Є ще 2 сторінки.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

(57) Набор для диагностики энтеровирусной пневмонии свиней, включающий емкости с антигеном и специфической сывороткой, для постановки реакции нейтрализации, отличающийся тем, что из антигенов используют антигены И 47, Ж 53. В 173, Р 190, И 54, Ж 75, В 161, Ч 72. Р 221, П 142, В 151 из сывороток используют сыворотки к штаммам Enterovirussuis-2,3,4,5,8,14,15,16,17,21, 22 и дополнительно для постановки реакции прямой иммунофлюоресценции, содержит емкости с флуоресцирующими иммуноглобулинами к штаммам Enterovlrus suis 2, 3, 4, 5, 8, 14, 15, 16. 17,21.22.

Текст

Набор для диагностики энтеровмрусной пневмонии свиней, включающий емкости с антигеном и специфической сывороткой, для постановки реакции нейтрализации, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что из антигенов используют антигены И 47, Ж 53. В 173, Р 190, И 54, Ж 75, В 161, Ч 72. Р 221, П 142, В 151 из сывороток используют сыворотки к штаммам Enterovirussuis-2,3,4,5,8,14,15,16,17,21, 22 и дополнительно для постановки реакции прямой иммукофлюоресценции, содержит емкости с флуоресцирующими иммун о глобулинами к штаммам Enterovlrus suis 2, 3, 4, 5, 8, 14, 15, 16. 17,21.22. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к проблеме диагностики вирусных болезней животных и применяется для качественного и количественного иммунологического анализа энтеровирусных антигенов и антител а образцах органов и крози свиней с целью дифференциальной диагностики энтеровирусной пневмонии свиней. Энтеровирусная пневмония свиней представляет собой болезнь, часто встречающуюся а свиноводческих хозяйствах, проявляющуюся в повышении температуры тела, чихании, кашле, потере аппетита, отставании в росте. Б 4% случаев болезнь приводит к летальному исходу. Диагностика знтеровирусной пневмонии свиней осуществляется на основании результатов комплекса исследований: клинических, патологоанатомических, вирусо логически* и иммунологических [1]. Поскольку клинические и патологоанатомические признаки болезни сходны с таковыми при пневмониях, вызываемых другими микроорганизмами, решающее значение в постановке диагноза знтеровирусной пневмонии свиней приобретают вирусологические и иммунологические исследования [2]. В основу изобретения поставлена задача создать набор для диагностики знтеровируской пневмонии свиней, в котором имеются ёмкости с антигеном и специфической сывороткой, а также дополнительно для постановки реакции прямой иммунофлюоресценцыи содержат емкости с флюоресцирующими иммунэглобулинами, позволяющими увеличить достоверность и точность постановки ділагноза и сократить эремя проведения анализа. 6179 Поставленная задача решается тем, что в набор для диагностики энтеровирусной пневмонии свиней включеі ы антигены И-47, Ж-53, В-173, Р-190. И-54, Ж-75, В-161, 4-72, Р-221, П-142, В-151, гипериммунные 5 сыворотки к штаммам Enterovlrus suls 2, З, 4,5,8,14, 15, 16, 17, 21, 22, а также флуоресцирующие иммуноглобулины к штаммам Enterovlrus suis2, 3,4,5, 8,14,15,16,17,21, 22, обладающие повышенной активностью и 10 специфичностью. Штаммы Enterovlrus suls 2, 3, 4, 5,8,14, 15, 16, 17, 21, 22 серотипов для получения компонентов набора диагностикумов энте ровирусной пневмонии свиней. 15 - Штамм И-47 Enterovlrus suis -2 выде лен от поросенка 2-месячного возраста, больного пневмонией, принадлежащего колхозу "Червоный партизан" Ичнянского района, Черниговской области в 1982 г.; де- 20 понирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ ветпрепаратов под № И-47-ДЕП. - Штамм Ж-53 Enterovlrus suls - 3 вы делен от поросенка 2,5-месячного возраста, тринадлсжащего колхозу "Дружба" Андру- 25 шевского района, Житомирской области в 1983 г.; депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ ветпрепаратов под Nfe Ж-53ДЕП -Штамм В-173 Enterovlrus suls - 4 вы- 30 делен от поросенка 3-месячного возраста, больного пневмонией, принадлежащего совхозу "Журавский" Варвинского района, Черниговской области в 1988 г,; депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ 35 ветпрепаратов под Ns В-173-ДЕП. -Штамм Р-190 Enterovlrus suls - 5 выделен от поросенка 2,5-месячного возраста, больного пневмонией, принадлежащего свинокомплексу "Искра" Рязанского райо- 40 на, Рязанской области в 1989 г.; депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ ветпрепаратов под № Р-190-ДЕП. - Штамм И-54 Enterovlrus suis - 8, вы делен от поросенка 2-месячного возраста, 45 больного пневмонией, принадлежавшего кзу "Червоный партизан", Ичнянского р-на, Черниговской области, в 1984 г., депониро ван в коллекции микроорганизмов ВГНКИ ветпрепаратов под № И-54-ДЕП. 50 -Штамм Ж-75 Enterovlrus suls - 14, выделен от поросенка 3-месячного возраста, больного пневмонией, принадлежащего свинокомплексу к-за "Комсомолец Украины", Чудновского р-на. Житомирской 55 области, в 1986 г., депонирован в коллекции ВГНКИ ветпрепаратов под Мг Ж-75-ДЕП. -Штамм В-161 Enterovlrus suis - 16, выделен от поросенка 2,5-месячного возра ста, больного пневмонией, принадлежавшего с-зу "Перемога" Луцкого р-на Волынской обл., в 1988 г., депонирован в коллекции ВГНКИ ветпрепаратов под № Ж-57, ДЕП. - Штамм 4-72 Enterovlrus suls - 15, вы делен от больного пневмонией поросенка, принадлежавшего к-зу "Шлях Ленина", Чер ниговского р-на, Черниговской обл., в 1986 г., депонирован в коллекции ВГНКИ ветпрепаратов под Ns 4-72 ДЕП. - Штамм Р-221 Enterovlrus suis - 17, выделен от больного пневмонией поросен ка, принадлежавшего свинокомплексу "Иск ра", Рязанского р-на, Рязанской обл., в 1989 г., депонирован в коллекции ВГНКИ ветпрепаратов под ISfe Р-221-ДЕП. - Штамм П-142 Enterovlrus suls - 21, выделен на свиноферме колхоза им. Энгель са, Полтавского р-на, Полтавской области от 5-месячного поросенка, больного пневмо нией в 1988 году. Присвоен регистрацион ный № 14 в коллекции ВГНКИ ветпрепаратов. - Штамм В-151 Enterovlrus suis - 22, выделен на свиноферме к-за им. Шевченко, Луцкого района, Волынской обл., от больно го пневмонией 3,5-месячного поросенка в 1988 году. Присвоен регистрационный № 15 в коллекции ВГНКИ ветпрепаратов Штаммы являются РНК-содержащими, размер вирусных частиц 26-28 нм; липидосодержащая оболочка отсутствует - (устой чивы к эфиру и хлороформу); резистентны к трипсину, средам со значениями рН 2,012,0, относительно термостабильны; обла дают репродуктивными и бляшкообрззующими сгс-йств; ми; в куль г у >е перевиваемой линии клеток СПЕВ размножа ются с активностью 1070-1080ТЦД5о/чл; вы зывают сероконверсию у кроликов: в гипериммунных кроличьих сыворотках вируснейтрализующие антитела обнаруживают в титре 1:256-1'2048, в реакции нейтрализации родственны референтным штаммам энтеровирусов свиней соответственно 2,3,4,5,8,14, 15,16,17, 21, 22 серотипов. На основе прототипных штаммов энтеровирусов свиней были приготовлены специфические антигены, антисыворотки и флуоресцирующие иммуноглобулины. Антигены представляют собой лиофилизированные вируссодержащие культуральные суспензии энтеровирусов свиней 2,3,4, 5, 8, 14, 15, 16, 17, 21, 22 серотипов с наполнителем при следующем соотношении компонентов (вес.%) Вируссодержащая суспензия с содержанием в 1 мл 1060- 10 ТЦД5о/мл вируса в поддерживающей среде, состоящей: 6179 Холин-хлорида 0 50 среда 199 30,0-33,0 Инозита (инозитола) . 0,55 0,5% гидролиззт Пара-аминобензойной лактальбумина 30,0-33,0 кислоты (ПАВК) 0,05 Наполнитель состоящий. Витамина А(аксерофитола) 0,1 желатоза 4,5% 5 Витамина Д2 (кальциферола) 0,01 концентрации на дистиллированной воде 11,0-13,0 Витамина Кз (2-метил-1,4пептон 15% нафтохинона) 0,01 концентрации на Витамина Е (альфадистиллированной воде 12,0-14,0 10 токоферол-фосфата) сахароза 15% двунатриевой соли 0,01 концентрации на л - Глютадиона 0,05 дистиллированной воде 11,0-13,0 Твина-80 (полиоксиВходящие в состав антигенов среда этиленмоноолеатсорбитана) 5,0 199 и 0,5% гидролизят лактальбумина со- 15 Холестерина (холистерола) 0,2 стоит: Натрия уксуснокислого 1. Среда 199/мг в 1000 мл раствора тригидрата (ЗНгО) 50,0 эрла/: л - Глютамина 100,0 л - Аргинина - хлоргидрата 70,0 Аденозинтрифосфата (АТФ) л - Гистидина - хлоргидрата 20,0 20 двубариевой соли 10,0 л - Лизина - хлоргидрата 70,0 Адениловой кислоты л - Тирозина 40,0 (мышечной) 0,2 дл - Триптофана 20,0 Железа азотнокислого дл - Фенилаланимина 50,0 трехвалентного л - Цистина 20,0 25 (FeNCbb -9H2O) 0,1 дл - Метионина 30,0 д - Рибозы 0,5 дл - Серинз ' 50,0 д - 2 Дезоксирибозы 0,5 дл - Треонина 60,0 Солевой раствор Зрла состоит (мл) из: дл - Лейцина 120,0 Раствора А 100,0 дл - Изолейцина ' 40,0 30 Раствора Б 100,0 дл - Валина 50,0 Раствора фенолового дл - Глютаминовой кислоты 150,0 красного (0,5%) 10,0 дл - Аспарагиновой кислоты 60,0 Воды дистиллированной 790,0 Никотиновой кислоты Раствор А (г в 1000 мл воды) из: (витамина РРі, ниацина) 50,0 35 Хлористого натрия (NaCI) 68,0 дл - Ананина (альфа) 50,0 Хлористого калия (KCI) 4,0 л - Пролина 40,0 Хлористого кальция (СаСІг) 2,0 л - Гидроксипролина 10,0 Сернокислого магния Гликоколла (глицина) 50,0 (MgSO4x7H2O) 2,6 . л - Цистеина 0,1 40 Раствор Б состоит (г в 1000 мл воды) из: Аденина - сульфата 10,0 Натрия двууглекислого Гуанина-хлоргидрата (HCI) 0,3 "' (гидрокарбоната МаНСОз) 22,0 Ксантина 03 Натрия фосфорнокислого Гипоксантина О&' однозамещенного Урацила '$$*'* 45 (NaH2PO4 -2H2O) 1,4 Метилурацила 0J5* Глюкозы 10,0 Тианина (витамина В-\)2. Гидролизат лактальбумина (0,5% рас ] хлоргидрата 0,01 твор) состоит (г) из: Пиридоксаля (альдегида Гидролизата лактальбумина витамина Вб, пиридоксаля50 ферментативного 5,0 хлоргидрата) 0,025 Раствора Хенкса (по весу) 995,0 • Рибофлавина (витамина Вг) 0,01 Раствор Хенкса состоит (мл) из: Витамина С Раствора А , 50,0 (аскорбиновой кислоты) 0,05 Раствора Б 50,0 Никотинамида 55 Раствора фенолового красного 4,0 (ниацинамида) 0,025 Воды дистиллированной 896,0 Пантотената кальция ' 0,01 Раствор А состоит (г в 1000 мл воды) из: д - Биотина б|1Н Хлористого натрия (NaCI) 160,0 Птероилглютаминовой Хлористого калия (КС!) 8,0 кислоты (витамин В12) 0,01 6179 Хлористого кальция безводного (СаСІг) 2,8 Сернокислого магния (MgSCM -7H2O) 4,0 Раствор Б (г в 1000 мл воды). Натрия двууглекислого (Naf-ІСОз) 7,0 Фосфата натрия двузамещенного (Na2HP4 -2Н2О) 1,2 Глюкозы 20,0 Специфические сыворотки к штаммам Enterovirus suis - 2, 3, 4, 5, 8, 14, 15, 16. 17, 21, 22 применяются для идентификации энтеровирусов - возбудителей энтеровирусной пневмонии свиней, в реакции нейтрализации а культуре клеток. Специфические сыворотки представляют собой сыворотки крови, полученные путем гипериммунизации кроликов антигенами штаммов энтеровирусов И47, Ж53, В173, Р190, И54, Ж75. В161, 472, Р221, П142, В151 соответственно 2, 3, 4, 5, 8, 14, 15, 16, 17, 21, 22 серотипов. Флуоресцирующие иммуноглобулины к штаммам Enterovirus suis - 2, 3, 4, 5, 8, 14, 15, 16, 17, 21, 22 применяются для обнаружения антигена (вируса) в мазках-отпечатках, приготовленных из патологического материала (легких, лимфоузлов) больных и павших животных, методом иммунофлуоресценции. Флуоресцирующие иммуноглобулины представляют собой фракции иммуноглобулинов специфических кроличьих сывороток крози, полученных на штаммы энтеровирусов И47, Ж53, В173, Р190, И54, Ж75, В161, 472, Р221, П142, В151, соответственно 2, 3, 4.5,8, 14, 15, 16, 17,21, 22 серотипов, меченые флуоресцеин-5-изотиоционатом. Антигены, специфические сыворотки и флуоресцирующие иммуноглобулины помещаются в стерильные флаконы, лиофильно высушиваются и укупориваются. Одного набора достаточно для проведения 50 анализов. П р и м е р 1. Приготовление антигенов. Антигены получают при репродукции прототипных штаммов знтеровирусов свиней 2-5, 8,14-17, 21, 22 серотипов в культуре клеток почки свиньи. Культуру клеток выращивают на среде 199 пополам с 0,5% раствором гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса с 10% сыворотки крупного рогатого скота. В качестве поддержиеающей используют ту же среду без сыворотки, Штаммы энтеровирусов свиней И-47, Ж-53, В-173, Р-190, И-54, Ж-75, 4-72, В 8 161. Р-221, П-142, В-151, используемые для приготовления специфических антигенов, поддерживают в перевиваемой линии культуры клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) 5 и сохраняют в лиофилизированном состоянии при температуре +2—М°С или в нзтивном - при температуре минус 40°С. Ежегодно готовят новые мэтриксные серии вируса, используемые для приготовления 10 антигена и получения специфических кроличьих сывороток. Для расплодки каждого из штаммов энтеровирусов из культуральных флаконов со сформировавшимся монослоем клеток сли15 вают питательную среду, монослой трижды отмывают раствором Хэнкса и вносят по 1 мл матриксного вируса с множественностью заражения не более 10-100 ТЦД50 на клетку. После адсорбции в течение одного часа в 20 культуральные флаконы вносят 150-200 мл поддерживающей среды (рН 7,4-7,7). Зараженные и контрольные культуральные флаконы помещают в термостат при температуре +37°С и ежедневно лросматри25 вают под микроскопом. Цитопатическое действие вируса (ЦПД) проявляется через 24-48 часов в виде округления клеток и появления в них зернистости. Культуральные флаконы с разрушенным монослоем клеток 30 замораживают при минус 20-60°С После оттаивания при +37°С вирусную суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную вируссодержащую жидкость разливают во флаконы и хранят 35 при минус 2О-60°С. Активность нативного вируса определяют путем титрования его в культуре клеток. Для этого готовят десятикратные разведения вируссодержащей культуральной жид40 кости с 10" до 10" и разведениями, начиная с последнего до 10"*, инокулируют пробирочные культуры со сформировавшимся монослоем клеток, в которых питательная среда заменена на поддерживающую. Рас45 плодка матриксного вируса считается пригодной для изготовления антигена, если она стерильна и имеет титр не ниже Ю^НЧЛАБО/МЛ. Вируссодержащую суспензию каждого штамма смешивают с наполни50 телем, состоящим из; желатозы 4,5% концентрации на дистиллированной воде 11,0-13,0; пептона 15% концентрации на дистиллированной воде- 12,0-14,0; сахарозы 15% концентрации на дистиллирован55 ной воде - 11,0-13,0, в соотношении V.1, расфасовывают в стерильные флаконы по 1 мл и высушивают. Для этого флаконы промораживают при минус 45°С в течение 12 час, затем устанавливают в суб 6179 лиматор вакуум-сушильного аппарата, конденсат которого должен быть охлажден до минус 40°С. Создают вакуум до 100-150 микрон и высушивают в течение 28-30 час. В последние 4 часа включают подогрев до +30°С. Флаконы закрывают с соблюдением правил асептики резиновыми пробками и обкатывают металлическими колпачками, обеспечивающими герметичность. Титр лиофилизированного антигена должен быть не ниже 1040ТЦД50/мл. П р и м е р 2. Приготовление специфических сывороток. Приготовленную расплодку матриксного вируса после замораживания и оттаивания центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отбирают, определяют инфекционный титр вируса в культуре клеток СПЭВ. Титр вируса должен быть не ниже 10 ТЦД5о/мл. В качестве антигена для иммунизации используют надосадочную жидкость и водно-масляную эмульсию, содержащую 1,5 части надосадочной жидкости и 1 часть неполного адьюванта Фрейнда (НАФ). НАФ состоит из 1 части ланолина и 9 частей вазелинового масла. Для получения специфической иммунной сыворотки к каждому серотипу энтеровируса свиней используют кроликов весом не ниже 2,5 кг. Антиген вводят животным подкожно (масляную эмульсию) в области лопатки и внутривенно (вируссодержащую культуральную жидкость) в крайнюю ушную вену. Иммунизацию проводят наростающими дозами антигена с недельным интервалом между инъекциями по схеме. 1 2 3 4 5 с адью- 5 вантом анти- без адь- гена юванта /мл/ 10 5 5 7 Номер иньекции Обьем Кровь отбирают через 14 дней после последнего введения антигена. Сыворотки проверяют на активность в реакции нейтрализации в культуре клеток СПЭВ. С этой целью делают разведение сыворотки 1:32, инактивируют при 56°С в течение 30 мин и делают дальнейшие двукратные разведения до 1:2048. После этого 0,5 мл каждого разведения сыворотки соединяют с равным объемом гомологичного штамма энте 10 ровируса в разведении, содержащем 1000 ТЦД5ОВируссывороточную смесь инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. Ростовую среду из пробирок с культурой клеток сливают, монослой промывают раствором Хенкса, а затем в каждую пробирку вносят по 1 мл вируссывороточной смеси и помещают в термостат при 37°С. На каждое разведение берется по 2-4 пробирки с культурой клеток. Контролями реакции служат: 4 пробирки с незараженной культурой клеток, ивокулированной наименьшим разведением сыворотки (1:32); по 4 пробирки с культурой клеток зараженной 1000; 100; 10; 1; 0,1 ТЦДБО вируса. Учет ЦПД вируса в культуре клеток проводят на 4-е и 7-е сутки микроскопией при малом увеличении микроскопа. Титром антител считается наибольшее разведение сыворотки, которое нейтрализует в 50% пробирочных культур клеток 1000 ТЦДБО вируса. Допустимый минимальный титр антисыворотки, используемой в наборе диагностикумов, 1:40. После проверки активности, сыворотки расфасовывают в стерильные флаконы по 1 мл и лиофилизируют. П р и м е р 3. Получение флуоресцирующих иммуноглобулинов. Глобулины выделяют из специфических сывороток 3-кратным высаливанием сульфатом аммония. К охлажденной при температуре 2-4°С сыворотке при помешивании добавляют по каплям равный объем охлажденного насыщенного раствора сульфата аммония. Смесь при перемешивании выдерживают 30 мин, а затем 2 часа при температуре 2-4°С. Осадок центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин при 2-4°С. Осадок растворяют в физиологическом растворе (рН 7,2), объем которого равен половине исходного объема сыворотки. Осаждение глобулинов проводят еще два раза в тех же условиях, растворяя осадок в половине забуференного физиологического раствора. Полученную пастозную массу диализируют при 2-4 С против зэбуференного физиологического раствора с рН 7,2. Присутствие сульфата аммония проверяют 10% раствором хлористого бария. Количество белка в глобулиновой фракции должно быть не менее 2 мг %. Метку (коньюгэцию) иммуноглобулинов проводят флуоресцеин-5-изотиоционатом (ФИТЦ). Оптимальная доза красителя - 2% по отношению к белку. Необходимое количество флуорохрома растворяют в 0,1 М растворе углекислого 11 6179 натрия, добавляют к охлажденному раствору белка, перемешивают 30 мин при комнатной температуре и оставляют на 18 час при 2-4°С. Очистку коньюгированного с ФИТЦ им- 5 муноглобулина проводят последовательной гельфильтрацией через сефадекс 50 или 25 и колоночной хроматографией с помощью Д ЭАЭ-целлюлозы. Активность коньюгатэ устанавливают 10 микроскопией окрашенных препаратов из зараженной гомологичным вирусом (энтеровирус 2, 3. 4, 5, 8, 14, 15, 16. 17, 21, 22 серотипов) культуры клеток, выращенных на покровных стеклах. Для этого выращенную 15 на покровных стеклах культуру клеток инокулируют вирусом в разведении 10' и термостатируют до появления ЦПД в виде округлых клеток в 50-60% монослоя. Перед окрашиванием препараты из культуры кле- 20 ток отмывают от питательной среды физиол огичес к им раство ром {рН 7, 2- 7, 4) и высушивают на воздухе. Препараты фиксируют охлажденным до-15°С ацетоном 15-20 мин при температуре 0-2°С, выдерживают 25 10 мин в двух сменах физиологического раствора (рН 7,2-7,4), сушат на воздухе. Готовят двукратные разведения флуоресцирующих иммуноглобулинов на физиологическом растворе с 1:2 до 1:128. Каждым 30 разведением окрашивают по два специфических препарата - зараженная культура клеток и по два контрольных - незаражен-ная культура клеток, помещают во влажную камеру и выдерживают 25-30 мин при тем- 35 пературе 37°С. Окончив окрашивание, препараты промывают в трех сменах физиологического раствора (рН 7,2-7,4) по 10 мин, споласкивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. В положи- 40 тельных случаях при микроскопии обнаруживают ярко-зеленое свечение в виде фокусов из 3-4 и более клеток с специфической флуоресценцией в цитоплазме^ Красящий титр коньюгата должен быть не 45 ниже 1:4. П р и м е р 4. Проверка специфичности антигенов, сывороток и флуоресцирующих иммуноглобулинов. Специфичность антигенов и сывороток SO проверяют в реакции перекрестной нейтрализации в- культуре клеток. В реакции используют антигены прототипных штаммов энтеровирусов 2-5^ 8. 14, 15, 16, 17, 21, 22 серотипов, референтные штаммы энтерови- 55 русов свиней 1-22 серотипов и специфические сыворот ки к ним. Антигены и референтные штаммы энтеровирусов используют в дозе 32-320 ТЦДбо; сыворотки к каждому антигену и штамму в разведении, 12 равном 20 нейтрализующим дозам. Реакцию нейтрализации выполняют таким образом, чтобы при испытании на специфичность антигена были использованы гомологичные и гетерологичные сыворотки, а при определении специфичности сывороток были использованы гомологичные и гетерологичные антигены серотипов энтеровирусов, включенных в набор, и референтных. Контролями реакции служат 4 пробирки с незараженной культурой клеток; по 4 пробирки с культурой клеток, инокулированной наименьшим разведением иммуной сыворотки (1:8); по 4 пробирки с культурой клеток, зараженной 1000, 100. 10, 1, 0,1 ТЦДбо вируса. Антиген и сыворотку к нему считают специфичными, если 32-320 ТЦДБО вируса нейтрализуется 20 нейтрализующими дозами только специфической гомологичной сыворотки. С целью определения специфичности флуоресцирующего иммуноглобулина, разведением его, равным красящему титру, окрашивают по два специфических препарата инфицированной культуры клеток. В качестве контроля специфичности иммунофлуоресценции служат по два препарата: - неинфицированной культуры клеток, окрашенной разведением коньюгата, рав ным красящему титру; - неокрашенной инфицированной кулчтуры клеток; - инфицированной культуры клеток, ок рашенной меченой нормальной сывороткой; - инфицированной культуры клеток, ок рашенной меченой гомологичной сыворот кой сорбированной гомологичным антигеном. Специфический флуоресцирующий иммуноглобулин должен вызывать в рабочем разведении ярко-зеленое свечение зараженных гомологичным штаммом вируса клеток, при отсутствии его в контрольных препаратах. П р и м е р 5. Сравнительная оценка активности и специфичности референтных и прототипных штаммов энтеровирусов свиней. Сравнительную оценку активности и специфичности референтных штаммов энтеровирусов свиней 2, 3, 4, 5, 8, 14, 15, 16, 17, 21, 22 серотипов и прототипных штаммов, входящих в набор диагностикумов, проводят в реакции нейтрализации в культуре клеток. Антигены используют в дозе 32-320 ТЦДБО / МЛ . Сыворотки к каждому серотипу берут в разведениях от 8 до 2048. Реакцию И 617Э 13 нейтрализации проводят таким образом, чтобы антигены и сыворотки реагировали с гомологичными и гетерологичными сыворотками и антигенами энтеровирусов включенных в набор серотипов Результаты исследования приведены в таблице 2 Цифрами обозначены проценты отношения гомологичных титров сывороток к гетерологичным. Применение селекционированных прототипных штаммов позволяет увеличить чувствительность реакции нейтрализации в 2-4 раза П р и м е р 6. Диагностика энтеровирусной пневмонии свиней иммунологическими методами с применением набора диагностиДля диагностики энтеровирусной пневмонии свиней проводят комплекс исследований, включающий 1 Отбор проб легких, лимфатических уз лов, назальных смывов и крови от больных и переболевших животных в очагах заболева ния пневмонией 2 Приготовление мазков отпечатков для выявления антигенов энтеровирусов в лег ких, лимфатических узлах 3. Анализ сывороток крови на наличие вируснейтрализующих антител к энтеровирусам свиней. 4 Титровано-типировэнные пассажи проб легких, лимфоузлов и назальных смывов в культуре клеток. Из A3 проб легких, лимфоузлов, назальных смывов, отобранных от поросят в очагах заболевания свиней пневмонией, выделено 7 изолятов вирусов, два мз которых окзза-5 лись родственными 17 серотипу, один - 4 серотипу, два 21 серот ипу, два обладали полиантигенным родством к 5, 4, 8 и 3, 8, 1^, 15, 16 серотипам энтеровирусов свиней В 34 из 43 исследованных сыворотках 10 крови выявлены вируснейтрализующие антитела к энтеровирусам саиней 4, 8, 15, 16, 17, 21 серотипов В мазках-отпечатках наблюдались свечение клеток легких на 2-3 креста в 13 из ?0 15 препаратах к 4, 8,16, 17, 21 серотипзм энтеровирусов свиней На основании полученных результатов был поставлен диагноз энтеровирусной пневмонии свиней даны рекомендации по 20 профилактике данной болезни Набор диагноста кумо в энтерозирусной пневмонии позволил в течение 1-3 дней поставить предварительный диагноз и в течение 114 дней окончательный диагноз энтерови-25 русной пневмонии свиней. Экономический эффект по данным производственной л ровер-ки 0,31 тыс.руб. на 1 набор или на 1 хозяйство при вынужденной диагностике. Данное изобретение, являющееся сово-30 купностью новых, "е известных ранее существенных признаков, представляет собой новое технико-экономическое решение поставленной проблемы и имеет коммерческую ценность. Табл ице Определение специфичности Антигв-к ы Сеи штаммы роти ПЫ энтеровирусоо сеиней 12 Э4 5б8 10 11 Р190 FT 12 13 И54 14 15 М2323 К9 18 К23 Л90 17 18 ХС75472 1В 8161 Р221 20 4184 И227 21 22 И249 Ш42 8151 Л СЫВОРОТОК Гипериммунные сыворотки /шгами-серотип/ Коп И47 ratt се 1 КопгаЧсс И17 Ж53 антигенов 2 Ж53 В173 Р19О F7 3 4 И54 М232 Э КЗ К22 Л90 Ж75 472 В161 14 15 16 5 6 в 10 11 12 13 ♦ Р221 Ч1В4 М22 И249 П142 В151 7 17 18 19 20 21 22 + * + 4 sm * * * * I 1 Таблица 2 Определение активности антигенов и сывороток СероТИП Штаммы Сыворотки /штамм-серотип/ ел Р190 У13 И54 М116 475 F59 F59 И47 F34 Ж53 F78 И57 F12 Р190 У13 И54 М116 475 473 472 Г95 В151 Б111 Р221 F34 Ж53 F78 И57 F12 2 22 3 34 45 58 8 14 14 15 15 16 16 17 17 И47 2 3 3 4 4 5 5 > 8 8 14 14 15 100 50 100 100 400 25 100 100 200 юо 100 400 50 100 100 200 200 100 100 200 100 100 100 100 400 100 473 В161 Б111 Р221 16 16 17 17 25 100 100 400 100 100 100 400 100 100 472 Г95 15 о» 6179 Упорядник Н. Буракова Замовлення 624 Техред М.Моргвнтал Коректор Е. Папп Тираж Підписне Державне патентне відомство УкрвТни, 254655, ГСП, КиТв-53, Львівська пл., В Виробничо-видавничий комбінат "Патент", м. Ужгород, вул.ГагарІна, 101

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Set for diagnostics of enterovirus pneumonia in pig

Автори англійською

Romanenko Volodymyr Pylypovych, Pinchuk Iryna Mykolaivna, Bokun Alevtyna Oleksandrivna

Назва патенту російською

Набор для диагностики энтеровирусной пневмонии свиней

Автори російською

Романенко Владимир Филиппович, Пинчук Ирина Николаевна, Бокун Алевтина Александровна

МПК / Мітки

МПК: C12Q 1/70, C12R 1/93, G01N 33/533

Мітки: діагностики, свиней, набір, ентеровірусної, пневмонії

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/10-6179-nabir-dlya-diagnostiki-enterovirusno-pnevmoni-svinejj.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Набір для діагностики ентеровірусної пневмонії свиней</a>

Подібні патенти