поліклональні антитіла до CD8, приготовані за замовленням спеціалізованою біотехнологічною фірмою, на основі яких була приготована активована потенційована форма водних розведень антитіл до CD8 у наднизькій дозі, отриманих за гомеопатичною технологією надрозведенням 12 30 50 початкового матричного розчину (концентрацією 2,5 мг/мл) в 100 , 100 , 100 разів, еквівалентних суміші сотенних гомеопатичних розведень С12, СЗО, С50 (далі - ННД ATfloCD8). Оцінка противірусної активності комплексного препарату проводилася з використанням мононуклеарних клітин периферичної крові людини, заражених in vitro штамом ВІЛ-1-LAI. Мононуклеари периферичної крові людини були виділені з крові здорових серонегативних донорів за допомогою центрифугування в градієнті щільності фіколла-гіпака. Клітини активували протягом 3 днів з використанням 1 мкг/мл фітогеммаглютину Ρ і 5 МЕ/мл рекомбінантного інтерлейкіну-2 людини. Для оцінки антиретровірусної активності препарати вносили до лунки, що містить 100 мкл активованих мононуклеарів периферичної крові людини, за 24 години або через 15 хвилин після зараження клітин штамом ВІЛ-1-LAI в дозі 100 TCID50 (50 мкл інокуляту штаму ВІЛ-1-LAI). Перед внесенням до лунки, ННД AT до CD8 (12,5 мкл) або азидотимідин (діюча речовина зидовудин) в дозі 1000 нМ (препарат порівняння) змішували з середовищем RPMI1640 (DIFCO) до досягнення кінцевого об'єму в 50 мкл. Супернатанти культури клітин були зібрані на 7 день після зараження. 10 UA 112747 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Ефективність препаратів визначали по інгібуванню реплікації ВІЛ, яка оцінювалася за вмістом основного нуклеокапсидного білку р24 ВІЛ в супернатантах клітин методом ИФА (Retrotek Elisa kit). Показано, що ННД AT до CD8 інгібують реплікацію ВІЛ на 87±11 % при внесенні до лунки за 24 години до, і на 40±4 % при внесенні до лунки через 15 хвилин після зараження клітин штамом ВІЛ-1-LAI, відповідно. Азидотимідин в дозі 1000 нМ інгібував реплікацію ВІЛ на 99±0 і 99±1 % при внесенні до лунки за 24 години до і через 15 хвилин після зараження клітин штамом ВІЛ-1-LAI, відповідно. Таким чином, в in vitro дослідженні показана висока антиретровірусна активність наднизьких доз кролячих поліклональних антитіл до CD8. Примітка: TCID50 - доза, що інфікує 50 % клітин культури тканини. Приклад З Оцінка антиретровірусної активності активованих потенційованих форм водних розведень поліклональних аффінно очищених кролячих антитіл до інтерферону альфа у наднизьких дозах (ННД), отриманих надрозведенням початкового матричного розчину (концентрацією 2,5 мг/мл) в 12 30 50 100 , 100 , 100 разів, еквівалентних суміші сотенних гомеопатичних розведень С12, СЗО, С50 (ННД AT до ІФН-α) проводилася з використанням мононуклеарних клітин периферичної крові людини, заражених in vitro штамом ВІЛ-1-LAI. В якості препарату порівняння використовували препарат азидотимідин. Мононуклеари периферичної крові людини були виділені з крові здорових серонегативних донорів за допомогою центрифугування в градієнті щільності фіколла-гіпака. Клітини активували протягом 3 днів з використанням 1 мкг/мл фітогеммаглютину Ρ і 5 МЕ/мл рекомбінантного інтерлейкіну-2 людини. Клітини заражали штамом ВІЛ-1-LAI, вносячи 50 мкл інокуляту штаму ВІЛ-1-LAI, що відповідає дозі 100 TCID50 (доза, що інфікує 50 % клітин культури тканини). Для оцінки антиретровірусної активності препарат ННД AT до ІФН-α і препарат порівняння азидотимідин вносили до лунок, що містять 100 мкл активованих мононуклеарів периферичної крові людини, за 24 години або через 15 хвилин після зараження клітин штамом ВІЛ-1-LAI. Перед внесенням до лунок, препарат ННД AT до ІФН-а (12,5 мкл) і препарат азидотимідин в дозі 1000 нМ змішували із середовищем RPMI1640 (DIFCO) до досягнення кінцевого об'єму в 50 мкл. Супернатанти культури клітин були зібрані на 7 день після зараження. Ефективність препаратів визначали по інгібуванню реплікації ВІЛ, яка оцінювалася за вмістом основного нуклеокапсидного білку ВІЛ р24 в супернатантах клітин методом ИФА (Retrotek Elisa kit). Показано, що препарат ННД AT до ІФН-α інгібує реплікацію ВІЛ на 95±2 % при внесенні до лунки за 24 години до, і на 59±14 % при внесенні до лунки через 15 хвилин після зараження клітин штамом BIJ1-1-LAI, відповідно. Азидотимідин в дозі 1000 нМ інгібує реплікацію ВІЛ на 99±0 і 99±1 % при внесенні до лунки за 24 години до і через 15 хвилин після зараження клітин штамом ВІЛ-1-LAI, відповідно. Таким чином, в in vitro дослідженні показана висока антиретровірусна активність препарату ННД AT до ІФН-а. 11 UA 112747 C2 12 UA 112747 C2 13 UA 112747 C2 14 UA 112747 C2 15 UA 112747 C2 16 UA 112747 C2 17 UA 112747 C2 18 UA 112747 C2 19 UA 112747 C2 20 UA 112747 C2 21 UA 112747 C2 22 UA 112747 C2 23 UA 112747 C2 24 UA 112747 C2 25 UA 112747 C2 26 UA 112747 C2 27 UA 112747 C2 28