Вакцина для собак проти хвороби лайма

Реферат: Винахід стосується вакцини для собак проти хвороби Лайма, яка містить імунологічно ефективну кількість організмів першого штаму геновидів борелій та імунологічно ефективну кількість організмів другого штаму геновидів борелій; де організми вказаного другого штаму експресують на свої поверхні OspA антиген, OspB антиген або експресують обидва OspA та OspB антигени; та де введення вказаної вакцини собаці викликає вироблення значних рівнів антитіл проти В. burgdorferi ss 50772 (АТСС No. PTA-439). UA 99719 C2 (12) UA 99719 C2 UA 99719 C2 Перехресне посилання на подібні заявки 5 Ця заявка є безумовною заявкою, пріоритет якої заявлено за 35 U.S.C. § 119(e) попередньої заявки США № 60/864,258, поданої 03 листопада 2006 року, вміст якої включено у даний документ як посилання. 10 Галузь винаходу Даний винахід стосується вакцини для собак проти хвороби Лайма. Також даний винахід стосується способів виготовлення та застосування вакцини як окремо, так і у комбінації з іншими захисними агентами. 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Передумови винаходу Хвороба Лайма у собак з’являється внаслідок зараження видами Borrelia spirochetes, включаючи, першочергово групи B. burgdorferi sensu stricto (ss) у США та B. burgdorferi ss, B. garinii та B. afzelii в Європі (Baranton et al., Int. J. Sys. Bacteriol. 1992,42:378-383; Hovius et al., J. Clin. Microbiol. 2000, 38:2611-2621). Спірохети переносяться у той момент, коли іксодові кліщі (Ixodes spp.) годуються кров’ю, та зараження собаки призводить до появи таких клінічних проявів як субклінічний синовіт, гострий артрит та артралгія (Jacobson et al., Semin. Vet. Med. Surg. 1996, 11:172-182; Summers et al, J. Comp. Path. 2005, 133:1-13). Дуже важливим є те, що випадки захворювання собак хворобою Лайма продовжують збільшуватись щорічно, що супроводжується збільшенням кількості випадків захворювання у людей (Haninkova et al., Emerg. Infect. Dis. 2006, 12:604-610). Антитіла, які виробляються у відповідь на зараження видами борелій (Borrelia spp.), мають дві різні функції, проте раніше, обидва види антитіл могли бути неефективними для видалення ізольованих спірохет з хазяїна ссавця. Існує багато пояснень цього дефекту нормальної відповіді імунної системи у відповідь на природню інфекцію, включаючи антигенні варіації (Schwan, Biochem. Soc. Trans. 2003, 31:108-112; Tokarz et al., Infect. Immun. 2004, 72:5419-5432), мімікрію хазяїна (Barbour et al. Microbiol. Rev. 1986, 50:381-400), та внутрішньоклітинну локалізацію (Ma et al., Infect. Immun. 1991, 59:671-678). Найбільш звичайною гуморальною імунною відповіддю є вироблення неспецифічних зв’язуючих/опсонізуючих антитіл, які «мітять» спірохет для захвату фагоцитами. Однак, нажаль, опсонізуючі антитіла виробляються у відповідь на декілька білків, загальних для інших мікроорганізмів (тобто білків молекулярною масою 41 кДа, з яких складаються бактеріальні жгутики), що ставить під сумнів їх включення у вакцину для викликання антитілоопосередкованого імунітету. Другою звичайною імунною відповіддю є вироблення (летальних) антитіл до борелії. На відміну від опсонізуючих антитіл, антитіла до борелії розпізнають епітопи тільки на декількох білках видів Borrelia. Після приєднання до специфічного місця на спірохеті антитіла до борелії зазвичай викликають комплемент з метою утворення мембраноатакуючого комплекса, який вбиває організми без необхідності утилізації фагоцитами. Бактерини хвороби Лайма у собак, які використовують у вакцинах, розробили з метою забезпечення захисту шляхом вироблення антитіл проти OspA борелій (Hsien-Chu et al., JAVMA 1992, 201:403-411; Ma et al., Vaccine 1996, 14:1366-1374; Wikle et al., Intern. J. Appl. Res. Vet. Med. 2006, 4:23-28; Straubinger et al., Vaccine 2001, 20:181-193), які вбивають OspAекспресуючих спірохет в інфекційних кліщах, коли паразит починає годуватись (Fikrig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89:5418-5421). Страубігер та ін. (Vaccine 2002, 20:181-193) повідомили, що цільноклітинна вакцина викликає вироблення значно більшої кількості антитіл проти борелій, ніж рекомбінантна OspA вакцина. Хоча такі вакцини вдало використовували, є багато повідомлень про невдалу дію вакцини (Levy et al. JAVMA 1993, 202:1834-1838; Ma et al., Vaccine 1996, 14:1366-1374; Schutzer et al., N. Engl. J. Med. 1997, 337:794-795). На даний час зрозуміло, що вироблені антитіла проти OspA борелій зазвичай не стерилізують кліщів під час їжі, оскільки антитіла тільки розпізнають B. burgdorferi ss (Jobe et al., J. Clin. Microbiol. 1994, 32:618-622; Lovrich et al., Infect. Immun. 1995, 63:2113-2119), яка експресує OspA, та кліщі зазвичай заражені спірохетами B. burgdorferi ss, які не експресують OspA (Fikrig et al., Infect. Immun. 1995, 63:1658-1662; Ohnishi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2001, 98:670-675). Окрім цього, кліщі зазвичай заражені іншими патогенними видами борелій (Borrelia spp.), зокрема, B. afzelii та B. garinii (Ornstein et al., J. Clin. Microbiol. 2001, 39:1294-1298), у той час як OspA антитіла є геновидо специфічними (Lovrich et al., Infect. Immun. 1995, 63:2113-2119). Більш того, «унікальна можливість» для захисту за допомогою антитіл проти OspA борелій є обмеженою, навіть коли спірохети є чутливими, тому що експресія OspA, яка опосередковує 1 UA 99719 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 прикріплення у середній кишці кліща (Pal et al., J. Clin. Invest. 2000, 106:561-569), даунрегулюється незабаром після того, як кліщ починає годуватись (Schwan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92:2909-2913). Білок OspC B. burgdorferi ss є іншою потенційною мішенню імунітету, опосередкованого антителами проти борелій (Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178:733-741). Вважається, що цей білок має епітоп, який відповідає за вироблення антитіл проти борелій та зберігається серед патогенних видів борелій Borrelia (Lovrich et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751). Хоча специфічна функція білку OspC залишається невідомою, вважається, що експресія OspC є обов’язковою умовою зараження ссавців, проте не для зараження кліщів (Grimm et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. 101(9):3142-3147). У будь-якому випадку спірохети, які викликають хворобу Лайма, експресують OspC незабаром після того, як кліщ починає їсти (Schwan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92:2909-2913) та для зараження ссавця експресія OspC повинна продовжуватись (Stewart et al., Infect. Immun. 2006, 74:3547-3553, Tilly et al., Infect. Immun. 2006, 74:3554-3564). Внаслідок цього, “ефективність” антитіл проти OspC борелій є значно вищою у порівнянні з ефективністю антитіл проти OspA борелій. Виявили, що білок OspC може викликати вироблення захисних антитіл проти борелій (Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178:733-741, Ikushima et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29:15-21), проте деякі попередні дослідження “картування” виявили, що епітопи знаходяться у сильно гетерогенних регіонах білку OspC (Buckles et al., Clin. Vacc. Immunol. 2006, 13:1162-1165). Тому, збільшення кількості OspC антитіл проти борелій специфічних проти цих регіонів буде викликати антитіло-опосередкований імунітет тільки проти невеликої кількості штамів борелій. Лорвіч та ін. (Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751) визначили, що епітоп антитіла проти OspC борелії складається з C-термінальних 7 амінокислот (OspC7) білку. У значній мірі епітоп зберігається серед патогенних видів борелій. Однак, звичайні лабораторні штами B. burgdorferi ss, які експресують OspA (наприклад, містять ospA/ospB оперон) не можуть бути обробленими у лабораторії для того щоб викликати вироблення значних рівнів антитіл проти OspC борелій без значного зменшення їх здатності викликати вироблення антитіл проти OspA борелій. Більш того, вакцинування вбитими традиційними лабораторними штамами B. burgdorferi ss, які експресують OspA, не викликає вироблення антитіл проти OspC борелій (Schwan et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:2909-2913, Obonyo et al., 1999, J. Clin. Microbiol., 37:2137-2141). Каллістер та ін. (Патенти США №. 6,210,676 та 6,464,985, наведені у даному документі як посилання) запропонували використовувати імуногенний поліпептидний фрагмент OspC, як окремо, так і у комбінації із поліпептидом OspA, для виготовлення вакцини для людей та інших ссавців проти хвороби Лайма. Лайві та ін.. (Патент США №. 6,872,550, наведений у даному документі як посилання) також запропонували вакцину для імунізації проти хвороби Лайма, яку одержують шляхом комбінування рекомбінантних білків OspA, OspB та OspC. Однак, на сьогодні, жодна вакцина з рекомбінантних білків не має переваг над іншими вакцинами представленими на ринку. Внаслідок цього у галузі залишається потреба у покращеній вакцині для захисту ссавців та, особливо собак, від хвороби Лайма. Цитування буд-яких посилань у даному документі слід розглядати як припущення, що такі посилання є доступними як «рівень техніки» для даної заявки. Резюме винаходу Відповідно, даний винахід стосується нових імуногенних композицій, які можна використовувати у вакцинах. У одному варіанті здійснення винаходу, вакцина захищає від хвороби Лайма. У конкретному варіанті здійснення вакцину вводять собакам. У іншому варіанті здійснення вакцину вводять домашнім котам. Шляхом застосування вакцини та/або способів даного винаходу також захищають інших домашніх ссавців, таких як коней та/або велику рогату худобу. Даний винахід також стосується комбінації вакцин для вироблення захисного імунітету проти хвороби Лайма та інших хвороб, наприклад, інших інфекційних хвороб собак. Також винахід стосується способів виготовлення та застосування вакцин даного винаходу. Вакцина даного винаходу містить імунологічно ефективну кількість організмів першого або єдиного штаму (необов’язково інактивованих), які експресують OspC антиген. Штамом є одиниця організмів, вирощених у стандартних культуральних умовах, вбитих у присутності OspC-специфічних антитіл проти борелій (необов’язково комплементу), включаючи антитіла проти борелій специфічні до консервативного епітопу OspC7, виділених з тварини, вакцинованої B. burgdorferi ss 50772 (ATCC No. PTA-439). У конкретному варіантіздійснення перший або єдиний штам геновидів Borrelia, сильно експресує OspC антиген. У більш конкретному варіанті здійснення першим штамом є B. burgdorferi ss 50772 (ATCC No. PTA-439). 2 UA 99719 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Композиція вакцини даного винаходу також може містити імунологічно ефективну кількість інактивованих організмів одного або кількох додаткових штамів (які у даному документі загально позначають другим штамом), з патогенних геновидів Borrelia. У конкретному варіанті здійснення другий штам експресує OspA та OspB антигени. Приклади бажаних других штамів включають один або кілька з наступних: B. burgdorferi ss S1-10 (ATCC No. PTA-1680), B. burgdorferi ss B-31 (ATCC No. 35210), B. afzelii (e.g., available as ATCC No. 51567) та B. garinii (наприклад, наявні як ATCC Nos. 51383 та 51991), B. burgdorferi ss DK7, B. burgdorferi ss 61BV3, B. burgdorferi ss ZS7, B. burgdorferi ss Pka, B. burgdorferi ss IP1,IP2,IP3, B. burgdorferi ss HII, B. burgdorferi ss P1F, B. burgdorferi ss Mil, B. burgdorferi ss 20006, B. burgdorferi ss 212, B. burgdorferi ss ESP1, B. burgdorferi ss Ne-56, B. burgdorferi ss Z136, B. burgdorferi ss ia та/або будь-які їх комбінації. 4 10 Композиція вакцини включає від приблизно 1 x 10 до приблизно 1 x 10 організмів на мл кожного представленого штаму. У конкретному варіанті здійснення вакцина містить від 6 9 приблизно 1 x 10 до приблизно 5 x 10 організмів на мл кожного представленого штаму. У 8 8 іншому варіанті здійснення, вакцина містить від приблизно 1,0 x 10 до приблизно 5 x 10 8 організмів на мл (або кожного) другого представленого штаму та від приблизно 5,0 x10 до 9 приблизно 5 x 10 організмів на мл першого штаму. Композиція вакцини також включає фармацевтично прийнятний ад’ювант, наприклад, такий як, сполуки алюмінію (наприклад, фосфат алюмінію, гідроксид алюмінію), олії, що метаболізуються та, що не метаболізуються, блок полімери, імуностимулюючі комплекси, вітаміни та мінерали, та CARBOPOL® (наприклад, CARBOPOL 941). У конкретному варіанті здійснення фармацевтично прийнятний ад’ювант включає рівномірно дисперговані мікроскопічні краплі олії у водній емульсії (наприклад, наявні на ринку під торговою маркою Emulsigen®). Необов’язково, композиція вакцини також містить фармацевтично прийнятний імунний стимулятор, наприклад, цитокіни, фактори росту, хемокіни, супернатанти культури клітин лімфоцитів, моноцити або клітини з лімфоїдних органів, клітинні перпарати та/або екстракти рослин, бактерії або паразити, або мітогени. Винахід також стосується способу імунізації собак або інших ссавців проти патогенних видів борелій Borrelia, зокрема B. burgdorferi ss, який включає введення собаці імунологічно ефективної кількості вищеописаної вакцини винаходу. Такі вакцини можуть містити, наприклад, 8 9 від приблизно 1 x 10 до приблизно 3 x 10 організмів кожного представленого штаму. Вакцини вводять наступними шляхами: внутрішньом’язово, підшкірно, внутрішньовенно, інтрадермально, орально, інтраназально та комбінацією цих шляхів. У конкретному варіанті здійснення, після вакцинації, імунізована собака продукує антитіла проти борелій. Винахід також стосується сироватки, отриманої з вакцинованих тварин, які мають антитіла проти борелій, які зв’язують OspC B. burgdorferi ss. Також, винахід стосується очищених антитіл, які зв’язують OspC. У конкретному варіанті здійснення, сироватка містить значну кількість антитіл специфічних до OspC7 борелій. Винахід також стосується комбінації вакцин, яка містить один або кілька штамів геновидів борелій (Borrelia) даного винаходу у комбінації з одним або кількома патогенами собак та/або імуногенами, включаючи, наприклад, імуногени, які викликають імунну відповідь на вірус собачої чумки; аденовірус собак; парвовірус собак; вірус парагрипу собак; коронавірус собак; вірус грипу собак; та/або серовар Leptospira, наприклад, серовар Leptospira kirschneri grippotyphosa, Leptospira interrogans серовар canicola, Leptospira interrogans серовар icterohaemorrhagiae, та/або Leptospira interrogans серовар pomona. Додаткові патогени собак, які додають до комбінації вакцини даного винаходу, включають лейшманії Leishmania, такі як Leishmania major та Leishmania infantum; Bordetella bronchiseptica; мікоплазми Mycoplasma (наприклад, Mycoplasma cynos); вірус сказу; анаплазми, такі як anaplasma phagocytophilum та anaplasma platys; та Ehrlichia canis. Вказані та інші аспекти даного винаходу можна краще оцінити за допомогою наступних Фігур та детального опису. Детальний опис фігур 55 60 Фіг. 1 показує вестерн-болттінг контрольної сироватки нормальних собак (НС) або сироватки собак після вакцинації (день дослідження 43) тестовим продуктом (TП) або після укусу (день дослідження 134) кліщів, інфікованих B. burgdorferi ss (NI). Показано присутність антитіл специфічних до інфекції проти білку молекулярною масою приблизно 20 кДa. Фіг. 2A показує вестерн-болттінг контрольної сироватки нормальних собак (НС) або сироватки собак, виділених у окремі групи (позначені як 1-15), після вакцинування плацебо та 3 UA 99719 C2 5 10 15 20 25 укусу кліщів, інфікованих B. burgdorferi ss (день дослідження 134). Фіг. 2B показує вестерн-болттінг контрольної сироватки нормальних собак (НС) або сироватки собак, виділених у окремі групи (позначені як 1-15), після вакцинування тестовим продуктом. Показано присутність антитіл, специфічних до білків м. м. 20 кДа, у 14 (93%) собак, вакцинованих плацебо (Фіг. 2A) та у жодної (p < 0.0001) собаки, вакцинованої тестовим продуктом (Фіг. 2B). Фіг. 3A є прикладом гістопатологічних змін у суглобах собак, інфікованих B. burgdorferi ss, яких вакцинували плацебо. На площі всередині прямокутника показано значну інфільтрацію нейтрофілів та мононуклеарних клітин, якими характеризується Лайм-артрит у собак. Фіг. 3B є прикладом відсутності гістопатологічних змін у суглобах собак, інфікованих B. burgdorferi ss, яких вакцинували тестовим продуктом. Площа всередині овалу не містить інфільтрованих нейтрофілів та мононуклеарних клітин. Фіг. 4 ілюструє визначення OspC7 ELISA реактивності за допомогою нормальної сироватки (Н) тварин без попереднього лікування (діаграма) хвороби Лайма або пов’язаних з нею симптомів (n = 36), не охарактеризованої сироватки з крові донорів (BD, n = 100) або індивідуумів, які пройшли скринінг холестерину (CS, n = 100), або сироватки добровольців з факторами крові або хворобами, які зазвичай крос-реагують з антитілами до B. burgdorferi ss, включаючи антинуклеарні антитіла (ANA, n = 20), ревматоїдний фактор (RF, n = 20), мононуклеоз (EBV, n = 10), цитомегаловірус (CMV, n = 10), сифіліс (SYPH, n = 13) або плямисту лихоманку Скелястих Гір (RMSF n = 4). Безперервна лінія означає три стандартні відхилення від середнього рівня адсорбції нормальних та можливо крос-реактивних сироваток. Значення над лінією відповідають позитивним результатам до 99% можливого (1% п’єдестал). Фіг. 5 ілюструє OspC7 ELISA реактивність шляхом використання сироватки пацієнтів можливо хворих хворобою Лайма з мігруючою ерітемою (n = 86), представлених пацієнтами з типовими пошкодженнями від хвороби Лайма, можливо хворі на хворобу Лайма пацієти з «атиповими пошкодженнями» (n = 22), та можливі пацієнти хворі на хворобу Лайма зі структурними симптомами (n = 49) [початкові кілнічні симптоми]. Безперервна лінія означає три стандартні відхілиення від середнього рівня адсорбції нормальних та можливо крос-реактивних сироваток. 30 35 40 45 50 55 60 Детальний опис винаходу Даний винахід стосується композиції, яка містить імунологічно ефективну кількість організмів одного або кількох штамів геновидів Borrelia, які викликають імунітет, опосередкований антитілами проти борелій у вакцинованих тварин. Коли організми таких штамів вирощують у стандартних умовах вирощування геновидів борелій, то вони помирають у присутності OspCспецифічних антитіл, наприклад, антитіло або антитіла, виділені з тварин, вакцинованих B. burgdorferi ss 50772 (ATCC No. PTA-439). У одному аспекті даного винаходу, вакцина даного винаходу викликає вироблення антитіл більшої ефективності у порівнянні зі звичайними вакцинами, які основані виключно на антитілах проти OspA борелій. У іншому аспекті даного винаходу, вакцина даного винаходу краще стимулює сприятливу вторинну імунну відповідь, наприклад, завдяки експресії OspC in vivo, та/або додаткового та/або покращеного захисту проти різноманітних патогенних штамів видів борелій. У одному варіанті здійснення даного винаходу, коли організми таких штамів вирощують при стандартних умовах вирощування геновидів борелій вони значно експресують OspC антиген. У конкретному варіанті здійснення, коли організми таких штамів вирощують при стандартних умовах вирощування геновидів борелій, їх вбиває специфічна реакція комплементу. У іншому варіанті здійснення, значна кількість OspC-специфічних антитіл проти борелій вироблених у сироватці у відповідь на введення вакцини, яка містить організми таких штамів, є специфічною до епітопу OspC7, та, таким чином, забезпечує захист проти різноманітних патогенних геновидів борелій (наприклад, B. burgdorferi ss, B. afzelii та/або B. garinii). У іншому варіанті здійснення, організми таких штамів не експресують OspA або OspB антигени. У іншому варіанті здійснення, організми таких штамів мають будь-які дві або кілька таких властивостей. У іншому варіанті здійснення, організми таких штамів мають будь-які три або більше таких властивостей. У іншому варіанті здійснення, організми таких штамів мають будь-які чотири або більше таких властивостей. У конкретному варіанті здійснення, організми таких штамів мають всі такі властивості. Одним таким конкретним штамом є B. burgdorferi ss 50772 (ATCC No. PTA-439). У альтернативному варіанті здійснення винаходу, вакцина винаходу представлена композицією, яка містить як перший штам, описаний вище, та ефективну кількість організмів щонайменше другого штаму. Другий штам бажано вибирають з патогенних геновидів борелій, 4 UA 99719 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 які викликають антитіла проти OspA борелій, при їх введенні як частини вакцини винаходу. Також до даної вакцина додають один або кілька сумісних геновидів. Додатково вакцина даного винаходу містить один або кілька патогенів інших ссавців (наприклад, собак) та/або імуногенів. Наступні пояснення надають з метою більш чіткого розуміння винаходу. Застосуванняі термінів у однині в описі винаходу не має на меті таке обмеження. Таким чином, наприклад, посилання на композицію, яка містить «поліпептид» включає посилання на один або кілька таких поліпептидів. Окрім цього термін «організм» включає множину таких оранізмів, доки не вказано протилежне. Як вказано у даному документі термін "приблизно" означає, що всі значення в межах 50% 10 від зазначеного значення, входять в нього, наприклад, композиція містить приблизно 1  10 9 10 організмів на мл означає, що вона містить від 5  10 дo 5  10 організмів на мл. Термін "геновиди" вперше використав та визначив Барантон та ін (G. Baranton et al., 1992, International J. of Systematic Bacteriology 42: 378-383), та використовується у даному документі подібно до того, як термін «види» застосовують при описуванні систематики не борелій. "Стандартні умови вирощування" для культивування геновидів борелій потребують o вирощування при температурі, яка знаходиться в діапазоні від приблизно 33 C до приблизно o 35 C, у BSK середовищі (Barbour Stoenner Kelly). BSK середовище, як описано у даному документі, одержували згідно з Callister et al. [Detection of Borreliacidal Антитіла by Flow Cytometry, Sections 11.5.1 - 11.5.12, Current Protocols in Cytometry, John Wiley and Sons, Inc. Supplement 26, (2003) включені у даному документі як посилання]. (BSK середовище також є наявним на ринку, наприклад, від фірми Sigma, St. Louis, MO). Як вказано у даному документі “OspC7” означає імунодомінантний епітоп антитла проти борелій, розташований у регіоні 7 амінокислоти (Lovrich et al., 2005, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12:746-751, включено у даному документі як посилання) всередині C-кінцевих 50 амінокислот OspC, як описано Callister et al. (Патенти США № 6,210,676 B1 та 6,464,985 B1, які включені у даному документі як посилання) які повністю збережені серед відомих патогенних видів борелій. Таке збереження підтверджується дослідженням BLAST сегменту кодону, який кодує сегмент сьомої амінокислоти, описаний Lovrich et al. В результаті такого дослідження, проведеного 9 жовтня 2006 року, визначено перелік 100 видів борелій, які містять сегмент, який кодує епітоп OspC 7. "OspC-специфічне антитіло проти борелій" означає антитіло, виділене з, наприклад, сироватки тварин, вакцинованих B. burgdorferi ss 50772 (ATCC No. PTA-439), та антитіло, яке селективно зв’язує будь-який епітоп антигену OspC та вбиває спірохет, чутливих та нечутливих до комплементу. "OspC7-специфічне антитіло проти борелій" означає антитіло присутнє, наприклад, у сироватці тварин, вакцинованих B. burgdorferi ss 50772 (ATCC No. PTA-439), та антитіло, яке селективно приєднується до 7 C-термінальних амінокислот OspC, як описано Lovrich et al. [Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12:746-751, (2005), включено у даному документі як посилання] та вбиває спірохет (головним чином шляхом викликання комплементопосередкованого мембрано-атакуючого комплексу). Специфічність антитіл проти OspC борелій є добре дослідженою. Наприклад, антитіла проти OspC борелій зазвичай знаходять у сироватці хворих на хворобу Лайма, шляхом вимірювання чутливості B. burgdorferi ss 50772 до тесту на антитіла проти борелій. Сироватка людей з тісно пов’язаними захворюваннями рідко містить (2%) крос-реактивні антитіал, які також вбивають штам 50772 (детально описаний Callister, et al., 1996, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 3(4): 399-402). Окрім цього, пептид ELISA, який використовує епітоп OspC7 борелій безпомилково захоплює антитіла проти борелій у сироватці хворих на хворобу Лайма, та сироватці пацієнтів з тісно пов’язаними хворобами рідко ( 13% зсув середнього значення інтенсивності флуоресценції у порівнянні з нормальною контрольною сироваткою розглядали як позитивний (Callister et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002, 9:908-912). Присутність нерухомих B. burgdorferi підтверджували 10 UA 99719 C2 темнопольною мікроскопією. Позитивний контроль включали у кожну пробірку, та визначали однакову реактивність (+/- одне розведення) від дослідження к дослідженню для мінімізування розбіжностей всередині аналізу. Окрім цього, зразки сироватки, зібрані з кожної собаки аналізували одночасно. 5 10 B. результати Вакцинація тільки вакциною rOspA викликало вироблення тільки мінімальної кількості (середній титр 2560) та рівень антитіл залишався підвищеним протягом дослідження. Таблиця 2 a b Середній титр антитіл проти OspA борелій після вакцинації собак вакцинами rOspA або GALAXY (S-1-10) проти хвороби Лайма Вакцина rOspA S-1-10 15 20 Тиждень 3 9 1470 Тиждень 7 61 >2560 Тиждень 9 4 970 Тиждень 15 c ND 735 a відповідне розведення. виявлені за допомогою B. burgdorferi ss S-1-10. c ND = не виявлено. b Тому, рекомбінантна OspA вакцина для собак не здатна викликати вироблення значних титрів антитіл до OspA борелій у хом’яків. Приклад 2 Вакцинація рекомбінантним OSPC 25 A. матеріали та методи - тварини: Хом’яки LVG віком від 5- до 10 тіжнів отримали від компанії Charles River Breeding Laboratories, Inc. (Wilmington, Mass.). Хом’яків помістили по три або чотири тварини у клітку при температурі навколишнього середовища 21C та забезпечували їжею та водою ad libitum. 30 35 40 45 50 - одержання рекомбінантної (“r”) OspC вакцини rOspC одержували з E. coli JM109 яка містить pX3-22, як раніше описано (Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178:733-741). Коротенько, E. coli культивували при 37C у 2xTY бульйоні, який містить ампіцилін, та додавали ізопропіл- -d-галактопіранозид (IPTG) (0,1 мM) протягом експоненціальної фази росту. Клітини осаджували центрифугуванням, ресуспендували у сольовому фосфатному буфері (PBS), та здійснювали лізис клітин шляхом обробки ультразвуком. Додавали Triton X-100 (1% об./об.), та лізат центрифугували при 10,000 x g протягом 5 хв. Клітини E. coli, оброблені ультразвуком, осаджували шляхом центрифугування, та супернатант пропускали крізь колонку, яка містила смолу SoftLink (Promega), яка зв’язувала OspC завдяки біотинільованому вільному кінцю термінальної амінокислоти. Зв’язані OspC елюювали буфером для очищення, який також містив 5 мМ біотин (Sigma). - Вакцинація хом’яків та збирання сироватки: Хом’яків вакцинували підшкірно у задню поверхню шиї 0,1 мл повного ад’юванту Френда, який містив 75 мкг rOspC, та після цього проводили бустер вакцинацію 0,1 мл неповного ад’юванту Френда, який містив 75 мкг rOspC, через три тижня після первинної вакцинації. На 5 тиждні після первинної вакцнації хом’яків анастезували шляхом інгаляції етером, у масці на рот та ніс, та кров відбирали за допомогою внутрішньосерцевої пункції. Кров згорталась, після чого відділяли сироватку та зберігали її при -70C до використання. Окрім цього, збирали сироватку з трьох невакцинованих хом’яків та використовували як нормальну контрольну сироватку. - Виявлення OspC Антитіл: 11 UA 99719 C2 5 10 15 20 25 rOspC розводили до 1000 нг/мл у буфері для сенсибілізації поверхні (0,015 M Na2CO3, 0,035 M NaHCO3, pH 9,6) та додавали по 100 мкл у індивідуальні плоскодонні амін-зв’язуючі мікротитр лунки (Costar, Cambridge, Mass.). Мікротитр-планшети інкубували протягом ночі при 4C. Після інкубування планшети тричі промивали PBS (pH 7,2) та блокували PBS, який містив 0,05% TWEEN 20 (Sigma) та 1% альбуміном бичачої сироватки (Sigma) протягом 1 години при кімнатній температурі струшуючи. Після блокування, планшети знову промивали PBS. Після цього, 100 мкл сироватки хом’яків, серійно розведеної від 1:80 дo 1:20,480 у PBS/Tween, додавали до індивідуальних лунок, та планшети інкубували протягом години при кімнатній температурі. Після інкубації, планшети тричі промивали PBS, до кожної лунки додавали по 100 мкл кон’югату міченого пероксидазою хріна проти-хом’ячного IgG (Organon Teknika Cappel), розведеного 1:3000 у PBS/Tween, та планшети повторно інкубували при кімнатній температурі протягом години. Після цього планшети тричі промивали PBS та до кожної лунки додавали 100 мкл o-фенілендіамін фосфату (0,4 мг/мл; Sigma) та інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Реакції зупиняли шляхом додавання 100 мкл 1 N H2SO4 та відразу ж вимірювали оптичну густину при 490 нм (модель EL 311; Bio-Tek Inc. Winooski, Vt.). - Виявленя антитіл проти OspC борелій: Антитіла проти OspC борелій виявляли як описано вище (приклад 1), окрім B. burgdorferi ss 50772. B. Результати Вакцинування rOspC вакциною, викликало вироблення значних рівнів антитіл проти OspC, що було виявлено за допомогою ELISA (Таблиця 3, infra), проте було виявлено тільки незначну активність проти борелій (титр 80). Вакцинування rOspC викликало вироблення значних концентрацій антитіл проти OspC, проте спостерігали вироблення антитіл (тобто опсонізуючих), що не забезпечать захист від інфекції. Це мало особливе значення, коли вакцина B. burgdorferi ss 50772 містила концентрацію білків 75 мкг, яку розраховували не враховуючи велику кількість не-OspC білків. Загальний результат (Приклади 1 та 2) внаслідок цього підтвердив попередні данні (Straubinger et al. Вакцина 2003, 20:181-193), що рекомбінантні Osps стимулювали значно меншу кількість антитіл проти борелій, які є нешкідливими для B. burgdorferi ss. 30 Таблиця 3 a Cередній титр антитіл, виявлений за допомогою OspC ELISA b або тесту на антитіла проти OspC борелій після вакцинування rOspC Зразок Нормальний rOspC Титр антитіл виявлений за допомогою: OspC ELISA тесту на антитіла проти OspC борелій c ND ND 10240 80 a відповідне розведення пулу сироваток з 5 хом’яків. виявлено при використанні B. burgdorferi ss 50772 c ND = не виявлено. b Таким чином, рекомбінантна вакцина для собак проти OspC не викликає вироблення достатніх титрів антитіл проти OspC борелій у хом’яків. 35 40 45 Приклад 3 Вакцинування штамом BURGDORFERI ss S-1-10 A. матеріали та методи - організм: B. burgdorferi ss штам S-1-10 є типовим патогенним штамом, який зазвичай не можна відрізнити від штаму B31 B. burgdorferi ss (Barbour et al., J. Infect. Dis.,1985, 152:478-484). Цей штам одержав Dr. Steven M. Callister, Gundersen Lutheran Medical Foundation, La Crosse, WI, з нирок білонового хом’ячка, Peromyscus leucopus, зхопленого у лютому 1988 неподалік від Ла Гросс, штат Вісконсін (La Crosse, WI), та компанія Solvay Animal Health отримала патент на включення цього штаму у вакцину для собак проти хвороби Лайма. Промисловий продукт (GALAXY Lyme) було придбано Schering Plough Animal Health 17 квітня 1997. Такий штам експресує OspA, OspB та OspC. Однак, звичайні інфекційні штами B. burgdorferi ss, продукують 12 UA 99719 C2 значно більші концентрації OspA та OspB, коли спірохети культивують у лабораторному BSK середовищі. Показали, що експресію OspC можна звести до мінімуму шляхом інкубації при 35ºC (Schwan, Biochem. Soc. Trans. 2003, 31:108-112). 5 - Тварини Цуценят хорта віком вісім тижнів (Ridglan Farms, Mount Horeb, WI) помістили разом, та давали їжу та воду ad libitum. Експеримент було розглянуто та затверджено Schering Plough Animal Health Animal Care та Комітетом утримання та використання тварин (IACUC). 10 - Одержання вакцини із включеним в неї штамом S-1-10 B. burgdorferi ss: Свіжу культуру B. burgdorferi ss S-1-10, яка досягла логаріфмічної фази росту при інкубації у BSK при 35C, інактивували шляхом додавання бінарного етиленіміну (BEI) до кінцевої концентрації 10 мM та інкубували протягом додаткових 48 годин. Після інактивації, BEI нейтралізували шляхом додавання стерильного тіосульфату натрію та інкубували при 35C протягом 6-12 годин. Після цього спірохети осаджували шляхом центрифугування та ресуспендування у стерильному збалансованому сольовому розчині, який містив < 30 мкг гентаміцину/мл та 211 ND c День 28 >8128 ND День 35 > 6160 ND День 43 День 78 День 106 День 134 День 162 День 197 >4889 ND 1404 ND 970 ND 970 ND 1016 ND 220 ND a відповідне розведення. виявлено при застосуванні тесту на антитіла проти борелій штаму B. burgdorferi ss S-1-10. c ND = не виявлено. b Таблиця 7 a b Середні титри (n = 15) активноті проти борелій після вакцинування вакциною Група вакциновані контролі День -3 c ND ND День 21 ND ND День 28 1470 ND День 35 884 ND День 43 221 ND День 78 50 d N/A День 106 48 N/A День 134 46 N/A День 162 42 N/A День 197 42 N/A a відповідне розведення. виявлено при застосуванні тесту на антитіла проти борелій штаму B. burgdorferi ss 50772. c ND = не виявлено. d N/A = не можна застосувати. b 5 10 - апробація антитіл проти OspA та OspC борелій. Для того, щоб підтвердити вироблення антитіл проти OspA та OspC борелій, імунну сироватку п’яти собак, вакцинованих вакциною, пропускали крізь розділювальну колонку, яка містила rOspA або rOspC, та досліджували активність проти борелій. Видалення OspAспецифічних або OspC-специфічних антитіл шляхом насичення сироватки переважно рекомбінантними білками (> 4-рази зменшення) зменшило активність проти борелій, виявлену при застосуванні штаму B. burgdorferi ss S-1-10 або 50772, відповідно. Совокупні дані таким чином підтверджують, що вакцина викликає вироблення значних рівнів антитіл проти OspA та OspC борелій, та активність проти борелій, виявлена при застосуванні штаму B. burgdorferi ss S1-10 або 50772, складалась майже повністю із антитіл специфічних до OspA або OspC борелій відповідно. Дивиться Таблицю 8 нижче. 15 18 UA 99719 C2 Таблиця 8 Вплив видалення антитіл проти OspA або OspC на активність проти борелій у сироватці собак (n = 5) вакцинованих вакциною а Сироватка до абсорбції 1 5120 2 2560 3 10240 4 2560 5 1280 OspA контроль 2560 OspC контроль Титр антитіл проти борелій b OsoA після абсорбції до абсорбції 160 5120 160 5120 d ND 5120 ND 1280 80 2560 ND --2560 C OspC після абсорбції 640 320 320 160 320 -ND a відповідне розведення. сироватка зібрана на 43 день дослідження. с сироватка зібрана на 28 день дослідження. d ND = не виявлено. b 5 10 - підтвердження наявності антитіл специфічних до OspC7 борелій Для того, щоб підтвердити наявність антитіл проти OspC борелій, більша частина яких є специфічними по OspC7, імунну сироватку п’яти собак вакцинованих вакциною пропускали крізь колонку, яка містить rOspC7, та визначали вплив на активність проти борелій. Видалення антитіл, специфічних проти OspC7 шляхом насичення сироватки рекомбінантним білком OspC7, значно зменшило (в 2-4 рази) активність проти борелій, виявлену при застосуванні штаму B. burgdorferi ss 50772. Таким чином, ці дані підтвердили, що вакцина викликає вироблення значних рівнів антитіл проти OspC борелій, специфічних по епітопу OspC7. Дивитись таблицю 9 нижче. Таблиця 9 Вплив видалення антитіл проти OspC7 на активність проти борелій у сироватці собак (n = 5) вакцинованих вакциною a Сироватка 1 2 3 4 5 OspC контроль Титр антитіл проти борелій : до насичення після насичення 20480 5120 10240 5120 10240 2560 5120 2560 10240 2560 2560 ND а відповідне розведення. сироватка зібрана на 28 день дослідження. c ND = не виявлено. b 15 - Здатність антитіл проти OspA та OspC борелій стерилізувати інфікованих кліщів: Дослідження середньої кишки кліщів, які годувались на вакцинованих або контрольних собаках, підтвердило, що антитіла проти OspA та OspC борелій, вироблення яких викликане введенням вакцини, стерилізували кліщів. B. burgdorferi ss виявили у мазку 34 (32%) - 106 самиць кліщів, які годувались на 13-15 плацебо-вакцинованих собаках (Таблиця 10 нижче). 19 UA 99719 C2 Навпаки, не було виявлено спірохет (0-99) у середній кишці самиць кліщів, які годувались на собаках, вакцинованих вакциною (p < 0,0001). Таблиця 10 Виявлення B. burgdorferi ss у самок кліщів, видалених з вакцинованих або контрольних собак Група дослідження Вакциновані Контроль Досліджувані Самки Кліщів (які годувались та не годувались) 99/151 (61%) 106/148 (64%) Мазки позитивні на B. burgdorferi 0/99 (0%) 34/106 (32%) Загальна кількість позитивних собак 0/15 13/15* * p < 0,0001 5 10 - Здатність вакцини запобігати поверненню B. burgdorferi ss з шкіри: Антитіла проти борелій, викликані введенням вакцини, також запобігають утворенню колоній спірохет на шкірі. B. burgdorferi ss одержали з 56 (79%) із 71 біопсій, зібраних з собак вакцинованих плацебо через місяць після укусу кліща (Таблиця 11 нижче), та спірохет одержали щонайменше з однієї біопсії шкіри 14 (93%) із 15 собак. Навпаки, B. burgdorferi ss не виявили у жодній біопсії шкіри, із біопсій взятих у собак, вакцинованих вакциною (p < 0,0001). Таблиця 11 Виділення B. burgdorferi ss з шкіри вакцинованих або невакцинованих контрольних собак Група дослідження День 78 День 106 День 134 День 162 День 197 Загальна кількість Загальна позитивних кількість біопсій позитивних собак 0/15 0/15 0/15 0/15 0/13 0/73 (0%) 0/15 (0%) 12/15 13/15 11/15 11/14 9/12 56/71 (79%) 14/15* (93%) Вакциновані Контроль P < 0,0001 15 20 25 30 - Здатність вакцини запобігати серологічному доказу інфекції: Вакцина також запобігає утворенню антитіл специфічних до хвороби Лайма. Попередні дослідження (Доповідь SPAHC B01-184-01R) підтвердили, що зараження B. burgdorferi ss надійно викликає вироблення антитіл у собак, які зв’язують білки молекулярною масою приблизно 20 кДа, та відповідь не була викликана введенням вакцини (Фіг. 1). У наступних дослідження антитіла, які зв’язують білки м.м. 20 кДа специфічні до інфекції, швидко виявляли у сироватці 14 (93%) з 15 контрольних собак, вакцинованих плацебо (Фіг. 2A). Окрім цього, сироватку, яка не містила жодних антитіл проти білків м.м. 20 кДа, взяли з контрольної собаки, яка не була заражена спірохетами з шкіри. Навпаки, антитіла проти білків м. м. 20 кДа не вироблялись (p 121 День 106 48 > 463 День 134 46 > 640 День 162 42 > 390 День 197 42 > 403 Загальна кількість собак з підвищеними титрами 0/15 10/15* *p = 0,0002 a відповідне розведення. b виявлено при зараженні штамом B. burgdorferi ss 50772. 5 10 15 20 - Здатність вакцина запобігати появі явних розладів кінцівок/суглобів: Попередні дослідження (Summers et al., J. Comp. Path. 2005, 133:1-13, Wikle et al., J. Appl. Res. Vet. Med. 2006, 4:23-28) виявили, що зараження B. burgdorferi ss рідко викликає появу явних розладів кінцівок/суглобів (наприклад, набряк, кульгавість), та ці дані підтверджені також даними дослідженнями. Порушення суглобів спостерігали тільки у однієї (8%) собаки, вакцинованої плацебо. Через 9 тижнів після укуса кліща ліва передня нога собаки заклякла, та з ліктя виявили спірохети B. burgdorferi ss. Однак, цих даних було достатньо, тому що у двох собак, вакцинованих вакциною, також розвилась закляклість однієї або кількох кінцівок, проте, на відміну від собак, вакцинованих плцебо, спірохети не знайшли у жодній з тканин. Для того, щоб ускладнити розвиток явних симптомів, собак, що залишились, імуносуперсували. Після цього, три контрольні собаки, вакциновані плацебо, почали кульгавити та у двох з цих собак виявили B. burgdorferi ss. Навпаки, у імуносупресованих собак, вакцинованих вакциною, не спостерігали кульгавості. Таким чином, совокупні данні показали, що вакцина запобігає розвитку артриту Лайма, хоча результати не були достатніми (p = 0,0996). Тим не менш треба подивитись додаткові дані наведені та обговорені нижче. - Здатність вакцини запобігати ерозійним змінам пов’язаним з зараженням B. burgdorferi ss: 25 30 Коли суглоби вищевказаних собак дослідили мікроскопом, то отримані дані чітко підтвердили ефективність вакцини. Капсули суглобів собак, вакцинованих вакциною, що залишились (n = 13), були нормальними. Навпаки, одна або кілька сполучних тканин шести (p = 0,0034) з 11 плацебо-вакцинованих контрольних собак (Таблиця 7 вижче), мали значне запалення, яке характеризувалось запаленням нейтрофілів та мононуклеарних клітин (Фіг. 3). Більш того, B. burgdorferi ss не виділили з жодної тканини собак, вакцинованих вакциною, однак спірохет виявили у сполучних тканинах п’яти (83%) з 6 плацебо-вакцинованих контрольних собак з ерозійними змінами. Таким чином совокупні результати підтвердили, що вакцина запобігає розвитку артриту Лайма у собак та також підтверджує попередні заяви щодо того, що синдром зазвичай характеризується субклінічним синовітом (Summers et al., J. Comp. Path. 2005, 133:1-13; Wikle et al., J. Appl. Res. Vet. Med. 2006, 4:23-28). 35 Приклад 7 Специфічність природних антитіл, спрямованих проти епітопу OSPC7 борелій 40 45 Дані, які підтверджують, що взяті з ссавців антитіла є специфічними проти OspC7 борелій, одержували шляхом дослідження сироватки з індивидів (людей) з історією та без історії хвороби Лайма або симптомів, пов’язаних з хворобою Лайма, та є наступними. A. Матеріали та методи 1. Сироватка: Зразки нормальної сироватки з індивідів без попередньої історії (діаграма) хвороби Лайма або симптомів пов’язаних з хворобою Лайма (n = 36), не характеризованої сироватки з крові донорів (n = 100) або індивідів, яких піддавали скринінгу по холестерину (n = 100), або сироватки волонтерів з факторами крові або захворюваннями, які зазвичай крос-реагують з 21 UA 99719 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антигенами B. burgdorferi ss, включаючи антинуклеарні антитіла (n = 20), ревматоїдний фактор (n = 20), мононуклеоз (n = 10), цитомегаловірус (n = 10), сифіліс (n = 13) або Плямисту лихоманку скелястих гір (n = 4), зберігали при -20C. Сироватки, зібрані з пацієнтів з хворобою Лайма, досліджували у медичному центрі Gundersen Lutheran Medical Center протягом 2003 або 2004. Сироватки (n = 86) пацієнтів з мігруючою ерітемою (EM), які відповідали критерію контролю CDC (Centers for Disease Control and Prevention. Morb. Mort. Wkly. Rep. 1990, 39:1921.), класифікували як практично з хворобою Лайма, сироватку (n = 22) пацієнтів, яких кусав кліщ та атипічними пошкодженнями шкіри класифікували як можливо з хворобою Лайма (n = 49), та сироватку пацієнтів, яких кусав кліщ та системними симптомами, які включають початковий головний біль, лихоманку, міаглію та артралгію, класифікували як імовірно з хворобою Лайма. Сироватку збирали протягом першого візиту, які зберігали при -20C, та блокували перед початком дослідження. Пептид OspC7. Пептид 7-aa OspC7 (AESPKKP; SEQ ID NO: 1) синтезували у університеті University of Wisconsin Biotechnology Center (Madison, WI) за допомогою автоматичного синтезатору (Protein Technologies) та способу Fmoc (Fields, et al., Peptide Res. 1991, 4:95-101). Після синтезу аміно-термінальний кінець пептиду біотинілювали вручну за допомогою активації HBTU та очищали рідинною хроматографією високого тиску. Композицію підтверджували іонізацією лазерною десорбцією в присутності матриці аналізатором time-of-flight (MALDI-TOF) мас-спектрометрії (прогнозована маса 1095,4; отримана маса 1095,8). OspC7 ELISA. Індивідуальні лунки мікротитр-планшет (Immunolon 2 HB, Thermo Labsystems, Franklin, MA) покривали 100 мкл суспензії стрептавідину концентрацією 4 мкг/мл (Pierce, Rockland, IL) у карбонатному буфері (90 мM NaHCO3, 60 мM Na2CO3; pH 9,6) та інкубували протягом ночі при 4C. Після інкубації планшети п’ять разів промивали сольовим розчином, забуференим Tris (TBS-T; 13 мM Tris HCl, 3 мM Tris основа, 140 мM NaCl, 2,7 мM KCl; pH 7,4), який містив 0,05% Tween 20. Після промивання, 200 мкл буферу для блокування (15 мM NaCl, 10 мM Tris HCl, 3% сироватка бичачого ембріону, 0,05% Tween 20), який містить 1 мкг/мл біотинільованого пептиду OspC7, додавали до кожної лунки та інкубували при повертанні (150 об./хв..) протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшети тричі промивали TBS-T та піддавали взаємодії з 100 мкл сироватки, розведеної 1:200 буфером для блокування, протягом 1 години при кімнатній температурі. Вторинне антитіло було представлено пероксидазакон’югованими козячими анти-людськими IgM та IgG (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, Md.), розведеними 1/15,000 у буфері для блокування. Після інкубування протягом години, зв’язані вторинні антитіла обліковували шляхом додавання o-фенілендіаміну та перекису водню у цитратному буфері (Sigma, St. Louis, Mo.) та вимірювали OD при 490 нм (SpectraMax 250; Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.). B. Результати У попередніх дослідженнях (Jobe et al., Clin. Diagn. Lab. Immuno. 2003, 10:573-578, Lovrich et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751), високо стабільний імунодомінантний OspC бореліцидний антитіло епітоп був локалізований у регіоні 7 амінокислот біля С-термінального кінця (OspC7). Для підтвердження епітопу, який викликає вироблення антитіл специфічних до зараження бореліями Borrelia spp., порівнювали реактивності ELISA з використанням OspC7, сироватки пацієнтів хворих на хворобу Лайма (Фіг. 5) та сироватки нормальних пацієнтів або пацієнтів з іншими захворюваннями, при яких виробляються антитіла, які також можуть зв’язувати борелій Borrelia spp. (Фіг. 4). На Фігурах 4 та 5, на лінії де вказано спектральну поглинальну здатність 1,25 означає три стандартних відхилення від середнього значення спектральної поглинальної здатності нормальної та потенційно крос-реактивної сироватки. Всі результати, які знаходяться над лінією тим не менш мають (99% можливого) достатню реактивність (позитивну). Дуже рідко виявляли значну реактивність у нормальній або потенційно крос-реактивній сироватці (Фіг. 4). Також треба відмітити, що більшість результатів отримали, використовуючи сироватку, отриману з пацієнтів, можливо хворих на хворобу Лайма, тому що сироватки (CS) отримували з групи, яка складалась з 100 пацієнтів, які спостерігались у медичному центрі Gundersen Lutheran Medical Center for a variety of ailments. Цей регіон є високоендемічним фокусом хвороби Лайма, та особливості та анамнез пацієнтів були невідомі. Навпаки, позитивні сироватки не були виявлені у зразках сироваток (n = 100), зібраних хаотично з донорів крові (BD) у Мілуокі, не ендемічному регіоні Вісконсіну. Окрім цього, позитивні результати (більше ніж 3 стандартні відхилення від значення сироватки, яка не повинна реагувати – Фіг. 4) колективно визначили в сироватці пацієнтів, хворих на хворобу Лайма, та значення спектральної поглинальної здатності були високі (Фіг. 5). Тим не менш колективні дані підтвердили високу специфічнвсть антитіл, спрямованих проти 22 UA 99719 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 епатопу OspC7, та імунодомінантність відповіді протягом хвороби Лайма людини. Підсумовуючи вищенаведені дані, групи (15 собак) щінків віком 8 тижнів вакцинували та 8 7 бустер-вакцинували вакциною, яка містила 5,0  10 B. burgdorferi ss 50772, 2,5  10 B. burgdorferi S-1-10 ss та 5% Emulsigen® або плацебо, яке містило тільки 5% Emulsigen®. Вакцина викликала невеличкий набряк у місці введення, який швидко спав. Більш значно, вакцина викликала вироблення високих концентрацій антитіл проти OspA та OspC борелій, з піком через тиджень після бустер-вакцинування та, які можна було виявити протягом дослідження. Окрім цього, значна частина антитіл проти OspC борелій була специфічною до сильно стабільного епітопу OspC7. Самиць клішів I. scapularis, інфекованих бореліями B. burgdorferi ss, годували на вакцинованих собаках, та дослідження середніх кишок кліщів підтвердили, що антитіла проти OspA та OspC борелій у крові, яку всмоктував паразит, повністю вбили борелій B. burgdorferi ss. Зокрема, B. burgdorferi ss виявили у 34 (32%) кліщів, зібраних з контрольних собак, вакцинованих плацебо, та не виявили у кліщів (n = 99), яких годували на собаках, вакцинованих вакциною (p 7075 >5120 ND ND ND День 49 День 79 День 114 День 142 >4457 735 926 532 ND ND ND ND 20 Група Вакциновані Контрольні День 175 702 ND День 210 День 238 День День 302 День 322 День 357 День 394 266 611 926 557 508 351 211 175 ND ND ND ND ND ND ND a відповідне розведення. виявлено при здійсненні тесту на антитіла проти штаму борелій B. burgdorferi ss S-1-10. c ND = не виявлено b 25 Таблиця 14 a b Середні титри (n = 15) активності проти борелій після вакцинування вакциною Група Вакциновані Контрольні Група Вакциновані Контрольні День -4 ND ND c День 175 ND ND День 21 40 ND День 210 ND ND День 28 День 35 1689 ND 532 ND День 238 День 266 ND ND ND ND День 49 69 ND День 302 ND ND День 79 41 ND День 322 ND ND День 114 ND ND День 357 ND ND День 142 ND ND День 394 ND ND a 30 відповідне розведення. виявлено при здійсненні тесту на антитіла проти штаму борелій B. burgdorferi ss 50772. c ND = не виявлено b  Здатність антитіл проти OspA та OspC борелій стерилізувати інфікованих кліщів: 24 UA 99719 C2 5 Дослідження середніх кишок кліщів, які годувались вакцинованими або контрольними собаками, підтвердило, що антитіла проти OspA та OspC борелій, викликані у відповідь на введення вакцини, стерилізували кліщів. B. burgdorferi ss виявили у мазках 15 (16%) з 95 самиць кліщів, яких годували на 12 з 15 плацебо-вакцинованих собаках (Таблиця 15). Навпаки, B. burgdorferi ss виявили у мазках кліщів тільки 2 (3%) з 75 самиць кліщів, які годувались на 2 з 15 вакцинованих собак (p = 0,0003). Таблиця 15 Виявлення B. burgdorferi ss у самицях кліщів, видалених з вакцинованих або контрольних собак a Група обробки Самки Кліщів Мазки позитивні на B. burgdorferi Загальна кількість позитивних собак Вакциновані 75/148 2/75 (51%) (3%) 95/146 15/95 (65%) 2/15 (16%) Контрольні 10 12/15* *p = 0,0003 a наповнені та ненаповнені кров’ю - Здатність вакцини запобігати відновленню зараження B. burgdorferi ss з шкіри: 15 20 Антитіла проти борелій, викликані у відповідь на введення вакцини, також запобігають збереженню B. burgdorferi на шкірі. B. burgdorferi ss видаляли з 33 (44%) з 75 біопсій, взятих з плацебо-вакцинованих собак через місяць після укусу кліща (Таблиця 16). Навпаки, B. burgdorferi ss виявили тільки у 6 (8%) з 75 біопсій, взятих з собак, вакцинованих вакциною (p < 0,0001). Спірохет виявили на щонайменше одній біопсії шкіри 10 (67%) з 15 контрольних собак, у порівнянні з 6 (40%) з 15 вакцинованих собак. Однак, у вакцинованих собак штами виявляли тількі перший місяць після вакцинування, у той час як у 8 (80%) з 10 контрольних собак з позитивною культурою виявляли біопсії шкіри позитивні на B. Burgdorferi протягом наступних місяців дослідження. Таблиця 16 Видалення B. burgdorferi ss з шкіри вакцинованих або невакцинованих контрольних собак Група День 43 День День День День дослідження PC 77 PC 112 PC 147 PC 174 PC Вакциновані (A) Контрольні (B) 25 6/15 0/15 0/15 9/15 8/15* 7/15 * a 0/15 0/15 6/15* 3/15 Позитивні біопсії b (загальне) Позитивні собаки c (загальне) Позитивні собаки d (загальне) 6/75 (8%) 33/75** (44%) 6/15 (40%) 10/15 (67%) 0/6 (0%) 8/10 (80%) a одна нова собака. загальна кількість позитивних біопсій. c загальна кількість позитивних собак. b загальна кількість собак позитивних через один місяць. * p < 0,05 ** p < 0,0001 b 30  Здатність вакцини запобігати серологічному доказу інфекції: 25 UA 99719 C2 5 Вакцина може також запобігати виробленню антитіл специфічних до хвороби Лайма. Собаки, хворі на хворобу Лайма, виробляють антитіла проти борелій не специфічні до OspC, які також виявляють при застосуванні B. burgdorferi ss 50772 (як описано у Прикладі 6). Значне підвищення рівню (≥ 4-рази) антитіл проти борелій штаму 50772 спостерігали після укусу кліша у 5 (33%) з 15 плацебо-вакцинованих собак, у порівнянні з відсутністю такого підвищення у жодної собаки, вакцинованої тестовою вакциною. Таблиця 17 a b Середні титри антитіла проти борелій після укусу кліща Група дослідження Вакциновані Контрольні День 43 PC День 77 PC 40 48 40 66 День 112 День 147 PC День 174 PC Загальна PC кількість собак з підвищеними титрами 40 40 40 0/15 c 88 88 106 5/15 a відповідне розведення. виявлено при застосуванні штаму B. burgdorferi ss 50772. c ≥ 4-рази збільшений титр b 10 15 20 25 30 35 40 45 - Здатність вакцини запобігати появі явних розладів кінцівок/суглобів та ерозійних змін, пов’язаних із зараженням B. burgdorferi ss: Попередні дослідження виявили, що зараження B. burgdorferi ss рідко викликає появу явних розладів кінцівок/суглобів (Приклад 6), та модель укусу кліща на старших собаках була менш ефективною. Для посилення розвитку явних симптомів, пригнічували імунну систему собак дексаметазоном приблизно через три місяці після укусу кліща. Чотири плацебо-вакциновані собаки почали кульгавити або у них розвились ерозійні пошкодження сполучних тканин. Навпаки, у жодної собаки, яку вакцинували вакциною даного винаходу, не з’явилось ніяких кліничних симптомів розладів кінцівок/суглобів або ерозійних пошкоджень, які зазвичай наявні у сполучних тканинах. Рамки даного винаходу не обмежуються конкретними варіантами здійснення винаходу, викладеними у даному документі. Зрозуміло, що різноманітні модифікації винаходу, окрім тих, що наведені у даному документі, будуть зрозумілими фахівцю у галузі з вищенаведеного опису. Такі модифікації входять у рамки заявленої формули. Також потрібно розуміти, що усі розміри основ або амінокислот, та значення молекулярної ваги та маси нуклеїнових кислот або поліпептидів є приблизними, та наведені для опису. Багаточисельні публікації, на які посилаються у даному документі, включені у даному описі за допомогою посилань. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Композиція вакцини для собак проти хвороби Лайма, яка містить імунологічно ефективну кількість організмів першого штаму геновидів борелій та імунологічно ефективну кількість організмів другого штаму геновидів борелій; де організми вказаного другого штаму експресують на свої поверхні OspA антиген, OspB антиген або експресують обидва - OspA та OspB антигени; та де введення вказаної вакцини собаці викликає вироблення значних рівнів антитіл проти В. burgdorferi ss 50772 (АТСС No. PTA-439). 2. Композиція вакцини за п. 1, де антитіла проти OspC борелій та OspA борелій виробляються у собаці, імунізованій вказаною композицією вакцини. 3. Композиція вакцини за п. 1, де значна кількість антитіл проти OspC борелій є специфічними до OspC7. 4. Композиція вакцини за п. 1, де вказаним першим штамом є В. burgdorferi ss 50772 (АТСС No. РТА-439). 5. Композиція вакцини за п. 4, де вказаним другим штамом є В. burgdorferi ss S-1-10 (АТСС No. РТА-1680). 26 UA 99719 C2 5 10 15 6. Композиція вакцини за п. 5, де імунологічно ефективна кількість організмів вказаного першого штаму та вказаного другого штаму є інактивованою. 4 10 7. Композиція вакцини за п. 6, яка містить від приблизно 1 × 10 до приблизно 1 × 10 організмів 4 10 на мл першого штаму та від приблизно 1 × 10 до приблизно 1 × 10 організмів на мл другого штаму. 8 9 8. Композиція вакцини за п. 7, яка містить від приблизно 5 × 10 до приблизно 5 × 10 організмів 8 8 на мл першого штаму та від приблизно 1 × 10 до приблизно 5 × 10 організмів на мл другого штаму. 9. Композиція вакцини за п. 4, де імунологічно ефективна кількість організмів вказаного першого штаму та вказаного другого штаму є інактивованою. 10. Композиція вакцини за п. 1, де імунологічно ефективна кількість організмів вказаного першого штаму та вказаного другого штаму є інактивованою. 11. Композиція вакцини за п. 1, яка додатково містить фармацевтично прийнятний ад'ювант, фармацевтично прийнятний імунний стимулятор або обидва - фармацевтично прийнятний ад'ювант та фармацевтично прийнятний імунний стимулятор. 12. Спосіб імунізації собак проти патогенних геновидів борелій, який включає введення собаці імунологічно ефективної кількості вакцини за п. 1. 13. Спосіб імунізації собак проти патогенних геновидів борелій, який включає введення собаці імунологічно ефективної кількості вакцини за п. 6. 20 ФІГ. 1 27 UA 99719 C2 ФІГ. 2 А ФІГ. 2В 28