Штам бактерій bradyrhizobium japonicum, який характеризується інтенсивним ростом і підвищеною сапрофітною компетентністю та рекомендований для інокуляції сої

Реферат: Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum з інтенсивним ростом та підвищеною сапрофітною компетентністю для виробництва бактеріальних добрив для інокуляції насіння сої, депонований у Депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України за реєстраційним номером В-7435. UA 100771 U (12) UA 100771 U UA 100771 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільськогосподарської мікробіології, а саме до мікробних засобів підвищення урожайності сої. Це інтенсивнорослий штам бульбочкових бактерій виду Bradyrhizobium japonicum, рекомендований для виготовлення бактеріальних препаратів для сої. Відомо, що важливу роль у формуванні високих урожаїв сої (Glycine max (L.) Merr.) відіграють бульбочкові бактерії (ризобії), які утворюють симбіоз із рослиною і забезпечують її біологічним азотом. Для підвищення урожайності сої широко використовуються біопрепарати на основі селекціонованих високоефективних штамів бульбочкових бактерій виду Bradyrhizobium japonicum [1-3]. Відомі штами повільнорослих бульбочкових бактерій сої: Bradyrhizobium japonicum 24108 [4] та Bradyrhizobium japonicum KH10 [5], які використовуються у виробництві біологічних добрив для підвищення урожайності сої. Здатність цих штамів виживати у ґрунті, формувати активну місцеву популяцію бульбочкових бактерій за наявності інших штамів специфічних ризобій практично не вивчалася. Відомий повільнорослий штам Bradyrhizobium japonicum 6346, який є активним симбіотичним азотфіксатором, він широко використовується як стандартний штам у наукових дослідженнях. Але цей штам поступається пропонованому штаму за конкурентоспроможністю та здатністю підвищувати урожайність сої. Найбільш близьким до запропонованої корисної моделі є штам Bradyrhizobium japonicum M8 [6]. Цей штам поступається пропонованому штаму за інтенсивністю росту, сапрофітною компетентністю (сапрофітна компетентність - здатність штамів виживати та зберігатися тривалий час у ґрунті), а також за здатністю формувати у ґрунті численну місцеву популяцію активних бульбочкових бактерій сої. В основу корисної моделі поставлена задача отримати новий високоефективний штам бульбочкових бактерій сої, який, на відміну від аналогів, відрізнявся би інтенсивним ростом, підвищеною сапрофітною компетентністю (краще приживався у ґрунті), як біоагент бактеріальних препаратів, домінував би у бульбочках та забезпечував стабільно високий урожай зерна сої. Поставлена задача вирішується шляхом отримання методом аналітичної селекції нового штаму Bradyrhizobium japonicum B-7435 з інтенсивним ростом. Новий штам відрізняється від інших повільнорослих штамів інтенсивним накопиченням бактеріальної маси при культивуванні 9 (титр культури через 72 години культивування досягає 3-4 × 10 КУО/мл), що характеризує його як більш технологічний при виробництві біопрепаратів. Штам виділений з численної популяції бульбочкових бактерій сої, він більше пристосований до різних ґрунтово-кліматичних умов України та жорсткої внутрішньовидової конкуренції між представниками місцевих популяцій специфічних ризобій. Пропонований штам характеризується підвищеною сапрофітною компетентністю, він здатний формувати активну місцеву популяцію бульбочкових бактерій сої у ґрунті і як представник цієї популяції домінувати у бульбочках. Штам здатний комплексно впливати на розвиток сої: посилювати процеси фотосинтезу та симбіотичної азотфіксації, суттєво підвищувати зернову продуктивність цієї культури. Новий штам виділений з бульбочок сої сорту Устя, яка вирощувалася на сірому лісовому середньосуглинковому ґрунті (м. Вінниця). Рн сольове ґрунту - 5,2-5,4; вміст гумусу - 1,8-2,1 %; азоту, що легко гідролізується - 72,0-78,0 мг; Р2О5 - 98,0-102,0 мг; K2О - 126,0-136,0 мг на 1 кг ґрунту. Пропонований штам ідентифікований за визначником Берджі [7] як Bradyrhizobium japonicum і депонований у Депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України (вул. Заболотного, 154, м. Київ) 27 травня 2013 р. за реєстраційним номером В-7435. Він також зберігається в Колекції корисних ґрунтових мікроорганізмів Інституту сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН за реєстраційним номером 257. Морфолого-культуральні властивості штаму. Інтенсивнорослий штам Bradyrhizobium japonicum В-7435 добре росте при температурі 2628 °C на модифікованому живильному бобовому середовищі такого складу, г/л: K2НРО4 - 0,5, KН2РО4 - 0,5, (NH4)2SO4 - 0,5, MgSO4 - 0,2, СаСl2 - 0,2, (NH4)2MoO4 - сліди, СоСl3 - сліди, сахароза - 10,0, маніт - 10,0, агар-агар - 20,0, люпиновий відвар - 150 мл, рН = 6,8-7,0, стерилізація - 1,0 атм. 30 хв. Культура бактерій неспороносна, характеризується інтенсивним ростом на твердому бобовому середовищі, наведеному вище. Клітини рухомі, мають форму злегка зігнутих паличок, грамнегативні. Палички у віці 1-3-х діб рухливі, монотрихи. Штрих на люпиновому середовищі слизистий, напівпрозорий, опуклий. На 3-5 добу росту на чашках Петрі колонії округлої форми, напівпрозорі, слизисті. Діаметр колоній досягає 2-4 мм. Оптимальна температура росту - 28 °C, рН = 6,8-7,0. 1 UA 100771 U 5 10 15 20 25 30 35 Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Аероб. Молоко з лакмусом не пептонізує, підвищує рН середовища до лужного. Желатину не розріджує. Відношення до джерел вуглецю. Штам добре росте на середовищах із глюкозою, галактозою, арабінозою, манітом та сорбітом, помірно використовує рамнозу, мальтозу і сахарозу, дуже слабо - ксилозу. Не засвоює дульцит та рафінозу. Відношення до джерел азоту. Новий штам добре росте на середовищах з амонійними солями, азотнокислим калієм, гліцином та тирозином. Переважно використовує відновлені форми азоту. На м'ясо-пептонному агарі та м'ясо-пептонному бульйоні не росте. Штам чутливий до більшості досліджених антибіотиків (левоміцетину, амоксициліну, ампіциліну, цефотаксиму, цефтріаксону, цефалексину, цефазоліну, гентаміцину, амікацину, канаміцину, еритроміцину, ципрофлоксацину, норфлоксацину). Не виявлено зон затримки росту нового штаму на твердому живильному середовищі при застосуванні оксациліну, фурадоніну та поліміксину. Ознаки штаму стійкі. Штам патогенних властивостей не має (належить до групи авірулентних мікроорганізмів, не здатних до інвазії у внутрішні органи теплокровних тварин). Штам пересівається один раз у 6 місяців і зберігається в лабораторних умовах на твердому бобовому (люпиновому) середовищі при 4-5 °C. Генетичні особливості штаму. Штам IMB В-7435 філогенетично наближений до штамів групи USDA 123 (Bradyrhizobium japonicum USDA 123) (гомологія 99,8 % по 16S рРНК та 99,5 % по міжгенному регіону 16S-23S рРНК). При ампліфікації ділянки міжгенного спейсера (16S-23SpPHK) нового штаму Bradyrhizobium japonicum В-7435 утворюється фрагмент розміром ~1000 пар нуклеотидів (п.н.). При обробці цього фрагменту ферментом ендонуклеазою рестрикції Mspl генеруються 4 фрагменти розміром 460, 220, 150 та 110 п.н. Сапрофітну компетентність, конкурентоспроможність та ефективність штаму Bradyrhizobium japonicum В-7435 вивчали у польових дослідах. Приклади конкретного застосування штаму. Приклад 1. У польових дослідах (протягом 3 років) вивчали приживаність двох штамів бульбочкових бактерій сої у дерново-підзолистому ґрунті, в якому відсутні місцеві бульбочкові бактерії сої (дослідне поле Інституту сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН, м. Чернігів). У перший рік досліджень рослини сої інокулювали окремо повільнорослим штамом - прототипом Bradyrhizobium japonicum M8 і новим пропонованим штамом і інтенсивним ростом Bradyrhizobium japonicum B-7435. Восени після відмирання бульбочок та навесні поле переорювали, забезпечуючи рівномірний розподіл двох інтродукованих штамів у ґрунті дослідного поля. На другий і третій роки на цьому ж полі вирощували сою без інокуляції. Приживаність інтродукованих штамів у ґрунті визначали за їхньою часткою у сформованих бульбочках. Ідентифікацію штамів в бульбочках проводили серологічним методом (реакція аглютинації) за допомогою специфічних антисироваток (М8 та КВ11). Новий штам Bradyrhizobium japonicum B-7435 належить до серогрупи КВ11. У досліді використовували сою сорту Устя. 40 Таблиця 1 Рік досліджень 2007 2008 2009 45 Варіанти досліду Інокуляція Bradyrhizobium japonicum M8 Інокуляція Bradyrhizobium japonicum B-7435 Без інокуляції Без інокуляції Частка штамів бульбочкових бактерій сої у бульбочках, % В-7435 М8 (серогрупа (серогрупа М8) КВ11) Активність симбіотичної азотфіксації, мкг N/рослину за год. 100,0 0 31,3±1,9 0 100,0 32,9±2,6 12,0 0 88,0 100,0 33,3±2,1 56,3±1,7 Наведені у таблиці 1 дані свідчать, що новий штам Bradyrhizobium japonicum В-7435 краще, ніж штам-прототип приживається у ґрунті. На другий рік вирощування сої у монокультурі пропонований штам домінував, утворюючи 88,0 % бульбочок, в той час як частка штамупрототипу Bradyrhizobium japonicum M8 в бульбочках становила 12,0 %. На третій рік вирощування сої в бульбочках був виявлений лише інтенсивнорослий штам Bradyrhizobium 2 UA 100771 U 5 10 15 20 25 30 japonicum B-7435 (100,0 %). Отримані дані свідчать про підвищену сапрофітну компетентність нового штаму. Крім того, на другий та третій роки досліджень симбіотичні системи бульбочкових бактерій і рослини-господаря характеризувалися високою азотфіксувальною активністю (33,3-56,3 MKrN/рослину за год.), що також свідчить про формування у ґрунті активної популяції бульбочкових бактерій сої за рахунок нового штаму Bradyrhizobium japonicum B-7435. Приклад 2. Протягом 4 років у польових дослідах вивчали здатність чотирьох штамів бульбочкових бактерій сої зберігатися у ґрунті (тип ґрунту - чорнозем вилугуваний, дослідне поле Інституту сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН, м. Чернігів). У перший рік досліджень рослини сої інокулювали окремо новим штамом з інтенсивним ростом Bradyrhizobium japonicum B-7435 та повільнорослими штамами Bradyrhizobium japonicum M8 (штам-прототип), Bradyrhizobium japonicum 46 і Bradyrhizobium japonicum 6346. Восени після відмирання бульбочок та навесні поле переорювали, забезпечуючи рівномірний розподіл всіх інтродукованих штамів у ґрунті. На другий, третій і четвертий роки досліджень сою вирощували на тому ж самому полі, але насіння не інокулювали. Приживаність штамів у ґрунті визначали за їхньою часткою у сформованих бульбочках (серологічний метод). У досліді використовували сою сорту Устя. Як видно з даних таблиці 2, новий інтенсивнорослий штам Bradyrhizobium japonicum B-7435 добре приживається і в чорноземі вилугуваному. Цей штам домінував у бульбочках сої протягом трьох років (71,7-100,0 %), в порівнянні із повільнорослими штамами Bradyrhizobium japonicum M8 (штам-прототип), Bradyrhizobium japonicum 46 та Bradyrhizobium japonicum 6346, частка яких вже на другий рік вирощування сої у монокультурі зменшилася від 100,0 % до 3,320,0 %. Найменше бульбочок (3,3 %) на коренях сої утворювалося за участі штаму-прототипу Bradyrhizobium japonicum M8. На четвертий рік досліджень бульбочки на коренях сої були утворені лише новим штамом із інтенсивним ростом Bradyrhizobium japonicum B-7435, що є доказом його підвищеної сапрофітної компетентності та високої конкурентоспроможності. Крім того, активність симбіотичної азотфіксації сої в монокультурі за умов домінування в бульбочках пропонованого інтенсивнорослого штаму Bradyrhizobium japonicum B-7435 (другийчетвертий роки) була достатньо високою (11,7-30,0 мкг N/рослину за год.) та не відрізнялася від інтенсивності фіксації молекулярного азоту у варіанті з повільнорослим штамом Bradyrhizobium japonicum M8 в перший рік вирощуванні сої (10,0-19,0 мкг N/рослину за год.). Даний факт є доказом формування у ґрунті активної місцевої популяції ризобій сої, яка здатна забезпечувати рослини біологічним азотом і представлена в основному запропонованим штамом з інтенсивним ростом Bradyrhizobium japonicum B-7435. 35 Таблиця 2 Рік досліджень 2008 2009 2010 2011 Варіанти досліду Інокуляція Bradyrhizobium japonicum 46 Інокуляція Bradyrhizobium japonicum M8 Інокуляція Bradyrhizobium japonicum B-7435 Інокуляція Bradyrhizobium japonicum 6346 Без інокуляції Без інокуляції Без інокуляції Частка штамів бульбочкових Активність Активність бактерій сої у бульбочках, % азотфіксації за азотфіксації інокуляції В-7435 мкг Bradyrhizobium (серо46 М8 6346 N/рослину за japonicum М8, мкг група год. N/рослину за год. КВ11) 100,0 0 0 0 33,3±3,6 0 100,0 0 0 29,8±3,9 0 0 100,0 0 30,2±3,5 0 0 0 100,0 15,3±1,2 20,0 8,3 0 3,3 0 0 71,7 91,7 100,0 5,0 0 0 30,0±1,5 11,7±1,0 22,7±1,5 10,0±0,6 19,0±1,3 3 UA 100771 U 5 10 Приклад 3. Ефективність запропонованого штаму Bradyrhizobium japonicum B-7435 як біоагенту твердої (торф'яної) форми препарату перевіряли у польових дослідах в ґрунтовокліматичних умовах Полісся України (дослідні поля Інституту сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН, м. Чернігів). Тип ґрунту - чорнозем вилугуваний. У ґрунті відсутня місцева популяція ризобій сої. Сорт сої Устя. Результати досліду наведені в таблиці 3. Як видно з таблиці 3, пропонований штам Bradyrhizobium japonicum B-7435 є високоефективним, він сприяє збільшенню урожайності сої в середньому за два роки на 24,7 % порівняно до контролю. Це зумовлено тим, що штам є активним симбіотичним азотфіксатором, спроможним активно колонізувати кореневу систему сої. Його підвищена здатність до виживання у ґрунті важлива для формування стабільної популяції бульбочкових бактерій у ґрунті, здатної активно постачати зв'язаний азот рослинам. Таблиця 3 Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Штам-прототип Bradyrhizobium japonicum M8 Новий штам Bradyrhizobium japonicum B7435 HCP05 15 20 2010 1,50 Урожайність, т/га Приріст до контролю, % 2011 Середнє 2,46 1,98 100,0 1,72 3,10 2,41 121,7 1,76 3,18 2,47 124,7 0,16 0,15 Приклад 4. Ефективність запропонованого штаму Bradyrhizobium japonicum B-7435 як біоагенту твердої (торф'яної) форми препарату перевіряли у польових дослідах в ґрунтовокліматичних умовах Полісся України (дослідні поля Інституту сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН, м. Чернігів) на фоні місцевих популяцій бульбочкових бактерій сої. Тип ґрунту - чорнозем вилугуваний. Сорт сої Устя. Результати досліду наведені в таблиці 4. Пропонований штам Bradyrhizobium japonicum В-7435 добре показав себе за наявності у ґрунті різних за щільністю місцевих популяції ризобій сої, що свідчить про його конкурентоспроможність та ефективність. Інокуляція новим штамом сприяла стабільному збільшенню урожайності сої в середньому за два роки на 0,33 т/га порівняно до контролю. 25 Таблиця 4 Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Новий штам Bradyrhizobium japonicum В7435 НСР05 30 35 40 2012 2,55 Урожайність, т/га Приріст до контролю, % 2013 Середнє 2,23 2,39 100,0 2,88 2,55 0,15 2,72 113,8 0,23 Таким чином, новий штам Bradyrhizobium japonicum В-7435 відповідає критеріям виробничих штамів: він має інтенсивний ріст, що характеризує його як технологічний штам; він має підвищену здатність до виживання в ґрунті (підвищена сапрофітна компетентність); штам є активним симбіотичним азотфіксатором, спроможним активно колонізувати кореневу систему сої за умов наявності в ґрунті різних за щільністю популяцій бульбочкових бактерій сої (висока конкурентоспроможність). Пропонований штам Bradyrhizobium japonicum В-7435 стабільно підвищує урожайність сої на 13,8-24,7 %. Джерела інформації: 1. Біологічний азот / [Патика В.П., Коць С.Я., Волкогон В.В. та ін.]; за ред. В.П. Патики - К.: Світ, 2003. - 424 с. 2. Доросинский Л.М. Бактериальные удобрения - дополнительное средство повышения урожая. - М.: Россельхозиздат, 1965. - 315 с. 3. Бабич А.О. Сучасне виробництво і використання сої. - Київ: Урожай, 1993. - 432 с. 4. Пат. 3324 С1 Україна, С 05 F 11/08, С12 N1/20. Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum для одержання добрив під сою / Скочинська Н.М., Антипчук А.Ф., Рангелова В.М., Канцелярук P.M., Танцюренко О.В., Заявл. 31.07.90; Опубл. 27.12.94., Бюл. № 1-6. - 3 с. 4 UA 100771 U 5 5. Пат. 69993 А Україна, МКИ С 05 F 11/08, С 12 N1/20. Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum для одержання бактеріального добрива під сою / Крутило Д.В., Ковалевська Т.М., Заявл. 22.12.03; Опубл. 15.09.04, Бюл. №9. – 3 с. 6. Пат. 39545 А Україна, МКИ С 05 F 11/08, С 12 N 1/20. Штам бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum M-8 Kircyner, який використовують для приготування бактеріального препарату, що підвищує урожайність сої / Толкачов М.З., Патика В.П., Каменева I.О., Грітчіна Л.Ю., Заявл. 06.10.2000; Опубл. 16.06.01, Бюл. №5. - 5 с. 7. Определитель бактерий Берджи: В 2 т.: Пер.с англ./ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. - М.: Мир, 1997. - Т. 1.-432 с. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum з інтенсивним ростом та підвищеною сапрофітною компетентністю для виробництва бактеріальних добрив для інокуляції насіння сої, депонований у Депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України за реєстраційним номером В-7435. Комп’ютерна верстка М. Шамоніна Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5