Профілактичний або терапевтичний агент проти вірусного захворювання, викликаного вірусом гепатиту с

1. Профілактичний або терапевтичний агент проти вірусного захворювання, викликаного вірусом гепатиту С, який відрізняється тим, що як діючі інгредієнти в ньому об'єднані 22βметоксіолеан-12-ен-3β,24(4β)-діол і інтерферон. C2 2 (19) 1 3 95299 4 факторами, які впливають на терапевтичний ефект інтерферону, а в Японії такі пацієнти становлять 70 % або більше з пацієнтів з хронічним гепатитом С. В доповнення, часто спостерігаються побічні ефекти, такі як лихоманка, слабкість і психічні розлади. Як стандартне лікування пацієнтів, які інфіковані вірусом гепатиту С з генотипом 1b і мають високе вірусне навантаження, відомі комбінована терапія рибавірином з інтерфероном, і комбінована терапія рибавірином з ПЕГ-інтерфероном -2а (PEG-IFN -2а) або ПЕГ-інтерфероном -2b (PEGIFN -2b). Терапевтична дія цих комбінацій (рівень повної відповіді) є недостатньою. Навіть найбільш ефективна комбінована терапія рибавірином з PEG-IFN в цей час дає рівень повної відповіді, найбільше, приблизно 50 %. Крім того, в порівнянні з лікуванням тільки одним інтерфероном, при лікуванні комбінацією рибавірину з інтерфероном часто спостерігаються побічні ефекти, такі як зниження рівня гемоглобіну, зниження кількості еритроцитів і лейкоцитів. При використанні PEG-IFN 2а грипозні симптоми виявляються слабше, ніж ті, які викликає інтерферон, але більш часто спостерігаються реакції шкіри і зниження кількості лімфоцитів, тромбоцитів і еритроцитів. При комбінованій терапії рибавірином і PEG-IFN -2b часто виникають ураження шкіри в місці ін'єкції, злегка сповільнюється відновлення порушених гематологічних показників; а у немолодих пацієнтів звичайно підвищується частота аномальних показників лабораторних тестів, і їм часто необхідне зниження дозування. У даних обставинах потрібна розробка методів лікування, які ефективні у випадку, якщо лікування інтерфероном не дає достатнього ефекту, у випадку, якщо не чекають, що введення інтерферону буде ефективним внаслідок інфекції вірусом з генотипом 1b і високого вірусного навантаження, у разі немолодих пацієнтів, у випадку, коли при інфекції розвивається цироз, і т.д. 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діол являє собою сполуку з наступною структурою, і відомо, що вона інгібує порушення роботи печінки (дивись патентні посилання 1 і 2). Крім того, було опубліковано, що 22метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діол має ефект проти HCV (дивись непатентне посилання 6), і очікують, що з цієї сполуки буде розроблений терапевтичний агент проти вірусних захворювань печінки. Однак, ефекти, отримані в результаті об'єднання цієї сполуки з іншими лікарськими сполуками вивчені не були. [Патентне посилання 1] International Publication WO97/03088 [Патентне посилання 2] Japanese Patent No.3279574 [Непатентне посилання 1] The Japan Society of Hepatology, ed., "Mansei kanen no chiryo gaido (Guidelines of treatment for chronic hepatitis)", BUNKODO Co., Ltd., 2006,p.21 [Непатентне посилання 2] Shiro IINO, "The guideline of treatment for hepatitis C", Nippon Rinsho, 2004,vol.62,suppl.7,p.342-346 [Непатентне посилання 3] Annual Review of Biochemistry, U.S.A., 1987,vol.56,p.727-777 [Непатентне посилання 4] Shiro IINO, "Akiraka ni natta interferon no kouka to genkai (Revealed effects and limit of interferon)", Naika, 1999,vol.84,no.2,p.285-291 [Непатентне посилання 5] Lancet, United Kingdom, 1998,vol.352,no.9138,p.1426-1432 [Непатентне посилання 6] Hepatology, U.S.A., 2005,vol.42,P-248A Для розв'язання перерахованих вище проблем автори винаходу провели інтенсивні дослідження агентів, які мають профілактичний або лікувальний ефект відносно вірусних захворювань, зокрема, інфекційних захворювань, що викликаються вірусом з (+)РНК-геномом; в результаті досліджень автори виявили, що комбінація 22-метоксіолеан12-ен-3, 24 (4)-діолу з інтерфероном збільшує інгібування реплікації HCV, і може являти собою лікарську сполуку, придатну для профілактики або лікування вірусних захворювань; тим самим винахід був завершений. Даний винахід належить до: [1] профілактичного або терапевтичного агента проти вірусного захворювання, який відрізняється тим, що як діючі інгредієнти в ньому об'єднані 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діол і інтерферон; [2] профілактичного або терапевтичного агента за п. [1], в якому вірусне захворювання викликане РНК-вірусом; 5 [3] профілактичного або терапевтичного агента за п. [2], в якому РНК-вірус має (+)РНК-геном; [4] профілактичного або терапевтичного агента за п. [3], в якому РНК-вірусом є вірус гепатиту С; [5] профілактичного або терапевтичного агента за п. [1], в якому вірусним захворюванням є гепатит С, або цироз або гепатоцелюлярна карцинома, викликані гепатитом С; [6] способу профілактики або лікування вірусного захворювання, який включає в себе введення суб'єкту, який потребує цього, ефективної кількості 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу і інтерферону; [7] способу за п. [6], в якому вірусне захворювання викликане РНК-вірусом; [8] способу за п. [7], в якому РНК-вірус має (+)РНК-геном; [9] способу за п. [8], в якому РНК-вірусом є вірус гепатиту С; [10] способу за п. [6], в якому вірусним захворюванням є гепатит С, або цироз або гепатоцелюлярна карцинома, викликані гепатитом С; [11] застосування 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу і інтерферону у виготовленні профілактичного або терапевтичного агента проти вірусного захворювання; [12] застосування за п. [11], в якому вірусне захворювання викликане РНК-вірусом; [13] застосування за п. [12], в якому РНК-вірус має (+)РНК-геном; [14] застосування за п. [13], в якому РНКвірусом є вірус гепатиту С; і [15] застосування за п. [11], в якому вірусним захворюванням є гепатит С, або цироз або гепатоцелюлярна карцинома, викликані гепатитом С Профілактичний або терапевтичний агент за даним винаходом виявляє сильні профілактичний або терапевтичний ефекти відносно вірусних захворювань, переважно, вірусних захворювань, викликаних РНК-вірусами, більш переважно, вірусних захворювань, викликаних вірусами, які мають (+)РНК-геном, найбільш переважно, гепатиту С, викликаного вірусом гепатиту С, або цирозу або гепатоцелюлярної карциноми, викликаних гепатитом С, шляхом введення комбінації 22метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу і інтерферону. На фігурі 1 представлений графік, який відображає інгібіторний ефект тільки 22метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу, тільки інтерферону і комбінації 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу і інтерферону на реплікацію HCV в день 1 після інфекції Ad-T7pol. На фігурі 2 представлений графік, який відображає інгібіторний ефект тільки 22метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу, тільки інтерферону і комбінації 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу і інтерферону на реплікацію HCV в день 2 після інфекції Ad-T7pol. На фігурі 3 представлений графік, який відображає інгібіторний ефект тільки 22метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу, тільки інтерферону і комбінації 22-метоксіолеан-12-ен-3р, 24 95299 6 (4)-діолу і інтерферону на реплікацію HCV в день 3 після інфекції Ad-T7pol. Термін "вірусні захворювання" означає хвороби, викликані вірусами. Віруси, що викликають захворювання, включають ДНК-віруси і РНКвіруси. Прикладами ДНК-вірусів можуть служити вірус гепатиту В, вірус віспи, вірус герпесу, аденовірус і парвовірус. Прикладами РНК-вірусів є реовірус, тогавірус, коронавірус, рабдовірус, параміксовірус, ортоміксовірус, буньявірус, аренавірус, ретровірус, пікорнавірус і каліцивірус. Як віруси, на які діє профілактичний або терапевтичний агент за даним винаходом, переважні РНК-віруси, більш переважні - РНК-віруси з (+)РНК-геномом, а найбільш переважний - вірус гепатиту С Прикладами РНК-вірусів, які мають (+)РНК-геном можуть служити поліовірус, коксаківірус, еховірус, ентеровірус, риновірус, вірус гепатиту А, вірус гепатиту Е, вірус краснухи, вірус східного енцефаліту коней, вірус західного енцефаліту коней, вірус жовтої лихоманки, вірус лихоманки денге, вірус енцефаліту Сент-Луїс, вірус гепатиту С, вірус гепатиту G, коронавірус, вірус Західного Ніла і вірус везикулярного стоматиту. Реплікація вірусів, що мають (+)РНК-геном відбувається звичайним чином. А саме: клітини інфікуються вірусом, і в клітину проникає вірусна РНК. З вірусною РНК, яка потрапила в клітину відбувається пряма трансляція вірусних білків, таких як РНК-залежна РНК-полімераза, яка необхідна для реплікації вірусної РНК. За допомогою цих трансльованих білків реплікується вірусна РНК на матриці вірусної РНК, що проникла в клітину. Реплікована вірусна РНК вбудовується в білки, що синтезуються з неї, і віруси, що утворилися вивільняються з клітини (дивись JP2005-35913А). Противірусний механізм дії інтерферону запропонований, наприклад, в JP2005-3591 3А: інтерферон зв'язується з рецептором на поверхні клітини, а потім в клітині індукується білок, що має противірусну дію. Наприклад оліго-2'-5'-аденілат утворюється в результаті дії 2'-5'-аденілатсинтетази, що індукується інтерфероном. Вважають, що оліго-2'-5'-аденілат активує РНК-залежну РНКазу, активована РНК-залежна РНКаза руйнує вірусну РНК, і в результаті, виявляється противірусний ефект інтерферону. Відповідно до приведеного вище механізму дії, вважають, що профілактичний або терапевтичний агент за даним винаходом ефективний проти РНК-вірусів, які мають (+)РНК-геном. Для вірусних захворювань приклади захворювань, викликаних вірусами гепатиту [такими як вірус гепатиту В (HBV) і вірус гепатиту С (HCV)], включають захворювання печінки і т.п. в результаті гострого або хронічного вірусного гепатиту (такого як гепатит В і гепатит С), переважно, гепатит С, або цироз або гепатоцелюлярна карцинома, викликані гепатитом С Гепатит В визначають як гепатит, який викликає інфекція HBV, а гепатит С визначають як гепатит, який викликає інфекція HCV. Хронічний гепатит визначають, як клінічний стан постійного запалення в печінці, який присутній або можливо присутній протягом 6 місяців або більше. Захворювання печінки визначають як за 7 пальні захворювання в печінці, і цей термін може застосовуватися як загальний, що включає ожиріння печінки, цироз і гепатоцелюлярну карциному відповідно до розвитку симптомів. 22-Метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діол, який може застосовуватися як один з діючих інгредієнтів для профілактичного або терапевтичного агента за даним винаходом, є відомою сполукою, і її можна отримати, наприклад, способом, описаним в прикладі 22 (сполука 27) з WO97/03088. Загалом, 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)діол можна приймати перорально як стандартний фармацевтичний склад, такий як капсули, мікрокапсули, таблетки, гранули, тонкодисперсні гранули, порошки і т.п. Крім того, його можна вводити парентерально (наприклад, внутрішньовенною ін'єкцією, внутрішньом'язовою ін'єкцією, введенням підшкірно, введенням інтраперитонеально, ректальним введенням, введенням через шкіру) як стандартний фармацевтичний склад, такий як склад для ін'єкцій (внутрішньовенних, внутрішньом'язових і т.п.) і т.п. Ці склади можна отримати стандартним способом з використанням інертного наповнювача, заповнювача, зв'язувальної речовини, зволожувача, розпушувача, поверхневоактивної речовини, змащувального агента, диспергуючого агента, буферної сполуки, консерванту, солюбілізатора, антисептичнтого засобу, ароматизатора, заспокійливого засобу, стабілізатора і т.п. Приклади перерахованих вище добавок, які нетоксичні і підходять для фармацевтичних препаратів, включають лактозу, фруктозу, глюкозу, крохмаль, желатин, карбонат магнію, синтетичний силікат магнію, тальк, стеарат магнію, метилцелюлозу, карбоксиметилцелюлозу або її сіль, гуміарабік, поліетиленгліколь, сироп, вазелін, гліцерин, етанол, пропіленгліколь, лимонну кислоту, хлориди натрію, сульфіт натрію, фосфат натрію і т.п. У профілактичному або терапевтичному агенті за даним винаходом форму, шлях введення, дозу, період введення і т.п. 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу можна відповідно вибрати в залежності від, наприклад, ваги, віку, симптомів і т.п. пацієнта. Крім того, ці величини конкретно не обмежені, поки противірусний ефект 22метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу посилюється при поєднанні його з інтерфероном. Наприклад, денну дозу в 1-1000 мг вводять перорально або парентерально як разову дозу або як декілька дробних доз. Переважно розділяти денну дозу 25800 мг на дві дози, які вводять перорально або парентерально. Вибір інтерферону, який можна використовувати як інший діючий інгредієнт профілактичного або терапевтичного агента за даним винаходом, не обмежений. Доступні в продажу інтерферони або інтерферони на стадії клінічних випробувань включають, наприклад, природний IFN (Sumiferon, виробництва Dainippon Suraimoto Pharma Co., Ltd.), IFN-2a, IFN-2b (Intron А, виробництва Schering-Plough), поліетиленгліколь(РЕО)природний IFN, PEG-IFN-2a (Pegasys, виробництва Chungai Pharmaceutical Co., Ltd.), PEG-IFN2b (PEG-Intron A), природний IFNp (IFNp Mochida, 95299 8 виробництва Mochida Pharmaceutical Co., Ltd., і Feron, виробництва Toray Industries, Inc.), PEGприродний IFNp, природний IFN, консенсусний IFN (Advaferon, виробництва Astellas Pharma Inc.), PEG-консенсусний IFN, їх комбінації і т.п. У разі профілактичного або терапевтичного агента за даним винаходом доза, тривалість, схема, шлях і т.п. при введенні інтерферону конкретно не обмежені, поки він діє як профілактичний або терапевтичний засіб проти вірусних захворювань. Наприклад, у разі гепатиту С, звичайно, денну дозу від 100000 МО до 10000000 МО вводять підшкірно, внутрішньом'язово або внутрішньовенно, як разову дозу або декілька дробних доз, постійно або періодично (наприклад, три рази на тиждень) протягом від 2 до 48 тижнів; але цю схему введення можна змінити в залежності від типу або кількості вірусу, ваги або віку пацієнта і т.п. Переважною схемою є введення денної дози від 6000000 до 10000000 МО постійно протягом від 2 до 8 тижнів з подальшим періодичним введенням протягом від 22 до 46 тижнів; але цю схему можна модифікувати відповідно до типу і форми використовуваного інтерферону. Співвідношення в комбінації (співвідношення при використанні або співвідношення в композиції) сполук 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу і інтерферону конкретно не обмежено, поки це співвідношення ефективне для профілактики або лікування вірусних захворювань. Наприклад у разі гепатиту С, співвідношення в комбінації відповідно можна вибрати з діапазону від 1мг/100000 МО до 1000мг/10000000 МО, переважно, від 25мг/1000000 МО до 800мг/10000000 МО, як денна доза. У профілактичному або терапевтичному агенті за даним винаходом 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діол і інтерферон вводяться в комбінації. Термін "введення в комбінації" включає варіант здійснення, в якому монопрепарат 22метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу і інший монопрепарат інтерферону вводяться одночасно або через проміжок часу. У цьому варіанті здійснення винаходу кількість введень одного препарату може співпадати або відрізнятися від кількості введень іншого препарату. Відповідні дозування і проміжки часу між введеннями 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу і інтерферону можна вибрати відповідно до контрольованого клінічного випробування. Профілактичний або терапевтичний агент за даним винаходом може являти собою одну лікарську форму, яка містить два діючих інгредієнти в композиції, або дві лікарські форми, які окремо містять два діючих інгредієнти в різних композиціях. Приклади Далі даний винахід проілюстрований на прикладах, які ні в якій мірі його не обмежують. Приклад 1: Підтвердження інгібіторного ефекту комбінації 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24(4)діолу і інтерферону на реплікацію HCV У цьому прикладі для оцінки профілактичного або терапевтичного агента за даним винаходом використовується описана в непатентному поси 9 ланні 6 модель реплікації HCV з повнорозмірним геномом. Була отримана кДНК з повнорозмірного клону вірусу інфекційного гепатиту С (HCV) H77 [GenBank AF011751;Yanagi, M., Purcell, R.H, Emerson, S.U., Bukh, J. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(16), 8738-8743 (1997)] з генотипом la, який є несприйнятливим до лікування інтерфероном, і вбудований в плазміду (рТ7flHCV-Rz), в якій кДНК знаходилася під контролем промотору Т7, а на її 5’ і 3'-кінцях знаходився ген рибозиму вірусу гепатиту дельта. Трансфекцію клітин HepG2 (номер джерела: JCRB1054) плазмідою pT7-flHCV-Rz (3 мкг/ямка) проводили в 6ямкових культуральних планшетах. Через 24 години після трансфекції клітини HepG2 заражали рекомбінантним аденовірусом, який експресує Т7полімеразу (Ad-T7pol) (10 БУО/ямка) для експресії гена HCV в клітинах-хазяях. У цій моделі реплікації в клітинах транскрибується РНК, повністю гомологічна гену HCV (позитивний (+) ланцюг). Цей позитивний ланцюг транслюється в білок NS5B, який має РНК-залежну РНК-полімеразну активність. У результаті транскрибується негативний (-) ланцюг HCV, і в клітині спостерігається реплікація HCV. Через 3 години після зараження Ad-T7pol до клітин додавали 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діол і/або IFN- 2b (Intron A, Schering-Plough), окремо або в комбінації, для дослідження їх здатності інгібувати реплікацію HCV. До кожного культурального середовища (2 мл) додавали 22метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діол і IFN-2b в кінцевій концентрації 0,1 мкмоль/л і 100 МО/мл, відповідно. Через один день після зараження AdT7pol культуральне середовище замінювали на середовище, що містить вищезазначені сполуки, що тестуються в таких же концентраціях. Як контроль в середовище додавали ДМСО, що використовується як розчинник для 22-метоксіолеан-12ен-3, 24 (4)-діолу, до кінцевої концентрації 0,1 %. Цей експеримент проводили при умовах, коли цитотоксичність кожної із тестованих сполук не спостерігалася. Клітини збирали в перший, другий і третій день після зараження Ad-T7pol і виділяли з них РНК. Проводили кількісний аналіз експресії РНК HCV з допомогою ПЛР в режимі реального часу (термоциклер серії Light Cycler від компанії Roche Diagnostics) на матриці, отриманій в результаті зворотної транскрипції з використанням rTth ДНКполімерази. Експресію мРНК гліцеральдегід-3 95299 10 фосфат-дегідрогенази (GAPDH), гена домашнього господарства (який постійно експресується) клітинхазяїв, оцінювали кількісно з допомогою ПЛР в режимі реального часу на матриці, отриманій в результаті реакції зворотної транскрипції з MuLVзворотною транскриптазою. У ПЛР в режимі реального часу використовували наступні праймери: для РНК HCV: Смисловий прайм ер: 5'-GCA GAA AGC GTC TAG CCA TGG CGT-3’ (SEQ ID NO.: 1, нуклеотиди 68-91 з 5'-UTR (нетрансльованої області)), і Антисмисловий праймер: 5'-СТС GCA AGC АСС СТА ТСА GGC AGT-3’ (SEQ ID NO.: 2, нуклеотиди 311-28835-UTR); а для HCV РНК використовували набір праймерів, доступний в продажу (Human GAPDH primer set, від компанії Search LC). Результати показані на фігурах 1-3. На фігурах 1-3 доріжка 1 являє собою контроль, доріжка 2 результат впливу одного 22-метоксіолеан-12-ен3, 24 (4)-діолу (0,1 мкмоль/л), доріжка 3 - результат впливу одного інтерферону (100 МО/мл), а доріжка 4 результат впливу комбінації 22метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діолу і інтерферону. У результаті було отримане підтвердження, що інгібіторний ефект на реплікацію HCV синергічно збільшується при об'єднанні 22-метоксіолеан12-ен-3, 24 (4)-діолу з інтерфероном значною мірою в порівнянні із застосуванням кожної сполуки окремо. За даним винаходом можна отримати профілактичний або терапевтичний агент, ефективний проти вірусних захворювань (переважно, агент проти інфекції, викликаної вірусом з (+)РНКгеномом, більш переважно, агент, ефективний проти гепатиту С, викликаного вірусом гепатиту С, або цирозу або гепатоцелюлярної карциноми, викликаних гепатитом С), який відрізняється тим, що в ньому об'єднані 22-метоксіолеан-12-ен-3, 24 (4)-діол з інтерфероном. Хоч опис даного винаходу даний з посиланням на конкретні варіанти здійснення винаходу, різні зміни і модифікації, очевидні для фахівців в даній галузі, є можливими, і при цьому вони не виходять з об'єму прикладеної формули. 11 95299 12 13 Комп’ютерна верстка І. Скворцова 95299 Підписне 14 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601