Злитий поліпептид проти пухлини, індукованої вірусом eb, і мутант коліцину ia

Реферат: Винахід належить до злитого поліпептиду проти пухлини, індукованої вірусом ЕВ, який включає антитіло або міметики антитіл проти вірусу ЕВ і коліцин Іа, який включає мутації G11A, H22G, A26G, V31L і H40D. UA 104933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Область винаходу Дійсний винахід відноситься до області протипухлинних засобів, і, більш конкретно, до нового поліпептиду проти пухлини, викликаної вірусом EB (Епштейна-Барра), і його застосування, і способу отримання. Область техніки, якої стосується дійсний винахід В області вивчення антибіотиків дослідження спрямовані на розробку нових антибіотиків, які відтворюють механізм взаємного кіллінгу між гомогенними гетерологічними штамами. У природі існує велика кількість бактеріальних токсинів, які знищують клітини шляхом безпосереднього утворення іонних каналів у клітинній мембрані бактерій. Показовим прикладом такого токсину є коліцин, бактеріальний токсин, що секретується E. coli. Коліцин Ia виявив Jacob у 1952 році, відтоді за допомогою старанної праці поколінь Qiu і співавт. (Major transmembrane movement associated with colicin Ia channel gating. J. Gen. Physiology, 107:313-328 (1996)) зрештою відкрили трансмембранну просторову структуру коліцину Ia за відкритих або закритих іонних каналів, утворених у штучних двошарових ліпідних мембранах, що на молекулярному рівні забезпечує фундаментальну основу для розробки і отримання нових антибіотиків. Як наслідок, існують поліпептидні молекули, створені шляхом з'єднання поліпептиду коліцину із сигнальним пептидом, таким як феромони Streptococcus albus або роду Staphylococcus, які націлюють коліцин на клітинну мембрану бактерії, що цікавить, і знищують клітину внаслідок витоку клітинного вмісту через утворені трансмембранні іонні канали. Злоякісна пухлина являє собою серйозну загрозу для здоров'я людини. Щорічно від злоякісної пухлини у світі помирають сім мільйонів людей, одна шоста з яких у Китаї. У нашій країні злоякісна пухлина зараз є другою за значимістю причиною смерті. Оскільки етіологія, патогенез і клінічний прояв злоякісної пухлини чітко не з'ясовані, профілактика та лікування не є ефективними. Протипухлинні засоби важливі для лікування пухлини. Незважаючи на те, що вони досягають терапевтичного ефекту стосовно деяких пухлин, залишаються деякі недоліки, такі як недостатня пухлинна селективність, імунологічне пригнічення, побічна реакція, стійкість до лікарських засобів і т.д. Поверхня клітин лімфоми Беркітта, лімфоми Ходжкіна і назофарингіальної карциноми, викликаних вірусом Епштейна-Барра (EB), несе специфічний поверхневий антиген вірусу EB. Таким чином, поверхневий антиген вірусу EB може бути розглянутий у якості специфічного маркера таких пухлинних клітин. Відносно засобів проти пухлини, викликаної вірусом EB, винахід з патентом Китаю № ZL200410081446.8 розкриває протипухлинний поліпептид, утворений шляхом кон'югації коліцину і міметиків антитіл, які розпізнають поверхневий антиген вірусу EB. Протипухлинний поліпептид здатний специфічно знищувати в організмі ракові клітини, викликані вірусом EB, не шкодить нормальним клітинам, його здатність до кіллінгу в кілька разів вище, ніж у інших протипухлинних засобів, і він долає проблеми, такі як пухлинна селективність, стійкість до лікарських засобів, ураження нормальної тканини при знищенні ракових клітин. Xiao-Qing Qiu і співавт. (Xiao-Qing Qiu et al., 2007, Small antibody mimetics comprising two complementarity-determining regions and a framework region for tumor targeting, Nature Biotechnology 25, 921–929, 1 August 2007) порівняли ефект кіллінгу протипухлинних поліпептидів, сконструйованих за допомоги ряду міметиків антитіл і коліцину, і виявили, що протипухлинні поліпептиди, сконструйовані за допомоги міметиків антитіл VHCDR1-VHFR2VLCDR3 і VLCDR1-VHFR2-VHCDR3 і коліцину мають чудову здатність до кіллінгу. Ця робота забезпечує більше ймовірних міметиків антитіл для отримання поліпептидів проти пухлини, викликаної вірусом EB. Однак відносно протипухлинного поліпептиду, описаного вище, через те, що гідрофобний кінець коліцину має кілька амінокислотних залишків, які можуть включати гіперчутливість, ліки, що містять поліпептид коліцину, більшою мірою здатні викликати ненормальну імунну відповідь in vivo. Повідомляли, що механізм обміну речовин багатьох пацієнтів, хворих на рак, є ненормальним через порушення, викликані раковими клітинами, вони схильні страждати алергічною реакцією на ліки з поліпептидів, тому не можуть лікуватися подібними ліками. Таким чином, необхідно поліпшити поліпептид коліцину для того, щоб одержати протиракові ліки, які є більш безпечними і придатними для більшого числа пацієнтів. Короткий опис винаходу Ґрунтуючись на недоліках прототипу, викладених вище, дійсний винахід забезпечує новий поліпептид проти пухлини, викликаної вірусом EB, і його застосування, і спосіб отримання, таким чином, забезпечує ліки для лікування пухлини, викликаної вірусом EB, які мають високу здатність до кіллінгу, високу специфічність і низьку ймовірність алергічної реакції. Новий поліпептид проти пухлини, викликаної вірусом EB, котрий утворюють шляхом функціонального зв'язування мутантного поліпептиду коліцину, здатного утворювати іонні 1 UA 104933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 канали, з поліпептидом антитіла до вірусу EB або поліпептидом міметиків антитіл до вірусу EB, при чому мутантний поліпептид коліцину, що здатний утворювати іонні канали, одержують шляхом мутації амінокислотних залишків G11A, H22G, A26G, V31L і H40D у пептидному ланцюгу коліцину дикого типу E1, Ia, Ib, A, B, N або їх доменів водних каналів, при чому амінокислотна послідовність поліпептиду антитіла до вірусу EB є тією ж, що у поліпептиді моноклонального антитіла, секретованого гібридомою ATCC HB-168. Поліпептид міметиків антитіл являє собою з'єднаний пептид регіону CDR1 важкого ланцюга, зв'язувальний пептидний сегмент CDR1-CDR2 важкого ланцюга і CDR3 легкого ланцюга антитіла до вірусу EB. Мутантний поліпептид коліцину, здатний утворювати іонні канали, одержують шляхом мутації коліцину Ia дикого типу. Новий поліпептид проти пухлини, викликаної вірусом EB, має амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO. 29. Ген, що кодує новий поліпептид проти пухлини, викликаної вірусом EB. Ген, який має нуклеотидну послідовність, показану в SEQ ID NO. 30. Рекомбінаційна плазміда, що містить зазначений ген. Спосіб отримання нового поліпептиду проти пухлини, викликаної вірусом EB, що включає етапи, на яких: трансформують зазначену рекомбінаційну плазміду в експресійну систему для експресії і виділяють експресований поліпептид. Застосування зазначеного нового поліпептиду проти пухлини, викликаної вірусом EB, для отримання ліків для лікування і профілактики пухлини, викликаної вірусом EB. Мутантний поліпептид коліцину Ia, його амінокислотна послідовність показана в SEQ ID NO. 24. Ген, що кодує мутантний поліпептид коліцину Ia. Застосування зазначеного гена для отримання пептидних ліків, функціонального зв'язування зазначеного гена з геном, який індукує пептид, клонування в експресійний вектор, потім трансформування експресійного вектора в експресійну систему і виділення експресованого поліпептиду. Дійсний винахід забезпечує новий поліпептид проти пухлини, викликаної вірусом EB, який утворений мутантним поліпетидом коліцину, здатним утворювати іонні канали, з поліпептидом антитіла до вірусу EB або поліпептидом міметиків антитіл до вірусу EB. Оскільки в молекулі поліпептиду коліцину дикого типу існують кілька амінокислотних залишків, які можуть включати гіперчутливість, згідно із дійсним винаходом в поліпептидній молекулі коліцину, здатного утворювати конструкт іонного каналу, селективно мутують амінокислотні залишки в гідрофобній області, які більшою мірою можуть викликати алергічну реакцію. Наприклад, у переважному варіанті здійснення дійсного винаходу мутантними сайтами поліпептиду коліцину Ia є: G11A, H22G, A26G, V31L і H40D. У мишей, імунізованих ін'єкцією поліпептиду коліцину Ia або поліпептиду мутантного Ia, відповідно, експериментальні дані показують, що сироватковий титр, продукований мишами, ін'єктованими поліпептидом мутантного Ia, на кілька порядків величини нижче, ніж попередній, тобто, рівень імунної відповіді нижче, що доводить, що мутантний поліпептид знижує ймовірність алергії, у той час як мутантний поліпептид зберігає функцію утворення іонних каналів у мембрані клітини. Експеримент показав, що здатність до кіллінгу рекомбінантного поліпептиду дійсного винаходу не порушена, що означає, що мутантні амінокислотні залишки не порушують функцію утворення коліцином іонних каналів. У новому поліпептиді проти пухлини, викликаної вірусом EB, забезпеченому дійсним винаходом, мутантний поліпептид коліцину націлюють на мембрану клітин-мішеней за допомогою розпізнавання поліпептидом антитіла до вірусу EB або поліпептидом міметиків антитіл до вірусу EB поверхневого антигену пухлинних клітин, викликаних вірусом EB, гідрофобний регіон трансмембранного домену іонного каналу мутантного поліпептиду коліцину вставляють у клітинну мембрану пухлинних клітин з утворенням іонного каналу, таким чином, пухлинні клітини гинуть від витоку клітинного вмісту. Амінокислотна послідовність поліпептиду антитіла до вірусу EB повністю відноситься до амінокислотної послідовності поліпептиду антитіла, секретованого гібридомою ATCC HB-168. У варіанті здійснення дійсного винаходу переважним є протипухлинний поліпептид даного винаходу з низькою молекулярною вагою, який одержують шляхом функціонального зв'язку поліпептиду міметиків антитіл до вірусу EB, описаних вище, з карбоксильним кінцем мутантного поліпептиду коліцину. Тобто, такий міметичний поліпептид з низькою молекулярною вагою містить пептидний ланцюг VHCDR1-VHFR2-VLCDR3, який одержують шляхом з'єднання регіону VHCDR1, регіону VLCDR3, зв'язувального пептидного сегмента VHCDR1-VHCDR2 і VLCDR3 легкого ланцюга поліпептиду антитіла до вірусу EB. Амінокислотна послідовність міметиків 2 UA 104933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіл нового протипухлинного пептиду 1 показана в SEQ ID NO. 25. Міметик антитіл містить тільки менше 30 амінокислот і має молекулярну вагу набагато нижче, ніж природне антитіло із 150 амінокислот. Він виконує вимогу розпізнавання антигену, у той час як значно знижує молекулярну вагу протипухлинного поліпептиду і сприяє тканинній проникності протипухлинного поліпептиду дійсного винаходу. Іншою метою дійсного винаходу є забезпечення послідовності гену, що кодує протипухлинний поліпептид дійсного винаходу. Ген протипухлинного поліпептиду дійсного винаходу утворений шляхом функціонального зв'язку гена, що кодує мутантний поліпептид коліцину, з геном, що кодує поліпептид антитіла до вірусу EB або поліпептид міметиків його антитіл, де поліпептид коліцину і генна послідовність антитіла до вірусу EB відомі в даній області техніки, ген мутантного поліпептиду коліцину одержують шляхом наступних крапкових мутацій у відповідних кодонах гена поліпептиду коліцину: G11A, H22G, A26G, V31L і H40D. Завдяки виродженості генетичного коду фахівець у даній області техніки може регулювати нуклеотидну послідовність, що кодує протипухлинний поліпептид дійсного винаходу, без зміни амінокислотної послідовності. Рекомбінаційна плазміда дійсного винаходу означає, що вихідний вектор, завантажений геном коліцину дикого типу, сайт-спрямовано мутують у подвійному нуклеотидному ланцюгу і вставляють мутантними кодонами в сайт спрямованої мутації, у такий спосіб одержуючи мутантний вектор, що містить ген мутантного поліпептиду коліцину. Таким же процесом сайтспрямованого мутагенезу вставляють ген, що кодує міметики антитіл до антитіла до вірусу EB, у ділянку гена, що кодує карбоксильний кінець мутантного поліпептиду коліцину, у такий спосіб TM одержуючи рекомбінантну плазміду дійсного винаходу. Вихідний вектор pSELECT -1, придбаний в Promega Corp., несе гени коліцину Ia і білка імунітету. Процес сайт-спрямованого мутагенезу виконують згідно з інструкцією до набору від Strategene Corp. Згідно з дійсним винаходом проводять декілька сайт-спрямованих мутагенезів для одержання мутантного поліпептиду коліцину, де п'ять кодонів є мутованими сайт-спрямовано. Таким чином, сконструювали 5 пар праймерних послідовностей (SEQ ID NO. 1-10). У прикладі дійсного винаходу 6 пар праймерних послідовностей сконструювали для гена міметиків антитіл. (SEQ ID NO. 11-22). Дійсний винахід також забезпечує спосіб отримання протипухлинного поліпептиду дійсного винаходу, який включає трансформування одержаного вище рекомбінантного вектора в бактерії BL21(DE3) E. coli, що модифікуються, відбір позитивного клону, виділення і очищення експресованого позитивним клоном білка, у такий спосіб одержуючи новий поліпептид дійсного винаходу проти пухлини, викликаної вірусом EB. Новий поліпептид проти пухлини, викликаної вірусом EB, забезпечений дійсним винаходом, може бути використаний для отримання ліків для лікування або профілактики пухлини, викликаної вірусом EB. Клінічно придатна фармацевтична композиція може бути створена шляхом додавання поліпептиду нових антибіотиків, одержаних згідно із дійсним винаходом, у фармацевтично прийнятний носій або середовище або інші додаткові компоненти. Дійсний винахід також забезпечує амінокислотну послідовність і нуклеотидну послідовність гена мутантного поліпептиду коліцину Ia. У дійсному винаході може бути використаний мутантний поліпептид, який також може бути використаний при конструюванні поліпептиду антитіла з іншими націлюючими поліпептидами. Експериментальні дані прикладу 3 дійсного винаходу підтверджують, що пептидні ліки, що містять мутантний поліпептид, мають низьку імуногенність, і, що поліпептид антитіла, утворений мутантним поліпептидом з іншим націлюючим поліпептидом, має бактерицидну здатність. Спосіб отримання є звичайним експериментальним процесом у даній області техніки. Новий протипухлинний поліпептид, забезпечений дійсним винаходом, має перевагу над протипухлинним поліпептидом, розкритим у патенті № ZL200410081446.8, тобто, високоспецифічне націлювання і безпечність для нормальних клітин, і відсутність схильності до розвитку стійкості до лікарських засобів. У той же час протипухлинний поліпептид дійсного винаходу мутований за тими амінокислотними залишками, які, як правило, викликають алергічну відповідь, при цьому імуногенність протипухлинного поліпептиду, що містить такий мутантний поліпептид, знижена, тобто, знижена ймовірність алергічної реакції. Поліпшені безпечність застосування і ефект кіллінгу пухлини ліками з таких поліпептидів. Це також може бути хорошим прикладом для поліпшення інших ліків, що містять поліпептид коліцину. Короткий опис графічних матеріалів Фігура 1. Схематична ілюстрація структури рекомбінантної плазміди pCHCEB11, яка містить ген поліпептиду міметиків антитіл VHCDR1-VHFR2-VLCDR3 і ген мутантного поліпептиду коліцину Ia. 3 UA 104933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 2. Схематична ілюстрація структури рекомбінантної плазміди pCHCEB22, яка містить ген поліпептиду міметиків антитіл VHCDR1-VHFR2-(Rev)VLCDR3 і ген мутантного поліпептиду коліцину Ia. Фігура 3. Експеримент 1 по вивченню сенсибілізуючого ефекту мутантного поліпептиду коліцину Ia. (A) Мишей Kunming, яким внутрішньочеревинно ін'єктують летальну дозу MRSA (ATCC BAA42), групують випадковим чином в (1) контрольну групу, (2) групу ампіциліну, (3) групу поліпептиду проти S. aurous (ZL 01128836.1), (4) групу поліпептиду 1 проти S. aurous. (B) Через 14 днів нову партію мишей Kunming групують у контрольну групу і групу ампіциліну. Мишей, що вижили, із групи поліпептиду проти S. aurous і групи поліпептиду 1 проти S. aurous групують у групу поліпептиду проти S. aurous і групу поліпептиду 1 проти S. aurous, і експеримент повторюють. (C) Через 41 день нову партію мишей Kunming групують в (1) контрольну групу, (2) групу левофлоксацину, (3) групу цефтриаксону натрію, (4) групу поліпептиду проти S. aurous, і (5) мишей, що вижили, із групи поліпептиду 1 проти S. aurous групують у групу поліпептиду 2 проти Pseudomonas aeruginosa і групу поліпептиду 1 проти Pseudomonas aeruginosa. Фігура 4. Експеримент 2 по вивченню низького сенсибілізуючого ефекту мутантного поліпептиду коліцину Ia. (A) сироватка крові групи поліпептиду проти S. aurous/поліпептиду 2 проти Pseudomonas aeruginosa, титр 1:50000; (B) сироватка крові групи поліпептиду 1 проти S. aurous/поліпептиду 1 проти Pseudomonas aeruginosa, титр 1:50000. (1) 1 тиждень, (2) 2 тиждень, (3) сироватка крові 7 тижня, (4) негативний контроль. Фігура 5. Порівняння ефекту кіллінгу нового протипухлинного поліпептиду in vitro щодо лімфоми Беркітта, викликаної вірусом EB. (A) контрольна група, (B) група, піддана впливу нового протипухлинного поліпептиду 1, (C) група, піддана впливу нового протипухлинного поліпептиду 2. Фігура 6. Ефект кіллінгу нового протипухлинного поліпептиду in vitro щодо клітин лімфоми Беркітта, викликаної вірусом EB, і інших пухлинних клітин. (A) EBV-позитивні клітини лімфоми Беркітта, (B) EBV-негативні клітини лімфоми Беркітта, (C) EBV-позитивні клітини злоякісної лімфосаркоми від хворого на СНІД пацієнта. (1) контрольна група, (2) група, піддана впливу нового протипухлинного поліпептиду 1. Фігура 7. Ефект кіллінгу нового протипухлинного поліпептиду щодо солідної пухлини, вирощеної в голих мишей з підсадженими клітинами лімфоми Беркітта, викликаної вірусом EB. (A) контрольна група. (B) SCID імунодефіцитні миші із групи, підданої впливу нового протипухлинного поліпептиду 1, усі інокульовані клітинами лімфоми Беркітта в обидві пахвові бічні поверхні. Стрілка ліворуч указує EBV-негативну лімфосаркому, стрілка праворуч указує EBV-позитивну лімфосаркому. Фігура 8. Ефект кіллінгу нового протипухлинного поліпептиду щодо солідної пухлини, вирощеної в голих мишей з підсадженими клітинами лімфоми Беркітта, викликаної вірусом EB. (A) зріз EBV-негативної лімфосаркоми контрольних мишей, (B) зріз EBV-позитивної лімфосаркоми контрольних мишей, (C) зріз EBV-негативної лімфосаркоми мишей, підданих впливу нового протипухлинного поліпептиду 1, (D) зріз EBV-позитивної лімфосаркоми мишей, підданих впливу нового протипухлинного поліпептиду 1. Варіанти здійснення Дійсний винахід тепер буде описано за допомогою опису переважних варіантів здійснення дійсного винаходу з посиланням на супровідні графічні матеріали. TM Вихідний вектор pSELECT -1, використаний у дійсному винаході, придбаний в Promega Corp. Бактерії BL21(DE3) E. coli, що модифікуються, придбані в Novagen Corp. Приклад 1. Конструювання рекомбінантної плазміди, що містить ген, що кодує мутантний коліцин Ia. TM Вихідний вектор являє собою плазміду pSELECT -1 (8,3 т.п.о) (придбана в Promega Corp.), яка несе гени коліцину Ia і білка імунітету. Послідовності олігонуклеотидних праймерів, показані в SEQ ID NO. 1-10, які кодують мутантні амінокислоти, функціонально зв'язують із геном коліцину Ia дикого типу, відповідно, шляхом техніки сайт-спрямованого мутагенезу подвійного олігонуклеотидного ланцюга (Quickchangetm Kit, Strategene Corp.), одержуючи ген, показаний в SEQ ID NO. 23, який кодує мутантний поліпептид коліцину Ia, і мутантну плазміду. Після цього ген з SEQ ID NO. 26 або SEQ ID NO. 28 вставляють у мутантну плазміду після кодону з гена 4 UA 104933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 I626 мутантного поліпептиду коліцину Ia, одержуючи дві рекомбінантні плазміди pCHCEB11 (показана на Фігурі 1) і pCHCEB22 (показана на Фігурі 2) для нового поліпептиду проти пухлини, викликаної вірусом EB. Послідовності 6 пар олігонуклеотидних праймерів, які сконструйовані для отримання в рекомбінантній плазміді гена, що кодує антитіло проти вірусу EB, показані в SEQ ID NO. 11-22. Рекомбінаційну плазміду трансфікували в бактерію BL21(DE3) E. coli, що модифікується (придбана в Novagen Corp.), для отримання поліпептиду. У переліку послідовностей одержані поліпептиди показані в SEQ ID NO. 29 (що надалі іменується "новий протипухлинний поліпептид 1") і SEQ ID NO. 31 (що надалі іменується "новий протипухлинний поліпептид 2") в переліку послідовностей. Процес сайт-спрямованого мутагенезу подвійного олігонуклеотидного ланцюга виконують згідно Strategene Quickchang Site-Directed Mutagenesis Kit (кат. № 200518). 1. Приготування реактивів для сайт-спрямованого мутагенезу: 5 мкл 10X буфера TM 2 мкл (10 нг) вихідної плазміди pSELECT -1, яка несе гени поліпептиду коліцину Ia дикого типу і білка імунітету. 1,25 мкл (125 нг) сконструйованого 5'-3' олігонуклеотидного праймера 1,25 мкл (125 нг) сконструйованого 3'-5' олігонуклеотидного праймера 1 мкл дНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфатів) двічі дистильована вода 50 мкл 1 мкл pfu (забезпечено набором, крім плазміди, праймерів і двічі дистильованої води) 2. ПЛР ампліфікація, умови ампліфікації: 25 циклів денатурації при 95 °C протягом 35 секунд, відпал при 53 °C протягом 70 секунд і подовження при 68 °C протягом 17 хвилин; 3. 1 мкл ендонуклеази Dpn 1 додають для розщеплення батьківського ланцюга ДНК (37 °C, 1 година), 1 мкл реагента і 50 мкл компетентних клітин XL1-blue спільно інкубують на льоду протягом 30 хвилин, потім, після теплового шоку при 42 °C протягом 45 секунд, інкубують на льоду протягом 2 хвилин; 4. 0,5 мл культурального середовища NZY додають, перемішуючи протягом 1 години при 37 °C і 220 об./хв.. 50-100 мкл реагента висівають на чашку Петрі (середовище LB плюс 1 % агар і 50 мкг/мл ампіциліну, протягом ночі при 37 °C); 5. Колонію відбирають через 18 годин. Плазміду екстрагують, секвенують, підтверджуючи успішність мутування; 6. 50 нг рекомбінаційної плазміди, зрештою одержаної шляхом мутування по декількох сайтах, інкубують з 40 мкл компетентних клітин BL-21(DE3) E. coli на льоду протягом 5 хвилин, піддають тепловому шоку при 42 °C протягом 30 секунд і інкубують у льоду протягом 2 хвилин. Додають 160 мкл культурального середовища SOC від Novagen crop. і після перемішування протягом 1 години при 37 °C і 220 об./хв. висівають на чашку Петрі (LB середовище плюс 1 % агар і 50 мкг/мл ампіциліну, протягом ночі при 37 °C). 7. Одиночну колонію відбирають для ампліфікації, додають 8-16 літрів середовища FB, перемішують при 250 об./хв. і 30 °C протягом 4-5 годин, піддають тепловому шоку при 42 °C і 250 об./хв. протягом 30 хвилин і при 37 °C протягом 2 годин. Бактерії осаджують центрифугуванням при 6000 g і 4 °C протягом 20 хвилин. До 50 ммоль/л боратного буфера (2 ммоль/л EDTA +2 ммоль/л DTT) і 50-80 мл бактеріальної суспензії при 4 °C додають 250 мл 0,2 моль/л PMSF і піддають впливу ультразвуку (4 °C, 400 Вт, 2 хвилини). Бактеріальний детрит центрифугують при високій швидкості (4 °C, 75000 g, 90 хвилин). До надосадової рідини додають 5 млн. умовних одиниць стрептоміцин сульфату для осадження ДНК. Після осадження центрифугуванням при 15000 g і 4 °C протягом 10 хвилин надосадову рідину діалізують протягом ночі в діалізному мішку для молекулярної ваги 15000 в 50 ммоль/л боратного буфера при 4 °C. Після повторного осадження центрифугуванням при 15000 g і 4 °C протягом 10 хвилин, надосадову рідину завантажують в іонообмінну колонку CM. Колонку елююють з використанням градієнта 0,1-0,3 моль/л NaCl + 50 ммоль/л боратного буфера, одержуючи рекомбінантний протипухлинний поліпептид. Послідовності праймерів, сконструйованих для сайт-спрямованого мутагенезу, є наступними: SEQ ID NO.1, 5'-3' олігонуклеотидний праймер, сконструйований для мутації G11A у гені коліцину: cgt att aca aat ccc GCA gca gaa tcg ctg ggg SEQ ID NO.2, 3'-5' олігонуклеотидний праймер, сконструйований для мутації G11A у гені коліцину: ccc cag cga ttc tgc TGC ggg att tgt aat acg 5 UA 104933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO.3, 5'-3' олігонуклеотидний праймер, сконструйований для мутації H22G у гені коліцину: gat tca gat ggc GGT aaa tta tgg gtg SEQ ID NO.4, 3'-5' олігонуклеотидний праймер, сконструйований для мутації H22G у гені коліцину: cac cca taa ttt ACC gcc atc tga atc SEQ ID NO.5, 5'-3' олігонуклеотидний праймер, сконструйований для мутації A26G у гені коліцину: gaaa ttatgggtgt tgatatttat SEQ ID NO.6, 3'-5' олігонуклеотидний праймер, сконструйований для мутації A26G у гені коліцину: ataaatatacaacacccataatttc SEQ ID NO.7, 5'-3' олігонуклеотидний праймер, сконструйований для мутації V31L у гені коліцину: gt tgatatttat CTC aaccctc cacgtgtc SEQ ID NO.8, 3'-5' олігонуклеотидний праймер, сконструйований для мутації V31L у гені коліцину: gacacgtggagggttgagataaatatcaac SEQ ID NO.9, 5'-3' олігонуклеотидний праймер, сконструйований для мутації H40D у гені коліцину: cgtgtcga tgtctttgatggtaccccgc ctgcat SEQ ID NO.10, 3'-5' олігонуклеотидний праймер, сконструйований для мутації H40D у гені коліцину: atgcaggcggggtaccatcaaagacatcgacacg SEQ ID NO.11, 5'-3' праймер для гена VHCDR1 у рекомбінаційній плазміді pCHCEB11: gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG Cgtcagtaa ata aaa tat aag aca ggc SEQ ID NO.12, 3'-5' праймер для гена VHCDR1 у рекомбінаційній плазміді pCHCEB11: gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt att cgc SEQ ID NO.13, 5'-3' праймер для гена VHFR2 у рекомбінаційній плазміді pCHCEB11: ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ata aaa tat aag aca ggc SEQ ID NO.14, 3'-5' праймер для гена VHFR2 у рекомбінаційній плазміді pCHCEB11: gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg acg cac cca atg cat acc SEQ ID NO.15, 5'-3' праймер для гена (Rev)VLCDR3 у рекомбінаційній плазміді pCHCEB11: aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc ACC TAC CCC TAC TCC TAC GGT CAG GGT taa ata aaa tat aag aca ggc SEQ ID NO.16, 3'-5' праймер для гена (Rev)VLCDR3 у рекомбінаційній плазміді pCHCEB11: gcc tgt ctt ata ttt tat tta ACC CTG ACC GTA GGA GTA GGG GGT ggc cac cca ctc cag acc ttt SEQ ID NO.17, 5'-3' праймер для гена VHCDR1 у рекомбінаційній плазміді pCHCEB22: gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG CGT CAG taa ata aaa tat aag aca ggc SEQ ID NO.18, 3'-5' праймер для гена VHCDR1 у рекомбінаційній плазміді pCHCEB22: gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt att cgc SEQ ID NO.19, 5'-3' праймер для гена VHFR2 у рекомбінаційній плазміді pCHCEB22: ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ataaaa tat aag aca ggc SEQ ID NO.20, 3'-5' праймер для гена VHFR2 у рекомбінаційній плазміді pCHCEB22: gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg acg cac cca atg cat acc SEQ ID NO.21, 5'-3' праймер для гена VLCDR3 у рекомбінаційній плазміді pCHCEB22: aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc GGT CAG GGT TAC TCC TAC CCC TAC ACC taa ata aaa tat aag aca ggc SEQ ID NO.22, 3'-5' праймер для гена VLCDR3 у рекомбінаційній плазміді pCHCEB22: gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGT GTA GGG GTA GGA GTA ACC CTG ACC ggc cac cca ctc cag acc ttt Приклад 2. Спостереження імунного ефекту нових протипухлинних поліпептидів, отриманих із застосуванням рекомбінаційних плазмід pCHCEB11 і pCHCEB22. Мишей імунізують новим протипухлинним поліпептидом 1 і новим протипухлинним поліпептидом 2, отриманим із застосуванням рекомбінаційних плазмід pCHCEB11 і pCHCEB22, одержаних у Прикладі 1, і протипухлинним поліпептидом 1 і протипухлинним поліпептидом 2 з 6 UA 104933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 попереднього винаходу, що належить винахіднику (ZL200410081446.8). Кожний білок, описаний вище, змішують з допоміжною речовиною. Посилена початкова доза і стимулююча доза являють собою одну внутрішньочеревинну ін'єкцію кожній миші 50 мкг (0,5 мл), всього п'ять ін'єкцій з 2-тижневим інтервалом. Сироватковий титр визначають непрямим способом ELISA. Титр у мишей, імунізованих новими протипухлинними поліпептидами 1 і 2, отриманими згідно із -3 -4 дійсним винаходом, знаходиться в діапазоні від 10 до 10 , у той час як титр у мишей, імунізованих протипухлинним поліпептидом 1 і протипухлинним поліпептидом 2, знаходиться в -4 -5 діапазоні від 10 до 10 . Очевидно, що ймовірність реакції гіперчутливості, індукованої новим протипухлинним поліпептидом дійсного винаходу, є на 1-2 порядки величини нижчою, ніж імовірність реакції гіперчутливості, індукованої протипухлинним поліпептидом, що містить коліцин Ia дикого типу. Приклад 3. Експеримент по вивченню низького сенсибілізуючого ефекту мутантного поліпептиду коліцину Ia, який утворює новий протипухлинний поліпептид. Мутантну плазміду для мутантного поліпептиду коліцину Ia (який мутований за амінокислотними залишками G11A, H22G, A26G, V31L і H40D у пептидному ланцюгу домену водного каналу) із Прикладу 1 функціонально зв'язують із феромоном AgrD1(YSTCDFIM) S. aurous N-кінцем або C-кінцем мутантного поліпептиду, одержуючи два антибактеріальних поліпептида. Поліпептид, одержаний шляхом зв'язування AgrD1 з карбоксильним кінцем мутантного коліцину Ia, називають як поліпептид 1 проти S. aurous, і поліпептид, одержаний шляхом зв'язування Agrd1 з амінокінцем мутантного коліцину Ia, називають як поліпептид 1 проти Pseudomonas aeruginosa. Плазміду для коліцину Ia дикого типу зв'язують на амінокінці з феромоном AgrD1(YSTCDFIM) S. aurous, одержуючи поліпептид 2 проти Pseudomonas aeruginosa. Експеримент 1: Партію мишей Kunming внутрішньочеревинно ін'єктують летальною дозою MRSA (ATCC BAA42) і групують випадковим чином в (1) контрольну групу, (2) групу ампіциліну, (3) групу поліпептиду проти S. aurous, (4) групу поліпептиду 1 проти S. aurous. Кожна група складається з 10 мишей. Спосіб обробки: Через одну годину після внутрішньоочеревинної ін'єкції летальної дози MRSA (ATCC BAA42): контрольна група: однократно ін'єктують 0,5 мл 0,3 моль/л NaСl + 50 ммоль/л боратного буфера у хвостову вену; група ампіциліну: однократно ін'єктують 2,5 мг/кг ампіциліну у хвостову вену; група поліпептиду проти S. aurous: однократно ін'єктують 6 мг/кг поліпептиду проти S. aurous, що належить винахіднику (ZL 01128836.1), у хвостову вену; група поліпептиду 1 проти S. aurous: однократно ін'єктують 6 мг/кг поліпептиду 1 проти S. aurous у хвостову вену; Результат: Усі миші в контрольній групі і групі ампіциліну гинуть протягом двох днів. Виживають 85 % мишей у групі поліпептиду проти S. aurous і групі поліпептиду 1 проти S. aurous. Експеримент 2: Через 14 днів після експерименту 1 нову партію мишей Kunming групують у контрольну групу й групу ампіциліну. Мишей, що вижили, із групи поліпептиду проти S. aurous і групи поліпептиду 1 проти S. aurous групують у групу поліпептиду проти S. aurous і групу поліпептиду 1 проти S. aurous для повторення описаного вище експерименту. Усі миші в контрольній групі і групі ампіциліну гинуть протягом двох днів. Виживають 75 % мишей у групі поліпептиду проти S. aurous і виживають 90 % мишей у групі поліпептиду 1 проти S. aurous. Експеримент 3: Через 41 день після експерименту 1 нову партію мишей Kunming групують у контрольну групу, групу левофлоксацину і групу цефтриаксону натрію. Мишей, що вижили, із групи поліпептиду проти S. aurous і групи поліпептиду 1 проти S. aurous групують у групу поліпептиду 2 проти Pseudomonas aeruginosa і групу поліпептиду 1 проти Pseudomonas aeruginosa. Мишам внутрішньочеревинно ін'єктують летальну дозу мультирезистентного Pseudomonas aeruginosa (клінічні ізоляти 13578, з кафедри експериментальної медицини Західнокитайського госпіталю Сичуаньського університету). Через одну годину, контрольній групі однократно ін'єктують 0,5 мл 0,3 моль/л WO 2011/072501 + 50 ммоль/л боратного буфера у хвостову вену; групі левофлоксацину однократно ін'єктують 5 мг/кг левофлоксацину у хвостову вену; групі цефтриаксону натрію однократно ін'єктують 30 мг/кг цефтриаксону натрію у хвостову вену; 7 UA 104933 C2 5 10 15 20 групі поліпептиду 2 проти Pseudomonas aeruginosa однократно ін'єктують 8 мг/кг поліпептиду 2 проти Pseudomonas aeruginosa у хвостову вену; групі поліпептиду 1 проти Pseudomonas aeruginosa однократно ін'єктують 8 мг/кг поліпептиду 2 проти Pseudomonas aeruginosa у хвостову вену. Усі миші в контрольній групі і групі левофлоксацину гинуть протягом дня. Виживають 25 % мишей у групі цефтриаксону натрію. Виживають 60 % мишей у групі поліпептиду 2 проти Pseudomonas aeruginosa. Виживають усі миші в групі поліпептиду 1 проти Pseudomonas aeruginosa. Показано, що антитіло організму-хазяїна меншою мірою заважає ефекту кіллінгу мутантного поліпептиду, ніж такому ефекту поліпептиду дикого типу. Див. Фігуру 3. На 1 тижні, 2 тижні і 7 тижні експерименту, сироватку крові мишей із групи поліпептиду проти S. aurous/групи поліпептиду 2 проти Pseudomonas aeruginosa і групи поліпептиду 1 проти S. aurous/групи поліпептиду 1 проти Pseudomonas aeruginosa кількісно аналізують за допомогою непрямого способу ELISA для виявлення антитіл у крові. У лунки мікропланшета з ферментною міткою вносять коліцин Ia дикого типу і мутантний поліпептид коліцину Ia, 100 нг/лунка. Перші антитіла являють собою сироваткові антитіла від мишей, що вижили, із групи поліпептиду проти S. aurous/групи поліпептиду 2 проти Pseudomonas aeruginosa і групи поліпептиду 1 проти S. aurous/групи поліпептиду 1 проти Pseudomonas aeruginosa. Друге антитіло являє собою антимишаче мічене антитіло кози. Перше антитіло негативного контролю являє собою 5 % розчин молока в PBS. Результати титрування 1:50000 є наступними (див. Фігуру 4): 1(1 тиждень) 2(2 тиждень) 3(7 тиждень) 4(контроль) 25 30 35 40 45 50 A(група поліпептиду проти S. aurous/група поліпептиду 2 проти Pseudomonas aeruginosa) 0,914 1,623 2,911 0,065 (група поліпептиду 1 проти S. aurous/група поліпептиду 1 проти Pseudomonas aeruginosa 0,254 0,598 1,41 0,069 Показано, що ймовірність реакції гіперчутливості організму-хазяїна, індукованої мутантним поліпептидом коліцину Ia, одержаним згідно із дійсним винаходом, нижче ніж ймовірність реакції гіперчутливості організму-хазяїна, індукованої коліцином Ia дикого типу. Приклад 4. Ефект кіллінгу нового протипухлинного поліпептиду in vitro щодо лімфоми Беркітта, викликаної вірусом EB. EBV-позитивна лінія клітин і EBV-негативна лінія клітин являють собою стандартні лінії клітин з ATCC (Американської колекції типових культур), США. Культивування клітин: 0,1 мл суспензії відновлених клітин Raji повільно додають в 3 мл рідкого середовища 1640 (плюс 10 % сироватки) у чашці для культивування (розведення 1:30), перемішують і культивують в інкубаторі при 37 °C з CO2. EBV-позитивна лінія клітин являє собою ATCC CCL-86 (стандартні клітини лімфоми Беркітта, які використовують у лабораторіях усього світу, клітини Raji, виділені у 12-річного африканського хлопчика в 1963 році). Клітини для тестування групують в 3 групи. Група 1 є контрольною групою, якій додають розчин консерванту (10 ммоль/л PB+0,2 моль/л NaCl фосфатного буфера (pH 7,4)) без протипухлинного поліпептиду. Групі 2 додають 200 мкг/мл нового протипухлинного поліпептиду 1 (плазміда pCHCEB11, розчин консерванту 10 ммоль/л PB + 0,2 моль/л NaCl фосфатного буфера, pH 7,4). Групі 3 додають 200 мкг/мл нового протипухлинного поліпептиду 2 (плазміда pCHCEB22, розчин консерванту 10 ммоль/л PB + 0,2 моль/л NaCl фосфатного буфера, pH 7,4). Після культивування протягом 24 годин у чашку для культивування додають описані вище обробляючі засоби. Через 72 години після додавання обробляючих засобів, у чашку для культивування додають 20 мкл 100 мкмоль/л пропідію йодиду (PI) і через 10 хвилин спостерігають за допомогою мікроскопа. Результати показують, що клітини контрольної групи добре ростуть, а більшість клітин у групі нового протипухлинного поліпептиду 1 забарвлені червоним за допомогою PI, показуючи, що протипухлинний поліпептид руйнує клітинну мембрану, що веде до загибелі пухлинних клітин. При порівнянні кількості загиблих клітин ефект нового протипухлинного поліпептиду 2 серед двох нових протипухлинних пептидів виявляється не настільки хорошим, див. Фігуру 5. Приклад 5. Спостереження мультифлуоресцентного забарвлення ефекту кіллінгу нового протипухлинного поліпептиду in vitro щодо клітин лімфоми Беркітта, викликаної вірусом EB, і інших пухлинних клітин. 8 UA 104933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Умови культивування клітин такі ж, як у Прикладі 2. Три лінії клітин використані в експерименті: лінія EB-вірус позитивних клітин: ATCC CCL-86 (клітини Raji, клітини лімфоми Беркітта); ATCC CRL-2230, лінія клітин злоякісної лімфосаркоми від 46-річного хворого на СНІД чоловіка, які є позитивними до вірусу EB і вірусу саркоми Капоші; лінія EB-вірус позитивних клітин: ATCC CRL-1648(CA-46, клітини, виділені з асцитичної рідини пацієнта, хворого на американську лімфому Беркітта). Кожну лінію групують в 2 групи для тестування. Групі 1 додають розчин консерванту (10 ммоль/л PB + 0,2 моль/л NaCl фосфатного буфера, (pH 7,4)) без нового протипухлинного поліпептиду. Групі 2 додають 200 мкг/мл нового протипухлинного поліпептиду 1 (плазміда pCHCEB11), розчин консерванту являє собою 10 ммоль/л PB + 0,2 моль/л NaCl фосфатного буфера, pH 7,4. Після культивування протягом 24 годин у чашку для культивування додають обробляючі засоби для описаних вище груп. Через 72 години після додавання обробляючих засобів у чашку для культивування додають два типи флуоресцентних барвників, тобто 20 мкл 50 мкмоль/л FITC і 20 мкл 50 мкмоль/л Rodamin-123 і через 10 хвилин спостерігають за допомогою мікроскопа Olympus IX-71. Результати показують, що лінія EBV-негативних пухлинних клітин добре росте після обробки новим протипухлинним поліпептидом 1, а більшість клітин кожної лінії EBV-позитивних пухлинних клітин проявляють зникнення мітохондрій і ядра, набухають і некротизуються, більшість із них гинуть. Очевидно, у порівнянні із забарвленням PI в експерименті Прикладу 4, результат експерименту із мультифлуоресцентним забарвленням більш явно показує потужний ефект кіллінгу нового протипухлинного поліпептиду 1 проти EB-вірус позитивних пухлинних клітин, див. Фігуру 6. EBV-негативні пухлинні клітини добре ростуть, що означає, що новий протипухлинний поліпептид не атакує клітини без поверхневого антигену вірусу EB на мембрані клітини. Це означає, що новий протипухлинний поліпептид дійсного винаходу має ідеальну націлюючу специфічність і безпечність. Приклад 6. Ефект кіллінгу нового протипухлинного поліпептиду щодо солідної пухлини, вирощеної в голих мишей з підсадженими клітинами лімфоми Беркітта, викликаної вірусом EB. SCID імунодефіцитні миші придбані в Шанхайському центрі лабораторних тварин Китайської академії наук. Мишей годують у відповідності зі стандартними вимогами до харчування. Усю воду, солому для підстилки і корм стерилізують високою температурою або УФвипромінюванням. Мишей годують протягом одного тижня у відносно асептичних умовах і використовують в інокуляційному експерименті, якщо немає аномалій. Клітинні суспензії Raji (ATCC CCL-86) і 1648 (ATCC CRL-1648) в експоненціальній фазі o відбирають у 50 мл центрифужні пробірки, центрифугують при 4 C. Надосадову рідину потім зливають. Клітини ресуспендують у рідкому культуральному середовищі 1640 (плюс теляча 7 сироватка) до 1,0 × 10 клітин/мл. Мишам підшкірно ін'єктують 0,1 мл клітинної суспензії Raji у ліву пахвову ямку та 0,1 мл клітинної суспензії 1648 (ATCC CRL-1648) у праву пахвову ямку. Через 3-4 дня після ін'єкції пухлина росте до близько 2 x 2 мм. Мишей з пухлиною групують в: (групу A) розчину консерванту (10 ммоль/л PB+0,2 моль/л NaCl фосфатного буфера (pH 7,4)) без протипухлинного поліпептиду в якості контрольної групи; (групу B) нового протипухлинного поліпептиду 1 (плазміда pCHCEB11) 300 мкг/миша/день (розраховане як 25 г) безперервно протягом 20 днів. Десяти мишам кожної групи двічі в день підшкірно ін'єктують 0,5 мл безперервно протягом 20 днів. За поведінкою мишей спостерігають і документують кожен день. Розмір пухлини визначають і фотографують кожні два дні. Результат (див. Фігуру 7) показує, що ріст пухлини в групі В нового протипухлинного поліпептиду значно пригнічується, причому пухлини у 7 мишей зникають, а пухлини в інших 3 мишей явно менше, ніж у контрольній групі. Новий протипухлинний поліпептид ефективний для пригнічення у мишей росту солідної пухлини, викликаної EBV-позитивними клітинами лімфосаркоми. Але новий протипухлинний поліпептид неефективний для пригнічення у мишей росту солідної пухлини, викликаної EBV-негативними клітинами лімфосаркоми. Приклад 7. Спостереження за патологією в in vivo експерименті по елімінації пухлини. Спостереження за гістопатологією пухлин: мишей умертвляють наприкінці експерименту із Прикладу 6. Пухлини видаляють, фіксують в 10 % формаліні. Парафінові зрізи забарвлюють HE (гематоксиліном і еозином) і спостерігають за допомогою звичайної оптичної мікроскопії. Солідні пухлини мишей контрольної групи, які спостерігають за допомогою мікроскопії, активно проліферують; клітини EBV-позитивних солідних пухлин, одержані від мишей групи 9 UA 104933 C2 5 нового протипухлинного поліпептиду, значно зморщуються. Більша частина клітинної маси в зрізі являє собою некротичні пухлинні клітини, і спостерігають більшу ступінь перитуморальної лімфоцитарної інфільтрації. Результат гістопатології показує, що в період 20-денної обробки новий протипухлинний поліпептид знищив практично всі пухлинні клітини в солідній пухлині (див. Фігуру 8, D). 10 UA 104933 C2 11 UA 104933 C2 12 UA 104933 C2 13 UA 104933 C2 14 UA 104933 C2 15 UA 104933 C2 16 UA 104933 C2 17 UA 104933 C2 18 UA 104933 C2 19 UA 104933 C2 20 UA 104933 C2 21 UA 104933 C2 22 UA 104933 C2 23 UA 104933 C2 24 UA 104933 C2 25 UA 104933 C2 26 UA 104933 C2 27 UA 104933 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 1. Поліпептид проти пухлини, викликаної вірусом ЕВ, який утворюють шляхом функціонального зв'язування мутантного поліпептиду коліцину, здатного утворювати іонні канали, з поліпептидом антитіла до вірусу ЕВ або поліпептидом міметиків антитіл до вірусу ЕВ, мутантний поліпептид коліцину, здатний утворювати іонні канали, одержують шляхом мутації амінокислотних залишків G11A, H22G, A26G, V31L і H40D у пептидному ланцюзі коліцину дикого типу Іа, амінокислотна послідовність поліпептиду антитіла до вірусу ЕВ є тією ж, що у поліпептиді моноклонального антитіла, секретованого гібридомою АТСС HВ-168, де поліпептид проти пухлини, викликаної вірусом ЕВ, має амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO: 29. 2. Поліпептид проти пухлини, викликаної вірусом ЕВ, за п. 1, де поліпептид міметиків антитіл являє собою з'єднаний пептид регіону CDR1 важкого ланцюга, зв'язувальний пептидний сегмент CDR1-CDR2 важкого ланцюга і CDR3 легкого ланцюга антитіла до вірусу ЕВ. 3. Поліпептид проти пухлини, викликаної вірусом ЕВ, за п. 2, де мутантний поліпептид коліцину, здатний утворювати іонні канали, одержують шляхом мутації коліцину Іа дикого типу. 4. Ген, що кодує поліпептид проти пухлини, викликаної вірусом ЕВ, за кожним з пп. 1-3. 5. Ген за п. 4, який має нуклеотидну послідовність, показану в SEQ ID NO: 30. 6. Рекомбінаційна плазміда, що містить ген за п. 4. 7. Спосіб отримання поліпептиду проти пухлини, викликаної вірусом ЕВ, за кожним з пп. 1-3, що включає етапи, на яких трансформують рекомбінаційну плазміду за п. 6 в експресійну систему для експресії і виділяють експресований поліпептид. 8. Застосування поліпептиду проти пухлини, викликаної вірусом ЕВ, за кожним з пп. 1-3 для отримання ліків для лікування і профілактики пухлини, викликаної вірусом ЕВ. 9. Мутантний поліпептид коліцину Іа, в якому його амінокислотна послідовність показана в SEQ ID NO: 24, при цьому мутантний поліпептид коліцину, здатний утворювати іонні канали, одержаний шляхом мутації амінокислотних залишків G11A, H22G, V31L i H40D у пептидному ланцюзі коліцину дикого типу Іа. 10. Ген, що кодує мутантний поліпептид коліцину Іа за п. 9. 28