Рекомбінантна молекула днк, яка вказує на присутність трансгенного об’єкта сої mon 87708

Реферат: Винахід належить до трансгенного об’єкта сої MON 87708, рослин, клітин рослин та насіння, що містять об’єкт сої MON 87708. Винахід також належить до нуклеотидів, специфічних для об'єкта MON 87708. Винахід також належить до способів, що стосуються об'єкта сої MON 87708. UA 115761 C2 (12) UA 115761 C2 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на споріднені заявки По даній заявці вимагається пріоритет по попередній заявці США № 61/243227, зареєстрованій 17 вересня 2009 року, включеній в даний документ як посилання в повному об'ємі. Включення списку послідовностей Список послідовностей, що міститься в файлі "55544-0001_seqlisting. txt", що становить 19,5 кілобайт (розмір, який визначається Microsoft Windows®) і створений 13 серпня 2010 року, зареєстрований за допомогою цього в електронному вигляді і включений в даний документ як посилання. Галузь винаходу Винахід стосується трансгенного об'єкта Glycine max MON 87708. Об'єкт виявляє стійкість до гербіциду дикамба. Винахід також стосується рослин, частин рослин, насіння рослин, рослинних клітин, сільськогосподарської продукції і способів, що стосуються об'єкта MON 87708, і стосується нуклеотидних молекул, що є унікальними для об'єкта і створеними застосовно до вбудовування трансгенної ДНК в геном рослини Glycine max. Передумови винаходу Соя (Glycine max) є важливою сільськогосподарською культурою в багатьох регіонах світу, і для отримання сої з бажаними властивостями до даної сільськогосподарської культури застосовують способи біотехнології. Однією такою бажаною властивістю є стійкість до гербіцидів. Експресія в рослині трансгена стійкості до гербіцидів може надавати рослині бажаної властивості стійкості до гербіцидів, але на експресію трансгена можуть впливати положення на хромосомі і геномний результат вбудовування трансгена. Наприклад, в рослинах часто спостерігають різноманітність рівня і профілю експресії трансгена серед окремих об'єктів, які відрізняються по ділянці вбудовування трансгена в хромосому, але в іншому ідентичні. Також можуть існувати небажані і/або бажані фенотипічні або агрономічні відмінності між об'єктами. Тому часто необхідними є отримання і аналіз великого числа окремих рослинних трансформованих об'єктів для селекції об'єкта, що має бажану властивість і оптимальні фенотипічні і сільськогосподарські характеристики, необхідні для того, щоб робити його прийнятним для комерційних цілей. Така селекція часто вимагає наявності теплиць і польових випробувань з багатьма об'єктами протягом багатьох років в багатьох місцях і в різних умовах, таким чином, можна збирати значну кількість агрономічних, фенотипічних і молекулярних даних. Потім з метою селекції комерційно прийнятного об'єкта команди вчених і агрономів повинні аналізувати отримані дані і спостереження. Вибравши такий об'єкт, потім можна застосовувати його для інтрогресії бажаної властивості в інше генетичне оточення із застосуванням способів селекції рослин і, таким чином, отримувати ряд різних сортів сільськогосподарських культур, що мають бажану властивість і відповідним чином пристосовані до конкретних місцевих умов вирощування. Суть винаходу Винахід стосується трансгенних рослин сої, що позначаються як об'єкт MON 87708, що виявляють комерційно прийнятну стійкість до застосування гербіциду дикамба, показовий зразок насіння якого зберігається в American Type Culture Collection (ATCC) як зразок № PTA9670. Винахід також стосується нових молекул ДНК, що стосуються об'єкта сої MON 87708, і способів застосування даних молекул. Винахід також стосується насіння, потомства, частин рослин, клітин і товарів об'єкта сої MON 87708. Винахід також стосується способів застосування об'єкта сої MON 87708 і способів отримання стійкої до дикамби сої. Винахід стосується рекомбінантних молекул ДНК, що стосуються об'єкта сої MON 87708. Дані рекомбінантні молекули ДНК можуть містити нуклеотидні молекули, які мають нуклеотидну послідовність, що являє собою область геномної ДНК, фланкуючу інсерцію трансгена, і/або область інсерції трансгена, і/або безперервну послідовність будь-якої з даних областей, такої як область з'єднання між інсерцією трансгена і фланкуючою геномною ДНК об'єкта сої MON 87708. Винахід також стосується молекул ДНК, застосовних як праймери і зонди, характерних для об'єкта сої MON 87708, і ампліконів, характерних для наявності об'єкта сої MON 87708. Також описують рослини сої, рослинні клітини, частини рослин, товари, потомство і насіння, що містять дані молекули. Винахід стосується способів, композицій і наборів, застосовних для визначення наявності і/або відсутності ДНК, отриманих з об'єкта сої MON 87708, і, таким чином, наявності і/або відсутності об'єкта. Винахід стосується способу визначення MON 87708 за допомогою приведення зразка, що містить ДНК, в контакт з набором праймерів, за допомогою якого при застосуванні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК з об'єкта сої MON 87708 отримують ампліфіковану ДНК, характерну для об'єкта сої MON 87708, проведення реакції 1 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ампліфікації нуклеїнової кислоти, таким чином, отримання ампліфікованої ДНК і визначення наявності і/або відсутності ампліфікованої ДНК. Винахід також стосується способу визначення MON 87708 за допомогою приведення зразка, що містить ДНК, в контакт зондом, який при застосуванні в реакції гібридизації з ДНК з об'єкта сої MON 87708 гібридизується з молекулою ДНК, специфічною для об'єкта сої MON 87708, проведення реакції гібридизації і визначення гібридизації зонда з молекулою ДНК. Також надають набори, що включають способи і композиції за винаходом, застосовні для визначення наявності ДНК, отриманої з об'єкта сої MON 87708. Винахід стосується рослини сої, насіння, рослинної клітини, рослини-нащадка, частини рослини або товару, отриманого з рослини, рослинної клітини або насіння об'єкта сої MON 87708. Винахід також стосується рослини сої, насіння, рослинної клітини, рослини-нащадка, частини рослини або товару, що містить рекомбінантну молекулу ДНК, яка має нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1-8 і комплементарних їм ланцюгів і їх фрагментам. Винахід також стосується рослини сої, насіння, рослинної клітини, рослининащадка, частини рослини або товару, що отримані з рослини або насіння об'єкта сої MON 87708 і містять рекомбінантну молекулу ДНК, з якої в способі ампліфікації ДНК отримують ампліфіковану молекулу ДНК, що містить SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 і/або SEQ ID NO: 8. Винахід стосується способу контролю бур'янів в полі за допомогою висівання об'єкта сої MON 87708 і потім нанесення ефективної дози гербіциду дикамба, здатного контролювати бур'яни без пошкодження рослин об'єкта сої MON 87708. Винахід також стосується способу контролю бур'янів в полі за допомогою нанесення ефективної дози гербіциду дикамба для контролю бур'янів в полі і потім висівання об'єкта сої MON 87708 в полі. Винахід також стосується способу отримання насіння сої, що по суті не містить насіння шкідливих видів бур'янів, за допомогою висівання насіння стійкого до дикамби сорту сої MON 87708 в полі, нанесення на полі післясходової ефективної дози гербіциду дикамба, достатньої для знищення шкідливих видів бур'янів, і збирання насіння з поля. Винахід стосується способів отримання рослини сої і/або насіння, стійких до нанесення гербіциду дикамба, за допомогою статевого схрещування рослини об'єкта сої MON 87708, що містить SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 і/або SEQ ID NO: 8, з другою рослиною сої, таким чином, отримуючи насіння, вирощуючи насіння для отримання рослин-нащадків, обробляючи рослини-нащадки дикамбою і вибираючи стійку до дикамби рослину-нащадка. Способи також можуть включати самозапилення вибраної рослини-нащадка для отримання множини рослин-нащадків другого покоління і селекції з них стійкої до дикамби рослини. Способи також можуть включати статеве схрещування вибраної рослини-нащадка з іншою рослиною сої для отримання насіння, вирощування насіння для отримання другого покоління рослин-нащадків, обробку другого покоління рослин-нащадків дикамбою і селекцію стійкої до дикамби рослини-нащадка другого покоління. Винахід стосується способів отримання рослини сої і/або насіння, стійкої до нанесення гербіциду дикамба, за допомогою самозапилення стійкої до дикамби рослини об'єкта сої MON 87708, що містить SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 і/або SEQ ID NO: 8, таким чином, отримуючи насіння, вирощуючи насіння для отримання рослин-нащадків, обробляючи рослини-нащадки дикамбою; і селекції рослини-нащадка, стійкої до дикамби. Винахід стосується способів визначення зиготності рослини або насіння об'єкта сої MON 87708, що включають приведення зразка ДНК сої в контакт з набором праймерів, що містить SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 і SEQ ID NO: 14, і набором зондів, що містить SEQ ID NO: 15 і SEQ ID NO: 16; потім здійснення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти із зразком, набором праймерів і набором зондів; потім визначення в даній реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти першого флуоресцентного сигналу, характерного для об'єкта MON 87708, і другого флуоресцентного сигналу, відмінного від першого флуоресцентного сигналу і характерного для геномної ДНК природної сої, що відповідає положенню інсерції трансгена об'єкта MON 87708; і аналіз наявності і/або відсутності першого флуоресцентного сигналу і другого флуоресцентного сигналу в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, де наявність обох флуоресцентних сигналів свідчить про те, що зразок є гетерозиготним по об'єкту MON 87708, і наявність тільки першого флуоресцентного сигналу свідчить про те, що зразок є гомозиготним по об'єкту MON 87708. Винахід також стосується рослини сої, насіння, рослинної клітини або частини рослини, що містить область гаплотипу сої в групі зчеплення 9 в приблизному положенні 143.5, що містить ген стійкості до дикамби і далі гаплотипу 19743, що визначається по "ковзаючому вікну" і 19767, і способів їх застосування. Вказані вище і інші аспекти винаходу стануть більш очевидними з подальшого докладного опису. 2 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Короткий опис креслень На Фіг. 1 представлена організація трансгенної інсерції в геномі об'єкта сої MON 87708; [А] відповідає відносному положенню SEQ ID NO: 1, що являє собою шістдесят нуклеотидів з'єднання між геномною ДНК сої і 5'-областю інсерції ДНК трансгена; [Α'] відповідає відносному положенню SEQ ID NO: 7, що являє собою сто нуклеотидів з'єднання між геномною ДНК сої і 5'областю інсерції ДНК трансгена; [В] відповідає відносному положенню SEQ ID NO: 2, що являє собою шістдесят нуклеотидів з'єднання між геномною ДНК сої і 3'-областю інсерції ДНК трансгена; [Β'] відповідає відносному положенню SEQ ID NO: 8, що являє собою сто нуклеотидів з'єднання між геномною ДНК сої і 3'-областю інсерції ДНК трансгена; [С] відповідає відносному положенню SEQ ID NO: 3, що є послідовністю генома сої, фланкуючою умовно виділений/визначений 5'-кінець вбудованої в геном об'єкта MON 87708 експресуючої касети; [D] відповідає відносному положенню SEQ ID NO: 4, що є послідовністю генома сої, фланкуючою умовно виділений/визначений 3'-кінець вбудованої в геном об'єкта MON 87708 експресуючої касети; [Е] представляє різні елементи, що містять SEQ ID NO: 5, і є послідовністю вбудованою в геном об'єкта MON 87708 експресуючої касети; і [F] представляє безперервну послідовність (що надається як SEQ ID NO: 6), що містить, як представлено на фігурі зліва направо, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO: 4, в які включають SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8, так як дані послідовності присутні в геномі об'єкта MON 87708. Короткий опис послідовностей SEQ ID NO: 1 є послідовністю шістдесяти нуклеотидів, що являє собою 5'-з'єднання між геномною ДНК сої і вбудованою трансгенною експресуючою касетою. SEQ ID NO: 1 вміщують в SEQ ID NO: 6 в нуклеотидне положення 1097-1156. SEQ ID NO: 2 є послідовністю шістдесяти нуклеотидів, що являє собою 3'-з'єднання між геномною ДНК сої і вбудованою трансгенною експресуючою касетою. SEQ ID NO: 2 вміщують в SEQ ID NO: 6 в нуклеотидне положення 4100-4159. SEQ ID NO: 3 є 5'-послідовністю, фланкуючою вбудовану ДНК об'єкта сої MON 87708 до області інсерції трансгенної ДНК і включаючи її. SEQ ID NO: 4 є 3'-послідовністю, фланкуючою вбудовану ДНК об'єкта сої MON 87708 до області інсерції трансгенною ДНК і включаючи її. SEQ ID NO: 5 є послідовністю вбудованої трансгенної експресуючої касети. SEQ ID NO: 6 є нуклеотидною послідовністю, що являє собою контиг 5'-послідовності, фланкуючої вбудовану ДНК об'єкта сої MON 87708 (SEQ ID NO: 3), послідовність вбудованої ДНК (SEQ ID NO: 5), і 3' послідовності, фланкуючої вбудовану ДНК об'єкта сої MON 87708 (SEQ ID NO: 4), і включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 7 є послідовністю ста нуклеотидів, що являє собою 5'-з'єднання між геномною ДНК сої і вбудованою трансгенною експресуючою касетою. SEQ ID NO: 8 є послідовністю ста нуклеотидів, що являє собою 3'-з'єднання між геномною ДНК сої і вбудованою трансгенною експресуючою касетою. SEQ ID NO: 9 є послідовністю праймера, що позначається як праймер SQ13570 і об'єкта сої, що застосовується для ідентифікації MON 87708. Він комплементарний вбудованій експресуючої касеті в області, близькій до 3'-краю інсерції трансгена. ПЛР-амплікон, що отримується при аналізі TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) із застосуванням поєднання праймерів SQ13570 і SQ13571 (SEQ ID NO: 10), є позитивним результатом наявності об'єкта MON 87708. SEQ ID NO: 10 є послідовністю праймера, що позначається як праймер SQ13571 і об'єкта сої, що застосовується для ідентифікації MON 87708. Він комплементарний 3'-області, фланкуючій вбудовану експресуючу касету і близькій до краю інсерції ДНК трансгена. ПЛРамплікон, що отримується при аналізі TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) із застосуванням поєднання праймерів SQ13570 (SEQ ID NO: 9) і SQ13571, є позитивним результатом наявності об'єкта MON 87708. SEQ ID NO: 11 є послідовністю зонда, що означається як зонд PB4655 і об'єкта сої, що застосовується для ідентифікації MON 87708. Він комплементарний області, що охоплює 3'з'єднання вбудованої експресуючої касети і геномної ДНК. Даний зонд є 6-FAM™-міченим синтетичним олігонуклеотидом. Випускання флуоресцентного сигналу в реакції ампліфікації із застосуванням праймерів SQ13570 і SQ13571 (SEQ ID NO: 9-10) в поєднанні з 6-FAM™-міченим зондом PB4655 є характерним для об'єкта MON 87708 в аналізі TAQMAN®. SEQ ID NO: 12 є послідовністю праймера, що позначається як праймер SQ20632 і об'єкта, що застосовується для ідентифікації зиготності MON 87708. SEQ ID NO: 13 є послідовністю праймера, що позначається як праймер SQ20636 і що застосовується для ідентифікації зиготності сої дикого типу і об'єкта MON 87708. 3 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO: 14 є послідовністю праймера, що позначається як праймер SQ20637 і що застосовується для ідентифікації зиготності сої дикого типу. SEQ ID NO: 15 є послідовністю зонда, що позначається як зонд PB10130 і об'єкта, що застосовується для аналізу зиготності MON 87708. SEQ ID NO: 16 є послідовністю зонда, що позначається як зонд PB10131 і застосовується для аналізу зиготності сої дикого типу. Докладний опис Для кращого визначення винаходу і керівництва фахівцям в даній галузі в практичному здійсненні винаходу надають наступні визначення і способи. Якщо не указано інакше, терміни потрібно розуміти відповідно до загальноприйнятого застосування фахівцями у відповідній галузі техніки. Винахід стосується трансгенного об'єкта сої MON 87708, що виявляє комерційно прийнятну стійкість до застосування гербіциду дикамба. Об'єкт містить одиночну інсерцію трансгенною ДНК в хромосому/геном ідіоплазми сої. "Об'єкт" отримують: (i) трансформацією рослинної клітини конструкцією нуклеїнової кислоти, що включає цікавлячий трансген, (ii) відновленням популяції рослин, що отримуються від інсерції трансгена в геном рослини, і (iii) селекцією конкретної рослини, що відрізняється інсерцією трансгена в конкретному положенні в геном рослини. Термін "об'єкт" стосується вихідного трансформанта, що включає трансген, вбудований в конкретному положенні в геном рослини. Термін "об'єкт" також стосується потомства трансформанта, що включає трансген, вбудований в конкретному положенні в геном рослини. Таке потомство можна отримувати статевим ауткросингом між трансформантом або його потомством і іншою рослиною. Такою іншою рослиною може бути трансгенна рослина, що містить той же або інший трансген, і/або нетрансгенна рослина, така як один з різних сортів. Навіть після повторного зворотного схрещування з рекурентним батьком, вбудована ДНК і фланкуюча ДНК з трансформованого батька присутні в потомстві від схрещування в тому ж геномному положенні. Як застосовують в даному документі, термін "соя" означає Glycine max і включає всі сорти рослин, які можна схрещувати з соєю, включаючи дикі сорти сої, а також рослини, що належать до Glycine, що дозволяють здійснювати схрещування між видами. Термін "об'єкт" також стосується молекули ДНК з вихідного трансформанта, що містить вбудовану ДНК і фланкуючу геномну ДНК сої, що безпосередньо прилягає до кожної сторони вбудованої ДНК. Дану молекулу ДНК отримують вбудовуванням трансгенної ДНК в геном рослини сої, тобто трансформацією. Таким чином, дана молекула ДНК містить нуклеотидну послідовність, специфічну для об'єкта і унікальну для генома рослини сої, в який вбудовують трансгенну ДНК, оскільки дана нуклеотидна послідовність містить послідовність і конкретної області геномної ДНК сої, і трансгенної ДНК інсерції. Таким чином, розташування вбудованої ДНК в об'єкті сої MON 87708 відносно оточуючої ДНК генома рослини сої є специфічним і унікальним для об'єкта сої MON 87708. Дана молекула ДНК також є складовою частиною хромосоми об'єкта сої MON 87708 і в зв'язку з цим є стаціонарною в рослині і може передаватися потомству рослини. Об'єкт MON 87708 містить трансген, що надає стійкості до застосування гербіциду дикамба до рослини сої. "Дикамба" стосується 3,6-дихлор-2-метоксибензойної кислоти. Дикамба є синтетичним ауксиновим гербіцидом, застосовним для контролю широколистих бур'янів. Рослини сої трансформували монооксигеназою дикамби (DMO), ферментом, клонованим з Stenotrophomonas maltophilia, як правило, що виявляється в ґрунтовий ризосфері. Монооксигеназа дикамби є ферментом, каталізуючим деактивацію дикамби за допомогою реакції О-деметилування негербицидної сполуки 3,5-дихлорсаліцилової кислоти. У деяких регіонах світу насіння шкідливих видів бур'янів може контамінувати зібране насіння сої, яке може впливати на здоров'я і харчування тварин, яких годують контамінованими товарами сої. Дані рослини можна видаляти з поля сої обробкою гербіцидом дикамба. Члени даної групи шкідливих бур'янів включають Cardaria spp., Heliotropium spp., Centaurea spp., Senecio spp., Crotalaria spp., Solanum spp., Xanthium spp., Amsinckia spp., Cassia spp., Sesbania spp., Datura spp., Ricinus spp., Argemone spp., Corchorus spp., Impomoea spp. і Echium spp. Як застосовують в даному документі, термін "рекомбінантний" стосується форми ДНК, і/або білка, і/або організму, що не виявляються в природі в нормі і в зв'язку з цим отримуються втручанням людини. Таким втручанням людини може отримувати рекомбінантну молекулу ДНК і/або рекомбінантну рослину. Як застосовують в даному документі, "рекомбінантна молекула ДНК" є молекулою ДНК, що містить поєднання молекул ДНК, що не існують в природі спільно, і є результатом втручання людини, наприклад, молекулою ДНК, що складається з поєднання щонайменше двом гетерологічних одна одній молекул ДНК, і/або молекулою ДНК, що штучно 4 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 синтезована і містить полінуклеотидну послідовність, відмінну від полінуклеотидної послідовності, що існують в природі в нормі, і/або молекулою ДНК, що містить трансген, штучно вбудований в геномну ДНК клітину-хазяїна і відповідну фланкуючу ДНК генома клітини-хазяїна. Прикладом рекомбінантної молекули ДНК є молекула, що описується в даному документі ДНК, отримана при інсерції трансгена в геномну ДНК сої, яка в кінцевому результаті може приводити до експресії молекули рекомбінантної РНК і/або білка в такому організмі. Як застосовують в даному документі, "рекомбінантні рослина" є рослиною, яка не існує в природі в нормі, що є результатом втручання людини і містить трансген і/або гетерологічну молекулу ДНК, вбудовану в його геном. В результатів таких геномних змін, рекомбінантна рослина помітно відрізняється від спорідненої рослини дикого типу. Прикладом рекомбінантної рослини є рослина сої, що описується в даному документі як об'єкт MON 87708. Як застосовують в даному документі, термін "трансген" стосується нуклеотидної молекули, штучно вбудованої в геном клітини-хазяїна. Такий трансген може бути гетерологічною клітиноюхазяїном. Термін "трансгенна рослина" стосується рослини, що містить такий трансген. Як застосовують в даному документі, термін "гетерологічний" стосується першої молекули, що не виявляється в природі в нормі в поєднанні з другою молекулою. Наприклад, молекулу можна отримувати з перших видів і вбудовувати в геном других видів. Таким чином, молекула буде гетерологічною хазяїну і штучно вбудованою в геном клітини-хазяїна. Як застосовують в даному документі, термін "химерний" стосується окремої молекули ДНК, що отримується злиттям першої молекули ДНК з другою молекулою ДНК, де ні першу, ні другу молекулу ДНК не виявляють в нормі в такій конфігурації, тобто злитою з іншою. Таким чином, химерна молекула ДНК є новою молекулою ДНК, у іншому випадку ткаою, що не виявляється в нормі в природі. Винахід стосується молекул ДНК і їх відповідних нуклеотидним послідовностей. Як застосовують в даному документі, термін "ДНК", "молекула ДНК", "нуклеотидна молекула" стосується молекули ДНК геномного або синтетичного походження, тобто полімеру дезоксирибонуклеїнових основ або полінуклеотидної молекули, що зчитується з 5'-кінця (в зворотному напрямку) до 3'-кінця (в прямому напрямку). Як застосовують в даному документі, термін "послідовність ДНК", "нуклеотидна послідовність" або "полінуклеотидна послідовність" стосується нуклеотидної послідовності молекули ДНК. Номенклатура, що застосовується в даному документі, передбачена Розділом 37 Кодекси федеральних нормативних актів США з 1.822 і викладена в таблицях в WIPO Standard ST.25 (1998), Додаток 2, Таблиці 1 і 3. Як правило, нуклеотидні послідовності за винаходом, що надаються як SEQ ID NO: 1-8, і їх фрагменти, описують з посиланням тільки на один ланцюг з двох комплементарних нуклеотидних ланцюгів. Непрямо, комплементарні послідовності (тобто послідовності комплементарного ланцюга), що також позначаються в даній галузі як зворотні комплементарні послідовності, знаходяться в об'ємі винаходу і визначено призначені для включення в об'єм заявленого об'єкта винаходу. Нуклеотидну послідовність, що відповідає повній нуклеотидній послідовності вбудованої трансгенної ДНК і значним сегментам геномної ДНК сої, фланкуючою кінець вбудованої трансгенної ДНК, надають в даному документі як SEQ ID NO: 6. Її частина є вбудованою трансгенною ДНК, що надається як SEQ ID NO: 5. Нуклеотидну послідовність геномної ДНК сої, фізично пов'язану фосфодіефірним зв'язком з 5'-кінцем вбудованої трансгенної ДНК і, таким чином, фланкуючу його, представляють, як указано в SEQ ID NO: 3. Нуклеотидну послідовність геномної ДНК сої, фізично пов'язану фосфодіефірним зв'язком з 3'-кінцем вбудованої трансгенної ДНК і, таким чином, фланкуючу його, представляють, як указано в SEQ ID NO: 4. Об'єкт сої MON 87708 додатково містить дві області, одну, що охоплює 5'-положення, і одну, що охоплює 3'-положення, де трансгенну ДНК вбудовують в геномну ДНК, що позначаються в даному документі як 5'- і 3'-з'єднання, відповідно. "Послідовність з'єднання" або "область з'єднання" стосується послідовності ДНК і/або відповідної молекули ДНК, що охоплює вбудовану трансгенну ДНК і прилеглу фланкуючу геномну ДНК. Послідовності з'єднання умовно можна представляти двома послідовностями 60 нуклеотидів, що надаються як SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2, кожна, що представляє собою 30 нуклеотидів фланкуючої геномної ДНК, що прилеглягає до 30 нуклеотидів вбудованої ДНК і безперервної з ними. Альтернативно, послідовності з'єднання умовно можна представляти двома послідовностями 100 нуклеотидів, що надаються як SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8, кожна представляюча собою 50 нуклеотидів фланкуючою геномної ДНК, прилеглої до 50 нуклеотидам вбудованої ДНК і неперервної з ними. Ці нуклеотиди з'єднані фосфодіефірним зв'язком і присутні в об'єкті сої MON 87708 як частина генома. У сої ідентифікація однієї або декількох SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8 в зразку, отриманому з рослини сої, насіння або частини рослини, свідчить про те, 5 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що ДНК отримували з об'єкта сої MON 87708, і вона є характерною для наявності в зразку ДНК з об'єкта сої MON 87708. Таким чином, винахід стосується молекули ДНК, що містить щонайменше нуклеотидну послідовність, як представлено в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 і/або SEQ ID NO: 8. Будь-який сегмент ДНК, отриманий з трансгенного об'єкта сої MON 87708, достатній для того, щоб містити SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 і/або SEQ ID NO: 8, знаходиться в об'ємі винаходу. Крім того, будь-який полінуклеотид, що містить послідовність, комплементарну будь-яким послідовностям, які описуються в даному параграфі, знаходиться в об'ємі винаходу. На Фіг. 1 представлене фізичне розташування SEQ ID NO: 1-5 і 7-8 відносно SEQ ID NO: 6, розташованої від 5' до 3'. Винахід стосується прикладів молекул ДНК, які можна застосовувати як праймери або зонди для визначення в зразку наявності ДНК, отриманої з рослини сої об'єкта MON 87708. Такі праймери або зонди є специфічними для цільової послідовності нуклеїнової кислоти і в зв'язку з цим застосовні для ідентифікації послідовності нуклеїнової кислоти об'єкта сої MON 87708 способами за винаходом, що описуються в даному документі. Як правило, "праймер" є високоочищеним виділеним полінуклеотидом, сконструйованим для застосування в конкретних способах відпалу або гібридизації, що включають термічну ампліфікацію. Можна застосовувати пару праймерів з матрицею ДНК, такою як зразок геномної ДНК сої, в термічній ампліфікаці, такий як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), для отримання амплікону, де амплікон, що отримується в такій реакції, буде мати послідовність ДНК, що відповідає послідовності матриці ДНК, що знаходиться між двома ділянками гібридизації праймерів на матриці. Як застосовують в даному документі, "амплікон" є частиною або фрагментом ДНК, синтезованим із застосуванням способів ампліфікації. Амплікон за винаходом містить щонайменше SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 і/або SEQ ID NO: 8. Як правило, праймер конструюють для гібридизації з комплементарним цільовим ланцюгом ДНК для утворення гібрида між праймером і цільовим ланцюгом ДНК, і наявність праймера є точкою розпізнавання полімеразою для початку елонгації праймера (тобто полімеризації додаткових нуклеотидів в нуклеотидній молекулі, що видовжується) із застосуванням цільового ланцюга ДНК як матриця. Як застосовують в даному винаході, пари праймерів призначені для позначення двох праймерів, які зв'язують протилежні ланцюги дволанцюжкового нуклеотидного сегмента з метою послідовної ампліфікації полінуклеотидного сегмента між положеннями, цільовими для зв'язування окремих членів пари праймерів, як правило, в термічній реакції ампліфікації або інших загальноприйнятих способах ампліфікації нуклеїнових кислот. Приклади молекул ДНК, застосовних як праймери, надають як SEQ ID NO: 9-10. Пара праймерів, що надається як SEQ ID NO: 9 і SEQ ID NO: 10, застосовна як перша молекула ДНК і друга молекула ДНК, відмінна від першої молекули ДНК, і кожна має достатню довжину безперервних нуклеотидів SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 або SEQ ID NO: 6 для функціонування як ДНКпраймери, за допомогою яких при спільному застосуванні в термічній реакції ампліфікації з матрицею ДНК, що отримуєтьсяз об'єкта сої MON 87708, отримують амплікон, що містить SEQ ID NO: 2. "Зонд" є виділеною нуклеїновою кислотою, комплементарного ланцюга цільової нуклеїнової кислоти. Зонди за винаходом включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також поліаміди і інші матеріали зондів, що специфічно зв'язуються з цільовою послідовністю ДНК, і визначення такого зв'язування може бути застосовним в діагностиці, розрізненні, визначенні або підтвердженні наявності такої цільової послідовності ДНК в конкретному зразку. Зонд можна прикріплювати до загальноприйнятої детектованої мітки або репортерної молекули, наприклад, радіоактивного ізотопу, ліганду, хемілюмінесцентного засобу або ферменту. Приклад молекули ДНК, застосовної як зонд, надають як SEQ ID NO: 11. Зонди і праймери за винаходом можуть мати повну ідентичність послідовностей з цільовою послідовністю, хоча загальноприйнятими способами можна конструювати праймери і зонди, відмінні від цільової послідовності, що зберігають здатність гібридизуватися переважно з цільовими послідовностями. Для того, щоб молекула нуклеїнової кислоти служила як праймер або зонд, їй тільки необхідно бути досить комплементарною в послідовності, щоб бути здатною утворювати стабільну дволанцюжкову структуру в конкретних концентраціях застосовуваного розчинника і солі. Для ідентифікації в зразку наявності трансгену ДНК з об'єкта сої MON 87708 можна застосовувати будь-який загальноприйнятий спосіб гібридизації або ампліфікації нуклеїнової кислоти. Як правило, зонди і праймери становлять щонайменше приблизно 11 нуклеотидів щонайменше приблизно 18 нуклеотидів щонайменше приблизно 24 нуклеотида, або щонайменше приблизно 30 нуклеотидів або більше. Такі зонди і праймери специфічно гібридизують з послідовністю ДНК в суворих умовах гібридизації. Загальноприйняті суворі умови описують в Sambrook et al., 1989 і в Haymes et al.: Nucleic acid Hybridization, А Practical Approach, 6 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 IRL Press, Washington, DC (1985). Як застосовують в даному документі, дві молекули нуклеїнової кислоти здатні специфічно гібридизуватися одна до одної, якщо дві молекули здатні утворювати антипаралельну дволанцюжкову структуру нуклеїнової кислоти. Молекула нуклеїнової кислоти "комплементарна" іншій молекулі нуклеїнової кислоти, якщо вони виявляють повну комплементарність. Як застосовують в даному документі, молекули виявляють "повну комплементарність", коли кожний нуклеотид однієї з молекул комплементарний нуклеотиду іншої. Дві молекули "мінімально комплементарні", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною з достатньою стабільністю, що дозволяє їм залишатися відпаленими одна з одною щонайменше при загальноприйнятих умовах "зниженої суворості". Аналогічно, молекули є "комплементарними", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною з достатньою стабільністю, що дозволяє їм залишатися відпаленими одна з одною щонайменше при загальноприйнятих умовах "підвищеної суворості". Таким чином, відхилення від повної комплементарності є допустимими при умові, що такі відхилення не усувають повністю здатність молекул утворювати дволанцюжкову структуру. Як застосовують в даному документі, термін "виділений" стосується молекули щонайменше частково відділеної від інших молекул, в нормі з нею асоційованих в своєму природному або природному стані. У одному з варіантів здійснення термін "виділений" стосується молекули ДНК щонайменше частково відділеної від нуклеїнових кислот, в нормі фланкуючих молекулу ДНК в своєму природному або природному стані. Таким чином, молекули ДНК, злиті з регуляторними або кодуючими послідовностями, з якими вони в нормі не асоційовані, наприклад, в результаті рекомбінантних способів, в даному документі вважають виділеними. Такі молекули вважають виділеними навіть при вбудовуванні в хромосому клітини-хазяїна або присутності в розчині нуклеїнової кислоти з іншими молекулами ДНК. Для виділення і маніпуляцій з молекулою ДНК або її фрагментом, що описується в даному винаході, можна застосовувати будь-яку кількість способів, добре відомих фахівцям в даній галузі. Наприклад, технологію ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) можна застосовувати для ампліфікації конкретної вихідної молекули ДНК і/або для отримання варіантів вихідної молекули. Молекули ДНК або їх фрагменти також можна отримувати іншими способами, такими як прямий синтез фрагмента хімічними засобами, який загальноприйнято проводять із застосуванням автоматичного синтезатора олігонуклеотидів. Таким чином, молекули ДНКі відповідні нуклеотидні послідовності, представлені в даному документі є застосовними, зокрема, для ідентифікації об'єкта сої MON 87708, селекції сортів рослин або гібридів, що містить об'єкт сої MON 87708, визначення наявності в зразку ДНК, отриманої з трансгенного об'єкта сої MON 87708, і контролю зразків на наявність і/або відсутність об'єкта сої MON 87708 або частин рослин, отриманої з рослин об'єкта сої MON 87708. Винахід стосується рослин сої, потомства, насіння, рослинних клітин, частин рослин (таким як пилок, насінний зачаток, стручок, тканина квітки, тканина кореня, тканина стебла і тканина листа) і товарів. Дані рослини, потомство, насіння, рослинні клітини, частини рослин і товари містять кількість полінуклеотиду за винаходом, що визначається, тобто такого як полінуклеотид, що має щонайменше одну з послідовностей, представлених як SEQ ID NO: 1-8. Рослини, потомство, насіння, рослинні клітини і частини рослин за винаходом також можуть містити один або декілька додаткових трансгенів. Такий трансген може бути будь-якою нуклеотидною послідовністю, що кодує білок або молекулу РНК, що надає бажаної властивості, включаючи, як необмежувальні приклади, підвищену стійкість до комах, підвищену ефективність використання води, підвищену врожайність, підвищену засухостійкість, підвищену якість насіння, поліпшену поживну якість і/або підвищену стійкість до гербіцидів, де бажану властивість вимірюють відносно рослини сої без такого додаткового трансгена. Винахід стосується рослин сої, потомства, насіння, рослинних клітин і частини рослини, такої як пилок, насінний зачаток, стручок, тканина квітки, кореня або стебла і листя, отриманих з трансгенної рослини об'єкта сої MON 87708. Показовий зразок насіння об'єкта сої MON 87708 депонований відповідно до з Budapest Treaty з метою надання винаходу. Сховищем, вибраним для отримання депозиту, є American Type Culture Collection (ATCC) за адресою 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA, Zip Code 20110. У сховищі ATCC насінню об'єкта MON 87708 привласнювали № доступу PTA-9670. Винахід стосується мікроорганізму, що містить молекулу ДНК, яка має SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2, присутньої в його геномі. Прикладом такого мікроорганізму є трансгенна рослинна клітина. Мікроорганізми, такі як рослинна клітина за винаходом, застосовні в багатьох промислових галузях застосування, включаючи, як необмежувальні приклади: (i) застосування як дослідницький інструмент для наукового дослідження або промислового дослідження; (ii) 7 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосування в культурі для отримання ендогенного або рекомбінантного вуглеводу, ліпіду, нуклеїнової кислоти або білкових продуктів або низькомолекулярних сполук, які можна застосовувати для подальших наукових досліджень або як промислова продукція; і (iii) застосування з сучасними способами культивування тканин рослин для отримання трансгенних рослин або культур тканин рослин, які потім можна застосовувати для сільськогосподарських досліджень або виробництва. У виробництві і застосуванні мікроорганізмів, такому як трансгенні рослинні клітини, застосовують сучасні мікробіологічні способи і втручання людини для отримання створеного людиною унікального мікроорганізму. У даному способі рекомбінантну ДНК вбудовують в геном рослинної клітини для отримання трансгенної рослинної клітини, окремої і унікальної відносно природних рослинних клітин. Потім дану трансгенну рослинну клітину можна культивувати подібно до бактерій і дріжджових клітин із застосуванням сучасних мікробіологічних способів, і вона може існувати в недиференційованому одноклітинному стані. Нова генетична композиція і генотип рослинної клітини є технічним ефектом, отриманим за допомогою вбудовування гетерологічної ДНК в геном клітини. Іншим аспектом винаходу є спосіб застосування мікроорганізму за винаходом. Способи застосування мікроорганізмів за винаходом, таких як трансгенні рослинні клітини, включають (i) способи отримання трансгенних клітин вбудовуванням рекомбінантної ДНК в геном клітини і потім застосування даної клітини для отримання додаткових клітин, що мають ту ж гетерологічну ДНК; (ii) способи культивування клітин, що містять рекомбінантну ДНК із застосуванням сучасних мікробіологічних способів; (iii) способи отримання і очищення ендогенного або рекомбінантного вуглеводу, ліпіду, нуклеїнової кислоти або білкових продуктів з культивованих клітин; і (iv) способи застосування сучасних способів культивування тканин рослин з трансгенними рослинними клітинами для отримання трансгенних рослин або культур тканин трансгенних рослин. Рослини за винаходом можуть передавати потомству об'єкт ДНК, включаючи трансген. Як застосовують в даному документі, "потомство" включає будь-яку рослину, насіння, рослинну клітину і/або регенеративну частину рослини, що містить об'єкт ДНК, отриманий від батьківської рослини, і/або полінуклеотид, що має щонайменше одну з послідовностей, наданих як SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2. Рослини, потомство і насіння можуть бути гомозиготними або гетерозиготними по трансгену. Потомство можна вирощувати з насіння, отриманого з рослини об'єкта сої MON 87708, і/або з насіння, отриманого з рослини, запиленої пилком від рослини об'єкта сої MON 87708. Рослини-нащадки можуть бути самозапилюваними (термін, також відомий як "самозапилення") для отримання чистої селекційної лінії рослин, тобто рослин, гомозиготних по трансгену. Самозапиленням відповідного потомства можна отримувати рослини, гомозиготні по обох екзогенних генах, що додаються. Альтернативно, рослини-нащадки можна піддавати ауткросингу, наприклад, схрещувати з іншою неспорідненою рослиною, для отримання сортового або гібридного насіння або рослин. Інша неспоріднена рослина може бути трансгенною або нетрансгенною. Таким чином, сортове або гібридне насіння або рослина за винаходом можна отримувати схрещуванням першого батька без специфічної і унікальної ДНК об'єкта сої MON 87708 з другим батьком, що містить об'єкт сої MON 87708, що приводить до гібрида, який містить специфічну і унікальну ДНК об'єкта сої MON 87708. Кожен батько може бути гібридом або інбредним/сортовим при умові, що схрещування або розведення приводить до рослини або насіння за винаходом, тобто насіння, що має щонайменше один алель, який містить специфічну і унікальну ДНК об'єкта сої MON 87708 і/або SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2. Таким чином, дві різних трансгенних рослини можна схрещувати для отримання гібридного нащадка, що містить два доданих екзогенних гени, що незалежно розщеплюються. Наприклад, стійку до дикамби сою MON 87708 можна схрещувати з іншою трансгенним рослиною сої для отримання рослини, що має характеристики обох трансгенних батьків. Одним прикладом цього буде схрещування стійкої до дикамби сої MON 87708 з рослиною, що має одну або декілька додаткових властивостей, таких як стійкість до гербіцидів (наприклад, об'єкт сої 40-3-2 або об'єкт сої MON 89788 (публікація патентної заявки США № 20060282915)), стійкість до комах (наприклад, об'єкт сої MON87701 (публікація патентної заявки США № 20090130071)) і/або інші бажані властивості (наприклад, підвищеною масляною композицією, такою як об'єкт сої MON87769 (патентна публікація PCT WO2009102873)), що приводить до рослини-нащадка або насіння, що стійке до дикамби і має одну або декілька додаткових властивостей Гербіциди, для яких демонстрували стійкість трансгенних рослин і можна застосовувати спосіб за винаходом, включають як необмежувальні приклади: гліфосат, глуфосинат, сульфонілкарбаміди, імідазолінони, бромоксиніл, далапон, циклогександіон, інгібітори протопорфіриногеноксидази і ізоксафлютолові гербіциди. Нуклеотидні молекули, що кодують білки, залучені до стійкості до гербіцидів, відомі в даній 8 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 галузі і включають, як необмежувальні приклади, нуклеотидну молекулу, що кодує: гліфосатстійку 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтетазу (EPSPS) (див., наприклад, патенти США №№ 5627061; 5633435; 6040497; 5094945; 5804425; 6248876; 7183110; RE39247); гліфосатоксидоредуктазу (GOX) (див., наприклад, патент США № 5776760); гліфосат-nацетилтрансферазу (GAT); стійку до гербіцидів ацетолактатсинтазу (ALS, також відому як синтаза ацетогідроксикислот (AHAS)) для стійкості до сульфонілкарбамідів, імідазолінонів, триазолопіримідинів, піримідилоксибензоатів, сульфоніламінокарбонілтриазолінонів і/або гетероарильних простих ефірів; стійку до гербіцидів ацетил-коензим-А-карбоксилазу (ACCase) або R-2,4-дихлорфеноксипропіонатдіоксигеназу (rdpA) для стійкості до арилоксифеноксипропіонату (AOPP) (такого як галоксифоп, квізалофоп, дихлорофоп і дихлофоп); детоксикаційний білок, такий як 2,4-D-діоксигеназа (tfdA), R-2,4дихлорфеноксипропіонатдіоксигеназа (rdpA), арилоксіалканоатдіоксигеназа (AAD) і/або S-2,4дихлорпропдіоксигеназа (sdpA) для стійкості до синтетичних ауксинових гербіцидів; бромоксинілнітрилазу (Bxn) для стійкості до бромоксинілу (див., наприклад, патент США № 4810648); фітоендесатуразу (crtl) для стійкості до норфлуразону; стійкість до біалофосу (bar) або білок фосфінотрицинацетилтрансферази (PAT) (див., наприклад, патент США № 5646024 і 5276268) для стійкості до глуфосинату і біалофосу; і білок стійкості до гербіциду трикетону (мезотріону, темботріону, топромезону, ізоксазолу), такий як стійка 4гідроксифенілпіруватдіоксигеназа (HPPD), детоксикаційний цитохром P450 або обхід шляху HPPD, такий як HPP оксидаза Artbrobacter globiformis (HPPO) і 4-HPA-1-гідроксилаза (HPAH) і NADH-оксидоредуктаза (HPAC) Pseudomonas acidovorans. Також передбачають зворотне схрещування з батьківською рослиною і ауткросинг з нетрансгенним рослиною як вегетативне розмноження. Опис інших способів схрещування, загальновживаних для різних властивостей і сільськогосподарських культур, можна знайти в одному з декількох посилань, наприклад, Fehr в Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987). Винахід стосується частини рослини, отриманої з об'єкта сої MON 87708. Як застосовують в даному документі, "частина рослини" стосується будь-якої частини рослини, що складається з матеріалу, отриманого з рослини об'єкта сої MON 87708. Частини рослин включають, як необмежувальні приклади, пилок, насінний зачаток, стручок, тканина квітки, кореня або стебла, волокна і листя. Частини рослин можуть бути життєздатними, нежиттєздатними, регенеративними і/або нерегенеративними. Винахід стосується товару, отриманого з об'єкта сої MON 87708. Як застосовують в даному документі, "товар" стосується будь-якої композиції або препарату, що складається з матеріалу, отриманого з рослини, насіння, рослинної клітини або частини рослини об'єкта сої MON 87708. Товари можна продавати споживачам, і вони можуть бути життєздатними або нежиттєздатними. Нежиттєздатні товари включають, як необмежувальні приклади, нежиттєздатне насіння і зерна; оброблене насіння, частини насіння і частини рослин; зневоднену тканину рослини, заморожену тканину рослини і оброблену тканину рослини; насіння і частини рослин, оброблених для застосування як корму для тварин для годування наземних і/або водних тварин, олії, борошна грубого помелу, борошна, пластівців, висівок, волокон, молока, сиру, паперу, сливок, вина і будь-якої іншої їжі для споживання людиною; і біомаси і паливних продуктів. Життєздатні товари включають, як необмежувальні приклади, насіння і рослинні клітини. Таким чином, об'єкт сої MON 87708 можна застосовувати для виробництва будь-якого товару, як правило, що отримується з сої. Будь-який такий товар, отриманий з об'єкта сої MON 87708, може містити щонайменше кількість, що визначається специфічною і унікальною ДНК, яка відповідає об'єкту сої MON 87708 і конкретно може містити кількість полінуклеотиду, яка визначається, що містить щонайменше 15 безперервних нуклеотидів SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 2. Можна застосовувати будь-який стандартний спосіб визначення нуклеотидних молекул, включаючи способи визначення, що описуються в даному документі. Товар знаходиться в об'ємі винаходу, в товарі знаходиться будь-яка кількість, яка визначається SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 2. Таким чином, рослини, потомство, насіння, рослинні клітини, частини рослин (такі як пилок, насінний зачаток, стручок, тканина квітки, кореня або стебла і листя) і товари за винаходом, зокрема, застосовні для вирощування рослин з метою отримання насіння і/або частин рослин об'єкта сої MON 87708 в сільськогосподарських цілях, отримання потомства об'єкта сої MON 87708 для схрещування рослин і дослідницьких цілей, застосування разом з мікробіологічними способами для промислового і дослідницького застосування і продажу споживачам. Винахід стосується способів контролю бур'янів і способів отримання рослин із застосуванням гербіциду дикамба і об'єкта сої MON 87708. Надають спосіб контролю бур'янів в полі, і він складається з висівання сортових або гібридних рослин об'єкта сої MON 87708 в поле 9 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 і нанесення на полі гербіцидно ефективної дози дикамби з метою контролю бур'янів в полі без пошкодження рослин MON 87708. Таке нанесення гербіциду дикамба може бути досходовим, тобто в будь-який час після висівання насіння MON 87708 і до сходу рослин MON 87708, або післясходовим, тобто в будь-який час після сходу рослин MON 87708. Також надають інший спосіб контролю бур'янів в полі, і він складається з нанесення ефективної дози гербіциду дикамба для контролю бур'янів в полі і потім висівання об'єкта сої MON 87708 в полі. Таке нанесення гербіциду дикамба буде бути передвисівним, тобто до висівання насіння MON 87708, і його можна здійснювати в будь-який час перед висіванням, включаючи, як необмежувальні приклади, від приблизно 14 днів перед висіванням до приблизно 1 дні перед висіванням. Винахід також стосується способу отримання насіння сої, що по суті не містить насіння шкідливих видів бур'янів, за допомогою висівання в полі насіння стійкого до дикамби сорту сої MON 87708, нанесення на полі післясходової ефективної доза гербіциду дикамба, достатньої для загибелі шкідливих видів бур'янів, і збирання насіння з поля. Гербіцидно ефективна доза дикамби для застосування в полі повинна знаходиться в діапазоні від приблизно 0,005 фунтів на акр приблизно до 8 фунтів дикамби на акр протягом висівного періоду. Можна застосовувати багаторазове нанесення дикамби протягом висівного періоду, наприклад, два нанесення (наприклад, передвисівне нанесення і післясходове нанесення або довсходове нанесення і післясходове нанесення) або три нанесення (наприклад, передвисівне нанесення, довсходове нанесення і післясходове нанесення). Надають способи отримання стійкої до гербіцидів рослини сої, що містить послідовності ДНК, специфічні і унікальні для трансгенного об'єкта MON 87708 за винаходом. Трансгенні рослини, що застосовуються в даних способах, можуть бути гомозиготними або гетерозиготними по трансгену. Рослини-нащадки, що отримуються даними способами, можуть бути сортовими або гібридними рослинами; їх можна вирощувати з насіння, що отримується з рослини об'єкта сої MON 87708, і/або з насіння, що отримується з рослини, запиленої пилком з рослини об'єкта сої MON 87708; і вони можуть бути гомозиготними або гетерозиготними по трансгену. Потім рослини-нащадки можна піддавати самозапиленню для отримання чистої селекційної лінії рослин, тобто гомозиготних по трансгену рослин, або, альтернативно, можна піддавати ауткросингу, наприклад, схрещувати з іншою неспорідненою рослиною, для отримання сортового або гібридного насіння або рослини. Стійку до нанесення гербіциду дикамба рослину сої можна отримувати статевим схрещуванням рослини об'єкта MON 87708, що містить нуклеотидну молекулу, яка містить послідовність SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2, з іншою рослиною сої і, таким чином, отриманням насіння, яке потім вирощує в рослини-нащадки. Потім дані рослини-нащадки можна обробляти гербіцидом дикамба для селекції рослин-нащадків, стійких до гербіциду дикамба. Альтернативно, дані рослини-нащадки можна аналізувати із застосуванням аналітичних способів для вибору рослин-нащадків, що містять ДНК об'єкта MON 87708. Інша рослина, що застосовується в схрещуванні, може бути або не бути стійкою до гербіциду дикамба і може бути або не бути трансгенною. Отримана рослина-нащадок і/або насіння можуть бути сортовим або гібридним насінням. У здійсненні даного способу етап статевого схрещування однієї рослини з іншою рослиною, тобто перехресне запилення, можна виконувати або полегшувати втручанням людини, наприклад: збираючи пилок однієї рослини і приводячи даний пилок в контакт з маточкою або приймочкою другої рослини руками людини; видаляючи, руйнуючи або покриваючи тичинки або пиляки рослини руками і/або діями людини (наприклад, за допомогою видалення суцвіть-волоті або нанесення хімічного гаметоциду) таким чином, що запобігають природному самозапиленню, і для здійснення запліднення буде відбуватися перехресне запилення; за допомогою поміщення людиною запилюючих комах, здатних до "спрямованого запилення" (наприклад, поміщуючи бджолиний вулик у фруктові сади або поля або ізолюючи рослини із запилюючими комахами); за допомогою відкривання або видалення людиною частин квітки, що роблять можливим поміщення або контакт чужорідного пилка на маточці або приймочці (наприклад, у сої, яка в природі має квітки, що перешкоджають або запобігають перехресному запиленню, роблячи їх природними облігатними самозапилювачами без втручання людини); вибірковим поміщенням рослин (наприклад, умисним висіванням рослин в галузі, доступній для запилення); і/або за допомогою нанесення хімічних речовин для прискорення цвітіння або для забезпечення сприйнятливості (приймочки для пилка). Рослину сої, стійку до нанесення гербіциду дикамба, можна отримувати самозапиленням рослини об'єкта MON 87708, що містить нуклеотидну молекулу, яка містить послідовність SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2, і, таким чином, отримувати насіння, що вирощується потім в рослининащадки. Потім дані рослини-нащадки можна обробляти гербіцидом дикамба для селекції стійких до гербіциду дикамба рослин-нащадків. Альтернативно, дані рослини-нащадки можна 10 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аналізувати із застосуванням аналітичних способів для селекції рослин-нащадків, що містять ДНК об'єкта MON 87708. У здійсненні даного способу етап статевого схрещування однієї рослини з самим собою, тобто самозапилення або самозапліднення, можна виконувати або полегшувати втручанням людини, наприклад: збираючи пилок рослини і приводячи даний пилок в контакт з маточкою або приймочкою тієї ж рослини руками людини, і потім, необов'язково, запобігаючи подальшому запиленню рослини; видаляючи, руйнуючи або покриваючи тичинки або пиляки інших близькорозташованих рослин руками і/або діями людини (наприклад, за допомогою видалення суцвіть-волоті або нанесення хімічного гаметоциду) таким чином, що запобігають природному перехресному запиленню, для здійснення запліднення буде відбуватися самозапилення; за допомогою поміщення людиною запилюючих комах, здатних до "спрямованого запилення" (наприклад, окремо ізолюючи рослину із запилюючими комахами); за допомогою маніпуляцій людини з квіткою або її частинами, що робить можливим самозапилення; вибірковим приміщенням рослин (наприклад, умисним висіванням рослин поза областю, доступною для запилення); і/або за допомогою нанесення хімічних речовин для прискорення цвітіння або для забезпечення сприйнятливості (приймочки для пилка). Потомство рослин сої і насіння, що включені в дані способи і що отримується із застосуванням даних способів, будуть відрізнятися від інших рослин сої, наприклад, тому що потомство рослин сої і насіння: є рекомбінантними і в зв'язку з цим отриманими втручанням людини; є стійкими до гербіциду дикамба; містять щонайменше один алель, що складається з ДНК трансгена за винаходом; і/або містять кількість полінуклеотидної послідовності, що визначається, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2. Насіння можна вибирати з окремого рослини-нащадка, і при умові, що насіння містить SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2, вони будуть знаходитися в об'ємі винаходу. При здійсненні винаходу для отримання гібридного нащадка, що містить два гетерологічні гени, що незалежно розщеплюються, можна схрещувати дві різні трансгенні рослини. Гомозиготні по обох генах рослини можна отримувати самозапиленням відповідного потомства. Також включають зворотне схрещування з батьківською рослиною і ауткросинг з нетрансгенним рослиною як вегетативне розмноження. Опис інших способів, загальновживаних для різних властивостей і сільськогосподарських культур, можна знайти в одному з декількох посилань, наприклад, Fehr в Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987). Рослини і насіння, що застосовуються в способах, які описуються в даному документі, також можуть містити один або декілька додаткових трансгенів. Такий трансген може бути будь-якою нуклеотидною послідовністю, що кодує молекулу білка або РНК, що надає бажаної властивості, включаючи, як необмежувальні приклади, підвищену стійкість до комах, підвищену ефективність використання води, підвищену врожайність, підвищену засухостійкість, підвищена якість насіння, поліпшена поживну якість і/або підвищену стійкість до гербіцидів, де бажану властивість вимірюють відносно рослини сої без такого додаткового трансгена. Таким чином, способи за винаходом застосовні, зокрема, для контролю бур'янів в полі одночасно з вирощуванням рослин з метою отримання насіння і/або частини рослин об'єкта сої MON 87708 для сільськогосподарських або дослідницьких цілей, селекції потомства об'єкта сої MON 87708 для схрещування рослин або дослідницьких цілей і отримання рослин-нащадків і насіння об'єкта сої MON 87708. Рослини, потомство, насіння, рослинні клітини, частини рослин (такі як пилок, насінний зачаток, стручок, тканина квітки, кореня або стебла і листя) і товари за винаходом можна оцінювати по композиції ДНК, експресії генів і/або експресіях білків. Таку оцінку можна провести із застосуванням будь-якого стандартного способу, такого як ПЛР, нозерн-блоттинг, саузернблоттинг, вестерн-блоттинг, імунопреципітація і ELISA, або із застосуванням способів визначення і/або наборів для визначення, що надаються в даному документі. Надають способи визначення в зразку наявності ДНК, отриманої з клітини, тканини, насіння сої або рослини об'єкта сої MON 87708. Один спосіб складається з (i) виділення зразка ДНК щонайменше з однієї клітини, тканини, насіння або рослини сої, (ii) приведення зразка ДНК в контакт з парою праймерів, за допомогою якою можна отримувати амплікон з ДНК об'єкта MON 87708 у прийнятних для ампліфікації ДНК умовах, (iii) здійснення реакції ампліфікації ДНК, і потім (iv) визначення молекули амплікону і/або підтвердження того, що нуклеотидна послідовність амплікону містить специфічну для об'єкта MON 87708 нуклеотидну послідовність, таку як одна, вибрана з групи, що складається з SEQ ID NO: 1-8. Амплікон повинен бути специфічним для об'єкта MON 87708, таким як амплікон, що містить SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 2. Визначення специфічної для об'єкта MON 87708 нуклеотидної послідовності в ампліконі є визначальним і/або характерним для наявності в зразку специфічної ДНК об'єкта сої MON 11 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 87708. Приклад пари праймерів, за допомогою якої можна отримувати амплікон з ДНК об'єкта MON 87708 у прийнятних для ампліфікації ДНК умовах, надають як SEQ ID NO: 10-11. Фахівець в даній галузі легко може конструювати інші пари праймерів, і вони будуть містити щонайменше один фрагмент SEQ ID NO: 6. Інший спосіб визначення в зразку наявності ДНК, отриманої з клітини, тканини, насіння сої або рослини об'єкта сої MON 87708, складається з (i) виділення зразка ДНК щонайменше з однієї клітини, тканини, насіння або рослини сої, (ii) приведення зразка ДНК в контакт зі специфічним для ДНК об'єкта MON 87708 ДНК-зондом, (iii) допускання гібридизації зонда і зразка ДНК в суворих умовах гібридизації і потім (iv) визначення гібридизації між зондом і цільовим зразком ДНК. Приклад послідовності ДНК-зонда, специфічної для ДНК об'єкта MON 87708, надають як SEQ ID NO: 11. Фахівець в даній галузі легко може конструювати інші зонди, і вони можуть містити щонайменше один фрагмент SEQ ID NO: 6. Визначення гібридизації зонда із зразком ДНК є характерним для наявності в зразку специфічної ДНК об'єкта сої MON 87708. Альтернативно, відсутність гібридизації характерна для відсутності в зразку специфічної ДНК об'єкта сої MON 87708. Надають набори для визначення ДНК, застосовні для ідентифікації в зразку ДНК об'єкта сої MON 87708, і їх також можна застосовувати по способах схрещування рослин сої, що містять відповідну ДНК об'єкта. Такі набори містять ДНК-праймери і/або зонди, що містять фрагменти SEQ ID NO: 1-8. Один приклад такого набору містить щонайменше одну молекулу ДНК з достатньою довжиною безперервних нуклеотидів SEQ ID NO: 6 як ДНК-зонд, застосовного для визначення в зразку наявності і/або відсутності ДНК, отриманої з трансгенного об'єкта сої MON 87708. Отримана з трансгенного об'єкта сої MON 87708 ДНК буде містити SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 і/або SEQ ID NO: 8. Надають молекулу ДНК, достатню для застосування як ДНК-зонд, тобто застосовну для визначення, детектування або діагностування в зразку наявності і/або відсутності ДНК об'єкта сої MON 87708, надану як SEQ ID NO: 11. Фахівець в даній галузі легко може конструювати інші зонди, і вони повинні містити щонайменше 15 безперервних нуклеотидів SEQ ID NO: 6 і бути досить унікальними для ДНК об'єкта сої MON 87708 для ідентифікації отриманої з об'єкта ДНК. Інший тип набору містить пару праймерів, застосовних для отримання амплікону, застосовного для визначення в зразку наявності і/або відсутності ДНК, отриманого з трансгенного об'єкта сої MON 87708. У такому наборі застосовують спосіб, що включає приведення зразка цільової ДНК в контакт з парою праймерів, як описано в даному документі, потім здійснення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, достатньої для отримання амплікону, що містить SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 і/або SEQ ID NO: 8, і потім визначення наявності і/або відсутності амплікону. Такий спосіб також може включати секвенування амплікону або його фрагмента, яке буде бути визначальним, тобто характерним, для наявності специфічної ДНК об'єкта сої MON 87708 в зразку цільової ДНК. Фахівець в даній галузі легко може конструювати інші пари праймерів, і вони повинні містити щонайменше 15 безперервних нуклеотидів SEQ ID NO: 6 і бути досить унікальними для ДНК об'єкта сої MON 87708 для ідентифікації отриманої з об'єкта ДНК. Ампліфікацію нуклеїнової кислоти можна здійснювати будь-яким з різних відомих в даній галузі способів ампліфікації нуклеїнової кислоти, включаючи способи термічної ампліфікації. У даній галузі відома множина способів для визначення, кількісного аналізу і/або секвенування амплікону, що отримується даними способами. Одним прикладом способу, застосовного в практичному здійсненні справжнього винаходу, є TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Набори і способи визначення за винаходом застосовні, зокрема, для ідентифікації об'єкта сої MON 87708, селекції сортів і гібридів рослин, що містить об'єкт сої MON 87708, визначення в зразку наявності ДНК, отриманої з трансгенного об'єкта сої MON 87708, і контролю зразків на наявність і/або відсутність об'єкта сої MON 87708 або частини рослин, отриманої з об'єкта сої MON 87708. Послідовність інсерції гетерологічної ДНК, послідовності з'єднання або фланкуючі послідовності з об'єкта сої MON 87708 (зразки насіння якого зберігаються в ATCC як PTA-9670) можна перевіряти (і при необхідності коректувати) ампліфікацією таких послідовностей з об'єкта із застосуванням праймерів, отриманих з послідовностей, що надаються в даному документі, з подальшим стандартним секвенуванням ДНК амплікону або клонованої ДНК. Як застосовують в даному документі, термін що "містить" означає "включаючи як необмежувальні приклади". Наступні приклади включають для демонстрації прикладів конкретних переважних варіантів здійснення винаходу. Фахівцям в даній галузі буде зрозуміло, що способи, які описуються в наступних нижче прикладах представляють підходи, що добре працюють за даними авторів винаходу в практичному здійсненні винаходу, і, таким чином, можна передбачати введення в 12 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 практику прикладів переважних способів. Однак, в світлі даного опису, фахівці в даній галузі повинні розуміти, що в конкретних варіантах здійснення, які описуються, можна здійснювати множину змін і як і раніше отримувати подібний або схожий результат без відступу від суті і об'єму винаходу. Приклади Приклад 1: Трансформація сої A3525 і селекція об'єкта MON 87708 Рослину сої MON 87708 отримували трансформацією сої за допомогою агробактерій. Клітини сої трансформували, і відновлювали в інтактних рослинах сої і вибирали з популяції рослин окремі рослини, що демонструють цілісність експресуючої касети рослини і стійкість до дикамби. З даної вибірки вибирали рослину об'єкта сої MON 87708 і охарактеризували. Трансгенну стійку до дикамби рослину сої MON 87708 отримували за допомогою трансформації меристеми сої за допомогою агробактерій із застосуванням трансформуючого вектора PV-GMHT4355. У патенті США № 6384301 (включеному в цей документ як посилання) описували спосіб, що дозволяє отримувати трансформовані рослини без застосування калюсу. У короткому викладі, меристему витягували із зародків пророщених насіння сої A3525 (Asgrow, St Louis, MO). Після спільного культивування з несучими вектор Agrobacterium меристему поміщували на селективне середовище, що містить гліфосат (Monsanto, St Louis, MO), динатрієву сіль карбеніциліну, натрієву сіль цефотаксиму і суміш динатрієвої солі тикарциліну/клавуланату калію, для інгібування росту нетрансформованих рослинних клітин і надлишку Agrobacterium. Потім меристему вміщували на середовище, що сприяє появі паростків і розвитку кореня. Вибирали рослини, що мають коріння, з нормальними фенотипічними характеристиками і переносили їх на ґрунт для вирощування і подальшої оцінки. Отримані за допомогою трансформації, що описується вище, рослини R0 переносили для вирощування на ґрунт і потім піддавали самозапиленню для отримання насіння R1. Протягом подальшого самозапилення рослин R0 для отримання покоління R1 розщеплювали непов'язані інсерції Т-ДНК I (експресуюча касета dmo) і Т-ДНК II (експресуюча касета cp4 epsps). Нелетальну дозу гліфосату наносили на рослини R1. Рослини з найменшими пошкодженнями вибирали для подальших аналізів, в той час як не демонструючі пошкоджень рослини, тобто які містять Т-ДНК II (експресуючу касету cp4 epsps) виключали з подальшого аналізу. Потім ідентифікували рослини R0, що містять тільки єдину інсерцію Т-ДНК I (тобто генетичну касету dmo). Експресуюча касета Т-ДНК I, що містить промотор вірусу хлоротичної смугастості арахісу (PCISV) з дуплікованою енхансерною областю (P-PCISV.FLt-enh); функціонально пов'язана з лідерною послідовністю ДНК, отриманою з РНК-транскрипту вірусу гравіювання тютюну (L-TEV); функціонально пов'язана з молекулою ДНК, що кодує N-кінцеву транзитну пептид хлоропласта з малої субодиниці рибулозо-1,5-бісфосфаткарбоксилази (SSU) Pisum sativum (TS-RbcS-3C); функціонально пов'язана з частиною зрілого білка з малої субодиниці рибулозо-1,5бісфосфаткарбоксилази (SSU) Pisum sativum (CR-RbcS-3C); функціонально пов'язана з молекулою ДНК, що кодує монооксигеназу дикамби (DMO) Stenotrophomonas maltophilia (вихідною назвою джерела гена DMO була Pseudomonas maltophilia. Потім даний організмджерело перекласифікували спочатку як Xanthomonas maltophilia і потім як Stenotrophomonas maltophilia); функціонально пов'язана з 3'-UTR молекули ДНК, отриманої з гена малої субодиниці рибулозо-1,5-бісфосфаткарбоксилази Pisum sativum (T-Ps.RbcS2-E9). Рослини вибирали за допомогою поєднання аналітичних способів, включаючи TaqMan, аналіз ПЛР і розпилення гербіцидів. Об'єкт MON 87708 вибирали з приблизно 2400 окремих трансгенних об'єктів на основі їх кращих фенотипічних характеристик, порівняльного аналізу молекулярного профілю і асоціації їх бажаних гаплотипів. Потім об'єкт MON 87708 схрещували з об'єктом MON 89788 (стійким до гліфосату). Потомство від даного схрещування обробляли дикамбою (Clarity®, BASF, Research Triangle Park, NC), гліфосатом (Roundup WeatherMAX®, Monsanto Co., St Louis, MO) або поєднанням дикамби і гліфосату. Обробки здійснювали перед висіванням, після висівання на стадії вегетативного росту з 3 листям (V3) і після висівання репродуктивної стадії 1 (R1). Оброблені рослини оцінювали по проценту інгібування росту на 14 день після обробки (DAT) для обробки гербіцидами до висівання, 3 DAT для післясходової обробки на стадії VE і 3 DAT для післясходової обробки на стадії R1. Гербіцид (гербіциди) наносили в різних кількостях на акр, як показано в таблиці 1. Вимірювання процента інгібування являють собою середнє значення з декількох повторень. 13 UA 115761 C2 Таблиця 1 Стійкість до дикамби і/або Roundup WeatherMAX®, що тестується на MON 89788 × MON 87708 Гербіцид (майже всюди Співвідношення г/га (фунт/акр)) Необроблені/без гербіциду Roundup® (3364(3,0)) Clarity® (2244(2,0)) Clarity® (561(0,5)) і Roundup® (841(0,75)) Clarity® (1120(1,0)) і Roundup WeatherMAX® (1682(1,5)) Clarity® (2244(2,0)) і Roundup® (3364(3,0)) 5 % інгібування при % інгібування при 3 % інгібування при 3 14 DAT PRE DAT POST (V3) DAT POST (R1) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 10,0 20,0 0,0 5,0 10,0 0,0 7,5 12,5 0,0 22,5 25,0 Трансген стійкості до дикамби картували в об'єкті сої MON 87708 по групі зчеплення 9 приблизно в положенні 143.5. Асоційоване "ковзаюче вікно" гаплотипу 19743 і 19767 не надавало ефекту на урожай, дозрівання, висоту або вилягання. Інформація про асоціацію гаплотипів представлена в таблиці 2, де GM_A92205 вказує на об'єкт MON 87708. Таблиця 2 Асоціація гаплотипів LG9, положення 143.5 14 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ДНК, вбудовану в геном рослини сої MON 87708, і фланкуючу послідовність охарактеризували за допомогою докладних молекулярних аналізів. Дані аналізи включають: послідовність інсерції, кількість інсерцій (кількість ділянок вбудовування в геномі сої), кількість піків (кількість піків ДНК трансгена в одному локусі), цілісність вбудованої генетичної касети, фланкуючі послідовності і асоціація інсерції з областями гаплотипів генома сої. Застосовували молекулярні ДНК-зонди, що включають інтактну кодуючу область і її відповідні регуляторні елементи, промотори, інтрони і послідовності поліаденілування експресуючих касет рослин. Аналіз показав, що MON 87708 містить єдину інсерцію ДНК трансгена з однією копією експресуючої касети. Здійснювали зворотну ПЛР і аналізи послідовності ДНК для визначення 5'- і 3'-з'єднання інсерцій з геномом рослин, підтвердження організації елементів всередині інсерції (Фіг. 1) і визначення повної послідовності ДНК інсерції в рослині сої MON 87708 (що надається в даному документі як SEQ ID NO: 5). Рослина сої, що містить в своєму геномі пов'язані генетичні елементи трансгена, показані на Фіг. 1, і стійкі до дикамби, є одним з аспектів винаходу. Послідовності, фланкуючі інсерцію ДНК трансгена в MON 87708, визначали із застосуванням зворотної ПЛР, як описано в Ochman et al., 1990 (PCR Protocols: А guide to Methods і Applications, Academic Press, Inc.), і/або способів "прогулянки по геному". Геномну ДНК рослин виділяли з A3525 і трансгенних ліній сої з тканини, вирощеної в стандартних умовах теплиці. Приблизно 1 грам тканини молодого листа об'єднували з рідким азотом і перемелювали в тонкодисперсний порошок із застосуванням ступки і товкача. ДНК виділяли із застосуванням набору для виділення геномної ДНК Nucleon™ PhytoPure™ (RPN8511, Amersham, Piscataway, NJ) по протоколу виробника. Після кінцевого етапу осадження ДНК ресуспендували в 0,5 мл TE (10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1 мМ ЕДТА). Фахівець в даній галузі може модифікувати даний спосіб для виділення ДНК з будь-якої тканини сої, включаючи, як необмежувальні приклади, насіння. Аліквоту ДНК розщеплювали рестрикційними ендонуклеазами, вибраними залежно від рестрикційного аналізу ДНК трансгена. Після самолігування рестрикційних фрагментів здійснювали ПЛР із застосуванням праймерів, сконструйованих з послідовності ДНК трансгена, за допомогою яких ампліфікують послідовності, що розповсюджуються за 5'- і 3'-кінці ДНК трансгена. Продукти ПЛР розділяли електрофорезом в агарозному гелі і очищали із застосуванням набору для виділення з гелю QIAGEN (Qiagen, Valencia, CA). Потім продукти ДНК секвенували безпосередньо із застосуванням стандартних способів секвенування ДНК. 5'- Фланкуючу послідовність, що розповсюджується на правий край послідовності ДНК експресуючої касети трансгена, надають як SEQ ID NO: 3 ([С], див. Фіг. 1). 3'- фланкуючу послідовність, що розповсюджується на лівий край послідовності ДНК експресуючої касети трансгена, надають як SEQ ID NO: 4 ([D], див. Фіг. 1). Частину ДНК експресуючої касети, повністю вбудовану в геномну ДНК A3525, представляють як SEQ ID NO: 5 ([Е], див. Фіг. 1). Послідовності виділених молекул ДНК порівнювали з послідовністю ДНК трансгена для ідентифікації фланкуючою послідовності і фрагмента, що спільно виділяється ДНК трансгена. Підтвердження наявності експресуючої касети здійснювали за допомогою ПЛР з праймерами, сконструйованими залежно від даних про встановлену фланкуючою послідовність і відому послідовність ДНК трансгена. Послідовність дикого типу, що відповідає тій же області, в яку вбудовують ДНК трансгена в трансформованій лінії, виділяли із застосуванням праймерів, сконструйованих з фланкуючих послідовностей в MON 87708. Реакції ПЛР здійснювали із застосуванням системи ампліфікації Elongase® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Фланкуючі послідовності ДНК в MON 87708 і послідовність A3525 дикого типу аналізували відносно численних баз даних нуклеотидів і білків. Дану інформацію застосовували для дослідження взаємовідносин трансгена і генома рослини і перевірки цілісності сайту вбудовування. Фланкуючу послідовність і послідовності дикого типу застосовували для конструювання праймерів для аналізів по кінцевій точці TAQMAN®, що застосовуються для ідентифікації об'єктів. Аналізи зиготності здійснювали із застосуванням даної інформації. Приклад 3: Специфічні для об'єкта аналізи по кінцевій точці TAQMAN® У даному прикладі описують специфічний для об'єкта спосіб термічної ампліфікації по кінцевій точці TAQMAN®, розроблений для ідентифікації об'єкта MON 87708 в зразку. Приклади умов, застосовних для специфічного для об'єкта MON 87708 способу аналізу по кінцевій точці TAQMAN®, є наступними: Етап 1: Воду з опором 18 мегаОм додавали до кінцевого об'єму 10 мкл. Етап 2: 5,0 мкл 2 Universal Master Mix (dNTP, фермент, буфер) додавали до кінцевої концентрації 1. Етап 3: 0,5 мкл суміші праймера об'єкта-1 (SQ13570) і праймера об'єкта-2 (SQ13571) (ресуспендовану у воді з опором 18 мегаОм до концентрації 20 мкМ для кожного праймера) додавали до кінцевої концентрації 1,0 мкМ (наприклад, в мікроцентрифужній 15 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пробірці, наступне необхідно додати для отримання 500 мкл при кінцевій концентрації 20 мкМ: 100 мкл праймера SQ13570 (SEQ ID NO: 9) в концентрації 100 мкМ; 100 мкл праймера SQ13571 (SEQ ID NO: 10) в концентрації 100 мкМ; 300 мкл води з опором 18 мегаОм). Етап 4: 0,2 мкл 6FAM™-MGB-зонда об'єкта PB4655 (ресуспендованого у воді з опором 18 мегаОм до концентрації 10 мкΜ (SEQ ID NO: 11)) додавали до кінцевої концентрації 0,2 мкМ. Етап 5: 0,5 мкл суміші праймера внутрішнього контролю-1 і праймера внутрішнього контролю-2 (ресуспендованої у воді з опором 18 мегаОм до концентрації 20 мкМ для кожного праймера) додавали до кінцевої концентрації 1,0 мкМ. Етап 6: 0,2 мкл VIC™-зонда внутрішнього контролю додавали до кінцевої концентрації 0,2 мкМ (ресуспендованого у воді з опором 18 мегаОм до концентрації 10 мкМ). Етап 7: додавали 3,0 мкл виділеної ДНК (матриці) для кожного зразка з кожним з наступних, які включають 1. Аналізовані зразки листя; 2. Негативний контроль (нетрансгенна ДНК); 3. Негативний контроль вода (без матриці); 4. Позитивний контроль ДНК MON 87708. Етап 8: Настройки термоциклера були наступними: один цикл при 50 °C протягом 2 хвилин; один цикл при 95 °C протягом 10 хвилин; десять циклів при 95 °C протягом 15 секунд, потім 64 °C протягом 1 хвилини з -1 °C/цикл; тридцять циклів при 95 °C протягом 15 секунд, потім 1 хвилина при 54 °C; кінцевий цикл при 10 °C. Застосовуваними в аналізі по кінцевій точці ДНК-праймерами є праймери SQ13570 (SEQ ID NO: 9), SQ13571 (SEQ ID NO: 10) і 6-FAM™-мічений зонд PB4655 (SEQ ID NO: 11). 6-FAM™ є флуоресцентним барвником, що виробляється Applied Biosystems (Foster City, CA), що приєднується до ДНК-зонда. Для TAQMAN® MGB™-зондів 5'-екзонуклеазна активність ДНКполімерази Taq розщеплює зонд з 5'-кінця між флуорофором і гасником. При гібридизації з цільовим ланцюгом ДНК гасник і флуорофор розділяються в достатній для отримання флуоресцентного сигналу ступеня, таким чином, випускаючи флуоресценцію. За допомогою SQ13570 (SEQ ID NO: 9) і SQ13571 (SEQ ID NO: 10) при застосуванні в даних способах реакції з PB4655 (SEQ ID NO: 11) отримують ДНК-амплікон, характерний для ДНК об'єкта MON 87708. Контролі для даного аналізу повинні включати позитивний контроль з сої, що містить ДНК об'єкта MON 87708, негативний контроль з нетрансгенної сої і негативний контроль, що не містить матриці ДНК. Додатково, контроль для реакції ПЛР включає праймери внутрішнього контролю і зонд внутрішнього контролю, специфічні для єдиної копії гена в геномі сої. Фахівець в даній галузі знає, як конструювати праймери, специфічні до єдиної копії гена в геномі сої. Дані аналізи оптимізують для застосування з ПЛР-системою 9700 GeneAmpо Applied Biosystems (запущеної на максимальній швидкості) або термоциклером MJ Research DNA Engine PTC-225. Інші способи і пристрої, відомі фахівцям в даній галузі, за допомогою яких можна отримувати амплікони, що ідентифікують ДНК об'єкта MON 87708, відомі фахівцям в даній галузі. Рослинам R0, що демонструють наявність експресуючої касети, дозволяли розвиватися в повністю зрілі рослини. Для аналізу саузерн-блоттингом застосовували зонди, сконструйовані на основі послідовностей касети трансгена стійкості до дикамби, для визначення зчеплення. Також рослини R0 оцінювали по кількості піків експресуючої касети із застосуванням поєднання саузерн-блоттинга і TAQMAN® по кінцевій точці. Аналіз зиготності застосуємо для визначення, якщо рослина, що містить об'єкт, є гомозиготною по об'єкту ДНК; тобто що містить екзогенну ДНК в тому ж положенні на кожній хромосомі з пари хромосом; або гетерозиготною по об'єкту ДНК, тобто що містить екзогенну ДНК тільки на одній хромосомі з пари хромосом; або не містить об'єкт ДНК, тобто є диким типом. Спосіб термічної ампліфікації по кінцевій точці TAQMAN® також застосовували для розробки аналізів зиготності для об'єкта MON 87708. У даному прикладі описують специфічний для об'єкта спосіб термічної ампліфікації по кінцевій точці TAQMAN®, розроблений для визначення зиготності об'єкта MON 87708 в зразку. Для даного аналізу застосовують аналіз з трьома праймерами, де праймер SQ20632 (SEQ ID NO: 12) гібридизується і специфічно подовжується від 3'-з'єднання вбудованої екзогенної ДНК і геномної ДНК, праймер SQ20636 (SEQ ID NO: 13) гібридизується і специфічно довшає від ДНК, фланкуючої 3'-сторону вбудованої екзогенної ДНК, і праймер SQ20637 (SEQ ID NO: 14) гібридизується і специфічно довшає від геномної ДНК, в яку вбудовують вбудовану екзогенну ДНК. Три праймера є характерними для об'єкта. У даному прикладі праймер SQ20636 (SEQ ID NO: 13), і праймер SQ20632 (SEQ ID NO: 12) і 6-FAM™-мічений олігонуклеотидний зонд PB10130 (SEQ ID NO: 15) є характерними, якщо присутня копія вбудованої екзогенної ДНК. У даному прикладі SQ20636 (SEQ ID NO: 13), і праймер SQ20637 (SEQ ID NO: 14) і VIC™-мічений олігонуклеотидний зонд PB10131 (SEQ ID NO: 16) є характерними, якщо немає копії вбудованої екзогенної ДНК в геномної ДНК, тобто дикий тип. При змішуванні трьох праймерів і двох зондів разом в реакції ПЛР з ДНК, виділеної з гомозиготного по об'єкту MON 87708 рослини, отримує флуоресцентний сигнал тільки від 6FAM™-міченого олігонуклеотидного зонда PB10130 (SEQ ID NO: 15), що свідчить про наявність 16 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гомозиготного по об'єкту MON 87708 рослини і характерний для нього. При змішуванні трьох праймерів і двох зондів разом в реакції ПЛР з ДНК, виділеної з гетерозиготного по об'єкту MON 87708 рослини, отримує флуоресцентний сигнал від 6-FAM™-міченого олігонуклеотидного зонда PB10130 (SEQ ID NO: 15) і VIC™-міченого олігонуклеотидного зонда PB10131 (SEQ ID NO: 16), що свідчить про наявність гетерозиготного по об'єкту MON 87708 рослини і характерний для нього. При змішуванні трьох праймерів і двох зондів разом в реакції ПЛР з ДНК, виділеної з рослини, що не містить об'єкт MON 87708 (тобто дикого типу), отримує флуоресцентний сигнал тільки від VIC™-міченого олігонуклеотидного зонда PB10131 (SEQ ID NO: 16), що свідчить про наявність рослини, що не містить об'єкт MON 87708, тобто дикого типу, і характерний для нього. Приклади застосовних для даного способу умов є наступними. Етап 1: Воду з опором 18 мегаОм додавали до кінцевого об'єму 10 мкл. Етап 2: 5,0 мкл 2× Universal Master Mix (Applied Biosystems, кат. № 4304437; dNTP, фермент, буфер) додавали до кінцевої концентрації 1×. Етап 3: 0,5 мкл праймерів для визначення зиготності SQ20632, SQ20636, SQ20637 (ресуспендованих у воді з опором 18 мегаОм до концентрації 20 мкМ для кожного праймера) додавали до кінцевої концентрації 1,0 мкМ. Етап 4: 0,2 мкл 6-FAM™-зонда PB10130 (SEQ ID NO: 15) (ресуспендованого у воді з опором 18 мегаОм до концентрації 10 мкМ) додавали до кінцевої концентрації 0,2 мкМ. Етап 5: 0,2 мкл VIC™-зонда PB10131 (SEQ ID NO: 16) (ресуспендованого у воді з опором 18 мегаОм до концентрації 10 мкМ) додавали до кінцевої концентрації 0,2 мкМ. Етап 6: додавали 3,0 мкл виділеної ДНК (матриці) для кожного зразка з кожним з наступних, які включають 1. Аналізовані зразки листя (4-80 нг геномної ДНК, розбавленої водою); 2. Негативний контроль (ДНК нетрансгенної сої; 4 нг, розбавлені водою); 3. Негативний контроль вода (без матриці; розчин, в якому ресуспендують ДНК); 4. Позитивний контроль геномна ДНК MON 87708 з відомого гетерозиготного об'єкта (4 нг, розбавлені водою); 5. Позитивний контроль геномна ДНК MON 87708 з відомого гомозиготного об'єкта (4 нг, розбавлені водою). Етап 7: Обережно перемісити. Етап 8: Налаштування термоциклера при застосуванні ПЛР-системи 9700 GeneAmpо Applied Biosystems (запущеної на максимальній швидкості) або термоциклера MJ Research DNA Engine PTC-225 були наступними: один цикл при 50 °C протягом 2 хвилин; один цикл при 95 °C протягом 10 хвилин; десять циклів (95 °C протягом 15 секунд, потім 64 °C протягом 1 хвилини (-1 °C/цикл)); тридцять циклів (95 °C протягом 15 секунд, потім 54 °C протягом 1 хвилин); необов'язкові додаткові 10-20 циклів (95 °C протягом 15 секунд, потім 64 °C протягом 1 хвилини (-1 °C/цикл) можуть забезпечувати більш чітке розділення популяції протягом аналізу по кінцевій точці TAQMAN®; один цикл зберігання при 10 °C. Приклад 4: Ідентифікація об'єкта MON 87708 в будь-якій селекційній роботі з MON 87708 У наступному прикладі описують, як можна ідентифікувати об'єкт MON 87708 в потомстві від будь-якої селекційної роботи із застосуванням об'єктів сої MON 87708. Пари праймерів для ДНК об'єкта застосовують для отримання амплікону, характерного для об'єкта сої MON 87708. Характерний для MON 87708 амплікон містить щонайменше одну послідовність з'єднання, надану як SEQ ID NO: 1, або SEQ ID NO: 2, або SEQ ID NO: 7, або SEQ ID NO: 8. Пари праймерів для об'єкта, за допомогою яких отримують характерний для MON 87708 амплікон, включають пари праймерів залежно від фланкуючих послідовностей і вбудованої експресуючої касети. Для отримання характерного амплікону, в якому виявляють SEQ ID NO: 1, необхідно конструювати молекулу прямого праймера залежно від SEQ ID NO: 3 від основи 1 до 1126 і молекулу зворотного праймера залежно від послідовності ДНК вбудованої експресуючої касети (SEQ ID NO: 5 від положення 1 до 3003), в яких молекули праймерів мають достатню довжину безперервних нуклеотидів для специфічної гібридизації з SEQ ID NO: 3 і SEQ ID NO: 5. Для отримання характерного амплікону, в якому виявляють SEQ ID NO: 2, необхідно конструювати молекулу прямого праймера залежно від послідовності ДНК вбудованої експресуючої касети (SEQ ID NO: 5 від положення 1 до 3003) і молекулу зворотного праймера залежно від 3'-фланкуючою послідовності (SEQ ID NO: 4 від основи 131 до 1947), в яких молекули праймерів мають достатню довжину безперервних нуклеотидів для специфічної гібридизації з SEQ ID NO: 4 і SEQ ID NO: 5. Для практичних цілей необхідно конструювати праймери, за допомогою яких отримують амплікони обмежених діапазонів довжин, наприклад, від 100 до 1000 основ. Менші (з коротшою довжиною полінуклеотиду) по розміру амплікони, в основному, більш надійно отримують в реакціях ПЛР, роблячи можливим коротший час циклів, і їх легко можна розділяти і візуалізувати в агарозних гелях або пристосовувати для застосування в подібних TAQMAN® аналізах по кінцевій точці. Можна отримувати менші амплікони і визначати їх відомими в даній галузі способами визначення ДНК-ампліконів. Крім того, амплікони, що отримуються із застосуванням пари праймерів, можна клонувати у вектори, нагромаджувати, виділяти і секвенувати або їх можна безпосередньо секвенувати добре 17 UA 115761 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 відомими способами в даній галузі. Будь-яка пара праймерів, отримана з поєднання SEQ ID NO: 3 і SEQ ID NO: 5 або поєднання SEQ ID NO: 4 і SEQ ID NO: 5, застосовних в способі ампліфікації ДНК для отримання амплікону, характерного для MON 87708 або його потомства, є одним з аспектів винаходу. Будь-яка окрема виділена молекула полінуклеотидного ДНК-праймера, що містить щонайменше 11 безперервних нуклеотидів SEQ ID NO: 3 або комплементарній їй послідовності, застосовна в способі ампліфікації ДНК для отримання амплікону, характерного для MON 87708 або його потомства, є одним з аспектів винаходу. Будь-яка окрема виділена молекула полінуклеотидного ДНК-праймера, що містить щонайменше 11 безперервних нуклеотидів SEQ ID NO: 4 або комплементарної їй послідовності, застосовна в способі ампліфікації ДНК для отримання амплікону, характерного для MON 87708 або його потомства, є одним з аспектів винаходу. Будь-яка окрема виділена молекула полінуклеотидного ДНКпраймера, що містить щонайменше 11 безперервних нуклеотидів SEQ ID NO: 5 або комплементарної їй послідовності, застосовна в способі ампліфікації ДНК для отримання амплікону, характерного для MON 87708 або його потомства, є одним з аспектів винаходу. Приклад умов ампліфікації для даного аналізу представлений в прикладі 3. Однак в дану галузь включають будь-яку модифікацію даних способів або застосування ДНК-праймерів, гомологічних або комплементарних SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4, або послідовності ДНК генетичних елементів, що містяться в інсерції трансгена (SEQ ID NO: 5) MON 87708, за допомогою яких отримують характерний для MON 87708 амплікон. Характерний амплікон містить молекулу ДНК, гомологічну або комплементарну щонайменше одній ДНК сполуки трансгена/геномної ДНК (SEQ ID NO: 1, або SEQ ID NO: 2, або SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8), або значної її частини. Аналіз зразка тканини рослини об'єкт MON 87708 повинен включати позитивний контроль у вигляді тканини з об'єкта MON 87708, негативний контроль з рослини сої, що не є об'єктом MON 87708 (як необмежувальні приклади, A3525), і негативний контроль, що не містить геномну ДНК сої. Пара праймерів, за допомогою яких ампліфікують ендогенну молекулу ДНК сої, буде служити внутрішнім контролем умов ампліфікації ДНК. Фахівці в галузі способів ампліфікації ДНК можуть вибирати послідовності додаткових праймерів з SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 або SEQ ID NO: 5, і умови, вибрані для отримання амплікону представленими в прикладі 3 способами, можуть відрізнятися, але приводять до утворення характерного для ДНК об'єкта MON 87708 амплікону. Застосування даних послідовностей ДНК праймерів з модифікаціями способів прикладу 3 знаходиться в об'ємі винаходу. Амплікон, що отримується за допомогою щонайменше однієї послідовності ДНК праймера, отриманої з SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 або SEQ ID NO: 5, характерний для MON 87708, є одним з аспектів винаходу. Набори для визначення ДНК містять щонайменше один ДНК-праймер з достатньою довжиною безперервних нуклеотидів, отриманий з SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 або SEQ ID NO: 5, за допомогою якого при застосуванні в способі ампліфікації ДНК отримують амплікон, характерний для MON 87708 або його потомства, є одним з аспектів винаходу. Рослина сої MON 87708, частина рослини, рослинна клітина, насіння або товар, за допомогою якого отримують характерний для MON 87708 амплікон при тестуванні в способі ампліфікації ДНК, є одним з аспектів винаходу. Аналіз амплікону MON 87708 можна здійснювати із застосуванням ПЛР-системи 9700 GeneAmpо Applied Biosystems (запущеної з максимальною швидкістю) або термоциклера MJ Research DNA Engine PTC-225 або будь-якої іншої системи ампліфікаці, яку можна застосовувати для отримання характерного для MON 87708 амплікону, як показано в прикладі 3. Депозит насіння зразка об'єкта сої MON 87708, що описується вище і перерахований в формулі винаходу, здійснюють з урахуванням Budapest Treaty в American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110. Номером доступу в ATCC для даного депозиту є PTA-9670. Депозит будуть зберігати в сховищі протягом 30 років або 5 років після останнього запиту, або протягом терміну дії патенту, незалежно від того, що буде довше, і будуть замінювати по мірі необхідності протягом даного періоду. Після ілюстрування і опису принципів винаходу фахівцям в даній галузі буде очевидно, що винахід можна модифікувати в структурі і подробицях без відхилення від таких принципів. Автори винаходу заявляють всі модифікації, що знаходяться в суті і об'ємі формули винаходу. 55 18 UA 115761 C2 19 UA 115761 C2 20 UA 115761 C2 21 UA 115761 C2 22 UA 115761 C2 23 UA 115761 C2 24 UA 115761 C2 25 UA 115761 C2 26 UA 115761 C2 27 UA 115761 C2 28