Біологічно чиста культура bradyrhizobium japonicum для підсилення росту рослин

Реферат: Винахід належить до бактеріальних штамів Bradyrhizobium japonicum та композицій на їх основі, які підсилюють ріст рослин (PGPR), мають підвищену конкурентну перевагу при колонізації UA 110375 C2 (12) UA 110375 C2 бобових рослин та підвищують загальну продуктивність росту бобових рослин. Також винахід розкриває спосіб скринінгу та добору бактеріальних штамів, що мають вищезгадані вигідні характеристики. UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Посилання на перелік послідовностей Дана заявка містить перелік послідовностей у формі, що читається комп’ютером. Форма, що читається комп’ютером, включена в даний документ посиланням. Посилання на депозит біологічного матеріалу Дана заявка містить посилання на депозит біологічного матеріалу, цей депозит включений в даний документ посиланням. Для повної інформації дивись таблицю 1. Галузь винаходу Даний винахід відноситься до виділених бактеріальних штамів та способу добору бактеріальних штамів із підвищеними конкурентоспроможністю та характеристиками продуктивності. Передумови винаходу Для того, щоб підтримувати нормальний ріст, рослини повинні добувати ряд елементів з ґрунту, в якому вони зростають. Ці елементи включають азот та так називані мікронутрієнти (наприклад, мідь, залізо та цинк), але багато ґрунтів мають недостатньо таких елементів або вони містять їх тільки у формах, які не можуть легко поглинатися рослинами (як правило вважають, що важливі елементи не можуть легко поглинатися рослинами, крім випадків, коли вони присутні у розчиненій формі у ґрунті). Азот є важливим елементом для більшості рослин, оскільки він грає певну роль в синтезі амінокислот, білків, нуклеотидів, нуклеїнових кислот, хлорофілу, коферментів та у загальному рості та здоров’ї рослини. Для перешкоджання таким нестачам зазвичай до ґрунту вносять джерела елементів, котрих не вистачає, для того, щоб підвищити темпи росту та врожаї, що отримують від сільськогосподарських культур. Наприклад, нітрат та/або амоній часто додають в ґрунт для перешкоджання браку доступного азоту. В галузі рослинництва добре відомо, що багато оброблюваних культур потребують, щоб ґрунт надавав рослині відносно великі кількості азоту. Примітні виключення з тих рослин, що потребують азот через ґрунт, являють собою рослини з родини бобових. А саме, бобові рослини відмінні від не бобових рослин своєю здатністю зв’язувати атмосферний азот в аміак. Здатність зв’язувати атмосферний азот в придатне джерело азоту для рослини усуває для рослини необхідність отримувати азот з ґрунту. Зв’язування азоту, однак, потребує симбіотичних відносин між бобовою рослиною та природними бактеріями в ґрунті. Одні з найбільш ретельно вивчених партнерів в симбіотичних відносинах є бактерії, що належить до роду Bradyrhizobium або Rhizobium (Gresshoff, P. (1999). Identification of Plant Genes Involved in Plant-Microbe Interactions; Stacey, G. & Keen, T. (Ed.), Plant-Microbe Interactions (4th ed.) (Ch. 6). St. Paul: APS Press). Симбіоз зазвичай досягається за допомогою обміну складними двосторонніми сигналами між рослиною та мікробом і мікробом та рослиною. Типово, рослинні фактори, такі як флавоноїди та подібні до флавоноїдів речовини, стимулюють колонізацію бактерій в кореневій бульбочці бобової рослини (Gresshoff, 1999). Після того, як бактерії колонізували кореневу бульбочку, бактерії здійснюють морфологічні зміни в рослини, а саме завивання кореневого волоска та розвиток нового органа кореня – бульбочки (Gresshoff, 1999). Бульбочка дає можливість формування нового фізіологічного оточуючого середовища для бульбочки, стимулюючи диференціювання бактерій в азотфіксуючий ендосимбіонт, або бактероїд, для колонізованої рослини (Gresshoff, 1999). Добре відомо, що рухливість та хемотаксис Rhizobial є важливими властивостями для конкурентоспроможності штаму. Наприклад, Althabegoiti, et al., 2008, FEMS Microbiol. Lett. 282: 115-123 обмірковує отримання спонтанного мутантного штаму від USDA 110 з підвищеною рухливістю, яка посилює утворення бульбочок у порівнянні з його штамом дикого типу. Крім того, Maier, et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56 (8): 2341-2346 обмірковує роль молібдену під час біологічного процесу зв’язування азоту. Більш того, Alves, et al., 2003, Plant and Soil 252: 1-9 обмірковує інокулянти, отримані з сої, застосовувані в Бразилії, та важливість конкурентоспроможності для ефективного зв’язування азоту. Зрештою, Bloem, J.F., et al., 2001, Bio Fertil. Soils 33: 181-189 повідомляє про важливість конкурентоспроможності при доборі штаму. При дослідженні дослідники застосовують способи генної інженерії, щоб ввести репортерний ген (GUS) в їх індексний штам у якості способу визначення конкурентоспроможності штамів(Bloem, et al. 2001). Оскільки здійснюване дослідження (Bloem, et al. 2001) потребувало широкого застосування хімічного забарвлювання та технології мікроскопічного дослідження, повідомлений спосіб залишається непрактичним підходом для скринінгу великих зразків мікробів. Метою даного винаходу є забезпечення суперконкурентної(их) культури (культур) бактерій з роду Bradyrhizobia для колонізування бобових рослин, що перевершує комерційно доступні штами, наприклад, промисловий штам USDA 532C, у здатності до колонізування. Ще одною 1 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 метою даного винаходу є забезпечення суперконкурентної(их) культури (культур) бактерій з роду Bradyrhizobia щодо колонізування бобових рослин, здатної(их) підвищити ефективність при стимуляції росту бобових рослин у порівнянні з комерційно доступними штамами, наприклад, промисловим штамом USDA 532C. Короткий опис винаходу Для поліпшення загального стану здоров’я рослини та доступності придатного до використання джерела азоту для рослин існує потреба у бактеріальних штамах, які є ліпшими у колонізуванні рослини та підсиленні загального росту рослини. Виділені штами даного винаходу реалізує ці переваги. Даний винахід відноситься до виділених штамів бактерій, які мають щонайменше наступні поліпшені особливості у порівнянні з комерційно доступними штамами, наприклад, промисловим штамом USDA 532C, де поліпшені властивості включають, без обмеження: a. підвищену конкурентоспроможність щодо колонізування рослини та b. підвищену ефективність при стимуляції росту рослини. Даний винахід спрямований на біологічно чисту(ті) культуру(и) штаму(ів) Bradyrhizobia japonicum: штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50592 (депонований також під номером NRRL B-59571); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50593 (депонований також під номером NRRL B-59572); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50586 (депонований також під номером NRRL B-59565); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50588 (депонований також під номером NRRL B-59567); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50587 (депонований також під номером NRRL B-59566); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50589 (депонований також під номером NRRL B-59568); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50591 (депонований також під номером NRRL B-59570); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50590 (депонований також під номером NRRL B-59569); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50594 (депонований також під номером NRRL B-50493); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50726; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50727; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50728; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50729 та штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50730 або комбінацію щонайменше двох або більше вищевказаних депонованих штамів. Даний винахід також відноситься до виділеного(их) бактеріального(их) штаму(ів) даного винаходу, включаючи штам(и), який(які) є близькоспорідненим(ми) до будь-якого з вищевказаних штамів, виходячи з ідентичності послідовності 16S рДНК, та який характеризується щонайменше 95% ідентичності з будь-яким з вищевказаних штамів, виходячи з ідентичності послідовності 16S рДНК. Даний винахід, крім того, включає спосіб підсилення росту рослини, що включає застосування щодо рослин, насіння рослин або ґрунту, що оточує рослини або насіння рослин, композиції, що містить щонайменше один зі штамів даного винаходу або комбінацію щонайменше двох або більше із вищевказаних депонованих штамів. Даний винахід, крім того, включає композиції, що містять один або декілька штамів даного винаходу, включаючи з агрономічно прийнятним носієм. Короткий опис графічних матеріалів На фіг. 1A представлено зображення ПЛР-гелю, на якому видно унікальний праймер 209, специфічний до USDA 532C. На фіг. 1B представлено зображення ПЛР-гелю, на якому видно праймер 209, специфічний до USDA 532C, та природні штами. На фіг. 2A представлено зображення ПЛР-гелю, на якому видно штам USDA 532C Bradyrhizobia japonicum у якості конкурентно домінантного штаму для утворення бульбочок сої. На фіг. 2B представлено зображення ПЛР-гелю, на якому видно штами, відмінні від штаму USDA 532C Bradyrhizobia japonicum, у якості конкурентно домінантного штаму для утворення 2 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бульбочок сої. На фіг. 3A представлена дендограма, отримана в результаті ДНК-фінгерпринтування виділених штамів та USDA 532C: 138 – NRRL B-50589 (депонований також під номером NRRL B-59568); 13 – NRRL B-50586 (депонований також під номером NRRL B-59565); p140 – USDA 532C; 184 – NRRL B-50594 (депонований також під номером NRRL B-50493); 142 – NRRL B-50590 (депонований також під номером NRRL B-59569); 130 – NRRL B-50587 (депонований також під номером NRRL B-59566); 65 – NRRL B-50588 (депонований також під номером NRRL B-59567); 198 – NRRL B-50592 (депонований також під номером NRRL B-59571); 135 – NRRL B-50591 (депонований також під номером NRRL B-59570) та 48 – NRRL B-50593 (депонований також під номером NRRL B-59572). На фіг. 3B представлена дендограма, отримана в результаті ДНК-фінгерпринтування виділених штамів та USDA 532C: 138 – NRRL B-50589 (депонований також під номером NRRL B-59568); 13 – NRRL B-50586 (депонований також під номером NRRL B-59565); 140 – USDA 532C; 184 – NRRL B-50594 (депонований також під номером NRRL B-50493); 142 – NRRL B-50590 (депонований також під номером NRRL B-59569); 130 – NRRL B-50587 (депонований також під номером NRRL B-59566); 65 – NRRL B-50588 (депонований також під номером NRRL B-59567); 198 – NRRL B-50592 (депонований також під номером NRRL B-59571); 135 – NRRL B-50591 (депонований також під номером NRRL B-59570); 48 – NRRL B-50593 (депонований також під номером NRRL B-59572) 318 – NRRL B-50727, 278 – NRRL B-50726, 727 – NRRL B-50730, 370 – NRRL B-50728 та 518 – NRRL B-50729. Детальний опис винаходу Даний винахід забезпечує виділені штами бактерій, що мають щонайменше наступні поліпшені властивості у порівнянні з комерційно доступними штамами, наприклад, промисловим штамом USDA 532C, де поліпшені властивості включають, без обмеження: a. підвищену конкурентоспроможність щодо колонізування рослини та b. підвищену ефективність при стимуляції росту рослини. «Бактеріальний(ні) штам(и)», як використовується в даному документі, означає бактеріальні штами, що є діазотрофами. Іншими словами, це бактерії, які є симбіотичними азотфіксуючими бактеріями. Необмежуючі приклади бактеріальних штамів, які використовуються в даному документі, включають, без обмеження, бактерії з родів Rhizobium spp. (наприклад, R. cellulosilyticum, R. daejeonense, R. etli, R. galegae, R. gallicum, R. giardinii, R. hainanense, R. huautlense, R. indigoferae, R. leguminosarum, R. loessense, R. lupini, R. lusitanum, R. mongolense, R. miluonense, R. sullae, R. tropici, R. undicola та/або R. yanglingense), Bradyrhizobium spp. (наприклад, B. bete, B. canariense, B. elkanii, B. iriomotense, B. japonicum, B. jicamae, B. liaoningense, B. pachyrhizi та/або B. yuanmingense), Azorhizobium spp. (наприклад, A. caulinodans та/або A. doebereinerae), Sinorhizobium spp. (наприклад, S. abri, S. adhaerens, S. americanum, S. aboris, S. fredii, S. indiaense, S. kostiense, S. kummerowiae, S. medicae, S. meliloti, S. mexicanus, S. morelense, S. saheli, S. terangae та/або S. xinjiangense), Mesorhizobium spp (M. albiziae, M. amorphae, M. chacoense, M. ciceri, M. huakuii, M. loti, M. mediterraneum, M. pluifarium, M. septentrionale, M. temperatum, M. tianshanense). В одному конкретному варіанті здійснення бактеріальний(ні) штам(и) даного винаходу додатково включає(ють) штами Bradyrhizobium japonicum з реєстраційними номерами, наданим при депонуванні, NRRL B-50592 (депонований також під номером NRRL B-59571), NRRL B-50593 (депонований також під номером NRRL B59572), NRRL B-50586 (депонований також під номером NRRL B-59565), NRRL B-50588 (депонований також під номером NRRL B-59567), NRRL B-50587 (депонований також під номером NRRL B-59566), NRRL B-50589 (депонований також під номером NRRL B-59568), NRRL B-50591 (депонований також під номером NRRL B-59570); NRRL B-50590 (депонований також під номером NRRL B-59569); NRRL B-50594 (депонований також під номером NRRL B50493); NRRL B-50726; NRRL B-50727; NRRL B-50728; NRRL B-50729; NRRL B-50730 або комбінацію щонайменше двох або більше вищевказаних депонованих штамів, включаючи два з 3 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вищевказаних штамів, щонайменше три з вищевказаних штамів, щонайменше чотири з вищевказаних штамів, щонайменше п’ять з вищевказаних штамів, щонайменше шість з вищевказаних штамів, щонайменше сім з вищевказаних штамів, щонайменше вісім з вищевказаних штамів, щонайменше дев’ять з вищевказаних штамів, щонайменше десять з вищевказаних штамів, щонайменше одинадцять з вищевказаних штамів, щонайменше дванадцять з вищевказаних штамів, щонайменше тринадцять з вищевказаних штамів, аж до всіх та включаючи всі з вищевказаних штамів. Вираз «комерційно доступний(ні) штам(и)» означає комерційно доступні бактеріальні штами, наприклад, USDA 532C, USDA 110, USDA 123, USDA 127, USDA 129 і т. д. (Cregan, P.B., et al., 1989, Appl. and Enviro. Microbiol. 55 (10): 2532-2536). Як використовується в даному документі, «підвищена конкурентоспроможність» та/або «підвищене утворення бульбочок» за визначенням позначає бактеріальний(ні) штам(и), які мають переважний процент заселеності бульбочок, наприклад, щонайменше 50%, щонайменше 55%, щонайменше 60%, щонайменше 65%, щонайменше 70%, щонайменше 75%, щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 91%, щонайменше 92%, щонайменше 93%, щонайменше 94%, щонайменше 95%, щонайменше 96%, щонайменше 97%, щонайменше 98%, щонайменше 99% до 100% заселеності бульбочок. «Підвищену конкурентоспроможність» визначали згідно з докладним(и) методом(ами), описаним(и) нижче (дивись Матеріали та способи: «Протокол первинного скринінгу» та «Протокол дослідження конкуренції»). Як використовується в даному документі, вираз «бульбочка» за визначенням включає, але не повинен обмежуватися, детермініновані бульбочки, недетерміновані бульбочки або їх комбінацію. Приклади детермінованих бульбочок та недетермінованих бульбочок добре відомі в галузі техніки та описані в Denison, R. F., 2000, The Amer. Naturalist. 156 (6): 567-576. Детерміновані бульбочки знаходять на видах Glycine, Lotus або Phaseolus, вони є круглими та сферичними за формою (Denison, 2000). Детерміновані бульбочки ростуть тільки впродовж обмеженого періоду часу – типово декілька тижнів (Denison, 2000). На відміну від детермінованих бульбочок, недетерміновані бульбочки знаходять на видах Medicago, Trifolium та Pisium, вони мають витягнуту форму та ростуть постійно (Denison, 2000). «Заселеність бульбочок» є виразом відомим в галузі техніки (McDermott T.R. & Graham, P.H., Appl. and Environ. Microbiol. 55(10): 2493-2498). Як використовується в даному документі, «заселеність бульбочок» означає відсоток бульбочок, заселених бактеріальним(ними) штамом(ами), відмінним(ними) від комерційно доступного штаму Bradyrhizobium, наприклад USDA 532C, та/або число бульбочок, що містять конкретний(ні) бактеріальний(ні) штам(и), відмінний(ні) від комерційно доступного штаму Bradyrhizobium, наприклад USDA 532C, поділене на загальне число бульбочок, що містять всі бактеріальні штами. «Заселеність бульбочок» визначали згідно з докладним(и) способом(ами), описаним(и) нижче (дивись Матеріали та способи: «Протокол первинного скринінгу» та «Протокол дослідження конкуренції»), та може бути визначена в результаті аналізу бульбочок з рослин, отриманих або зі зразків з теплиці, або зі зразків з поля. Як приклад, відсоток заселеності бульбочок = A/(A+B), де A являє собою число бульбочок, що містять конкретний(ні) бактеріальний(ні) штам(и), відмінний(ні) від комерційно доступного штаму Bradyrhizobium, наприклад, USDA 532C, та B являє собою число бульбочок, які містять комерційно доступний штам Bradyrhizobium, наприклад, USDA 532C. В галузі техніки добре відомо, що, незважаючи на рідкі виключення, одна бульбочка буде містити тільки один бактеріальний штам (Johnston, A.W.B., et al., 1974, J. Gen. Microbiol 87: 343-350; Dunham, D. H. & Baldwin, I.L., 1931, Soil Science 32: 235-249; Johnson, H.W., et al., 1963, Agrono. J. 55: 269-271; Dudman, W.F. & Brockwell, J., 1968, J. Agricul. Res. 19: 739-747; Nicol, H. & Thorton, H.G., 1941, Proc. Roy. Soc. B 130, 32-59; Hughes, D.Q., & Vincent, J.M., 1942, Proc. of the Linnenan Soc. of New South Wales 67: 142-152; та Vincent, J.M. & Waters, L.M., 1953, J. Gen. Microbiol. 9: 357-370). Як використовується в даному документі, «підвищена ефективність при стимуляції росту» включає щонайменше одне зі збільшеного врожаю рослини, вимірюваного у перерахунку на бушель/акр, збільшеної кількості плодів, збільшеної кількості коренів, збільшеної довжини коренів, збільшеної маси коренів, збільшеного об’єму коренів, збільшеної площі листя, збільшеної густоти стояння рослин, збільшеної сили рослини та/або підвищеної здатності зв’язувати азот (N2). «Підвищену ефективність при стимуляції росту» визначали згідно з докладним(ми) способом(ами), описаним(и) нижче (дивись Матеріали та способи: «Протокол первинного скринінгу» та «Протокол дослідження продуктивності»), та вона може бути визначена в результаті аналізу рослин, отриманих або зі зразків з теплиці, або зі зразків з поля. Як використовується в даному документі, «збільшена кількість плодів» означає збільшене загальне число бобів сої на рослині сої та/або збільшену загальну суху вагу бобів сої на рослині сої. 4 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як використовується в даному документі, «загальна суха вага» означає вагу рослинної речовини (наприклад, плід рослини, боби рослини, корені рослини, бульбочки рослини, цілі рослини, неповні рослини і т. д.) після інкубації при 80°C впродовж визначеного періоду часу, наприклад, щонайменше 4 годин, щонайменше 8 годин, щонайменше 12 годин, щонайменше 24 годин, щонайменше 48 годин і т. д., або будь-якого періоду часу, необхідного для висушування рослинної речовини. Необхідно розуміти, що час сушіння для цілей визначення «загальної сухої ваги» залежить від багатьох факторів. Необмежуючі фактори, які можуть впливати на час сушіння, включають матеріал, що треба висушити, масу матеріалу, що треба висушити, кількість матеріалу, що треба висушити та/або їх комбінації. Інкубацію можна виконувати у будьякому обладнанні з контрольованою температурою, застосовуваному у галузі техніки. Для цілей ® даного винаходу «загальну суху вагу» визначали за допомогою термостата Eppendorf Innova 42R. Вираз «підвищена здатність зв’язувати азот (N2)», як використовується в даному документі, означає, що виділені бактерії можуть збільшувати зв’язування азоту (N 2). Згідно з «Протоколом дослідження продуктивності», представленим нижче (Матеріали та способи), відносна здатність бактерій зв’язувати азот (N2) може бути кількісно визначена за допомогою вимірювання загального вмісту азоту рослини, використовуючи стандартні способи визначення кількості азоту, відомі фахівцеві в даній галузі техніки (наприклад, спосіб К’єльдаля і т. д.). Дивись Takahashi, M., et al., 2007. Uptake, Assimilation, and Novel Metabolism of Nitrogen Dioxide in Plants, p. 109-118. In N. Willey (ed.), Phytoremediation: Methods and Reviews, vol. 23. Humana Press, New York; Bremner, J. M. 1965. Total nitrogen, p. 1149-1178. In C.A. Black (ed.), Methods of soil analysis, vol. 2. American Society for Agronomy, Madison; Schank, S.C., et al., 1981, App. and Enviro. Microbiol., 41 (2): 342-345. У ще іншому аспекті даного винаходу виділений(ні) бактеріальний(ні) штам(и) мають підвищену витривалість до температур. «Підвищена витривалість до температур» означає діапазон температур, при яких виділений(ні) бактеріальний(ні) штам(и) здатні рости, наприклад, максимальні та мінімальні температури, при яких виділений(ні) штам(и) Bradyrhizobium може(уть) рости. В одному аспекті «підвищену витривалість до температур» визначали відповідно до «Протоколу температурного режиму», описаного нижче (Матеріали та способи). У ще іншому аспекті даного винаходу виділений(ні) бактеріальний(ні) штам(и) є природно стійким(ми) до гліфосату. В одному аспекті «підвищену витривалість до температур» визначали відповідно до «Протоколу профілю стійкості до гліфосату», описаного нижче (Матеріали та способи). В іншому аспекті виділений(ні) бактеріальний(ні) штам(и) даного винаходу включає(ють) штам(и), що є близькоспорідненим(ми) до будь-якого з вищевказаних штамів, виходячи з ідентичності послідовності 16S рДНК. Дивись Stackebrandt E, et al., «Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology,» Int J Syst Evol Microbiol. 52(3):1043-7 (2002) щодо застосування ідентичності послідовності 16S рДНК для визначення спорідненості у бактерій. У варіанті здійснення щонайменше один штам є щонайменше на 95% ідентичним до будь-якого з вищевказаних штамів, виходячи з ідентичності послідовності 16S рДНК, щонайменше на 96% ідентичним до будь-якого з вищевказаних штамів, виходячи з ідентичності послідовності 16S рДНК, щонайменше на 97% ідентичним до будь-якого з вищевказаних штамів, виходячи з ідентичності послідовності 16S рДНК, щонайменше на 98% до будь-якого з вищевказаних штамів, виходячи з ідентичності послідовності 16S рДНК, щонайменше на 98,5% ідентичним до будь-якого з вищевказаних штамів виходячи з ідентичності послідовності 16S рДНК, щонайменше на 99% ідентичним до будь-якого з вищевказаних штамів, виходячи з ідентичності послідовності 16S рДНК, або щонайменше на 99,5% до будь-якого з вищевказаних штамів, виходячи з ідентичності послідовності 16S рДНК. В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб виділення бактеріального(них) штаму(мів), що має(ють) підвищену конкурентоспроможність для заселення бульбочок бобової рослини та підвищену ефективність стимуляції росту бобової рослини. Як використовується в даному документі, вираз «виділяють, виділяє, виділення та/або виділений і т. д.» означає, що згадуваний матеріал видаляють з оточуючого середовища, в якому його зазвичай знаходять. Спосіб включає, між іншим, етапи, на яких: a. одержують бактеріальний(ні) штам(и) із зразка ґрунту; b. бобову рослину піддають впливу бактеріального(них) штаму(ів) та комерційно доступного штаму; c. відбирають бактеріальний(ні) штам(и), який (які) є більш конкурентним(и), ніж комерційно доступний штам щодо заселення бульбочок бобової рослини; d. аналізують вибраний(ні) бактеріальний(ні) штам(и), який(які) є більш конкурентним(и), 5 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ніж комерційно доступний штам щодо заселення бульбочок бобової рослини відносно того(тих) бактеріального(них) штаму(мів), що мають підвищену ефективність при стимуляції росту бобової рослини та e. виділяють бактеріальний(ні) штам(и), що мають підвищену ефективність при стимуляції росту бобової рослини. В одному аспекті виділений(ні) бактеріальний(ні) штам(и) є штамом(ами) з роду Bradyrhizobium. У ще іншому аспекті спосіб додатково включає етап, на якому проводять скринінг штаму(мів) Bradyrhizobium за допомогою специфічного праймера, властивого тільки для комерційно доступного штаму Bradyrhizobia, наприклад, промислового штаму USDA 532C. У ще іншому аспекті спосіб включає виділення культури Bradyrhizobia japonicum, вибраної із групи, що включає: штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50592 (депонований також під номером NRRL B-59571); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50593 (депонований також під номером NRRL B-59572); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50586 (депонований також під номером NRRL B-59565); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50588 (депонований також під номером NRRL B-59567); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50587 (депонований також під номером NRRL B-59566); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50589 (депонований також під номером NRRL B-59568); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50591 (депонований також під номером NRRL B-59570); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50590 (депонований також під номером NRRL B-59569); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50594 (депонований також під номером NRRL B-50493); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50726; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50727; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50728; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50729 та штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50730 або комбінацію щонайменше двох або більше з вищевказаних депонованих штамів, включаючи більше двох, наприклад, щонайменше три з вищевказаних штамів, щонайменше чотири з вищевказаних штамів, щонайменше п’ять з вищевказаних штамів, щонайменше шість з вищевказаних штамів, щонайменше сім з вищевказаних штамів, щонайменше вісім з вищевказаних штамів, щонайменше дев’ять з вищевказаних штамів, щонайменше десять з вищевказаних штамів, щонайменше одинадцять з вищевказаних штамів, щонайменше дванадцять з вищевказаних штамів, щонайменше тринадцять з вищевказаних штамів, аж до включення всіх з вищевказаних штамів. У ще іншому аспекті спосіб включає виділення бактеріального(их) штаму(ів), що мають підвищену витривалість до температур. Дивись Матеріали та способи: «Протокол температурного режиму». Більш того, спосіб включає виділення бактеріального(их) штаму(ів), що мають природну стійкість до гліфосату. Дивись Матеріали та способи: «Протокол профілю стійкості до гліфосату». В іншому переважному аспекті спосіб включає виділення бактеріального(их) штаму(ів), вибраного(их) з родів, що включають Rhizobium та Bradyrhizobium, здатних підвищувати утворення бульбочок бобової рослини. Композиція Даний винахід включає композицію, що містить щонайменше один із виділених бактеріальних штамів даного винаходу або комбінацію щонайменше двох або більше із вищевказаних депонованих штамів, включаючи більше двох, наприклад, щонайменше три з вищевказаних штамів, щонайменше чотири з вищевказаних штамів, щонайменше п’ять з вищевказаних штамів, щонайменше шість з вищевказаних штамів, щонайменше сім з вищевказаних штамів, щонайменше вісім з вищевказаних штамів, щонайменше дев’ять з вищевказаних штамів, щонайменше десять з вищевказаних штамів, щонайменше одинадцять з вищевказаних штамів, щонайменше дванадцять з вищевказаних штамів, щонайменше 6 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 тринадцять з вищевказаних штамів, аж до включення всіх з вищевказаних штамів та агрономічно прийнятного носія. В деяких варіантах здійснення композиція може являти собою композицію інокулянту. Як використовується в даному документі та в галузі техніки, вираз «композиція інокулянту» зазвичай відноситься до композицій або матеріалів, що вводять сумісні бактеріальні штами або на зовнішню поверхню насіння, або у борозну для насіння. Композиція може містити один або декілька агрономічно прийнятних носіїв. У випадках коли використовують декілька агрономічно прийнятних носіїв, агрономічно прийнятні носії можуть бути однаковими або різними. Як використовується в даному документі по відношенню до «носію», вираз «агрономічно прийнятний» відноситься до будь-якого матеріалу, який можна використовувати для доставки активних речовин до насіння, ґрунту або рослини, та переважно носія, який можна додати (до насіння, ґрунту або рослини) без шкідливого впливу на ріст рослини, структуру ґрунту, осушення ґрунту або подібного. Прийнятні носії включають, без обмеження, луску пшениці, висівки, помелену солому пшениці, порошки або гранули з торфом, гранули з гіпсом та глини (наприклад, каолін, бентоніт, монтморилоніт). Для покриття насіння будуть придатними склади, такі як рідкий, торф’яний або змочуваний порошок. При застосуванні для покриття насіння матеріал можна змішувати з водою, наносити на насіння та можна давати йому можливість висохнути. Приклад ще інших носіїв включає зволожені висівки, висушені, просіяні та нанесені на насіння перед покриттям адгезивом, наприклад, гуміарабіком. У варіантах здійснення, що включають склад активних речовин, агрономічно прийнятний носій може бути водним. Якщо застосовують рідкий носій, рідкий (наприклад, водний) носій буде типово включати середовища для росту для культивування бактеріальних штамів. Необмежуючі приклади придатних середовищ для росту для бактеріальних штамів включають дріжджовий екстракт з манітом, дріжджовий екстракт з гліцерином або будь-які середовища, відомі фахівцеві в даній галузі техніки, що сумісні з бактеріальними штамами та/або надають нутрієнти для росту бактеріальним штамам. Також охопленими композиціями даного винаходу є композиції, що містять одну або декілька сигнальних молекул. Необмежуючі приклади сигнальних молекул рослин включають Nod-фактори (тобто ліпо-хітоолігосахариди), хітоолігосахариди, хітинові сполуки, флавоноїди, жасмонову кислоту або її похідні, лінолеву кислоту або її похідні, ліноленову кислоту або її похідні, карикіни або їх комбінації. Ліпо-хітоолігосахаридні сполуки (LCO), також відомі в даній галузі техніки як симбіотичні Nod-сигнали або Nod-фактори, містять олігосахаридний скелет із зв’язаних β-l,4-зв’язками залишків N-ацетил-D-глюкозаміну («GIcNAc»), що зв’язані за N-атомом з ацильним ланцюгом жирної кислоти, сконденсованих за кінцем, що не відновлює. LCO розрізняються в кількості залишків GIcNAc в скелеті, за довжиною та ступенем насиченості жирного ацильного ланцюга та в замінах залишків цукру, що відновлюють, та залишків цукру, що не відновлюють. Приклад LCO представлено нижче у вигляді формули I, , 40 45 в якій: G являє собою гексозамін, який може бути заміщений, наприклад, ацетильною групою за азотом, сульфатною групою, ацетильною групою та/або ефірною групою за киснем, R1, R2, R3, R5, R6 та R7, які можуть бути однаковими або різними, являють собою H, CH 3CO-, Cx Hy CO-, де x являє собою ціле число від 0 до 17, та y являє собою ціле число від 1 до 35, або будь-яку іншу ацильну групу, наприклад, карбаміл, R4 являє собою моно-, ди- або триненасичений аліфатичний ланцюг, що містить 7 UA 110375 C2 5 щонайменше 12 атомів вуглецю, та n являє собою ціле число від 1 до 4. LCO можна отримати (виділити та/або очистити) з бактерій, таких як Rhizobia, наприклад, Rhizobium spp., Bradyrhizobium spp., Sinorhizobium spp. та Azorhizobium spp. Структура LCO є характерною для кожних таких бактеріальних видів, та кожний штам може продукувати різні LCO з різними структурами. Наприклад, специфічні LCO з S. meliloti також були описані в патенті США № 5549718, як ті, що мають формулу II, , 10 15 20 25 30 в якій R являє собою H або CH3CO-, та n дорівнює 2 або 3. Ще більш специфічні LCO включають NodRM, NodRM-1, NodRM-3. При ацетилюванні (R=CH3CO-), вони стають AcNodRM-1 та AcNodRM-3, відповідно (патент США № 5545718). LCO з Bradyrhizobium japonicum описані в патентах США № 5175149 та № 5321011. Загалом, вони є пентасахаридними фітогормонами, що містять метилфукозу. Описано ряд цих LCO, отриманих з B. japonicum, а саме: BjNod-V (C18:1); BjNod-V (AC, C18:1), BjNod-V (C16:1) та BjNod-V (AC, C16:0), де «V» вказує на наявність п’яти N-ацетилглюкозамінів; «Ac»- ацетилювання; число після «C» вказує кількість атомів вуглецю у боковому ланцюзі жирної кислоти та число після «:» – кількість подвійних зв’язків. LCO, застосовувані в композиціях даного винаходу, можна одержати (тобто виділити та/або очистити) з бактеріальних штамів, що продукують LCO, таких як штами Azorhizobium, Bradyrhizobium (включаючи B. japonicum), Mesorhizobium, Rhizobium (включаючи R. leguminosarum), Sinorhizobium (включаючи S. meliloti) та бактеріальні штами, створені способами генетичної інженерії для продукування LCO. Також даним винаходом охоплені композиції, в яких використовують LCO, одержані (тобто виділені та/або очищені) з мікоризного гриба, наприклад, грибів групи Glomerocycota, наприклад, Glomus intraradicus. Структури типових LCO, отриманих з цих грибів, описані в WO 2010/049751 та WO 2010/049751 (LCO описані та також згадувані як «Myc-фактори»). Додатково охопленим виразом «композиції даного винаходу» є застосування синтетичних сполук LCO, таких як ті, що описані в WO 2005/063784, та рекомбінантних LCO, отриманих за допомогою генної інженерії. Основна структура LCO природного походження, може містити модифікації або заміни, які зустрічаються в LCO природного походження, такі як ті, що описані в Spaink, Crit. Rev. Plant Sci. 54:257-288 (2000) та D'Haeze, et al., Glycobiology 12:79R-105R (2002). Олігосахаридні молекули-попередники (CO, котрі, як описано нижче, також придатні у якості рослинних сигнальних молекул в даному винаході) для побудови LCO також можуть бути 8 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 синтезовані організмами, отриманими способами генетичної інженерії, наприклад, як у Samain, et al., Carb. Res. 302:35-42 (1997); Samain, et al., J. Biotechnol. 72:33-47 (1999). LCO можна використовувати у різних формах чистоти та можна застосовувати окремо або у вигляді культури LCO-продукуючих бактерій або грибів. Способи забезпечення по суті чистих LCO включають просте видалення мікробних клітин із суміші LCO та мікроорганізму або з подальшим виділенням та очищенням молекул LCO через відділення LCO в фазі розчинника з подальшою ВЕРХ-хроматографією, як описано, наприклад, в патенті США № 5549718. Очищення можна поліпшити за допомогою повторюваної ВЕРХ таочищені молекули LCO можна ліофілізувати для тривалого зберігання. Хітоолігосахариди (CO) відомі в даній галузі техніки як N-ацетилглюкозамінові структури, зв’язані β-1-4-зв’язками, які виявляють як хітинові олігомери, також як Nацетилхітоолігосахариди. CO мають унікальні та різноманітні відмітні бічні ланцюги, що робить їх відмінними від молекул хітину [(C8H13NO5)n, № CAS 1398-61-4], та молекул хітозану [(C5H11NO4)n, № CAS 9012-76-4]. Типова література, що описує структуру та одержання CO, є наступною: Van der Holst, et al., Current Opinion in Structural Biology, 11:608–616 (2001); Robina, et al., Tetrahedron 58:521–530 (2002); Hanel, et al., Planta 232:787–806 (2010); Rouge, et al. Chapter 27, «The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates» in Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer Science; Wan, et al., Plant Cell 21:1053–69 (2009); PCT/F100/00803 (9/21/2000); та Demont-Caulet, et al., Plant Physiol. 120(1):83–92 (1999). CO можуть бути синтетичними або рекомбінантними. Способи одержання рекомбінантних CO відомі в даній галузі техніки. Дивись, наприклад, Samain, et al. (вище); Cottaz, et al., Meth. Eng. 7(4):311–7 (2005) та Samain, et al., J. Biotechnol. 72:33–47 (1999). Композиції даного винаходу можуть також містити хітинові сполуки (відмінні від CO), флавоноїди, жасмонову кислоту, лінолеву кислоту та ліноленову кислоту та їхні похідні та карикіни. Хітини та хітозани, які являють собою головні компоненти клітинної стінки грибів та екзоскелетів комах та ракоподібних, також складаються із залишків GIcNAc. Хітинові сполуки включають хітин (ІЮПАК: N-[5-[[3-ацетиламіно-4,5-дигідрокси-6-(гідроксиметил)оксан-2іл]метоксиметил]-2-[[5-ацетиламіно-4,6-дигідрокси-2-(гідроксиметил)оксан-3-іл]метоксиметил]-4гідрокси-6-(гідроксиметил)оксан-3-іс]етанамід) та хітозан (ІЮПАК: 5-аміно-6-[5-аміно-6-[5-аміно4,6-дигідрокси-2(гідроксиметил)оксан-3-іл]окси-4-гідрокси-2-(гідроксиметил)оксан-3-іл]окси2(гідроксиметил)оксан-3,4-діол). Ці сполуки можна отримати комерційно, наприклад, від SigmaAldrich, або одержати від комах, з панцерів ракоподібних або клітинних стінок грибів. Способи одержання хітину та хітозану відомі в даній галузі техніки та були описані, наприклад, в патенті США № 4536207 (одержання з панцерів ракоподібних), Pochanavanich, et al., Lett. Appl. Microbiol. 35:17–21 (2002) (отримання з клітинних стінок грибів) та патенті США № 5965545 (отримання з панцерів крабів та гідроліз комерційного хітозану). Можна отримати деацетильовані хітини та хітозани з діапазоном деацетилювання від менш ніж 35% до більш ніж 90%, та вони охоплюють широкий спектр молекулярної ваги, наприклад, хітозанові олігомери з низькою молекулярною вагою менше 15 кДа та хітинові олігомери з молекулярною вагою від 0,5 до 2 кДа; хітозан «практичного типу» з молекулярною вагою від приблизно 15 кДа; та хітозан з високою молекулярною вагою до 70 кДа. Хітинові та хітозанові композиції, складені для оброблення насіння, також комерційно доступні. Комерційні продукти включають, наприклад, ELEXA® (Plant Defense Boosters, Inc.) та BEYOND™ (Agrihouse, Inc.). Флавоноїди являють собою фенольні сполуки, що мають загальну структуру з двох ароматичних кілець, зв’язаних тривуглецевим містком. Флавоноїди продукуються рослинами та мають багато функцій, наприклад, у якості корисних сигнальних молекул та у якості захисту від комах, тварин, грибів та бактерій. Класи флавоноїдів включають халкони, антоціаніди, кумарини, флавони, флавоноли, флавоноли, флаванони та ізофлавони. Дивись Jain, et al., J. Plant Biochem. & Biotechnol. 11:1-10 (2002); Shaw, et al., Environmental Microbiol. 11:1867-80 (2006). Типові флавоноїди, що можуть бути придатними в композиціях даного винаходу, включають геністеїн, даідзеїн, формононетин, нарингенін, гесперетин, лютеолін та апігенін. Флавоноїдні сполуки є комерційно доступними, наприклад, від Natland International Corp., Research Triangle Park, NC; MP Biomedicals, Irvine, CA; LC Laboratories, Woburn MA. Флавоноїдні сполуки можна виділити з рослин або насіння, наприклад, як описано в патентах США № 5702752; № 5990291 та № 6146668. Флавоноїдні сполуки можуть також продукуватися організмами, одержаними способами генетичної інженерії, наприклад дріжджами, як описано в Ralston, et al., Plant Physiology 137:1375-88 (2005). Жасмонову кислоту (JA, [1R-[1α,2β(Z)]]-3-оксо-2-(пентеніл)циклопентаноцтову кислоту) та її 9 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 похідні, лінолеву кислоту ((Z,Z)-9,12-октадекадієнову кислоту) та її похідні та ліноленову кислоту ((Z,Z,Z)-9,12,15-октадекатриєнову кислоту) та її похідні можна також застосовувати в композиціях даного винаходу. Жасмонова кислота та її метиловий естер, метилжасмонат (MeJA), разом відомі як жасмонати, є октадеканоїдними сполуками, які природно зустрічаються в рослинах. Жасмонова кислота продукується коренями сходів пшениці та мікроорганізмамигрибами, наприклад, Botryodiplodia theobromae та Gibbrella fujikuroi, дріжджи (Saccharomyces cerevisiae), та патогенні і непатогенні штами Escherichia coli. Лінолева кислота та ліноленова кислота продукуються в ході біосинтезу жасмонової кислоти. Як повідомлялося, жасмонати, лінолева кислота та лінолева кислота (та їх похідні) є індукторами експресії Nod-генів або продукції LCO різобактеріями. Дивись, наприклад, Mabood, Fazli, Jasmonates induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum, May 17, 2001; and Mabood, Fazli, «Linoleic and linolenic acid induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum,» USDA 3, May 17, 2001. Придатні похідні лінолевої кислоти, ліноленової кислоти та жасмонової кислоти, що можуть бути придатними в композиціях даного винаходу, включають естери, аміди, глікозиди та солі. Типові естери являють собою сполуки, в яких карбоксильна група лінолевої кислоти, ліноленової кислоти або жасмонової кислоти була заміщена -COR-групою, де R являє собою 1 1 OR -групу, в якій R являє собою алкільну групу, таку як нерозгалужена або розгалужена алкільна група C1-C8, наприклад, метильна, етильна або пропільна група; алкенільну групу, таку як нерозгалужена або розгалужена алкенільна група C 2-C8; алкінільну групу, таку як нерозгалужена або розгалужена алкінільна група C2-C8; арильну групу з, наприклад, від 6 до 10 атомами вуглецю; або гетероарильну групу з, наприклад, від 4 до 9 атомами вуглецю, де гетероатоми в гетероарильній групі можуть являти собою, наприклад, N, O, P або S. Типові аміди є сполуками, в яких карбоксильна група лінолевої кислоти, ліноленової кислоти або 2 3 2 3 жасмонової кислоти була заміщена -COR-групою, де R являє собою NR R -групу, в якій R та R незалежно являють собою водень; алкільну групу, таку як нерозгалужена або розгалужена алкільна група C1-C8, наприклад, метильна, етильна або пропільна група; алкенільну групу, таку як нерозгалужена або розгалужена алкенільна група C 2-C8; алкінільну групу, таку як нерозгалужена або розгалужена алкінільна група C2-C8; арильну групу з, наприклад, від 6 до 10 атомами вуглецю; або гетероарильну групу з, наприклад, від 4 до 9 атомами вуглецю, де гетероатоми в гетероарильній групі можуть являти собою, наприклад, N, O, P або S. Естери можна одержати відомими способами, такими як каталізоване кислотою нуклеофільне приєднання, при якому здійснюють реакцію карбонової кислоти зі спиртом в присутності каталітичної кількості мінеральної кислоти. Аміди також можна отримати відомими способами, такими як здійснення реакції карбонової кислоти з відповідним аміном в присутності зв’язуючого агента, такого як дициклогексилкарбодіімід (DCC), за нейтральних умов. Придатні солі лінолевої кислоти, ліноленової кислоти та жасмонової кислоти включають, наприклад, солі приєднання основи. Основи, які можна використовувати в якості реагентів для отримання метаболічно прийнятних основних солей цих сполук, включають ті, що походять від катіонів, таких як катіонів лужних металів (наприклад, калію та натрію), та катіонів лужноземельних металів (наприклад, кальцію та магнію). Ці солі можна легко отримати через змішування разом розчину лінолевої кислоти, ліноленової кислоти або жасмонової кислоти з розчином основи. Сіль можна осадити з розчину та зібрати фільтрацією або можна вилучити іншим засобами, такими як випаровуванням розчинника. Карикіни являють собою вінілогічні 4H-пірони, наприклад, 2H-фуро[2,3-c]піран-2-они, включаючи їх похідні та аналоги. Приклади цих сполук представлені наступною структурою, , де Z являє собою O, S або NR5; кожний з R1, R2, R3 та R4 незалежно являє собою H, алкіл, 10 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 алкеніл, алкініл, феніл, бензил, гідроксі, гідроксіалкіл, алкоксі, фенілоксі, бензилоксі, CN, COR 6, COOR=, галоген, NR6R7 або NO2 та кожний з R5, R6 та R7 незалежно являє собою H, алкіл або алкеніл, або її біологічно прийнятною сіллю. Приклади біологічно прийнятних солей цих сполук можуть включати солі приєднання кислоти, утворені з біологічно прийнятних кислот, приклади яких включають гідрохлорид, гідробромід, сульфат або бісульфат, фосфат або гідрофосфат, ацетат, бензоат, сукцинат, фумарат, малеат, лактат, цитрат, тартрат, глюконат; метансульфонат, бензолсульфонат та п-толуолсульфонову кислоту. Додаткові біологічно прийнятні солі металів можуть включати солі лужних металів з основ, приклади яких включають натрієві та калієві солі. Приклади сполук, охоплені структурою та які можуть бути придатними для застосування в даному винаході, включають наступні: 3-метил-2H-фуро[2,3-c]піран-2-он (де R1=CH3, R2, R3, R4=H), 2H-фуро[2,3-c]піран-2-он (де R1, R2, R3, R4=H), 7-метил-2H-фуро[2,3c]піран-2-он (де R1, R2, R4=H, R3=CH3), 5-метил-2H-фуро[2,3-c]піран-2-он (де R1, R2, R3=H, R4=CH3), 3,7-диметил-2H-фуро[2,3-c]піран-2-он (де R1, R3=CH3, R2, R4=H), 3,5-диметил-2Hфуро[2,3-c]піран-2-он (де R1, R4=CH3, R2, R3=H), 3,5,7-триметил-2H-фуро[2,3-c]піран-2-он (де R1, R3, R4=CH3, R2=H), 5-метоксиметил-3-метил-2H-фуро[2,3-c]піран-2-он (де R1=CH3, R2, R3=H, R4=CH2OCH3), 4-бром-3,7-диметил-2H-фуро[2,3-c]піран-2-он (де R1, R3=CH3, R2=Br, R4=H), 3метилфуро[2,3-c]піридин-2(3H)-он (де Z=NH, R1=CH3, R2, R3, R4=H), 3,6-диметилфуро[2,3c]піридин-2(6H)-он (де Z=N-CH3, R1=CH3, R2, R3, R4=H). Дивись патент США № 7576213. Ці молекули також відомі як карикіни. Дивись Halford, вище. Композиції даного винаходу можуть додатково включати агрикультурно/агрономічно корисний засіб. Необмежуючі приклади таких засобів, що можуть бути придатними в практичному здійсненні даного винаходу, включають гербіциди, фунгіциди та інсектициди. Придатні гербіциди включають бентазон, ацифлуорфен, хлоримурон, лактофен, кломазон, флуазифол, глуфосинат, гліфосат, сетоксидим, імазетапір, імазамокс, фомесаф, флуміклорак, імазаквін та клетодим. Комерційні продукти, що містять кожну з цих сполук, легко доступні. Концентрація гербіциду в композиції буде зазвичай відповідати позначеній робочій концентрації для конкретного гербіциду. «Фунгіцид», як використовується в даному документі та в даній галузі техніки, являє собою засіб, що знищує гриби або інгібує ріст грибів. Як використовується в даному документі, фунгіцид «проявляє активність по відношенню до» конкретного виду грибів, якщо оброблення фунгіцидом приводить до знищення або інгібування популяції грибів (наприклад, в ґрунті) відносно необробленої популяція. Ефективні фунгіциди згідно з даним винаходом будуть відповідно проявляти активність по відношенню до широкого спектра патогенів, включаючи, без обмеження, Phytophthora, Rhizoctonia, Fusarium, Pythium, Phomopsis або Selerotinia і Phakopsora та їх комбінації. Комерційні фунгіциди можуть бути придатними для застосування в даному винаході. Придатні комерційно доступні фунгіциди включають PROTÉGÉ, RIVAL або ALLEGIANCE FL або LS (Gustafson, Плано, Техас), WARDEN RTA (Agrilance, Сент-Пол, Мінесота), APRON XL, APRON MAXX RTA або RFC, MAXIM 4FS або XL (Syngenta, Уілмінгтон, Делавер), CAPTAN (Arvesta, Гелф, Онтаріо) та PROTREAT (Nitragin Argentina, Буенос-Айрес, Аргентина). Активні інгредієнти в цих та інших комерційних фунгіцидах включають, без обмеження, флудіоксоніл, мефеноксам, азоксистробін та металаксил. Комерційні фунгіциди найкраще застосовувати згідно з інструкцією виробника в рекомендованих концентраціях. Як використовується в даному документі, інсектицид «проявляє активність по відношенню до» конкретного виду комах, якщо оброблення інсектицидом приводить до знищення або інгібування популяції комах відносно необробленої популяції. Ефективні інсектициди згідно з даним винаходом будуть відповідно проявляти активність по відношенню до широкого спектра комах, включаючи, без обмеження, дротяників, совок, свищів, злакового кореневого хробака, личинку мухи росткової, ґрунтових блішок, клопів-наземників, афід, листоїдів та щитників. Комерційні інсектициди можуть бути придатними для застосування в даному винаході. Придатні комерційно-доступні інсектициди включають CRUISER (Syngenta, Уілмінгтон, Делавер), GAUCHO та PONCHO (Gustafson, Плано, Техас). Активні інгредієнти в цих та інших комерційних інсектицидах включають тіаметоксам, клотіанідин та імідаклоприд. Комерційні інсектициди найкраще застосовувати згідно з інструкцією виробника в рекомендованих концентраціях. Вираз «композиції даного винаходу», як передбачено, також включає застосування одного або декількох засобів, які роблять фосфат розчинним. Як використовується в даному документі, засоби, які роблять фосфат розчинним, включають, без обмеження, мікроорганізми, які роблять фосфат розчинним. Як використовується в даному документі, «мікроорганізм, який робить фосфат розчинним,» являє собою мікроорганізм, який здатен підвищувати кількість фосфору, 11 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 доступного для рослини. Мікроорганізми, які роблять фосфат розчинним, включають штами грибів та бактеріальні штами. У варіанті здійснення мікроорганізм, який робить фосфат розчинним, являє собою спорогенний мікроорганізм. Необмежуючі приклади мікроорганізмів, які роблять фосфат розчинним, включають види з роду, вибраного з групи, що включає Acinetobacter, Arthrobacter, Arthrobotrys, Aspergillus, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Candida, Chryseomonas, Enterobacter, Eupenicillium, Exiguobacterium, Klebsiella, Kluyvera, Microbacterium, Mucor, Paecilomyces, Paenibacillus, Penicillium, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Streptomyces, Streptosporangium, Swaminathania, Thiobacillus, Torulospora, Vibrio, Xanthobacter та Xanthomonas. Необмежуючі приклади мікроорганізмів, які роблять фосфат розчинним, вибрані з групи, що включає Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter spp., Arthrobacter spp., Arthrobotrys oligospora, Aspergillus niger, Aspergillus spp., Azospirillum halopraeferans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Burkholderia vietnamiensis, Candida krissii, Chryseomonas luteola, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter spp., Enterobacter taylorae, Eupenicillium parvum, Exiguobacterium spp., Klebsiella spp., Kluyvera cryocrescens, Microbacterium spp., Mucor ramosissimus, Paecilomyces hepialid, Paecilomyces marquandii, Paenibacillus macerans, Paenibacillus mucilaginosus, Pantoea aglomerans, Penicillium expansum, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas lutea, Pseudomonas poae, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas trivialis, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, Streptomyces sp., Streptosporangium spp., Swaminathania salitolerans, Thiobacillus ferrooxidans, Torulospora globosa, Vibrio proteolyticus, Xanthobacter agilis та Xanthomonas campestris. В одному варіант здійснення мікроорганізм, який робить фосфат розчинним, являє собою штам грибів Penicillium. Штами грибів Penicillium, що можуть бути придатними для практичного здійснення даного винаходу, включають P. bilaiae (раніше відомий як P. bilaii), P. albidum, P. aurantiogriseum, P. chrysogenum, P. citreonigrum, P. citrinum, P. digitatum, P. frequentas, P. fuscum, P. gaestrivorus, P. glabrum, P. griseofulvum, P. implicatum, P. janthinellum, P. lilacinum, P. minioluteum, P. montanense, P. nigricans, P. oxalicum, P. pinetorum, P. pinophilum, P. purpurogenum, P. radicans, P. radicum, P. raistrickii, P. rugulosum, P. simplicissimum, P. solitum, P. variabile, P. velutinum, P. viridicatum, P. glaucum, P. fussiporus та P. expansum. В іншому варіанті здійснення мікроорганізм, який робить фосфат розчинним, видів Penicillium являє собою P. bilaiae, P. gaestrivorus та/або їх комбінацію. У ще іншому варіанті здійснення штами P. bilaiae вибрані з групи, що включає ATCC 20851, NRRL 50169, ATCC 22348, ATCC 18309, NRRL 50162 (Wakelin, et al., 2004. Biol Fertil Soils 40:36-43), та штам P. gaestrivorus являє собою NRRL 50170 (дивись Wakelin, вище.). Згідно з композиціями даного винаходу передбачається, що можна використовувати більше одного мікроорганізму, який робить фосфат розчинним, наприклад, щонайменше два, щонайменше три, щонайменше чотири, щонайменше п’ять, щонайменше 6, включаючи будьяку комбінацію Acinetobacter, Arthrobacter, Arthrobotrys, Aspergillus, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Candida, Chryseomonas, Enterobacter, Eupenicillium, Exiguobacterium, Klebsiella, Kluyvera, Microbacterium, Mucor, Paecilomyces, Paenibacillus, Penicillium, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Streptomyces, Streptosporangium, Swaminathania, Thiobacillus, Torulospora, Vibrio, Xanthobacter та Xanthomonas, включаючи один вид, вибраний з наступної групи: Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter spp., Arthrobacter spp., Arthrobotrys oligospora, Aspergillus niger, Aspergillus spp., Azospirillum halopraeferans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Burkholderia vietnamiensis, Candida krissii, Chryseomonas luteola, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter spp., Enterobacter taylorae, Eupenicillium parvum, Exiguobacterium spp., Klebsiella spp., Kluyvera cryocrescens, Microbacterium spp., Mucor ramosissimus, Paecilomyces hepialid, Paecilomyces marquandii, Paenibacillus macerans, Paenibacillus mucilaginosus, Pantoea aglomerans, Penicillium expansum, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas lutea, Pseudomonas poae, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas trivialis, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, Streptomyces spp., Streptosporangium spp., Swaminathania salitolerans, Thiobacillus ferrooxidans, Torulospora globosa, Vibrio proteolyticus, Xanthobacter agilis та Xanthomonas campestris. В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб підсилення росту рослин, що включає внесення до рослин, насіння рослин, ґрунту, що оточує рослини або насіння рослин, одного або декількох бактеріальних штамів даного винаходу (включаючи композицію, що містить щонайменше один із виділених бактеріальних штамів даного винаходу та агрономічно прийнятний носій). Один або декілька бактеріальних штамів можуть включати тільки один 12 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бактеріальний штам або комбінацію щонайменше двох або більше штамів даного винаходу, включаючи більше двох, наприклад, щонайменше три з вищевказаних штамів, щонайменше чотири з вищевказаних штамів, щонайменше п’ять з вищевказаних штамів, щонайменше шість з вищевказаних штамів, щонайменше сім з вищевказаних штамів, щонайменше вісім з вищевказаних штамів, щонайменше дев’ять з вищевказаних штамів, щонайменше десять з вищевказаних штамів, щонайменше одинадцять з вищевказаних штамів, щонайменше дванадцять з вищевказаних штамів, щонайменше тринадцять з вищевказаних штамів, до включення всіх з вищевказаних штамів. Застосування Способи даного винаходу включають етап обробки, на якому вносять щонайменше один з виділених штамів та/або одну з композицій, що містять щонайменше один з виділених штамів, до насіння, сходів, коренів, рослин, ґрунтів або їх комбінації. Вирази «оброблення» або «обробка» використовуються в даному документі та галузі техніки, відносяться до будь-якого застосування, яке приводить до контакту насіння, сходів, коренів або рослин з ефективною кількістю композиції для обробки або компонентів для обробки із підвищенням конкурентоспроможності щодо колонізації рослини та ефективності при стимуляції росту рослини. Ефективна кількість та/або придатні норми внесення варіюють відповідно до типу ґрунту, типу рослин, розміру джерела мікронутрієнтів, присутніх в ґрунті або доданих в нього і т. д., та придатну норму можна легко знайти за допомогою простих випробувань шляхом проб та помилок для кожного конкретного випадку. Зазвичай норма внесення щонайменше одного із виділених штамів та/або композицій, що містять щонайменше один із виділених штамів, 2 8 належитьдо діапазону від 1 x 10 до 1 x 10 колонієутворюючих одиниць (куо) на насінину (при застосуванні дражируваного насіння). У конкретному варіанті здійснення норма внесення 4 5 належить до діапазону від 1 x 10 до 1 x 10 колонієутворюючих одиниць (куо) на насінину (при застосуванні дражируваного насіння). Норма внесення для зернистого носія належить до 8 13 діапазону від 1 x 10 до 1 x 10 куо на гектар. У конкретному варіанті здійснення норма 11 11 внесення для зернистого носія належить до діапазону від 2 x 10 до 6 x 10 куо на гектар. Не дивлячись на те, що композиції інокулянту та/або композиції, застосовувані згідно з даним винаходом, можуть включати суміш/комбінацію щонайменше двох або більше різних бактеріальних штамів, по всьому опису приводиться загальна кількість колонієутворюючих одиниць в об’єднаній суміші. Ефективну кількість LCO та/або CO, застосовуваних в композиції даного винаходу для безпосереднього оброблення насіння, виражають в одиницях -5 -14 концентрації, та вони зазвичай варіюють від приблизно 10 до приблизно 10 M (молярна -5 -11 концентрація) та в деяких варіантах здійснення від приблизно 10 до приблизно 10 M, та в -7 -8 деяких інших варіантах здійснення від приблизно 10 до приблизно 10 M. Виражена в одиницях ваги ефективна кількість зазвичай варіює від приблизно 1 до приблизно 400 мкг/хандредвейт (cwt) насіння, та в деяких варіантах здійснення від приблизно 2 до приблизно 70 мкг/cwt, та в деяких інших варіантах здійснення від приблизно 2,5 до приблизно 3,0 мкг/cwt насіння. В цілях обробки насіння опосередковано, тобто внесенням в борозну, ефективна кількість LCO або CO зазвичай варіює від 1 мкг/акр до приблизно 70 мкг/акр та в деяких варіантах здійснення від приблизно 50 мкг/акр до приблизно 60 мкг/акр. В цілях нанесення на рослини ефективна кількість LCO або CO зазвичай варіює від 1 мкг/акр до приблизно 30 мкг/акр та в деяких варіантах здійснення від приблизно 11 мкг/акр до приблизно 20 мкг/акр. Обробку можна здійснити безпосередньо, тобто нанесенням безпосередньо на насіння, сходи, корені або рослини (включаючи листя), або можна здійснити опосередковано, тобто внесенням в ґрунт (включаючи борозну). Як буде зрозуміло, обробку за допомогою кожного компонента можна здійснювати послідовно або одночасно. Наприклад, якщо застосовують рідкий носій, компоненти можна спільно суспендувати в комерційному змішувальному резервуарі для обробки та пізніше наносити на насіння будь-яким придатним способом нанесення покриття, наприклад, плівкове покриття. В процесі плівкового покриття суспензію розпорошують на насіння під час безперервного процесу нанесення покриття. Альтернативно, наприклад, якщо використовують пилоподібний або порошкоподібний носій, компоненти можна наносити послідовно. Відповідно, обробка може також охоплювати нанесення на листя та/або внесення композицій в борозну. Необмежуючі приклади рослин, які підлягають обробці виділеними штамами та/або композиціями, що містять щонайменше один із виділених штамів, включають бобові культури. Необмежуючі приклади бобових культур включають, без обмеження, рослини, такі як соя, люцерна, земляний горіх, горох, сочевиця, квасоля та конюшина. Як буде зрозуміло, вираз 13 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "сільськогосподарська культура" охоплює будь-який рослинний матеріал, який можна зібрати. Культура Даний винахід спрямований на біологічно чисту культуру штаму(ів) Bradyrhizobia japonicum: штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50592 (депонований також під номером NRRL B-59571); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50593 (депонований також під номером NRRL B-59572); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50586 (депонований також під номером NRRL B-59565); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50588 (депонований також під номером NRRL B-59567); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50587 (депонований також під номером NRRL B-59566); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50589 (депонований також під номером NRRL B-59568); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50591 (депонований також під номером NRRL B-59570); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50590 (депонований також під номером NRRL B-59569); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50594 (депонований також під номером NRRL B-50493); штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50726; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50727; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50728; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50729 та штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50730. Як використовується в даному документі, фраза «біологічно чиста культура» означає культуру, яка є по суті вільною від біологічного забруднення та має генетичну однорідність, так що різноманітні субкультури взяті з неї будуть демонструвати по суті однакові генотипи та фенотипи (наприклад, культури мають чистоту щонайменше 60%, щонайменше 65%, щонайменше 70%, щонайменше 75%, щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 91%, щонайменше 92%, щонайменше 93%, щонайменше 94%, щонайменше 95%, щонайменше 96%, щонайменше 97%, щонайменше 98%, щонайменше 99%, до 100% чистоти). Такі культури можуть бути придатні в широкомасштабній ферментації або для інших комерційних цілей. Відповідно, мутанти, транскон’юганти, рекомбінанти та варіанти, одержані способами генетичної інженерії, які отримані зі штамів Bradyrhizobium japonicum з реєстраційними номерами, наданими при депонуванні, NRRL B-50592 (депонований також під номером NRRL B-59571), NRRL B-50593 (депонований також під номером NRRL B-59572), NRRL B-50586 (депонований також під номером NRRL B-59565), NRRL B-50588 (депонований також під номером NRRL B-59567), NRRL B-50587 (депонований також під номером NRRL B59566), NRRL B-50589 (депонований також під номером NRRL B-59568), NRRL B-50591 (депонований також під номером NRRL B-59570); NRRL B-50590 (депонований також під номером NRRL B-59569); NRRL B-50594 (депонований також під номером NRRL B-50493); NRRL B-50726; NRRL B-50727; NRRL B-50728; NRRL B-50729; NRRL B-50730 та їх культури включені в обсяг даного винаходу. В одному варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50592 (депонований також під номером NRRL B-59571). В іншому варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50593 (депонований також під номером NRRL B-59572). В іншому варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50586 (депонований також під номером NRRL B-59565). В іншому варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50588 (депонований також під номером NRRL B59567). В іншому варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50587 (депонований також під номером NRRL B-59566). В іншому варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50589 (депонований також під номером NRRL B-59568). В іншому варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50591 (депонований також під номером NRRL B-59570). В іншому варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50590 (депонований також під номером NRRL B59569). В іншому варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером 14 UA 110375 C2 5 10 депонування NRRL B-50594 (депонований також під номером NRRL B-50493). В іншому варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50726. В іншому варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50727. В іншому варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50728. В іншому варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50729. В іншому варіанті здійснення культура являє собою штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50730. Депонування біологічного матеріалу Нижченаведений біологічний матеріал був депонований за умов Будапештського договору в Американській колекції типових культур (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20108, USA, та the Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit (NRRL) Національного центру прикладних досліджень в сільському господарстві, 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604, USA, та отримав наступний номер доступу: Таблиця 1 Депозит біологічного матеріалу Позначення Bradyrhizobia japonicum Bradyrhizobia japonicum Bradyrhizobia japonicum Bradyrhizobia japonicum Bradyrhizobia japonicum Bradyrhizobia japonicum Bradyrhizobia japonicum Bradyrhizobia japonicum Bradyrhizobia japonicum Bradyrhizobia japonicum Bradyrhizobia japonicum Bradyrhizobia japonicum Bradyrhizobia japonicum Bradyrhizobia japonicum Реєстраційний номер NRRL B-50592 NRRL B-59571 NRRL B-50593 NRRL B-59572 NRRL B-50586 NRRL B-59565 NRRL B-50588 NRRL B-59567 NRRL B-50587 NRRL B-59566 NRRL B-50589 NRRL B-59568 NRRL B-50591 NRRL B-59570 NRRL B-50590 NRRL B-59569 NRRL B-50594 NRRL B-50493 NRRL B-50726 NRRL B-50727 NRRL B-50728 NRRL B-50729 NRRL B-50730 Дата депонування Листопад-09-2011 Березень-08-2011 Листопад-09-2011 Березень-08-2011 Листопад-09-2011 Березень-08-2011 Листопад-09-2011 Березень-08-2011 Листопад-09-2011 Березень-08-2011 Листопад-09-2011 Березень-08-2011 Листопад-09-2011 Березень-08-2011 Листопад-09-2011 Березень-08-2011 Листопад-09-2011 Березень-08-2011 Березень 09-2012 Березень 09-2012 Березень 09-2012 Березень 09-2012 Березень 09-2012 *NRRL означає депонування в колекції культур Служби досліджень в сільському господарстві (Agricultural Research Service Culture Collection), Peoria, IL. 15 20 25 Штам був депонований за умов, які гарантують, що доступ до культури буде дійсним впродовж розгляду даної патентної заявки для особи, що отримає право доступу від уповноваженого Патентів та Знаків для товарів та послуг за 37 C.F.R. §1.14 та 35 U.S.C. §122. Депозит являє собою чисту культуру депонованого штаму. Депозит є доступним згідно з іноземним патентним законодавством в країнах, де подані еквівалентні заявки даної заявки або споріднені їй. Однак, треба розуміти, що доступність депозиту не передбачає дозволу на роботу з даним винаходом з ціллю обмежити права на патент, надані діями уряду. Наступні приклади включені тільки для цілей ілюстрації та не призначені обмежити обсяг даного винаходу. ПРИКЛАДИ Матеріали та способи Середовища YEM-агар (YEMA): (10 г/л D-маніту; 0,50 г/л дріжджового екстракту Oxoid; 0,10 г/л NaCl; 0,50 15 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 г/л K2HPO4; 0,20 г/л MgSO4·7H2O; 12,0 г/л агару; pH≈6,8). Рідкий YEM: (10 г/л D-маніту; 0,50 г/л дріжджового екстракту Oxoid; 0,10 г/л NaCl; 0,50 г/л K2HPO4; 0,20 г/л MgSO4·7H2O; pH≈6,8). Протокол виділення ДНК Для штамів, що росли у чашках, петлю на 1 мкл кожного штаму з чашок окремо додавали до ® 100 мкл розчину для виділення ДНК PrepMan Ultra від Applied Biosystems. Розчин нагрівали до 100°C впродовж 10 хвилин. Виділену ДНК використовували для ПЛР-аналізу. Для ДНК виділеної з бульбочок, бульбочки видаляли за допомогою пінцета з коренів сої та полоскали в diH2O. Роз’єднані бульбочки окремо поміщали в 100 мкл розчину для виділення ® ДНК PrepMan Ultra від Applied Biosystems та нагрівали при 100°C впродовж 10 хвилин з використанням 96-лункового ПЛР-планшета також від Applied Biosystems. Щоб уникнути перехресного зараження використовували одноразові шпички для розламування бульбочок. Виділену ДНК використовували для ПЛР-аналізу. Протокол ПЛР Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) виконували з використанням 96-лункового ® термоциклеру для проведення швидкої ПЛР від Applied Biosystems Veriti . ПЛР проводили для кожного штаму. Додавали 2 мкл ДНК до 0,5 мкл 3’ праймера, 0,5 мкл 5’ праймера, 0,5 мкл Taq® полімерази (New England Biolabs, Inc.) та 21,5 мкл Platinum Blue PCR Supermix (Invitrogen). ПЛР-суміш нагрівали до 94°C впродовж 4 хвилин. Після денатурації, ПЛР виконували впродовж 35 циклів з наступною програмою: 94°C впродовж 1 хвилини, 68°C або температура(и), залежна(і) від відпалювання праймера, впродовж 1 хвилини та реакція подовження при 72°C впродовж 1 хвилини. Після завершення програми ПЛР 5 мкл ПЛР-суміші проводили на системі ® ® Lonza FlashGel . Протокол виділення штаму Для виділення штамів поверхню бульбочок стерилізували 10% господарським відбілювачем протягом 2 хвилин. Бульбочки полоскали в стерильній воді та потім поміщали в мікроцентрифужну пробірку з 250 мкл стерильної води. Бульбочки роздрібнювали стерильними шпичками та вивільняли штами Rhizobium у воду. Дві 10 мкл петлі води наносили штрихами у ® чашки з YEMA для поодиноких колоній. Усі планшети обгортали Parafilm та вирощували при ® 30°C в термостаті Eppendorf Innova 42R. Час росту різнився для кожного ізоляту. Протокол первинного скринінгу Здійснювали первинний скринінг штамів за двома окремими протоколами, тобто «Протокол відносно ґрунтів з полів з соєю (поле, оброблене USDA 532C)» та «Протокол відносно необроблених (контрольних) полів». Кожен протокол описали. Протокол відносно ґрунтів з полів з соєю (поле, оброблене USDA 532C) Насіння сої, покриті USDA 532C, висаджували у різноманітні ґрунти в усіх регіонах, де вирощують сою, в Сполучених Штатах, наприклад, Південна Дакота, Північна Дакота, Джорджія, Айова, Небраска, Іллінойс, Індіана, Техас, Канзас, Міннесота і т. д. Насіння сої, оброблене штамом USDA 532C Bradyrhizobium japonicum, вирощували у цих ґрунтах, збирали та одразу ж аналізували бульбочки сої з використанням ПЛР-аналізу. Сорок (40) бульбочок збирали з кожного зразка ґрунту. Окремі бульбочки сої завантажували в поодинокі лунки 96-лункового титраційного мікропланшета. ДНК з цих окремих бульбочок сої виділяли безпосередньо з бульбочок на основі описаного вище способу (дивись Матеріали та способи: Протокол виділення ДНК). ПЛР-аналіз з використанням USDA 532C-специфічного праймера 209 здійснювали безпосередньо на 96-лунковому планшеті (дивись Матеріали та способи: Протокол ПЛР). Обраховували ампліфікацію праймера 209 (смужка 0,9 т.п.о.) із 40 бульбочок, щоб визначити відсоткову ампліфікацію. Якщо ДНК-ампліфікація 0,9 т.п.о. становила 30% або менше (тобто 70% або більше результатів ПЛР були негативними щодо ампліфікації праймера 209), тоді зразок ґрунту містив штами Bradyrhizobium japonicum з більшою конкурентоспроможністю, ніж штам USDA 532C. Бульбочки сої з меншою або рівною 30% ампліфікацією містили природні штами визначені як більш конкурентні, ніж USDA 532C на основі описаного способу (дивись Матеріали та способи: Протокол виділення штаму). Якщо більше ніж 30% бульбочок сої були колонізовані штамом USDA 532C Bradyrhizobia japonicum, тоді ґрунт вважали непридатним для виділення нового штаму та припиняли роботу з цим зразком ґрунту. Протокол відносно необроблених (контрольних) полів Бульбочки отримували з сої з полів, необроблених USDA 532C, у наступних штатах: Арканзас, Джорджія, Іллінойс, Індіана, Айова, Оклахома, Небраска, Канзас, Міссурі та Техас. Штами Bradyrhizobium japonicum виділяли безпосередньо з цих бульбочок відповідно описаному 16 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вище протоколу (дивись Матеріали та способи: Протокол виділення штаму). Виділені штами піддали прямій конкуренції зі штамом USDA 532C Bradyrhizobia japonicum відповідно «Протоколу дослідження конкуренції» (дивись Матеріали та способи: Протокол дослідження конкуренції). Виділені штами, які заселили більше 70% бульбочок сої при зрівнянні зі штамом USDA 532C Bradyrhizobia japonicum, відбирали для оцінювання продуктивності (дивись Матеріали та способи: Протокол дослідження продуктивності). Протокол дослідження конкуренції ® Визначали оптичну густину (спектрофотометр Nanodrop ND1000). Отримували співвідношення 1:1 інокуляту USDA 532C до кожного виділеного штаму. USDA 532C розводили або концентрували до оптичної густини 0,5 при 600 нм та 0,5 мл інокуляту USDA 532C залишали для кожного ізоляту. Усі виділені штами або концентрували, або розводили до оптичної густини 0,5 при 600 нм з використанням наступного обчислювання: (0,5 оптична густина USDA 532C) x (0,5 мл USDA 532C) = (оптична густина виділеного штаму) x (мл виділеного штаму). Додавали 0,5 мл USDA 532C до 0,5 мл кожного ізоляту в якості окремої обробки. Насіння сої покривали сумішшю інокуляту при нормі 0,5 мл суміші інокуляту на 12 насінин сої. Забезпечували просочування насіння впродовж 30 хвилин. 5 з 12 оброблених ® насінин сої висаджували в ґрунтову суміш Fafard 3B в горщик на 1 галон. Рукавиці одягали при посадці насіння та змінювали між обробками. Після саджання 7 оброблених насінин сої, що залишилися, відбракували. При проростанні горщики проріджували до 3 рослин. Рослини вирощували впродовж 6-7 тижнів в теплиці та уникали перехресного зараження під час процесу поливання. Температури варіювали від приблизно 23°C до 32°C. Поливання здійснювали способом «за необхідністю». Бульбочки збирали з кожної обробленої рослини та використовували для виділення ДНК та ПЛР-аналізу з USDA 532C-специфічним праймером 209. Дивись Матеріали та способи: Протокол виділення ДНК та протокол ПЛР. Протокол дослідження продуктивності Дослідження продуктивності являє собою пряме порівняння продуктивності штам до штаму між окремим виділеним штамом та комерційно доступним штамом USDA 532C Bradyrhizobium japonicum. Виділений штам та контрольний штам (штам USDA 532C Bradyrhizobium japonicum) наносили штрихами одночасно на окремі чашки з YEMA. Виділений штам та контрольний штам окремо засівали в 5 мл рідкого середовища YEM, щоб отримати початкову оптичну густину 0,03 ® при 600 нм в кожній пробірці з інокулятом (спектрофотометр Nanodrop ND1000). Виділений штам та контрольний штам інкубували окремо при 30°C впродовж 3 днів. Після інкубації інокулят для виділеного штаму та контрольного штаму додатково розводили або концентрували до кінцевої оптичної густини 0,5 при 600 нм в кожній пробірці з інокулятом (спектрофотометр ® Nanodrop ND1000) з отриманням експериментального засобу для обробки (виділений штам) та контрольного засобу для обробки (контрольний штам, штам USDA 532C Bradyrhizobium japonicum). Додавали 0,75 мл експериментального засобу для обробки до 32 насінин сої. Забезпечили просочування обробленого насіння впродовж 30 хвилин. Після 30 хвилин по 2 насінини ® висаджували в 15 окремих (4"x4"x6") горщиків з ґрунтовою сумішшю Fafard 3B. Одягали рукавиці при посадці насіння та змінювали між обробками. Після саджання 2 оброблені насінини сої, що залишилися, відбракували. Цей процес повторили для контрольного засобу для обробки. При проростанні горщики з експериментальним засобом для обробки та контрольним засобом для обробки проріджували до однієї рослини. Рослини вирощували впродовж 810 тижнів в теплиці та уникали перехресного зараження під час процесу поливання. Температури варіювали від приблизно 23°C до 32°C. Поливання здійснювали способом «за необхідністю». Після 8-10 тижнів боби збирали та висушували впродовж ночі при 80°C. Для визначення статистично значущого підвищення продуктивності у порівнянні зі штамом USDA 532C Bradyrhizobium japonicum застосовували аналіз із статистичним програмним ® забезпеченням JMP (SAS Institute, Inc.). Протокол температурного режиму Виділені штами Bradyrhizobium japonicum наносили штрихами на чашки з YEMA (10 г/л Dманіту; 0,50 г/л дріжджового екстракту Oxoid; 0,10 г/л NaCl; 0,50 г/л K2HPO4; 0,20 г/л MgSO4·7H2O; 12,0 г/л агару; pH≈6,8) та інкубували при 30°C та 35°C, відповідно, впродовж 7 днів. Виділений штами аналізували за здатністю вирощування з них виділених колоній. Протокол профілю стійкості до гліфосату Виділені штами Bradyrhizobium japonicum наносили штрихами на чашки з YEMA з 1 ммоль гліфосату та 2 ммоль гліфосату (10 г/л D-маніту; 0,50 г/л дріжджового екстракту Oxoid; 0,10 г/л 17 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 NaCl; 0,50 г/л K2HPO4; 0,20 г/л MgSO4·7H2O; 12,0 г/л агару; pH≈6,8). Чашки інкубували при 30°C впродовж 7 днів та штами аналізували за здатністю вирощування з них виділених колоній. Протокол антибіотичного профілю Виділені штами Bradyrhizobium japonicum наносили Т-штрихами на YEMA з гентаміцином (50 мг/л), YEMA з хлорамфеніколом (50 мг/л), YEMA з поліміксином B (100 мг/л), YEMA з карабеніциліном (100 мг/л), YEMA з неоміцином (50 мг/л) та YEMA з налідиксовою кислотою (50 мг/л). Чашки інкубували при 30°C впродовж 7 днів та штами аналізували за здатністю вирощування з них виділених колоній. ® Протокол ПЛР Diversilab ® ® ПЛР Diversilab виконували з використанням Diversilab Pseudomonas Kit від BioMerieux. Цей набір містив запатентовані компанією праймери, призначені для ампліфікації різноманітних частин геному, для здійснення фінгерпринтінгу багаторазової ампліфікації ДНК. Кожний штам має унікальний фінгерпринт, та можна визначити відсоток схожості серед штамів з використанням програмного забезпечення Diverilab. ПЛР виконували відповідно. 2 мкл ДНК додавали до 18,0 мкл Re-PCR MM1, 2,0 мкл суміші праймерів, 0,5 мкл Taq-полімерази (New England Biolabs, Inc.) та 2,5 мкл буферу з Taqполімеразою (New England Biolabs, Inc.) до загального об’єму 25 мкл. ПЛР нагрівали до 94°C впродовж 2 хвилин та потім виконували 35 циклів відповідно до наступного: 94°C впродовж 0,5 хвилини, потім 50°C впродовж 0,5 хвилини та наприкінці 70°C впродовж 1,5 хвилини. Після завершення 35 циклів усю реакцію підтримували при 70°C впродовж 3 хвилин. Після ® завершення ПЛР-аналізу ПЛР-продукт проводили на Agilent 2100 Series Bioanalyzer. Для ® ® завантаження ПЛР-продукту на чипи Diversilab System використовували Diversilab DNA Reagents & Supplies Kit від BioMerieux. Набір експлуатували відповідно до інструкцій. Перед застосуванням набір знаходився при кімнатній температурі впродовж 30 хвилин перед ® ® завантаженням чипу Diversilab . Чіп Diversilab завантажували в повній відповідності з усіма ® передбаченими протоколами та інструкціями. По завершенні завантаження чипу Diversilab чіп ® завантажували в Agilent 2100 Series Bioanalyzer та здійснювали аналіз до завершення. Приклад 1 Структура унікального праймера для комерційного штаму USDA 532C Bradyrhizobium Спосіб генетичної ідентифікації розробили для оцінювання конкурентоспроможності комерційного штаму USDA 532C Bradyrhizobium japonicum в порівнянні з природними штамами в польових умовах. Ідентифікували праймер специфічний до USDA 532C та застосовували ПЛР-технологію, щоб ефективно оцінити конкурентоспроможність USDA 532C в польових умовах. Секвенування цілого геному USDA 532C здійснювали у Novozymes Davis. Було виявлено, що двадцять п’ять різноманітних ДНК-фрагментів мають низьку гомологію із загальнодоступними послідовностями Bradyrhizobium japonicum. ДНК виділяли із штамів B. japonicum (USDA 532C, P152, Br173, Br187, P190 та P194), що росли на чашках відповідно до описаного вище способу (дивись Матеріали та способи: Протокол виділення ДНК). Відносно цих двадцяти п’яти ДНК-фрагментів здійснювали додатковий аналіз послідовностей. Передбачувані унікальні праймери для штаму USDA 532C обирали та застосовували для скринінгу USDA 532Cспецифічного праймера за допомогою ПЛР відносно деяких типових штамів Bradyrhizobium japonicum. Після оцінювання ПЛР було ідентифіковано один унікальний праймер для USDA 532C та названо p209. Послідовність праймера 209 була наступною: SEQ ID NO: 1 - P209p5-TTGGGTTGAGCATGCCCACCCGGACGG, SEQ ID NO: 2 - P209p3-GTCTCAGTTGCCGAGCCCACGGCGC. Специфічність праймера Двадцять п’ять праймерів окремо тестували відносно позитивної ідентифікації USDA 532C. Праймери далі тестували відносно специфічності по відношенню до USDA 532C за допомогою ПЛР з використанням USDA 532C та 5 різноманітних природних штамів B. japonicum (P152, Br173, Br187, P190 та P194) для порівняння. Секвенування геному показало, що Br187 та USDA 532C були генетично ідентичними. 18 UA 110375 C2 Таблиця 2 Узагальнення скринінгу праймера Праймер 787 1114 1181 943 1073 125 209* 487 567 744 811 989 1073 989 a 893 2254 607 389 728 869 1424 1181 989 b 895 943 USDA 532C + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + P152 + + + + + Br173 + + + + + + + + Br187 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + P190 + + + + + + + + + + + + + + P194 + + + + + + + + + + + + + ПЛР-Temp 65 65 64 60 65 68 68 68 58 65 65 69 69 64 64 68 68 60 65 62 65 60 65 65 64 *Праймер 209 показував найчистіші смужки та був вибраний для подальшого оцінювання. 5 10 15 20 25 Таблиця 2 узагальнює отриманні результати («+» означає позитивну ідентифікацію смужки ПЛР-ампліфікації в гелі, «-» означає відсутність ампліфікації ДНК). У відношенні фіг. 1A, було показано, що виділений праймер 209 є специфічним до USDA 532C та Br187. Додаткове генетичне тестування показало, що USDA 532C та штам P187 Bradyrhizobium japonicum є ідентичними (результати не показані). Вміст лунки (зліва направо) показує наступні природні штами USDA 532C, P152, Br173, Br187, Br190, Br194 та контрольну драбинку. Дивись фіг. 1A. Специфічність праймера 209 тестували відносно природних штамів P152, Br173, Br187, Br190, Br194 та USDA 532C. Дивись фіг. 1B. ПЛР з праймером 209 проводили для 100 штамів, отриманих з необроблених ділянок у польових випробуваннях відповідно до вищевказаного способу (дивись Матеріали та способи: Протокол відносно необроблених (контрольних) полів). Штам USDA 532C Bradyrhizobium japonicum не додавали до цих ділянок. Тільки 3% природних штамів з протестованих штамів може бути ампліфіковано з одержанням смужки 0,9 т.п.о., специфічної до праймера 209. Цей результат демонструє, що праймер 209 можна застосовувати для специфічного визначення USDA 532C. Приклад 2 Аналізування та виділення нових штамів Праймер 209 застосовували у якості маркера, щоб показати наявність або відсутність колонізації штамом USDA 532C Bradyrhizobia japonicum в кореневих бульбочках рослин сої. Смужки (тобто смужка 0,9 т.п.о.), що показують наявність праймера 209, виконують роль позитивної ідентифікації штаму USDA 532C Bradyrhizobia japonicum. Дивись фіг. 2A. Фіг. 2A є ілюстративною для прикладу, де штам USDA 532C Bradyrhizobia japonicum є переважно конкурентним штамом щодо колонізації бульбочок рослини сої порівняно з іншими природними штамами Rhizobial. На фіг. 2B кількість смужок, що показують позитивну ідентифікацію для праймера 209 та, таким чином, наявність штаму USDA 532C Bradyrhizobia japonicum, знижена у 19 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 порівнянні із загальною кількістю смужок, наявних для праймера 209 на фіг. 2A. На фіг. 2A та фіг. 2B продемонстровано, що наявність або відсутність праймера 209 можна використовувати для визначення, чи є USDA 532C переважно конкурентним штамом в бульбочках рослини сої. Виділені штами Bradyrhizobium japonicum відбирали з бульбочок відповідно до обох протоколів скринінгу (дивись Матеріали та способи: Протокол первинного скринінгу). Відібрані штами виділяли з бульбочок відповідно до способу виділення (дивись Матеріали та способи: Протокол виділення штаму). Приклад 3 Оцінювання прямої конкуренції Усі виділені штами використовували в програмі скринінгу, призначеної для безпосереднього випробування конкурентоспроможності ізоляту відносно штаму USDA 532C Bradyrhizobium japonicum щодо здатності колонізувати бульбочки (дивись Матеріали та способи: Протокол дослідження конкуренції). Виділений праймер 209 специфічний до USDA 532C використовували у якості маркера, щоб показати наявність або відсутність колонізації штамом USDA 532C Bradyrhizobia japonicum в кореневих бульбочках рослин сої. Позитивна ідентифікація для праймера 209 вказала на колонізацію штамом USDA 532C Bradyrhizobia japonicum в кореневих бульбочках рослин сої. Навпаки, відсутність смужок, що показують позитивну ідентифікацію для праймера 209, вказує на колонізацію природним штамом в кореневих бульбочках рослин сої, відмінним від штаму USDA 532C Bradyrhizobia japonicum. Виділені штами, що демонстрували більше 70% колонізації аналізованих бульбочок, обирали для вторинного оцінювання для підтвердження. Штами піддавали щонайменше двом циклам оцінювання конкуренції. Під час цієї процедури більше 1000 ізолятів піддавали скринінгу щодо підвищеної конкурентоспроможності. Приклад 4 Оцінювання продуктивності Дослідження продуктивності являє собою пряме порівняння штаму до штаму виділених штамів до USDA 532C. Підвищену продуктивність вимірювали як функцію сухої ваги бобів (г). Дивись Матеріали та способи: Протокол дослідження продуктивності. Результати представлені в таблицях 3A – 3D. 30 Таблиця 3A Підвищена продуктивність як функція від сухої ваги бобів (г) Штам NRRL B- 59571 NRRL B-59567 NRRL B-59572 NRRL B-59565 USDA532-C Відсоток колонізації 85 80 85 80 Суха вага бобів (г) 5,92 6,12 6,05 5,87 5,72 Відсоток колонізації підтверджували у трикратному дослідженні та підвищену суху вагу бобів підтверджували в двократному дослідженні для всіх штамів. Таблиця 3B Підвищена продуктивність як функція від сухої ваги бобів (г) Штам NRRL B- 50493 NRRL B-59570 USDA532-C Відсоток колонізації 75 80 Суха вага бобів (г) 4,86 5,30 5,45 35 Відсоток колонізації підтверджували у трикратному дослідженні та підвищену суху вагу бобів підтверджували в двократному дослідженні для всіх штамів. 20 UA 110375 C2 Таблиця 3C Підвищена продуктивність як функція від сухої ваги бобів (г) Штам NRRL B-59566 NRRL B-59569 NRRL B-59568 Відсоток колонізації 85 85 95 Суха вага бобів (г) 5,30 5,50 5,69 USDA532-C 4,69 Відсоток колонізації підтверджували у трикратному дослідженні та підвищену суху вагу бобів підтверджували в двократному дослідженні для всіх штамів. 5 Таблиця 3D Підвищена продуктивність як функція від сухої ваги бобів (г) Штам 15 Суха вага бобів (г) NRRL B-50726 NRRL B-50727 NRRL B-50728 NRRL B-50729 NRRL B-50730* USDA532-C 10 Відсоток колонізації 95 85 83 83 90 5,79 5,02 5,78 5,94 5,94 5,45 Відсоток колонізації та підвищену суху вагу бобів підтверджували у двократному дослідженні для всіх штамів, крім NRRL B-50730*, який пройшов один цикл тестування. Комерційно доступний штам USDA 532C застосовували у якості контролю для кожного оцінювання. Результати таблиць 3A-3D показують, що усі, крім одного, із виділених штамів мали підвищену продуктивність порівняно з контролем, USDA 532C. Приклад 5 Дослідження характеристик Виділені штами Bradyrhizobium japonicum додатково характеризували виходячи з температури, стійкості до гліфосату та антибіотичних профілів (дивись Матеріали та способи: температурний режим, профіль стійкості до гліфосату та протоколи антибіотичних профілів). Результати наведені в таблиці 4. 21 UA 110375 C2 Таблиця 4: Характеристика виділених штамів як функції від температурного режиму, стійкості до гліфосату та стійкості до антибіотиків NRRL NRRL NRRL NRRL NRRL NRRL NRRL NRRL NRRL USDA Обробка B B B B B B B B B 532C 59565 59572 59567 59566 59570 59568 59569 50493 59571 30°C + + + + + + + + + + 35°C + + + + + + + + + + + 1,0 ммоль гліфосату 2,0 ммоль гліфосату Гентаміцин + + + + + Хлорамфенікол + + + + + + + Поліміксин B + + + + + + + + + + Карабеніцилін + + + + Неоміцин + + + + + + + + + Налідиксова кислота 5 10 15 20 25 30 Таблиця 4 узагальнює результати («+» означає ріст виділених колоній, «-» означає відсутність росту та «+-» означає декілька виділених колоній/мінімальний та спорадичний ріст). Результати показують, що штами NRRL B-59570, NRRL B-59568, NRRL B-59565, NRRL B-59566 та NRRL B-50493 є витривалими до температур фактично 35°C. Результати додатково показують, що виділені штами NRRL B-59569, NRRL B-59568, NRRL B-59565 та NRRL B-50493 є природно стійкими до гліфосату. Було виявлено, що штами NRRL B-59566 та NRRL B-59569 мають стійкість до налідиксової кислоти. Приклад 5 Дослідження ДНК-фінгерпринтінгу ® Найрезультативніші ізоляти піддавали аналізу ДНК-фінгерпринтінгу Diversilab (дивись ® Матеріали та способи: Протокол ПЛР Diversilab ). ДНК виділяли з кожного штаму відповідно до способів, що обмірковуються (дивись Матеріали та способи: Протокол виділення ДНК). Виділену ДНК застосовували для ПЛР-аналізу. Результати аналізу ДНК-фінгерпринтінгу Diversilab показані на фіг. 3A – 3B. Результати демонструють, що виділені штами є унікальними штамами та штамами відмінними від USDA 532C. Даний винахід описаний, щонайменше частково, наступними пронумерованими параграфами: 1. Біологічно чиста культура Bradyrhizobia japonicum, вибрана з групи, що включає: штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50592; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50593; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50586; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50588; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50587; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50589; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50591; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50590; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50594; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50726; 22 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50727; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50728; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50729 та штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50730. 2. Штами Bradyrhizobium за параграфом 1, де вказані штами здатні стимулювати зв’язування азоту в рослини. 3. Штами Bradyrhizobium за будь-яким з параграфів 1-2, де вказані штами витривало ростуть при температурі фактично 35°C. 4. Штами Bradyrhizobium за будь-яким з параграфів 1-3, де вказані штами, вибрані з групи, що включає: штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50591; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50589; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50586; штам з реєстраційним номером депонування NRRL 50594 та комбінацію щонайменше двох або більше штамів. 5. Штами Bradyrhizobium за будь-яким з параграфів 1-4, де вказані штами Bradyrhizobium є природно стійкими до гліфосату. 6. Штами Bradyrhizobium за параграфом 5, де вказані штами вибрані з групи, що включає: штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50590; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50594 та комбінацію щонайменше двох або більше штамів. 7. Штами Bradyrhizobium за будь-яким з параграфів 1-6, де вказані штами мають підвищену конкурентоспроможність щодо колонізації рослини. 8. Штами Bradyrhizobium за будь-яким з параграфів 1-7, де вказані штами мають підвищену ефективність при стимуляції росту рослини. 9. Штами Bradyrhizobium за будь-яким з параграфів 1-8, де підвищена конкурентоспроможність включає щонайменше 51% заселеність бульбочок, наприклад, щонайменше 55%, щонайменше 60%, щонайменше 65%, щонайменше 70%, щонайменше 75%, щонайменше 80%, щонайменше 85%, щонайменше 90%, щонайменше 91%, щонайменше 92%, щонайменше 93%, щонайменше 94%, щонайменше 95%, щонайменше 96%, щонайменше 97%, щонайменше 98%, щонайменше 99% або 100% заселеність бульбочок. 10. Штами Bradyrhizobium за будь-яким з параграфів 1-9, де підвищена ефективність при стимуляції росту рослини включає щонайменше одне з збільшеного врожаю рослини, вимірюваного у перерахунку на бушель/акр, збільшеної кількості плодів, збільшеної кількості коренів, збільшеної довжини коренів, збільшеної маси коренів, збільшеного об’єму коренів, збільшеної площі листя, збільшеної густоти стояння рослин, збільшеної сили рослини та/або збільшеної здатності зв’язувати азот (N2) у порівнянні з комерційно доступним штамом, наприклад, USDA 532C. 11. Штами Bradyrhizobium за будь-яким з параграфів 1-10, де підвищена ефективність при стимуляції росту сої включає підвищення загальної сухої ваги бобів сої на вказаній рослині сої при порівнянні вказаної загальної сухої ваги бобів сої із загальною сухою вагою бобів сої на рослині сої, підданої впливу комерційно доступного штаму, наприклад, промислового штаму USDA 532C. 12. Композиція, що містить штам Bradyrhizobia japonicum, вибраний з групи, що включає: штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50592; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50593; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50586; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50588; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50587; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50589; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50591; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50590; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50594; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50726; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50727; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50728; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50729; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50730 та комбінацію щонайменше двох або більше штамів, та агрономічно прийнятний носій. 13. Композиція за параграфом 12, де вказана композиція включає одну або декілька 23 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сигнальних молекул. 14. Композиція за параграфом 13, де рослинна сигнальна молекула являє собою ліпохітоолігосахарид (LCO). 15. Композиція за будь-яким з параграфів 13-14, де LCO є синтетичним. 16. Композиція за будь-яким з параграфів 13-15, де LCO є рекомбінантним. 17. Композиція за будь-яким з параграфів 13-16, де LCO має природне походження. 18. Композиція за будь-яким з параграфів 13-17, де LCO отриманий з виду Rhizobia, вибраного з Rhizobium spp., Bradyrhizobium spp., Sinorhizobium spp. та Azorhizobium spp. 19. Композиція за будь-яким з параграфів 13-18, де LCO отриманий з Bradyrhizobium japonicum. 20. Композиція за будь-яким з параграфів 13-19, де LCO отриманий з деревоподібного мікоризного гриба. 21. Композиція за параграфом 13, де рослинна сигнальна молекула являє собою хітинову сполуку. 22. Композиція за параграфом 22, де хітинова сполука являє собою хітоолігомер (CO). 23. Композиція за будь-яким з параграфів 21-22, де CO є синтетичним. 24. Композиція за будь-яким з параграфів 21-23, де CO є рекомбінантним. 25. Композиція за будь-яким з параграфів 21-24, де CO має природне походження. 26. Композиція за параграфом 13, де рослинна сигнальна молекула являє собою флавоноїд. 27. Композиція за параграфом 13, де рослинна сигнальна молекула являє собою жасмонову кислоту або її похідну. 28. Композиція за параграфом 13, де рослинна сигнальна молекула являє собою лінолеву кислоту або її похідну. 29. Композиція за параграфом 13, де рослинна сигнальна молекула являє собою ліноленову кислоту або її похідну. 30. Композиція за параграфом 13, де рослинна сигнальна молекула являє собою карикін. 31. Композиція за будь-яким з параграфів 12-30, де композиція включає щонайменше дві різні рослинні сигнальні молекули. 32. Композиція за будь-яким з параграфів 12-31, де композиція включає щонайменше один агрономічно корисний засіб. 33. Композиція за параграфом 32, де агрономічно корисний засіб являє собою гербіцид, інсектицид або фунгіцид. 34. Композиція за параграфом 33, де агрономічно корисний засіб являє собою щонайменше один мікроорганізм, який робить фосфат розчинним. 35. Композиція за параграфом 34, де щонайменше один мікроорганізм, який робить фосфат розчинним, містить штам гриба Penicillium. 36. Композиція за параграфом 35, де щонайменше один мікроорганізм, який робить фосфат розчинним, містить штам P. bilaiae. 37. Композиція за параграфом 36, де штам P. Bilaiae вибраний з групи, що включає NRRL 50162, NRRL 50169, ATCC 20851, ATCC 22348 та ATCC 18309. 38. Композиція за параграфом 34, де щонайменше один мікроорганізм, який робить фосфат розчинним, містить штам P. gaestrivorus. 39. Композиція за параграфом 38, де штам P. gaestrivorus являє собою NRRL 50170. 40. Спосіб виділення бактеріального(них) штаму(ів), вибраних з родів, що включають Rhizobium та Bradyrhizobium, що мають підвищену конкурентоспроможність щодо колонізування бобової рослини та підвищену ефективність при стимуляції росту бобової рослини, що включає етапи, на яких: a. отримують бактеріальний(ні) штам(и) із зразка ґрунту; b. бобову рослину піддають впливу вказаного(их) бактеріального(их) штаму(ів) та комерційно доступного(их) штаму(ів), наприклад промисловому штаму USDA 532C; c. відбирають бактеріальний(ні) штам(и), який (які) є більш конкурентними, ніж комерційно доступний штам щодо заселення бульбочок бобової рослини; f. аналізують вибраний(ні) бактеріальний(ні) штам(и), який(які) є більш конкурентними, ніж комерційно доступний штам щодо заселення бульбочок бобової рослини відносно того(тих) бактеріального(них) штаму(мів) з підвищеною ефективністю при стимуляції росту бобової рослини та d. виділяють вказаний(ні) бактеріальний(ні) штам(и) з підвищеною ефективністю при стимуляції росту бобової рослини. 41. Виділений бактеріальний штам за параграфом 40, де вказаний бактеріальний штам 24 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 являє собою штам Bradyrhizobium spp. 42. Виділений штам Bradyrhizobium за параграфом 41, де вказаний штам Bradyrhizobium spp. являє собою штам Bradyrhizobium japonicum. 43. Виділений штам Bradyrhizobium за будь-яким з параграфів 41-42, де вказаний штам являє собою штам Bradyrhizobia japonicum, вибраний з групи, що включає: штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50592; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50593; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50586; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50588; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50587; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50589; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50591; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50590; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50594; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50726; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50727; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50728; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50729; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50730 та комбінацію щонайменше двох або більше штамів. 44. Спосіб за будь-яким з параграфів 40-43, де виділений штам Bradyrhizobia japonicum здатний зв’язувати азот в рослині. 45. Спосіб за будь-яким з параграфів 40-44, де виділений штам Bradyrhizobia japonicum витривало росте при температурі фактично 35°C. 46. Спосіб за параграфом 45, де виділений штам Bradyrhizobia japonicum вибраний з групи, що включає: штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50591; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50589; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50586; штам з реєстраційним номером депонування NRRL 50594 та комбінацію щонайменше двох або більше штамів. 47. Спосіб за будь-яким з параграфів 40-46, де штам Bradyrhizobia japonicum має природну стійкість до гліфосату. 48. Спосіб за параграфом 47, де виділений штам Bradyrhizobia japonicum вибраний з групи, що включає: штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50590; штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50594 та комбінацію щонайменше двох або більше штамів. 49. Спосіб підсилення росту рослини, що включає етап, на якому оброблюють насіння, сходи, корінь, рослину, ґрунт або їх комбінацію композицією за будь-яким з параграфів 1-39. 50. Спосіб за параграфом 49, де насіння, сходи, корінь або рослина належать до бобових. 51. Спосіб за параграфом 50, де насіння, сходи, корінь або рослина являють собою насіння сходи, корінь або рослину сої. 52. Спосіб за будь-яким з параграфів 49-51, де вказану композицію додають до ґрунту в 8 13 11 кількості від 1 x 10 до 1 x 10 колонієутворюючих одиниць на гектар, переважно від 2 x 10 до 11 6 x 10 колонієутворюючих одиниць на гектар. 53. Спосіб за будь-яким з параграфів 49-52, де вказану композицію застосовують у якості 2 8 4 5 покриття для насіння, що включає від 1 x 10 до 1 x 10 , переважно від 1 x 10 до 1 x 10 колонієутворюючих одиниць на насінину. Даний винахід, описаний та заявлений у даному документі, не повинен обмежуватися в обсягу розкритими в даному документі конкретними варіантами здійснення, оскільки дані варіанти здійснення, як призначається, є ілюстрацією деяких аспектів даного винаходу. Будь-які рівноцінні варіанти здійснення передбачаються в обсязі даного винаходу. Дійсно різні модифікації даного винаходу на додаток до тих, що показані та описані в даному документі, будуть очевидними для фахівців в даній галузі техніки з попереднього опису. Такі модифікації також, як передбачено, охоплені обсягом доданої формули винаходу. У випадку суперечок, дане розкриття, включаючи приведені в ньому визначення, буде мати переважну силу. Різні посилання процитовані в даному документі, розкриття яких включені посиланням у всій своїй повноті. 60 25 UA 110375 C2 Перелік послідовностей 5 Канг, Яовей Семонс, Шоун Сміт, Джессіка Вудс, Крісті Конкурентоспроможні та ефективні бактеріальні штами 10 12091-WO-PCT 2 PatentIn версія 3.5 15 1 27 ДНК Штучна послідовність 20 Праймер 209p5 25 30 1 ttgggttgag catgcccacc cggacgg 27 2 25 DNA Штучна послідовність Праймер 209p3 35 2 gtctcagttg ccgagcccac ggcgc 25 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 40 45 50 55 1. Біологічно чиста культура Bradyrhizobia japonicum для підсилення росту рослини, вибрана з групи, що включає: штам з реєстраційним номером депонування NRRL В-50592, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50593, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50586, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50588, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50587, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50589, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50591, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50590, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50594, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50726, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50727, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50728, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50729 та штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50730. 2. Біологічно чиста культура Bradyrhizobia japonicum за п. 1, де вказані штами здатні стимулювати зв'язування азоту в рослині. 3. Біологічно чиста культура Bradyrhizobia japonicum за будь-яким з пп. 1-2, де вказані штами 26 UA 110375 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 витривало ростуть при температурі фактично 35 °C. 4. Біологічно чиста культура Bradyrhizobia japonicum за будь-яким з пп. 1-3, де вказані штами вибрані з групи, що включає: штам з реєстраційним номером депонування NRRL В-50591, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50589, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50586, штам з реєстраційним номером депонування NRRL 50594 та комбінацію щонайменше двох або більше штамів. 5. Біологічно чиста культура Bradyrhizobia japonicum за будь-яким з пп. 1-4, де вказані штами Bradyrhizobium є природно стійкими до гліфосату. 6. Біологічно чиста культура Bradyrhizobia japonicum за п. 5, де вказані штами вибрані з групи, що включає: штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50590, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50594 та комбінацію щонайменше двох або більше штамів. 7. Біологічно чиста культура Bradyrhizobia japonicum за будь-яким з пп. 1-6, де вказані штами мають підвищену конкурентоспроможність щодо колонізування рослини. 8. Біологічно чиста культура Bradyrhizobia japonicum за будь-яким з пп. 1-7, де вказані штами мають підвищену ефективність при стимуляції росту рослини. 9. Біологічно чиста культура Bradyrhizobia japonicum за будь-яким з пп. 1-8, де підвищена конкурентоспроможність включає щонайменше 51 % заселеність бульбочок, наприклад, щонайменше 55 %, щонайменше 60 %, щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % заселеність бульбочок. 10. Біологічно чиста культура Bradyrhizobia japonicum за будь-яким з пп. 1-9, де підвищена ефективність при стимуляції росту рослини включає щонайменше одне зі збільшеного врожаю рослини, вимірюваного у перерахунку на бушель/акр, збільшеної кількості плодів, збільшеної кількості коренів, збільшеної довжини коренів, збільшеної маси коренів, збільшеного об'єму коренів, збільшеної площі листя, збільшеної густоти стояння рослин, збільшеної сили рослини та/або збільшеної здатності зв'язувати азот (N2) у порівнянні з комерційно доступним штамом, наприклад, USDA 532C. 11. Біологічно чиста культура Bradyrhizobia japonicum за будь-яким з пп. 1-10, де підвищена ефективність при стимуляції росту сої включає збільшення загальної сухої ваги бобів сої на вказаній рослині сої при порівнянні вказаної загальної сухої ваги бобів сої із загальною сухою вагою бобів сої на рослині сої, підданої впливу комерційно доступного штаму, наприклад промислового штаму USDA 532C. 12. Композиція, що містить штам Bradyrhizobia japonicum, вибраний з групи, що включає: штам з реєстраційним номером депонування NRRL В-50592, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50593, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50586, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50588, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50587, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50589, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50591, штам з реєстраційним номером депонування NRRL В-50590, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50594, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50726, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50727, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50728, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50729, штам з реєстраційним номером депонування NRRL B-50730 та комбінацію щонайменше двох або більше штамів, та агрономічно прийнятний носій. 13. Композиція за п. 12, де вказана композиція включає одну або декілька сигнальних молекул. 14. Композиція за п. 13, де рослинна сигнальна молекула являє собою ліпохітоолігосахарид, хітинову сполуку, флавоноїд або карикін. 15. Композиція за п. 13, де рослинна сигнальна молекула являє собою жасмонову кислоту, лінолеву кислоту, ліноленову кислоту або їх похідну. 16. Композиція за будь-яким з пп. 12-15, де композиція включає щонайменше один агрономічно 27 UA 110375 C2 5 10 корисний засіб. 17. Композиція за п. 16, де агрономічно корисний засіб являє собою щонайменше один мікроорганізм, який робить фосфат розчинним. 18. Спосіб підсилення росту рослини, що включає етап, на якому оброблюють насіння, сходи, корінь, рослину, ґрунт або їх комбінації композицією за будь-яким з пп. 12-17. 19. Спосіб за п. 18, при якому насіння, сходи, корінь або рослина належать до бобових. 20. Спосіб за п. 19, при якому насіння, сходи, корінь або рослина являють собою насіння, сходи, корінь або рослину сої. 21. Спосіб за будь-яким з пп. 18-20, при якому вказану композицію додають до ґрунту в кількості 8 13 11 11 від 1×10 до 1×10 колонієутворюючих одиниць на гектар, переважно від 2×10 до 6×10 колонієутворюючих одиниць на гектар. 22. Спосіб за будь-яким з пп. 18-21, при якому вказану композицію застосовують як покриття 2 8 4 5 для насіння, що включає від 1×10 до 1×10 , переважно від 1×10 до 1×10 колонієутворюючих одиниць на насінину. 15 Фігура 1А 28