Імуномодулятори

1 Полипептид длиной самое большее в 100 аминокислотных остатков, который включает в себя следующую последовательность Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID № 19), где Х4 и Хб независимо выбраны из группы, состоящей из Met, lie, Leu и Val, и Хє выбирают из группы, состоящей из Asn, Asp, Gin и Glu, и который обладает по меньшей мере одним из нижеследующих свойств а) индуцирует ингибирование спонтанной продукции IL-8 моноцитами человека, б) индуцирует ингибирование IL-lp-индуцируемой продукции IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови человека (РВМС), в) индуцирует продукцию белка-антагониста рецептора интерлейкина-1 (IRAP) моноцитами человека, г) индуцирует in vitro хе мота кс и чес кую миграцию СD8+-T-лимфоцитов человека, д) десенсибилизирует СО8+-Т-клетки человека, приводя кареактивности в отношении rhll_-10, е) вызывает супрессию хемотаксического ответа СD4+-T-лимфоцитов человека на IL-8, ж) вызывает супрессию хемотаксического ответа моноцитов человека на MCAF/MCP-1, з) индуцирует продукцию IL-4 культивируемыми СО4+-Т-клетками здоровых людей, и) снижает продукцию TNFCC в реакции смешанных лейкоцитов человека 2 Полипептид по пункту 1, отличающийся тем, что включает в себя следующую последовательность X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID № 20), где Хз, Х4 и Хб независимо выбраны из группы, состоящей из Met, lie, Leu и Val, и Хб выбран из группы, состоящей из Asn, Asp, Gin и Glu 3 Полипептид по пункту 1, отличающийся тем, что содержит следующую последовательность X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID № 21), где Хг представляет собой Туг или Phe, Хз, Х4 и Хб независимо выбраны из группы, состоящей из Met, lie, Leu и Val, и Хб выбран из группы, состоящей из Asn, Asp, Gin и Glu 4 Полипептид по пункту 1, отличающийся тем, что включает в себя следующую последовательность Xi-X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID № 22), где Xi представляет собой Ala или Gly, Х2 представляет собой Туг или Phe, Хз, Х4 и Хб независимо выбраны из группы, состоящей из Met, lie, Leu и Val, и Хб выбран из группы, состоящей из Asn, Asp, Gin и Glu 5 Полипептид по любому из пунктов 1-4, отличающийся тем, что содержит по меньшей мере 12 аминокислот 6 Полипептид по любому из пунктов 1-4, отличающийся тем, что содержит по меньшей мере 15 аминокислот 7 Полипептид по любому из пунктов 1-4, отличающийся тем, что содержит по меньшей мере 11 аминокислот 8 Полипептид по любому из пунктов 1-4, отличающийся тем, что содержит по меньшей мере 10 аминокислот 9 Полипептид по пункту 1, отличающийся тем, что имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из О о ю 57702 4 31 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, г,, Aia-Phe-Het-Tbr-Leii-Lys-Leu-Asg-ftsn 1 SEQ ID * 3 что Хб представляет собой Asn AU-Tyr-Met-Thr-Het-Iys-Val-Arg-Clu і SEQ ID B - * . 32 Полипептид, имеющий формулу Glu-Tyc-MeC-Thr-fet-Li'S-Ile-Ars-Usp ISfcQ ID # S j , X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID № 21), Ala-Pi-e-Met-M-r-Met-Lys-Ile ftcg-Rsp ISEQ ID * 6), где Ua-Tyr-I-e-Thr-Het~Lys-Iie~Arg-asp (SEQ ID ff 7i, Хг представляет собой Туг или Phe, Ala-5yr~Leu~Thr--Het-Lys-Ile-.&rg-Asp (SEQ IB I • a ) , P Хз, Х4 и Хб независимо выбраны из группы, соSla-Tvr-Val-Thr-Met-Lys-I^e-Srg-ftsp tSEQ ID E 9i, стоящей из Met, lie, Leu и Val, и Ala~TyC-4et-Thr~Iie-LyE-I.e-Rr5-a.3p I5EQ IP P 1С) Хб выбран из группы, состоящей из Asn, Asp, Gin и Aia-ryr-MeC-Thr-Leu-Lvs-l^e-Arc-Asp (SEQ -rj к* Ш Glu Ala Tyr-Met T h r - ^ a l - L y s - I ^ e - J u r g - f i s p (SEQ ID № 12) A.a-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-firg-Asp 33 Полипептид, имеющий формулу і SEQ ID * 13) A_a-T.yr-Met-Thr-MSt-Lys-Met-Arg-Asp X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID № 20), (SEQ ID » 14) A-a-Tyc-Met-Thr-Met-bys-Vdl-AEg-Asp где і SEQ ID № 15) A~a-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glci Хз, Х4 и Хб независимо выбраны из группы, со{SEQ ID » 16) Aj-a-Tyr-Met-Shr-Met-Lys-Ile-Arg-Glu ISEQ ID & I" ) стоящей из Met, lie, Leu и Val, и Хб выбран из группы, состоящей из Asn, Asp, Gin и 10 Полипептид по пунісгу 1, отличающийся тем, Glu что он находится в чистой форме 34 Полипептид, имеющий формулу 11 Полипептид, имеющий формулу Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID № 19), Xi-X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID № 22), где где Х4 и Хб независимо выбраны из группы, состоящей Xi представляет собой Ala или Gly, из Met, lie, Leu и Val, и Х2 представляет собой Туг или Phe, Хб выбран из группы, состоящей из Asn, Asp, Gin и Хз, Х4 и Хб независимо выбраны из группы, соGlu стоящей из Met, lie, Leu и Val, и 35 Полипептид, имеющий аминокислотную поХб выбран из группы, состоящей из Asn, Asp, Gin и следовательность Glu АI а-Ту г- М et-Th г- М et- Lys12 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, (SEQ ID № 1) Ile-Arg-Asn что Xi представляет собой Ala 36 Вещество, которое представляет собой поли13 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, пептид по пункту 1, соль, сложный эфир или что Xi представляет собой Gly конъюгат указанного полипептида 14 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, 37 Вещество по пункту 36, отличающееся тем, что Хг представляет собой Туг что конъюгат представляет собой конъюгат сахар15 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, ного остатка или конъюгат полиэтиленгликоля что Хг представляет собой Phe указанного полипептида 16 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, 38 Вещество по пункту 36, отличающееся тем, что Хз представляет собой Met что обладает по меньшей мере одним из свойств 17 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, (а)-(и), указанных в пункте 1 что Хз представляет собой Не 39 Полипептид, который включает в себя амино18 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, кислотную последовательность, представленную что Хз представляет собой Leu в любом из пунктов 1-35, при условии, что поли19 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, пептид не является IL-10 человека что Хз представляет собой Val 40 Молекула ДНК, кодирующая полипептид по 20 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, пункту 1 что Х4 представляет собой Met 41 Антитело, которое специфически связывается 21 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, с полипептидом по пункту 1 что Х4 представляет собой Не 42 Антитело по пункту 41, отличающееся тем, 22 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, что оно специфически связывается с полипептичто Х4 представляет собой Leu дом, имеющим формулу 23 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, что Х4 представляет собой Val Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (SEQ ID № 19), где 24 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, Х4 и Хб независимо выбраны из группы, состоящей что Хб представляет собой Met из Met, lie, Leu и Val, и 25 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, Хб выбран из группы, состоящей из Asn, Asp, Gin и что Хб представляет собой Не Glu 26 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, 43 Антитело по пункту 42, отличающееся тем, что Хб представляет собой Leu что оно специфически связывается с полипепти27 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, дом, имеющим формулу что Хб представляет собой Val АI а-Ту г- М et-Th г- М et- Lys-11 e28 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, что Хб представляет собой Asp Arg-Asn (SEQ ID № 1) 44 Антитело по пункту 42, отличающееся тем, 29 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, что оно специфически связывается с полипептичто Хб представляет собой Gin дом, выбраным из группы 30 Полипептид по пункту 11, отличающийся тем, что Хб представляет собой Glu Ala Туг M e t - T m r - T l e - L y s - M e t - A r g - A s ISEQ ID № 1 1 57702 Ala Tyr Met-Tmr-Tle-Lys-Met-Arg-Asaia-Phe-Het-Thr-Leii-Lys-Leu-Asg-ftsn AU-Tyr-Met-Thr-Het-Iys-Val-Arg-Clu Glu-Tyc-MeC-Thr-fet-Li'S-Ile-Ars-Usp Ala-Pi-e-Met-M-r-Met-Lys-Ile ftcg-Rsp ISEQ ID № г,, 1 SEQ ID * 3 і SEQ ID B * , ID # S j , I SEQ ID * 6), (SfcQ (SEQ ID ff (SEQ IB I P 7i, •a), Ala-Tvr-Val-Thr-Met-Lys-I^e-Arg-Asp tSEQ ID E 1 91, Ala-Tyr-4et-Thr-Iie-LyE-I.e-Arg-a.3p I5EQ IP P 1С) (SEQ ГС I P Ш Thrr-^al-Lys-I^e-Arg-fisp (SEQ ID № 12) A.a-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-firg-Asp і SEQ ID * 13) A_a-T.yr-Met-T^r-Met-Lys--Met-Arg~Asp (SEQ ID » 14! A-a-Tyc-Met-Thr-Met-bys-Val-AEg-Asp {SEQ ID № 15) A^a-Tvr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glci {SEQ ID » (SEQ ID F* 16) I"*} Ala Tyr-Met A-i_a—Туf—met-Tnr—Met—Lys-lie—A£g-Glu 45 Антитело по любому из пунктов 41-44, отличающееся тем, что способно нейтрализовать по меньшей мере одну из активностей (а)-(и), указанных в пункте 1 46 Антитело по любому из пунктов 41-45, отличающееся тем, что представляет собой политональное антитело 47 Антитело по любому из пунктов 41-45, отличающееся тем, что представляет собой моноклональное антитело 48 Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из пунктов 41 -47 49 Способ ослабления или нейтрализации высоких концентраций hlL-Ю и/или vlL-Ю, включающий применение антитела по любому из пунктов 41 -47 50 Способ лечения и/или предупреждения рака яичника и/или СПИДа, включающий введение пациенту терапевтически или профилактически эффективного количества антитела по любому из пунктов 41-47 51 Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по пункту 1 52 Полипептид по пункту 1, отличающийся тем, что его применяют для лечения или профилактики заболевания, выбранного из группы, состоящей из преждевременных родов, вызванных инфекцией или другими состояниями, ревматоидного артрита, артрита Лима, подагры, септического синдрома, гипертермии, неспецифического язвенного колита или энтероколита, остеопороза, цитомегаловируса, заболевания периодонта, гломерулонефрита, хронического неинфекционного воспаления легких, образования гранулемы, фиброза печени, фиброза легких, отторжения трансплантата, заболевания "трансплантат против хозяина", хронического миелоидного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, других неопластических заболеваний, бронхиальной астмы, сахарного диабета Настоящее изобретение относится к фармацевтическому использованию вещества, которое представляет собой агонист интерлейкина 10 (IL10), в частности, к использованию вещества для производства фармацевтического препарата для предупреждения и/или лечения заболеваний, патогенез которых связан со снижением образования и/или функции медиаторов иммуноподав типа 1 (инсулинзависимого), артериосклероза/атеросклероза, псориаза, хронического Влимфоцитарного лейкоза, общей вариабельной иммунной недостаточности, побочных действий других модификаторов биологического ответа, диссеминированной внутрисосуд истой коагуляции, системного склероза, энцефаломиелита, воспаления легких, синдрома гипер-ІдЕглобулинемии, энтероколитов, ракового метастазирования и роста, адоптивной иммунной терапии, приобретенного респираторного дистресссиндрома, сепсиса, реперфузионного синдрома, постхирургического воспаления, трансплантации органов и алопеции 53 Полипептид по пункту 1, отличающийся тем, что его применяют для производства фармацевтической композиции для лечения или предупреждения одного или более заболеваний, указанных в пункте 52 54 Способ лечения и/или предупреждения одного или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из преждевременных родов, вызванных инфекцией или другими состояниями, ревматоидного артрита, артрита Лима, подагры, септического синдрома, гипертермии, неспецифического язвенного колита или энтероколита, остеопороза, цитомегаловируса, заболевания периодонта, гломерулонефрита, хронического неинфекционного воспаления легких, образования гранулемы, фиброза печени, фиброза легких, отторжения трансплантата, заболевания "трансплантат против хозяина", хронического миелоидного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, других неопластических заболеваний, бронхиальной астмы, сахарного диабета типа 1 (инсулинзависимого), артериосклероза/атеросклероза, псориаза, хронического В-лимфоцитарного лейкоза, общей вариабельной иммунной недостаточности, побочных действий других модификаторов биологического ответа, диссеминированной внутрисосуд истой коагуляции, системного склероза, энцефаломиелита, воспаления легких, синдрома гипер-ІдЕ-глобулинемии, энтероколитов, ракового метастазирования и роста, адоптивной иммунной терапии, приобретенного респираторного дистресс-синдрома, сепсиса, реперфузионного синдрома, постхирургического воспаления, трансплантации органов и алопеции, включающий введение пациенту терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида по пункту 1 ления, главным образом цитокинов, и/или связано с увеличением образования и/или функции определенных иммуновоспалительных медиаторов, главным образом цитокинов В частности, изобретение относится к использованию вещества настоящего изобретения для производства фармацевтического препарата для предупреждения и/или лечения аутоиммунных заболеваний 57702 (сахарный диабет, тип 1, воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта, ревматоидный артрит, подагрический артрит (подагра), кожная аллергия? аллергические реакции на коже, в легких и дыхательных путях (в том числе, бронхиальная астма), повреждение ткани в результате гипоксии/ишемии (инфаркт, реперфузия), атеросклероз, псориаз, гранулематозные заболевания, хронический миелоидный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, рак, реакция "трансплантант против хозяина" и состояния, связанные с отторжением трансплантанта, фиброз легких, фиброз печени, хроническое неинфекционное воспаление легких, гломерулонефрит, преждевременные роды, периодонтит, воспалительные реакции, связанные с вирусными инфекциями, остеопорозом, септическим шоком) и/или для производства противозачаточного средства Известный уровень техники Исследования последних двух десятилетий показали, что стимуляция, регуляция и прекращение воспалительных реакций, также как и регуляция роста и дифференцировки в рамках организма млекопитающих, находятся под строгим контролем особой группы сигнальных полипептидов с общим названием цитокины Цитокины представляют собой полипептиды, которые могут быть продуцированы большинством ядерных клеток, и которые передают регуляторные сигналы между клетками, создавая, таким образом, коммуникационную сеть между идентичными или различными типами клеток организма Цитокины являются очень сильными медиаторами и активны при концентрациях, ниже 10 15 М Цитокины являются также ключевыми факторами для развития иммунных реакций, которые в свою очередь создают основу для клинических проявлений воспалительного процесса, связанного с инфекцией, аллергией, травмой, реакциями "трансплантант против хозяина" и аутоиммунными заболеваниями Аллергические и аутоиммунные заболевания объясняли аномалиями в иммунной системе, главным образом в иммунитете, опосредованном Т-лимфоцитами, хотя обычно эти заболевания имеют неизвестную этиологию В исследованиях ин витро, в экспериментах на животных и клинических экспериментальных исследованиях было показано, что цитокины играют важную патофизиологическую рольв отношении воспалительных реакций, связанных с аутоиммунными заболеваниями, аллергией, ишемией, реперфузионном повреждении, травме, инфекциях, и важны для развития опухоли, атеросклероза, развития беременности и плода, костного гомеостаза Цитокины могут быть вовлечены в другие иммуновоспалительные и пролиферативные заболевания, также описанные достаточно подробно ниже Указанные заболевания обычно являются хроническими и лечение является паллиактивным, т е большинство лекарств, прописанных в связи с указанными заболеваниями, направлены на ослабление симптомов и обычно не обладают лечебным эффектом Другие способы лечения представляют собой так называемые восстано 8 вительные терапии, которые предполагают долговременное поддержание пациента веществами, например гормонами, необходимыми вследствие сниженного/недостаточного внутреннего образования указанного вещества Указанные способы лечения зачастую неудовлетворительны, из-за нежелательных и часто серьезных побочных эффектов, и скорее только замедляют, а не предотвращают развитие болезни Поэтому крайне необходимы усовершенствованные способы лечения и улучшенные фармацевтические препараты Интерлейкин-10 (IL-10) является недавно описанным естественным эндогенным иммуносупрессивным цитокином, идентифицированным в организме мышей и человека Мышиный интерлейкин 10 (мИЛ-10) первоначально описали как фактор, ингибирующий синтез цитокина, высвобождающийся из клонов ТНг-хелперных Тклеток, но он также обладает пролиферативными воздействиями на различные субклассы лимфоцитов, в том числе усиливающим действием на эффективность клонирования CD-, CD8+-Tклеток селезенки мыши (4) Недавно человеческий интерлейкин-10 (чИЛ-10) секвенировали и обнаружили его высокую гомологию на уровне последовательности ДНК, также как и на аминокислотном уровне, с мИЛ-10 Кроме того, недавно секвенировали свиной интерлейкин-10 и обнаружили его высокую гомологию на уровне последовательности ДНК, также как и на аминокислотном уровне, с человеческим ИЛ-10 (88), смотри также Фигуру 2 чИЛ-10 обладает также высокой гомологией с открытой рамкой считывания генома вируса Эпштейна-Барр, BCBF1, а вирусный ИЛ-10 проявляет некоторую активность сходную с чИЛ-10, сравни Фиг 1 (5) Человеческий ИЛ-10 вырабатывается активированными Т-клетками и иммортализованными В-клетками и помимо своего цитокина синтезируют ингибирующий фактор (С S IF), подавляющий образование нескольких провоспалительных цитокинов и колониестимулирующих факторов, который также стимулирует образование мононуклеарными клетками белок/пептидного (ХВАР) антагониста рецептора интерлейкина-1, косвенно ингибируя таким образом активность ИЛ-1 ИЛ-10 также снижает регуляцию своего собственного образования с помощью моноцитов и подавляет экспрессию молекул класса П экспрессируемого МНС (12) Далее, чИЛ-10 понижает антигенспецифичную пролиферацию человеческих Тклеток и клонов СО4+-Т-клеток при использовании моноцитов в качестве антигенпрезентирующих клеток Опыты ин виво на мышах свидетельствуют, что исход заражения лейшманией зависит от профиля цитокина из соответствующих СО4+-Т-лимфоцитов (13) У мышей C57BL/6, резистентных к инфекции лейшманией, СО4+Т-клетки из дренированных лимфоузлов нуждаются в регуляции цитокинами у-ИФН- и ИЛ-2, тогда как чувствительные к этой инфекции мыши BALB/C в своих дренированных лимфоузлах содержат СD4+-T-клетки, высвобождающие ИЛ-4 и ИЛ-10, которые могяи бы отражать корреляцию с прогрессирующим заболева 57702 ниєм (13) Таким образом, ИЛ-10 может оказывать сильный регуляторный эффект на иммунологические ответы в условиях ин витро и ин виво Кроме того, ИЛ-10 сильно влияет на биологию хемокина, поскольку человеческий интерлейкин-10 представляет собой специфиче+ ский хемотаксический фактор для СD8 -T-клеток, + так как ИЛ-10 супрессирует способность CD4 -T+ клеток, но не СD8 -T-клеток, перемещаться в ответ на хемотаксический цитокин ИЛ-8 Т-клеток (14) ИЛ-10 ингибирует также хем отаке и чес кое действие других хемокинов -MCP-1/MCAF и RANTES (75) Так как ИЛ-10 является дезактиватором функций моноцита/-макрофаза и ингибитором Тп 1-активности, лекарства с полной или частичной ИЛ-10-подобной активностью могут обладать терапевтическим действием в отношении заболеваний, характеризующихся дисбалансом в образовании цитокина и/или уровня его активности Раньше предлагали готовить фармацевтические препараты, включающие чИЛ-10 или вИЛ-10, и использовать чИЛ-10 или вИЛ-10 для производства фармацевтического препарата, предназначенного для лечения различных состояний, таких как септический или токсический шок, ревматоидный артрит, реакция "трансплантант против хозяина", отторжение ткани, сахарный диабет, аутоиммунные нарушения, лейкоз и рак, раскрытого, например, в WO093/02693 и WO94/04180 Кроме того, антагонисты ИЛ-10, например антитела специфически связывающиеся с ИЛ-10, раскрытые, например, в ЕР 405980 и WO94/06473, относительно которых предположили, что такие антитела могли бы быть применены для лечения пациентов, инфицированных ВИЧ Краткое изложение существа изобретения В соответствии с настоящим изобретением установлено, что вещество, отличное от человеческого интерлейкина-10, которое обладает одним или большим числом нижеследующих свойств a) индуцирует подавление ИЛ-8, спонтанно образуемого человеческими моноцитами, b) индуцирует подавление ИЛ-10, индуцирующего образование ИЛ-8 мононуклеарными клетками периферической крови человека (РВМС), c) индуцирует образование человеческими моноцитами белка, антагонистичного рецептору интерлейкина-1 (IRAP) d) индуцирует ин витро хемотаксическую миграцию CD8+ человеческих Т-лимфоцитов в условиях ин витро, e) десенситизирует человеческие CD8+-Tклетки, влияя на их толерантность к рчИЛ-10, f) супрессирует хемотаксический ответ CD4+ человеческих Т-лимфоцитов к ИЛ-8, д) супрессирует хемотаксический ответ человеческих моноцитов к MCAF/MCP-1, п) не подавляет на человеческих моноцитах экспрессию молекул МНС класса П, в противоположность человеческому ИЛ-10, і) индуцирует образование ИЛ-4 при культивировании СО4+-Т-клеток здоровых людей 10 j) снижает образование a-TNF в реакции смешанной культуры лейкоцитов человека, такой как полипептид, который включает в себя аминокислотную последовательность Ала-Тир-МетТре-Мет-Лиз-Иле-Арг-Асп или аналог или вариант указанной последовательности (нонапентид с последовательностью, гомологичной чИЛ-10, названный IT9302), а его производные могут быть использованы для предупреждения и/или лечения некоторых форм воспалительных процессов, в частности форм, связанных с иммунной и/или гормональной системами Предположено (как это подробно описали в нижеследующем описании иммунологических механизмов), что действие механизма осуществляется в результате нарушения действия медиаторов иммунной системы, в частности цитокинов, таких как монокины, лимфокины, хемокины и антагонистов рецепторов монокинов, т е что вещество настоящего изобретения нарушает/супрессирует образование и/или действие некоторых цитокинов и таким образом подавляет патологические процессы, приводящие к повреждению ткани, и что вещество настоящего изобретения индуцирует образование естественных антагонистов рецепторов монокинов, нарушая/супрессируя таким образом действие некоторых цитокинов, ингибируя тем самым патологические процессы, которые приводят к повреждению ткани Важность осуществления настоящего изобретения связывают, поэтому с фармацевтическим препаратом, включающим в себя, в качестве активного ингредиента, вещество настоящего изобретения Другие варианты осуществления настоящего изобретения связывают с веществом, которое обладает способностью нейтрализации одного или большего числа вышеупомянутых действий а) - д), например антителом и фармацевтическим препаратом, включающим в себя такое вещество Другая цель настоящего изобретения связана с использованием вещества настоящего изобретения для промышленного производства фармацевтического препарата, в значительной мере ингибирующего биологическое действие, вызванное цитокином, т е использование вещества настоящего изобретения в качестве белокпептид-антагониста рецептора ИЛ-1, лимфокина, монокина, интерлейкина, интерферона, хемокина или колониестимулирующего фактора Очередная цель связана с использованием вещества настоящего изобретения для промышленного производства фармацевтического препарата для профилактики или лечения состояния, связанного с расстройством цитокиновой системы, т е белок/пептид-антагонистом рецептора ИЛ-1, лимфокина, монокина, интерлейкина, интерферона, хемокина или системы колониестимулирующего фактора Следующая цель настоящего изобретения связана также со способом лечения состояния у людей, вызванного расстройством цитокиновой системы, способом, который включает в себя введение индивидууму эффективного количества вещества настоящего изобретения Клеточная иммунная система частично от 57702 12 11 ветственна за такие нарушения как инфекции, ниях) воспалительная реакция и неопластические заДиссеминированная внутрисосудистая коаболевания Иммунокомпетентные клетки и их гуляция (DIC) продукты могут играть важную роль в стимуляАртериосклероз (атеросклероз) ции, развитии и возможной хронической природе Шок (например, при грам-отрицательном сеппроявления воспалительных состояний Этиолосисе) гия этих нарушений часто неизвестна и предКахексия (например, при раке, хронических ставлена обычными заболеваниями, такими как инфекционных и хронических воспалительных сахарный диабет, воспалительные заболевания заболеваниях) желудочно-кишечного тракта и кожи Кроме этих Отторжение трансплантанта и реакция примеров, клеточно-опосредованныи иммунитет "трансплантант против хозяина" или провоспалительные медиаторы способствуЦитокины ют возникновению других воспалительных и проТ-лимфоциты организовывают индукцию и лиферативных заболеваний (смотри Таблицу 2) регуляцию клеточно-опосредованных иммунных реакций, а цитокиновые продукты (лимфокины) Таблица 2 Т-клеток инициируют и контролируют иммунный Некоторые заболевания, в которых наблюответ (1,2) Медиаторы, активированные лимфодаются иммунные реакции, опосредованные цитами (лимфокины), образованные антигенмакрофагами/Т-лимфоцитами, считающиеся папрезентирующими клетками, относятся к группе тогенетически тяжелыми полипептидов, называемых цитокинами ЦитокиКожные заболевания ны являются посредниками общения между клетПсориаз ками в физиологических и патофизиологических Атопический дерматит условиях, но могут также функционировать в каКонтактный дерматит честве гормонов, обеспечивая сигнализацию Кожная Т-клеточная лимфома (CTCL) между иммунной системой и другими тканями и Пузырчатка обыкновенная органами Цитокины могут быть получены через, Синдром Сезари поверхность клеток иммунной системы и соверПемфигоид буллезный шенно ясно, что все ядерные клетки обладают Эритема узловатая способностью продуцировать один или несколько Склеродермия цитокинов Поэтому, например кератиноциты и Аутоиммунные (в том числе, ревматические) фибробласты являются основными продуцентазаболевания ми цитокинов и в данной системе цитокины могут Увеит функционировать в качестве аутокринных и паБолезнь Бехчета ракринных гормонов независимо от иммунной Саркоидоз Бека системы (3) Синдром Шегрена Ревматоидный артрит Интерлейкин-10 Детский ревматоидный артрит Мышиный интерлейкин-10 (мИЛ-10) первоначально описали как фактор, ингибирующий синСиндром Рейтера тез цитокина (CSIF), высвобождаемый из клонов Артрит подагрический ТЬЬ-хелперных Т-клеток, который обладал также (Остео) артроз пролиферативным действием на различные субВолчанка красная классы лимфоцитов, в том числе усиливающим Полимиозит действием на эффективность клонирования CD4Миокардит , 8+-Т-клетки селезенки мышей (4) Описанный Первичный биллиарный цирроз недавно человеческий интерлейкин-10 (чИЛ-10) Болезнь Крона (5), обладает высокой гомологией с открытой Колит язвенный рамкой считывания генома вируса ЭпштейнаМножественный склероз и другие демиелиБарр, BCRF1, но вирусный ИЛ-10 не проявляет низирующие заболевания какой-либо активности сходной с чИЛ-10 Ниже Апластическая анемия следует краткое изложение биохимической, биоИдиопатическая тромбоцитопеническая пурлогической, физиологической и предполагаемой пура патофизиологической роли ИЛ-10 Множественная миелома и В-клеточная лимфома Структура ИЛ-10 Пангипопитуитаризм Симмондса Первичные структуры мышиного (мИЛ-10) и человеческого ИЛ-10 показывают высокую стеБолезнь Грейвса и офтальмопатия Грейвса пень гомологии нуклеотидных последовательноПодострый тиреоидит и хронический лимфостей (>80%) по всей их длине (4,5) Значительматозный тиреоидит (зоб Хасимото) ным отличием является инсерция элемента Болезнь Аддисона человеческой Alu- повторяющейся последоваИнсулинзависимый сахарный диабет (тип 1) тельности в З'-нетранслируемую область клона Другие заболевания кДНК чИЛ-10 Очень сходные открытые рамки Различные клинические синдромы с васкулисчитывания (ОРС) кДНК мИЛ-10 и кДНК чИЛ-10 тами (например, полиартериит нодозный, Вегекодируют последовательности из 178 аминокиснера гранулематоз, гигантоклеточный артериит) лот, в том числе гидрофобные лидерные послеЛихорадка, недомогание довательности, соответствующие 73% аминокисАнорексия (например, при острых и хроничелотной гомологии мИЛ-10, который активен в ских воспалительных и инфекционных заболева 57702 14 13 мышиных клетках, в человеческих клетках не да цитокинов, в том числе у-интерферона (уобладают большой перекрестной реактивностью ИФН), фактора а некроза опухолей (TNF-a), грачИЛ является/полипептидом с мол массой 18кД, нулоцитно-макрофагального колониестимулив котором не обнаруживаются углеводы, а мИЛрующего фактора (ГМ-КСФ), гранулоцитного КСФ 10 гликозилирован по сайту, расположенному (Г-КСФ), ИЛИ а, ИЛИр, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8 и хемовозле его Н-конца, который утрачен чИЛ-10 И таксического полипептида-1 моноцитов (МСРмИЛ-10 и рекомбинантный чИЛ-10 (рчИЛ-10) экс1 /MCAF) ИЛИ 0 подавляет также способность прессируются в виде нековалентных гомодимемоноцитов к миграции как ответ на хемокин ров Уровень биологической активности мономеMCP/MCAF (75) Далее, чИЛ-10 индуцирует обров мИЛ-10 или чИЛ-10 еще не определили разование эндогенного антагониста (IRAP) реСогласно данным, опубликованным Moore et al, цептора естественного интерлейкина-1 (6), котокоторые первыми секвенировали последоварый ингибирует ИЛИ а и ИЛИ р в результате тельность человеческого ИЛ-10 (6), мИЛ-10 и конкурентного связывания рецептора Поскольку чИЛ-10 с полипептидными "метками", как миниИЛ-8 сильно индуцируется с помощью ИЛИ а и мум из 8 аминокислот на N-конце и 21 аминокисИЛИр, ИЛ-10 оказывает определенное ингибилоты на С-конце, не обнаруживают потери активрующее действие на образование ИЛ-8, стимуности Меченье С- и N-концов целого ИЛ-10 не лируя образование IRAP, антагониста рецептора обязательно вызывает функциональные изменеИЛИ Этот последний механизм очень важен для ния, поскольку меченье является случайным или настоящего изобретения и иллюстрируется нинесущественным Большое число возможных жеследующим примером IBAP обладает протиаминокислотных замен, о которых подробно извовоспалительным действием (9), и было выскаложено ниже, может также объяснить, отчего зано предположение о его терапевтическом меченьем не удается показать потерю функций действии на ревматоидный артрит (10) IRAP Рекомбинантные мИЛ-10 и чИЛ-10 экспрессиротакже оказался эффективен при лечении септивали в клетках CDS7, клетках миеломы мыши, ческого синдрома и проявил дозовую зависиовариальных клетках китайского хомячка, бакумость, а в исследовании Fisher et ol (11) 28ловирусной экспрессионной системе, и Е colL дневный благоприятный исход увязали с примеБиологическое действие этих рИЛ-10-белков до сих пор не различают (6) нением IRAP (p=0,015) IRAP проявляет определенное противовоспалительное действие в реГен мИЛ-10 содержит в себе пять экзонов, зультате ингибирования образования хемокина, протянувшихся, примерно, более чем на 5,1 такого как ИЛ-8 т п н ДНК Сам геномный клон кодирует экспресИЛ-10 и экспрессия антигена сируемый мИЛ-10 белок Гены мИЛ-10 и чИЛ-10 ИЛ-10 подавляет экспрессию МНС класса П расположены, соответственно, на 1-й хромосоме на человеческих моноцитах (8) Экспрессия HLAмыши и 1-й хромосоме человека (6,7) DR/DP и DQ, конститутивно индуцированная ИЛмЙЛ-10 и чИЛ-10 проявляют высокую гомо4 или у -ИНФ, была подавлена с помощью чИЛлогию нуклеотидных последовательностей ДНК, 10 (12) Кроме того, моноциты, преинкубировани аминокислотных последовательностей, с отные с ИЛ-10, приобретают резистентность к покрытой рамкой считывания в геноме вируса Эпследующей индукции, с помощью ИЛ-4 или уштейна-Барр, BCRF1, ограниченную гомологию ИФН, экспрессии МНС класса П ИЛ-10 подавляпоследовательности, кодирующей зрелый белок, ет экспрессию МНС класса П с помощью челочеи не обнаруживают гомологии в сигнальной поских моноцитов после их активации LPS (12,76) следовательности или 5'- и З'-нетранслируемых Мыши BALB/c, получившие 1-10мг ИЛ-10 вместе последовательностях (5) Из трех последовтс летальной дозой LPS были защищены от гибелеьностей, мИЛ-10 и чИЛ-10 являются наиболее ли (6) близкой парой по уровню последовательности ИЛ-10 подавляет образование промежуточДНК (81%), тогда как последовательности ДНК, ных соединений азота и супероксидных анионов кодирующие зрелые белки чИЛ-10 и DCRF1, ИЛИ 0 подавляет также реакционную способимеют 7 1 % гомологии Гомология на аминокисность промежуточного соединения азота (NO), лотном уровне между чИЛ-10 и BCRF1 составляподобно тому, как реакционная способность проет 84% Предполагается, что гены мИЛ-10 и чИЛ10 эволюционировали от общего предка, тогда межуточных соединений кислорода (Н2О2) покак BCRF1 представляет сохраненный клеточный давляется макрофагами после их активации уцитокиновый предковый ген в процессе становИНФ (13) ления, и это ограничило сходство BCRF1-белка с ИЛ-10 и активность Т-клеток чИЛ-10 BCRF1 экспрессируется в течение литиИЛ-10 обладает также модулирующим дейческого цикла EBV ОРС BCRF1 кодирует секрествием на функции/активность Т-клеток Поэтотируемый полипептид с мол массой 17кД, котому, чИЛ-10 является потенциальным хемотаксирый, подобно чИЛ-10, содержит мало углеводов ческим фактором для СО8+-Т-лимфоцитов, и не и не гликозилирован BCRF1 проявляет некотообнаруживает хемотаксиса в отношении CD4+-Tрые черты ИЛ-10 и был назван вирусным ИЛ-10 клеток (14) Кроме того, ИЛ-10 супрессирует спо(вИЛ-10), хотя как установлено, его активность собность СО4+-Т-клеток отвечать на хемотаксисоставляет 10% от чИЛ-10 ческие сигналы р-хемокина RANTES, как и ахемокина ИЛ-8 чИЛ-10 также непосредственно Действие ИЛ-10 на образование цитокинов ингибирует пролиферацию Т-клеток периферичИЛ-10 с помощью моноцитов/макрофагов ческой крови человека и клоны СО4+-Т-клеток и/или Т-лимфоцитов подавляет образование ря 15 (14) ИЛ-10 и В-лимфоциты чИЛ костимулирует пролиферацию Влимфоцитов, индуцированную перекрестно связанными поверхностными Ig с иммобилизованными анти-lg М-антителами и этот эффект усиливается, когда В-клетки стимулируют перекрестно связывающими их CD4Oантигенами с анти- CD4O -антителами и мышиными L-клетками, экспрессирующими FcyRn/CD32 человека (15) Действие ИЛ-10 на пролиферацию и дифференциацию активированных человеческих В-клеток дает основание предполагать, что этот цитокин намного улучшает способность Т-клеток экспрессировать чИЛ-10, содействующего ответам В-клеток ИЛ-10 как гомеостатический фактор иммунной системы Физиологическими следствиями функционирования ИЛ-10, рассмотренного выше, очевидно будет достижение иммунной системой некоторого гомеостаза Так, ИЛ-10 определенно ингибирует функции хелперных Т-клеток и, повидимому, стимулирует Т-клетки с супрессорными функциями В этой связи очевидно, что ИЛ-10, подобно ИЛ-4, регулирует равновесие между цитокиновыми профилями Тп1 и Тп2 Т-клеток В частности очевидно, что ИЛ-10 подавляет дифференциацию Тп1 -клеток Поскольку Тп1 -клетки продуцируют цитокины (у-ИФН и ИЛ-2), которые благоприятствуют клеточно-опосредованным иммунным ответам, а Тп2-клетки вырабатывают цитокины (ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-10), которое благоприятствуют гуморальному ответу и супрессируют клеточно-опосредованныи иммунный ответ ИЛ-10 вероятно супрессирует, опосредованную Т-клетками иммунную реакцию, такую как реакция гиперчувствительности замедленного типа, а она благоприятствует гуморальным ответам Следствием характеристик ИЛ-10, рассмотренных выше, является описанная ранее активность ИЛ-10, ингибирующая синтез макрофагов и Thi-цитокина В этом связи проанализировали, действительно ли недостаток образования и/или активности может играть роль в заболеваниях, в которых усиление клеточно-опосредованнои иммунорективности определенно влияет на такие заболевания как аутоиммунные и воспаление Мыши, подвергавшиеся обработке анти-ИЛ-10антителами, проявляют сильнейший воспалительный ответ на монокин, индуцирующий воспаление, и значительно больше подвержены гибели, вызванного LPS-индуцированным септическим шоком, воспалительной реакцией, опосредованной монокином (16) ИЛ-10 вызывает также у мышей сильнейшую спонтанно развивающуюся кишечную воспалительную реакцию, подобную той, которая имеет место при неспецифическом язвенном колите (17) Кроме того, исследовали возможную роль ИЛ-10 в различных паразитарных, микробактериальных или вирусных инфекциях и показали, что ИЛ-10 играет патофизиологическую роль при параличе иммунной системы, связанной с инфекцией Schistosoma monsoni (18) Такая же его роль предполагается при Myco-bactenum leprae Недавно установлено, 57702 16 что больные СПИД'ом с неблагоприятным прогнозом имеют в плазме крови очень высокий уровень ИЛ-10, который, как предполагается, усиливает паралич иммунной системы, вызванный СПИД (19) Терапевтическая ценность Эти результаты/данные, полученные ин виво, дают большое основание предполагать гомеостатическое значение ИЛ-10 в регуляции клеточно-опосредованного и усиленного монокином иммунного воспаления и указывают на возможность широкого терапевтического применения ИЛ-10 или лекарственного средства с ИЛ-10подобным действием при лечении заболеваний, которые характеризуются уменьшенным/недостачным образованием и/или активностью ИЛ-10 Поскольку вещество настоящего изобретения иллюстрируется IT9302, осуществляющему действие, подобное ИЛ-10, в результате 1) индукции образования IRAP человеческими моноцитами, 2) подавления спонтанного образования ИЛ8 человеческими моноцитами, 3) подавления стимулированного ИЛ-1р образования ИЛ-8 с помощью мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), 4) стимуляция хемотаксической миграции CD8+, но не CD4+, человеческих Т-лимфоцитов, 5) десенситизации человеческих CD8*-Tклеток, предназначенных для индуцированной ИЛ-10 хемотаксической миграции 6) подавления, опосредованного ИЛ-8, хемотаксиса СО4+-Т-клеток человека, и 7) подавления, опосредованного МСР1/MCAF, хемотаксиса человеческих моноцитов, 9) индукции образования ИЛ-4 путем культивирования СО4+-Т-клеток здоровых людей, 9) снижения образования TB/F-a в реакции смешанной культуры лейкоцитов человека, этот полипептид и его аналоги могут таким образом обладать теми же терапевтическими возможностями, что чИЛ-10 В Таблице 3 приведен перечень некоторых заболеваний, в отношении которых иммуномодулятор, подобный ИЛ-10, или иммуномодулятор с активностью подобной ИЛ10, имеет важное терапевтическое значение Таблица 3 Некоторые заболевания, в отношении которых иммуномодулятор с действием, подобным ИЛ-10, связанным с его индукцией образования IRAP и/или подавлением образования цитокина и/или активностью может иметь терапевтическое значение (ссылки 20-74) Преждевременные роды, вызванные инфекцией или другими состояниями Ревматоидный артрит Артрит Лима Подагра Септический синдром Гипертермия Неспецифический язвенный колит или энтероколит Остеопороз Цитомегаловирус Заболевания периодонтитом 57702 18 17 Гломерулонефрит тов, полученных в химическом синтезе, на наличие ИЛ-10-подобной активности, установили, что Хроническое, неинфекционное воспаление синтетический нонапептид, ІТ9302, обладает легких (например, саркоидоз и легкие курильщинесколькими иммуно-супрессивными активнока) стями, имитирующими чИЛ-10, которые подробно Образование гранулемы описаны в нижеследующих примерах ІТ9302 Фиброз печени соответствует нонапептидной последовательноФиброз легких сти со стороны N-конца чИЛ-10 со следующей Отторжение трансплантанта аминокислотной последовательностью Заболевание "трансплантант против хозяина" |\ІН2-Ала-Тир-Мет-Тре-МетХронический миелоидный лейкоз Лиз-Иле-Арг-Асн-СООН (SEQ ID NO 1) Острый миелоидный лейкоз ІТ9302 обладает 100%-й гомологией с сегментом чИЛ-10, соответствующего аминокислоДругие неопластические заболевания там с № 152 по № 160, находящимся на С-конце Астма бронхиальная Кроме того, эта полипептидная последовательДиабет сахарный, тип 1 (инсулинзависимый) ность имеет 6 аминокислот, общих с соответстАртериосклероз/атеросклероз вующей областью вирусного вИЛ-10, смотри ФиПсориаз гуры 1 и 2, которые означают, что 6 из 9 или 66% Хронический В-лимфоцитарный лейкоз указанных здесь аминокислот являются гомолоОбщая иммунная недостаточность гами, а 4 аминокислоты являются общими с мИЛПобочное действие других модификаторов 10, т е 4 из 9 или 44% Этот нонапептид предбиологического ответа ставляет собой единственную последовательДиссеминированная внутрисосудистая коаность, полученную или извлеченную из чИЛ-10, и гуляция (крови) исследованную к настоящему времени, которая Системный склероз обладает специфическими свойствами, предЭнцефаломиелит ставленными в примерах До обсуждения этих Воспаление легких особенностей авторами настоящего изобретеСиндром ІдЕ-гиперглобулинемии ния, нет смысла рассматривать эту последоваЭнтероколиты тельность в качестве функционального домена Метастазы рака и новообразования Адоптивная иммунная терапия Поэтому, в соответствии с общей целью, настоящее изобретение относится к веществу, коПриобретенный респираторный дистрессторое проявляет активность агониста ИЛ-10, т е синдром веществу, которое отличается от человеческого Сепсис интерлейкина-10 одним или несколькими нижеРеперфузионный синдром следующими свойствами Постхирургическое воспаление Трансплантация органов a) индуцирует подавление ИЛ-8, спонтанно образующегося моноцитами человека, Алопеция Детальное описание изобретения b) индуцирует подавление, обусловленного ИЛ-1р, образования ИЛ-8 мононуклеарными Создание нонапептидного ИЛ-10-гомолога с клетками периферической крови человека ИЛ-10-подобной активностью (РВМС), Отдельные последовательности чИЛ-10 имеющие длину в 9 аминокислот, отобрали, наc) индуцирует образование человеческими сколько это возможно, в соответствии с принцимоноцитами белка, антагонистичного рецептору пом, по которому последовательности вИЛ-10 и интерлейкина-1 (IRAP), чИЛ-10 должны обладать высокой гомологией d) индуцирует хе мота кс и чес кую миграцию между собой, а с мИЛ-10-низкой гомологией Эта CD8+ человеческих Т-лимфоцитов в условиях ин стратегия основана на том факте, что вИЛ-10 витро, отчасти перекрестно реагирует с чИЛ-10, а мИЛe) десенситизирует человеческие CD8+-T10 не реагирует перекрестно с чИЛ-10 (смотри клетки, влияя на их толерантность кчИЛ-10, выше) Поэтому, последовательности чИЛ-10, f) супрессирует хемотаксический ответ CD4+ ответственные за некоторые действия в оргачеловеческих Т-лимфоцитов к ИЛ-8, низме человека, могут быть расположены в обд) супрессирует хемотаксический ответ челастях, где имеется высокая гомология между ловеческих моноцитов к MCAF/MCP-1, чИЛ-10 и вИЛ-10, а низкая - в отношении мИЛ-10 п) не ингибирует экспрессию молекул МНС Предполагается, что сигнальный полипептид класса П, в противоположность человеческому чИЛ-10 состоит, скорее всего, из 18 аминокислот ИЛ-10, Зрелый белок начинается с аминокислоты № 19 і) индуцирует образование ИЛ-4 при культи(№ 1, который представлен серином, в функциовировании СО4+-Т-клеток здоровых людей, нальном белке) а весь белок содержит 160 амиj) понижает образование TNFa в реакции нокислот Сопоставляя человеческие и вирусные смешанной культуры лейкоцитов человека СООН-концевые последовательности и в осоИзо всех этих действий, d) и д) посчитали бенности позиции 157 и 159, содержащие остатнаиболее уникальными Одним из важных варики лизина и аргинина, установлено, что эта обантов осуществления настоящего изобретения ласть оказывается отчасти ответственной за является вещество, которое проявляет активсвязывание рецептора (Фигуры 1 и 2) ность агониста чИЛ-10, как указано выше, и котоПосле скринирования нескольких кандидарое включает в себя аминокислотную последова 57702 20 19 тельность Ала-Тир-Мет-Тре-Мет-Лиз-Иле-Аргв которой Асн или аналог или вариант указанной последоХі представляет собой Ала или Гли, вательности Эта последовательность и все друХг представляет собой Тир или Фен, гие представленные полипептидные последоваХз, Х4 и Хб представляют собой выбранные из тельности, даже когда они не точно определены, группы, состоящей из Мет, Иле, Лей и Вал, написаны в традиционной форме, от N-конца к Са Хб представляет собой выбранную из группы, концу состоящей из Асн, Фсп, Глн и Глу Нонапептид IT9302 представляет собой Таким образом настоящее изобретение оточень эффективный стимулятор различных носится к веществу или полипептиду, включаюфункций, очень стабилен и предполагается, что щему в себя вышеуказанную аминокислотную он не может неверно присоединяться к рецептопоследовательность, при условии, что вещество рам Нонапептид был выбран потому, что 9 амиили полипептид не представляет собой ИЛ-10 нокислот полипептидной последовательности, в человека общем, являются уникальными для белка ОднаПримеры специфических полипептидов, коко, следует отметить, что 6 аминокислот, распоторые как предполагается, имеют вышеуказанложенные на самом конце чИЛ-10, по-видимому, ную активность агониста чИЛ-10, приведены ниявляются наиболее важными В рамках объема же настоящего изобретения вещество или полипеп1 NHi Ала-Тар-Меї-Тре-Шк-Лш-Мєг-Арг-Асн-СООН (SEQ ID NO 2) тид представляет собой, таким образом, после2 КНі-Ала-Фен-Мет-Тре-Дей-Лиз-Лей-Арг-Асн-СООН (SEQ IDNO'3) довательность, включающую в себя аминокис3. NHr-Ала-Твр-Мет-Тре-Меі-Лиї-Ваа-Арг-Гаї-СООН (SEQ ID NO 4) лотную последовательность Ала-Тир-Мет-Тре4 ННгГли-Тир-Мет-Тре-Мет-Лш-Иле-Арг-Асп-СООН (SEQ ID NO 5) Мет-Лиз-Иле-Арг-Асн (SEQ ID NO 1) Вполне вероятно, что определенные аминокислотные замены не оказывают вредного воздействия на активность указанного выше агониста чИЛ-10, до тех пор, пока имеются треонин, лизин и аргинин с одной промежуточной расположенной аминокислотой Поэтому, в соответствии с первой целью настоящее изобретение относится к полипептиду, имеющему формулу Тре-Х4-Лиз-Х5-Арг-Х6 (SEQ ID NO 19), в которой Х4 и Хб представляют собой независимо выбранные из группы, состоящей из Мет, Иле, Лей и Вал, а Хб представляет собой выбранную из группы, состоящей из Асн Асп, Глн и Глу, при условии, что полипептид не представляет собой последовательность Тре-Мет-Лиз-Иле-Арг-Асн В соответствии со следующей целью, настоящее изобретение относится к полипептиду, имеющему формулу Х3-Тре-Х4-Лиз-Х5-Арг-Хб (SEQ ID NO 20), в которой Хз, Х4 и Хб представляют собой независимо выбранные из группы, состоящей из Мет, Иле, Лей и Вал, а Хб выбрана из группы, состоящей из Асн, Асп, Глн и Глу В соответствии с очередной целью, настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим формулу Х2-Хз-Тре-Х4-Лиз-Х5-Арг-Хб (SEQ ID NO 21), в которой Хг представляет собой Тир или Фен, Хз, Х4 и Хб представляют собой независимо выбранные из группы, состоящей из Мет, Иле, Лей и Вал, а Хб представляет собой выбранную из группы, состоящей из Асн, Асп, Глн и Глу Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения представлены полипептидами, имеющими формулу Хі-Х2-Хз-Тре-Х4-Лиз-Х5Арг-Хє (SEQIDNO22), 5 ШгАла-Фен-Мет-Тре-Мет-Лш-Иле-Арг-Асп-СООН (SEQ ID N0.6) 6 МНі-Аяя-Тяр-Иле-Тре-Мет-Лиз-Иле-Арг-Асн-СООН (SEQ ID NO 7) 7 ННг-Аіа-Тир-ЛеЙ-Тре-Мет-Лиз-Иле-Арг-Асп-СООН (SEQ ID N0.8) 8 NHrAjia-Тир-Вал-Тре-Мет Лиз-Иле-Арг-Аея-СООН (SEQ ID NO 9) 9 ЫНг-Аяа-Тнр-Ми-Тре-Иле-Лиз-Иле-Арг-Асп-СООН (SEQ ID "HO !0) 10 ЬНі-Ала-Тир-Меї-Трв-Лей-Лиз-Иле-Арг-Аеп-СООН (SEQIDNO-Sl) 1L ЫН:-Аяа-Тир-Мет-Тре-Еая>Лиз-Ияе-Арг-Ага-СООН (SEQ ID NO'12) 12 Ш:-Ала-Тир-Мет-Тре-Мет-Лиз-Иле-Арг-Асп-С0ОН (SEQ ID NO 13) В КНі-Ала-Тир-Мет-Тре-Мет-Лиз-Мег-Арг-Ася-СООН (SEQ ID NO 14) 14 КНМл^-Тир Мет-Тре-Мет-Яиз-Вал-Арг-Асп-СООН {SEQ ID NO 15) 15 КНМла-Тир-Мст-Тре-Мет-Лиз-Иле-Арг-Гня-СООН 16 ЫН--Ала-Тнр-Мет-Тре-Мег-Лиз-Иле-Арг--Гя>-СООН (SEQIDNO 16) (SEQ ID N0.17) Для сравнения синтезировали другой нонапептид, названный ІТ9301, со 100% гомологией с последовательностью чИЛ-10 Этот полипептид, ІТ9301, соответствует последовательности нонапептида, начинающейся на N-конце полипептида чИЛ-10 (номера аминокислот от 19 до 27, т е первые 9 аминокислот зрелого белка) и имеет нижеследующую аминокислотную последовательность ЫНг-Сер-Про-Гли-Глн-ГлиТре-Глн-Сер-Глу-СООН (SEQ ID NO 18) Этот полипептид не проявил активности подобной ИЛ-10 в использованной методике, описанной ниже, и был выбран единственно потому, что представлял другой конец полипептида чИЛ10 и служил преимущественно в качестве контроля для отрицательных результатов Он не обладал признаками С-концевой последовательности в отношении последовательности, гомологичной чИЛ-10, и не имел аминокислот, благоприятствующих связыванию рецептора ІТ9301 протестировали в индуцированной ИЛ-1р мононуклеарной клеточной системе периферической крови человека, образующей ИЛ-8, но он не вызывал какого-либо подавления образования ИЛ-8 этими клетками В соответствии с настоящим изобретением, выражение "вещество настоящего изобретения, являющееся агонистом чИЛ-10", включает в себя любое фармацевтически активное и приемлемое соединение, которое суть идентично или структурно сходно с ІТ9302 и проявляет необходимое 57702 22 21 биологическое действие, подобное действию смысле является термином для белкового, гемоIT9302, в том числе производных IT9302, в частпоэтического колониестимулирующего медиатоности фармацевтически переносимых солей, ра, высвобождаемого главным образом, но не эфиров и сольватов, также как и конъюгатов исключительно, популяцией теток иммунной IT9302 или производных IT9302, в том числе системы как ответ на специфическое стимулипептидомиметиков Ковалентное присоединение рующее средство, например специфический анIT9302 на Nbh- конце полипептида к соответсттиген или аллоантиген, или с помощью неспецивующим носителям, например к полиэтиленглифического, политонального активатора, колю или сахару, может удлинить время полунапример эндотоксина или с помощью иных комжизни полипептида ин виво понентов клеточной стенки грамм-отрицательной бактерии В данном тексте использовали следующие определения Термин "полипептид", как он используется здесь, означает и короткие пептиды, длиной не "Цитокин" в общем смысле является термименее двух аминокислотных остатков и самое ном для белковых медиаторов, высвобождаемых большее - 10 аминокислотных остатков, олигоглавным образом, но не исключительно, популяпептиды (11-100 аминокислотных остатков), и цией клеток иммунной системы как ответ на спедлинные пептиды (обычно интерпретируемые как цифическое стимулирующее средство, например "полипептиды", т е в длину превышающие 100 специфический антиген или аллоантиген, или аминокислотных остатков), а также белки (функнеспецифический, политональный активатор, циональный объект, включающий как минимум например эндотоксин или другие компоненты один пептид, олигопептид, или полипептид, котоклеточной стенки грам-отрицательной бактерии рые могут быть химически модифицированы в "Лимфокин" в общем смысле является террезультате гликозилирования, в результате лимином для белковых медиаторов, высвобождаепидирования, или в результате включения промых с помощью сенсибилизированных лимфоцистетических групп) Определение полипептидов тов как ответ на стимулирующее средство, включает в себя также естественные формы пепнапример специфический антиген или аллоантитидов/белков человека, а также рекомбинантные ген, или с помощью политонального активатора, белки или пептиды, экспрессируемые любым вызывающего лейкоцитарную реакцию, напритипом векторов, трансформирующие хозяина мер эндотоксина или с помощью иных компоненлюбого вида, а также химически синтезировантов клеточной стенки грамм-отрицательной бакные пептиды терии "Монокин" в общем смысле является термиОдин из вариантов осуществления настояном для белковых медиаторов, высвобождаемых щего изобретения относится к полипептиду, в главным образом, но не исключительно, с помочастности полипептиду SEQ Ю N0 1, включающью мононуклеарных фагоцитов (например, мощему в себя субпоследовательность последованоцитами или макрофагами или тетками Куптельности человеческого И/1 -10, и имеющему фера (печень) или клетками Лангерганса (кожа)) степень гомологии с вИЛ-10, равной 66%, и стекак ответ на любое стимулирующее средство пень гомологии с мИЛ-10, равной 44% Термином "гомология" обозначили идентичность в последо"Хемокин" в общем смысле является термивательностях аминокислот на участках из двух ном для белковых хемотаксических и/или актиили большего числа аминокислот, которые бы вирующих лейкоциты медиаторов, высвобожгармонировали по наименованию и положению даемых главным образом, но не исключительно аминокислот данного полипептида популяцией клеток иммунной системы как ответ на специфическое стимулирующее средство, Гомология в качестве термина, использованнапример специфический антиген или аллоантиного здесь, представляет собой, таким образом, ген, или с помощью неспецифического, политомеру подобия между двумя аминокислотными нального активатора, например эндотоксина или (или нуклеотидными) последовательностями с помощью иных компонентов клеточной стенки Гомологию выражают в виде долей или проценграмм-отрицательной бактерии и относящихся к тов соответствия аминокислот (или оснований) отдельному семейству генов, либо к семейству после совмещения двух последовательностей генов а-хемокина, либо к семейству р-хемокина (возможно и неравной длины) Термин совмещение использовали в значении, определенном в "Интерферон" в общем смысле является тер(76) В первом приближении две последовательмином для белкового противовирусного и/или ности совместили, максимизируя число совпаактивируемого моноцитами активатора, высводающих оснований (или аминокислот) между бождаемого главным образом, но не исключидвумя последовательностями, со вставкой из тельно, популяцией теток иммунной системы минимального числа "заглушённых" или "нулекак ответ на вирусный или интерфероновый инвых" оснований в любой из двух последовательдуктор, такой как полинуклеотид, в частности, ностей, для обеспечения максимального перететками иммунной системы как ответ на специкрывания фическое стимулирующее средство, например специфический антиген или аллоантиген, или с Термин "гомологи", использованный здесь в помощью неспецифического, политонального данном виде, среди прочего предназначается активатора, например эндотоксина или с помодля иллюстрации степени, идентичности между щью иных компонентов клеточной стенки граммаминокислотной последовательностью данного отрицательной бактерии полипептида и аминокислотной последовательностью IT9302 Данную аминокислотную после"Колониестимулирующий фактор" в общем 23 довательность, которую сравнивают с аминокислотной последовательностью IT9302, можно вывести из нуклеотидной последовательности, такой как последовательность ДНК или последовательность РНК, например, полученную в результате гибридизации, как показано ниже, или может быть получена с помощью известных способов аминокислотного секвенирования Степень гомологии предпочтительно определяли по аминокислотной последовательности зрелого полипептида, т е без учета какой-либо лидерной последовательности Вообще, при сравнении нуклеотидных последовательностей для определения гомологии между ними принимали во внимание только кодирующие области Хотя предполагается, что большая степень гомологии чИЛ-10 и вИЛ-10 полезна, вполне возможно, что субпоследовательности последовательности чИЛ-10, которая имеет сниженную степень гомологии с вИЛ-10, скажем, например 50%, 55% или 60%, могут также проявлять одну или больше полезных активностей агониста чИЛ10 Кроме того, как обсуждалось выше, не обязательно, чтобы степень гомологии с чИЛ-10 составляла 100% В рамках объема настоящего изобретения имеются полипептиды, также обладающие пониженной степенью гомологии с чИЛ10, такой как 75%, 80%, 85%, 90% или 95%, хотя 100%-я гомология предпочтительна Такие полипептиды можно рассматривать как аналоги нонапептида Поэтому термин "аналог или его вариант" означает полипептид, не имеющий в точности последовательности Ала-ТирМет-Тре-Мет-Лиз-Иле-Арг-Асн (SEQ Ю N0 1), но все же обладающий вышеуказанной "активностью агониста чИЛ-10" В общем, такие полипептиды представлены полипептидами, которые в сравнении с IT9302, описанному в примерах, отличаются в какой-то мере аминокислотным составом или посттрансляционными модификациями, например гликозилированием или фосфорилированием Таким образом, термин "аналог" или "вариант", использован в настоящем контексте для указания белка или полипептида, с несколько отличающейся аминокислотной последовательностью, но все же близкой аминокислотной последовательности IT9302, допускающей небольшие вариации, которые изменяют аминокислотную последовательность, например делеции, сайт-направленные мутации, инсерции дополнительных аминокислот или комбинации этих изменений при получении полипептидных аналогов 1Т9302 Сайт-направленный мутагенез является одним из подходящих способов для осуществления консервативных аминокислотных замен и им подобных в естественной последовательности белка По другому аналоги можно получить с помощью хорошо известных способов жидкофазного или твердофазного полипептидного синтеза, с использованием последовательного присоединения индивидуальных аминокислот к полипептидной последовательности, или же полипептид можно синтезировать в результате присоединения индивидуальных аминокислот, образующих 57702 24 фрагменты полипептидной последовательности, которые затем соединяют так, чтобы получить желаемый полипептид Термин "консервативный" в том виде как он используется здесь означает (і), что изменения, представленные по возможности в виде конформационно нейтральных, означают получение минимальных изменений в третичной структуре мутантного полипептида, по сравнению с естественным белком, и (м) что изменения представленные по возможности в виде антигенно нейтральных, означают получение минимальных изменений в антигенных детерминантах мутантных полипептидов, по сравнению с естественным белком Конформационная нейтральность желательна для сохранения биологической активности, а антигенная нейтральность желательна для того, чтобы избежать запуска у больных или животных, получивших вещества настоящего изобретения, иммуногенных ответов Хотя трудно выбрать с абсолютной уверенностью, какая альтернатива будет конформационно или антигенно нейтральной, существуют правила, позволяющие специалистам в данной области произвести изменения, с высокой вероятностью конформационно или антигенно нейтральные, смотри например (77) и (78) Некоторые из наиболее важных правил включают 1) замещение гидрофобных остатков представляется маловероятным для получения изменений в антигенности, потому что они, повидимому, находятся внутри белка, например Berzofsky (вышеприведенная ссылка) и Bowie et ol (вышеприведенная ссылка), 2) замещение физико-химически подобными, т е синонимичными, остатками представляется маловероятным для получения конформационных изменений, потому что замещающая аминокислота может иметь такое же значение для структуры, что и замещенная аминокислота, и 3) изменение эволюционно консервативных последовательностей, представляется вероятным для получения вредных конформационных следствий, поскольку предполагается, что эволюционно консервативные последовательности могут быть функционально важными В дополнение к этим основным правилам по отбору заглушённых последовательностей, необходимо провести анализ для подтверждения биологической активности и конформации биоинженерных молекул Биологические испытания, выполненные для веществ настоящего изобретения, более полно описаны ниже, в примерах Изменения в конформации протестированы, как минимум, двумя хорошо известными способами, методом фиксации микрокомплемента, например (79) и (80), широко используемый в эволюционных исследованиях третичной структуры белков, и анализом сродства к наборам конформационноспецифичных моноклональных антител, например (81) Поэтому, важный вариант осуществления настоящего исследования относится к полипептиду, в котором, как минимум, один аминокислотный остаток был замещен отличающимся аминокислотным остатком и/или в котором, как 25 минимум, один аминокислотный остаток был делетирован или добавлен, так чтобы получить полипептид включающий в себя аминокислотную последовательность, суть отличную от аминокислотной последовательности или субпоследовательности указанной аминокислотной последовательности, как указано ниже, однако по существу имеющую вышеуказанную активность агониста чИЛ-10 Интересный вариант осуществления настоящего изобретения относится к полипептиду, который представляет собой аналог, и/или включает в себя, по крайней мере, часть полипептида настоящего изобретения, в целом составляющий от 10 до 100 аминокислот, например, хотя бы 12 аминокислот, хотя бы 15 аминокислот, хотя бы 20 аминокислот или хотя бы 30 аминокислот В предпочтительном варианте настоящего изобретения вещество или полипептид использовали в очищенном виде Для этого необходимо осуществить выделение очисткой полипептида Примерами использования методик по выделению очисткой полипептидов являются (і) иммунопреципитация или хроматография по сродству с антителами, (м) хроматография по сродству с подходящим лигандом, (ш) другие хроматографические методики, такие как гель-фильтрация, ионообменная или жидкостная хроматография высокого разрешения или варианты любой из вышеперечисленных методик, (iv) электрофоретические методики, такие как электрофорез в полиакриламидном геле, денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле, электрофорез в агарозном геле и изоэлектрическое фокусирование, (v) любые иные методики специфической солюбилизации и/или выделений очисткой В рамках объема настоящего изобретения представлена также нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеуказанный полипептид, в частности нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, включающий в себя или суть аминокислотную последовательность SEQ ID N 0 1 , например нуклеотидную последовательность, включающая в себя последовательность GCC ТАС ATG- АСА ATGAAG ATA CGA AAC (SEQ ID NO 23) или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий субпоследовательность указанной аминокислотной последовательности Кроме того, модифицированная нуклеотидная последовательность, которая отличается от вышеуказанной нуклеотидной последовательности, в которой как минимум один нуклеотид делетирован, заменен или модифицирован или хотя бы один нуклеотид дополнительно вставлен так, чтобы получить нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, имеющий активность агониста чИЛ-10, представленного в рамках настоящего изобретения В данном описании и формуле изобретения термин "субпоследовательность" означает по 57702 26 следовательность, которая предпочтительно имеет размер не менее чем из 18 нуклеотидов, более предпочтительно - не менее чем из 21 нуклеотида, и наиболее предпочтительно - не менее чем из 24 нуклеотидов В числе вариантов осуществления настоящего изобретения субпоследовательность или аналог нуклеотидной последовательности настоящего изобретения будет включать в себя не менее 27 нуклеотидов, или не менее 30 нуклеотидов, или не менее 45 нуклеотидов Такой полипептид, кодируемый такой "субпоследовательностью" должен соответствовать, по крайней мере, одному из вышеприведенных критериев а) - д), и/или нуклеотидная "субпоследовательность" должна гибридизировать с нуклеотидной последовательностью, включающей в себя последовательность SEQ ID NO 23 в строго соблюдаемых условиях Термин "очень строгий", примененный применительно к условиям гибридизации, описанной в технике, которая осуществляется на 5 - 10°С ниже точки плавления Т т , сравни Sambrook et ol , 1989, страницы 11 45 -11 49 Термин "аналог" по отношению к фрагментам ДНК из настоящего изобретения включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, идентичный или практически идентичный полипептиду, кодируемому вышеуказанной ДНК Поскольку хорошо известно, что одни и те же аминокислоты могут кодировать разные кодоны, использованный кодон, будучи связанный, среди прочего, с предпочтительными организмами, о которых идет речь, будет экспрессировать данную нуклеотидную последовательность Поэтому, один или больше нуклеотидов или кодонов фрагмента ДНК настоящего изобретения могут быть заменены другими, которые при экспрессии дают полипептид идентичный или фактически идентичный полипептиду, кодируемому вышеуказанным фрагментом ДНК Кроме того, подразумевается, что термины "аналог" и "субпоследовательность" допустимы для применения, касающиеся изменений в последовательности, таких как замена, инсерция (включая интроны), добавление и перестройка одного или большего числа нуклеотидов, изменения которых не имеют какого-либо пагубного действия на активность агониста чИЛ-10, полипептида кодируемого фрагментом ДНК или его суб последовательностью Поэтому настоящее изобретение включает также нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий субпоследовательность аминокислотной последовательности SEQ ID NO 1 Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены при использовании технологии рекомбинантной ДНК Важный пример осуществления настоящего изобретения относится к системе экспрессии, включающей в себя нуклеотидную последовательность данного изобретения Поэтому в рамках объема настоящего изобретения представлена также экспрессионная система, включающая в себя нуклеотидную последовательность данного изобретения, такую как реплицируемый экспрессионный вектор, который переносит и способен опосредовать экспрессию 27 вышеуказанной последовательности Организм, который использовали для образования полипептида настоящего изобретения, может быть высшим организмом, например животным, или низшим организмом, например микроорганизмом, таким как Eschenehia col і, дрожжами, простейшим, или клеткой, выделенной из многоклеточного организма, таким как гриб, клетка насекомого, растительная клетка, клетка млекопитающего или клеточная линия, которая несет вышеуказанную экспрессионную систему Независимо от типа использованного организма, фрагмент ДНК настоящего изобретения интродуцировали в организм либо непосредственно, либо посредством подходящего вектора Альтернативно полипептиды могут быть получены в линиях клеток млекопитающих в результате интродуцирования фрагмента ДНК или его аналога, или субпоследовательности настоящего изобретения либо прямо, либо посредством экспрессионного вектора Полипептиды настоящего изобретения можно также получить в результате химического синтеза, как описано выше Настоящее изобретение относится, кроме того, к плазмидному вектору, содержащему последовательность ДНК, кодирующей полипептид настоящего изобретения или слитой полипептид, как определяется здесь В одном особенно важном варианте осуществления фрагмента ДНК или его аналог или субпоследовательность настоящего изобретения или фрагмент слитого белка настоящего изобретения, как определяется здесь, может быть перенесен с помощью реплицируемого экспрессионного вектора, который обладает способностью реплицироваться в организме хозяина или в клеточной линии Вектор может в частности быть плазмидой, фагом, космидой, минихромосомой или вирусом В интересном варианте осуществления настоящего изобретения вектор может быть вектором, который, при введении в клетку хозяина, интегрируется в геном клетки хозяина Полученный, как описано выше полипептид может быть, подвергнут посттрансляционной или постсинтетической модификациям в результате температурной обработки, химической обработки (формальдегидом, глутаральдегидом и пр) или ферментной обработки (пептидазами, протеиназами и ферментами, модифицирующими белок) Полученный в организме полипептид может быть процессирован по-разному, хотя условия его образования одинаковы Например, при экспрессии полипептида клеткой высшего организма, таким как дрожжи или предпочтительно млекопитающие, часто происходит гликозилирование Обычно гликозилирование связано с аминокислотными остатками Асн, Сер, Тре или гидроксилизином Итак, один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к способу получения полипептида, как указано выше, включающему следующие стадии a) включение нуклеотидной последовательности, как указано выше, в экспрессионный вектор, b) трансформирование соответствующего 57702 28 организма хозяина вектором, образованным на стадии (а), c) культивирование организма хозяина, полученного на стадии (Ь) при соответствующих условиях, для экспрессии полипептида d) получение полипептида, и e) необязательная посттрансляционная модификация полипептида Предполагается, что действие антагонистов на чИЛ-10 или вИЛ-10 можно осуществить, среди прочего, в результате использования антител, специфически связывающихся с нонапептидом IT9302, и что их можно использовать в терапии для нейтрализации высоких концентраций ИЛ-10 В соответствии с другой целью настоящее изобретение, поэтому относится к антителу, которое специфически связано с полипептидом настоящего изобретения Термин "антитело" относится к веществу, которое продуцируется млекопитающим, или более точно, клеткой млекопитающего, принадлежащей иммунной системе, как проявление ответа на полипептидный антиген настоящего изобретения В настоящем описании и формуле изобретения "антитело" определяется как, состоящее по существу из специфически связывающей базовой единицы, которая состоит из двух тяжелых цепей и двух легких цепей Однако в самом широком плане понятие антитело будет также включать, например, димерную или пентамерную структуру базовой единицы Вариантную область антитела составляют вариабельная и константная последовательности Вариантную часть данной области называют идиотипом антитела Эта часть антитела ответственна за взаимодействие с антигеном, связывание антигена В данном контексте термин антитело подразумевает целую молекулу антитела или его любые фрагменты Антитело может быть фрагментировано в течение и/или после его образования Оно может быть также сделано вначале фрагментированным и использовано в таком виде или использовано после соединения различных фрагментов Особенно интересными фрагментами представляются связывающие фрагменты антител настоящего изобретения, например Fab- или Fab-фрагменты Идиотипическая (антиген-связывающая) структура антитела является антигенной и может вызывать образование специфических антител, направленных против идиотипической структуры Антитела, возникшие против идиотипа, названы антиидиотипическими антителами Такие антитела могут имитировать структуру исходного антигена и, следовательно, могут действовать как исходный антиген Такие антитела способны заменять частично или полностью функции исходного антигена, что присуще и свойственно исходному полипептиду настоящего изобретения Антитела настоящего изобретения включают в себя политональные антитела, также как и моноклональные антитела Антитело или его фрагменты могут быть моноспецифическимм (политональными) Моноспецифическое антитело можно получить в результате введения соответствующему животному 29 очищенного препарата полипептида настоящего изобретения Это можно осуществить путем однократной или неоднократной или неоднократных инъекций с соответствующими интервалами перед первым кровопусканием Животным открывают кровь каждые 5 - 7 дней после очередной иммунизации Антитела можно выделять из сыворотки избирательно, используя стандартные методики выделения очисткой Животное, которое использовали для получения антител, связывающие полипептид настоящего изобретения, предпочтительно выбирали из группы состоящей из кролика, обезьяны, барана, козы, мыши, крысы, свиньи, лошади и морской свинки Продуцирующими антитела клетки могли быть лимфоцитарными клетками селезенки или периферической крови Моноклональное антитело или его фрагменты могут образоваться против основного компонента полипептида, т е эпитопа Моноклональные антитела можно получить, применяя традиционные методики (Kohler and Milstem, 1975), путем использования гибридомной клеточной линии или ее клонов или субклонов или с помощью клеток, несущих генетическую информацию о гибридомной клеточной линии, продуцирующей указанные моноклональные антитела Моноклональные антитела можно получить путем слияния клеток, продуцирующих указанные моноклональные антитела с клетками соответствующей клеточной линии, и клонирования полученных гибридомных клеток, продуцирующих указанные моноклональные антитела Альтернативно моноклональные антитела можно получить в результате иммортализации линии неслитых клеток, продуцирующих указанные моноклональные антитела В конечном итоге моноклональные антитела выделяли из среды, в которой росли клетки Используемые гибридомные клетки, продуцирующие моноклональные антитела можно выращивать ин витро или в полости тела животного Моноклональное тело или его фрагменты можно также получить, применяя методы рекомбинантной flHK(Huseetol 1989) Моноклональные антитела можно также получить путем иммунизации соответствующих животных неочищенным препаратом полипептида настоящего изобретения Полученные гибридомные клоны, секретирующие моноклональные антитела, необходимо скринировать для выяснения их способности связывать полипептид(ы) или его аналог Для целей, не требующих высокой специфичности, антитело может быть политональным антителом Политональные антитела можно получить, например как описано у Harboe and Jngild, смотри выше Для получения политональных антител с большей специфичностью, полипептид настоящего изобретения или представляющий его аналог, предпочтительно инъецировать животному после добавления подходящего адъюванта, такого как неполный или полный адъювант Фрейнда Животному открывают регулярно кровь, например с недельными интервалами, и полученную кровь разделяют на сывороточную фракцию, содержащую антитело, 57702 30 и указанную произвольную фракцию, которую далее подвергают обычным процедурам по очистке антитела и/или применяют методики очистки полипептида или его аналога Антитело может быть также антиантиидиотипическим антителом, направленным против антиидиотипического антитела, которое представляет собой антитело, направленное против участка антитела, которое реагирует с эпитопом антигена Антиидиотипическое антитело можно получить подобным способом, который вкратце изложен выше для моноклонального или политонального антитела В рамках объема настоящее изобретение представляет антитело, которое связывается с веществом или вышеуказанным полипептидом, в частности антитело, которое специфически связывается с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность Ала-Тир-Мет-ТреМет-Лиз-Иле-Арг-Асн В широком плане настоящее изобретение относится, следовательно, к веществу, которое способно нейтрализовать одну или больше активностей чИЛ-10, от а) до j), т е имеющему активность антагониста чИЛ-10, такому как наделенному этими свойствами антителу Известно монотональное антитело 19F1 (82), которое способно специфически связываться с ИЛ-10 и может блокировать эндогенный ИЛ-10, образованный моноцитами, стимулированными LPS, смотри Таблицу 1 (82) Это антитело распознает естественную укладку ИЛ-10, но не обязательно всю функциональную область, однако, это антитело специфически не связывает IT9302 В рамках объема настоящее изобретение представляет также фармацевтический препарат, включающий в себя такое вещество, как и фармацевтический препарат, включающий в себя вещество или полипептид настоящего изобретения Очень важная цель настоящего изобретения относится к фармацевтическому препарату, включающему в себя вещество, имеющее активность агониста чИЛ-10 или активность антагониста чИЛ-10, как указано выше, и фармацевтически приемлемый наполнитель Препарат может содержать, например очищенный синтезированный белок или очищенный рекомбинантный полипептид, монотональное или политональное антитело или любое иное вещество подпадающее под критерий a)-j) или, обладающее активностью антагониста чИЛ-10, способное нейтрализовать одну или больше активностей чИЛ-10 от а) до j) Агонист или антагонист ИЛ-10, использованный в данном изобретении, может быть приготовлен согласно технологии приготовления лекарственного средства, в фармацевтически приемлемой среде, например, в физрастворе, фосфатном солевом растворе (PBS) растворе Рингера, декстрозно-солевом растворе, растворе Хенка и в глюкозе Препараты могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для достижения физиологических условий, такие как буферные агенты, агенты, регулирующие тонус, смачивающие аген 57702 32 31 ты, детергенты и т п Добавки могут также вклюДля твердых препаратов можно использочать дополнительные активные ингредиенты, вать традиционно нетоксичные твердые носитенапример бактерицидные агенты или стабилизали, которые включают в себя, например, фарматоры Их введение пациенту будет определяться цевтически чистые маннит, лактозу, крахмал, общим объемом вводимого препарата, целью, с стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлокоторой вводится препарат, профилактической зу, глюкозу, сахарозу, углекислый магний и т п или терапевтической, состоянием реципиента, Для перорального введения фармацевтически способом введения, и тому подобное приемлемый нетоксический препарат получают путем включения обычно используемых наполФармацевтические препараты обычно преднителей, таких как те же вышеперечисленные назначены для трансдермального или парентеносители, и в общем, 10-95% активного ингредирального введения, например, внутривенно, подента, предпочтительно 25-75%, который предкожно или внутримышечно Перорально ставляет собой вещество агониста или антагонивводимые формы также желательны и могут ста ИЛ-10 быть созданы путем модификации препарата, не поддающегося влиянию среды желудка ПрепаДля аэрозольного применения агонист или рат можно применять для профилактического антагонист ИЛ-10 предпочтительно готовят в и/или терапевтического лечения Предпочтитонко измельченном виде вместе с поверхносттельно, чтобы фармацевтические препараты но-активным веществом и газом-вытеснителем вводили внутривенно Таким образом, настояОбычно процентная доля агониста или антагонищим изобретением разработали препарат, котоста ИЛ-10 составляет 0,01-20% по весу, предпочрый включает в себя вещество, антагонистичное тительно 1-10% Поверхностно-активное вещестили агонистичное ИЛ-10, растворенное или сусво, должно быть, разумеется, нетоксичным и пендированное в соответствующем носителе, предпочтительно растворимым в газепредпочтительно в водном носителе Эти препавытеснителе Представителями таких агентов раты можно стерилизовать с помощью традициявляются эфиры или неполные эфиры жирных онных методов стерилизации, или стерилизовать кислот, содержащие от 6 до 22 углеродных атофильтрацией мов, такие как капроновая, каприловая, лауриновая, пальмитиновая, стеариновая, линолевая, Полученные водные растворы фасуют готолиноленовая, олестериновая и олеиновая кисловыми к употреблению или лиофилизируют, или ты с алифатическим многоатомным спиртом или лиофилизируют в сочетании со стерильным водего циклическим ангидридом, таким как этиленгным носителем перед введением Антагонист ликоль, глицерин, эритритол, арбитол, маннит, или агонист ИЛ-10 можно также ввести со втосорбит, ангидриды гекситола, полученные из рым биологически активным фактором, таким как сорбита, и полиоксиэтиленовые и полиоксипростандартный хемотерапевтический фактор Тапиленовые производные этих эфиров Возможно кие факторы включают в себя, но не ограничииспользование смешанных эфиров, таких как ваются винкристином, даунорубицином, Lсмешанные или природные глицериды аспарагиназой, митоксантроном и амсакрином С терапевтической целью фармацевтические Поверхностно-активное вещество может сопрепараты вводят пациенту в количестве, достаставлять 0,1-20% от веса препарата, предпочтиточном для получения желаемого эффекта, оптельно 0,25-5% Фактор, уравновешивающий ределяемого как "терапевтически эффективная препарат, представлен обычно газомдоза" Терапевтически эффективная доза антавытеснителем Сжиженные газы-вытеснители в гониста или агониста ИЛ-10 будет изменяться в условиях окружающей среды представляют сосоответствии, например, с особенностями осубой обычные газы, а под давлением они конденществляемого лечения, способом введения, обсируются Среди подходящих сжиженных газовщим здоровьем и состоянием пациента, и на освытеснителей имеются низшие алканы, содерновании предписании врача К примеру, доза для жащие до 5 углеродных атомов, такие как бутан и непрерывного вливания будет обычно колебатьпропан, и предпочтительно фторированные или ся от 500нг до 800мкг в день в расчете на пацифторхлорированные алканы Можно также исента весом 70кг, предпочтительно в интервале пользовать вышеуказанные смеси Для получемежду Юмкг и до ЗООмкг Обычная доза колебния аэрозоля, контейнер снабжают специальным лется в интервале между 700нг/кг/день и клапаном через который вводят соответствую16мкг/кг/день щий газ-вытеснитель, содержащий тонко диспергированные полипептид(ы) и поверхностноКонцентрация агониста или антагониста ИЛактивное вещество Ингредиенты удерживаются, 10 в технологии приготовления лекарственного таким образом, под повышенным давлением до средства может варьировать широко, т е , привысвобождения путем нажатия клапана мерно, от Юмкг до 5мг/мл, предпочтительно в интервале между почти 10Омкг и до почти 2мг/мл Вначале желаемую концентрацию подбирали по объемам жидкости, вязкости и т д , в соответствии с определенным способом введения Поэтому, обычный фармацевтический препарат для внутривенного вливания необходимо доводить до объема 250мл, содержащем декстрозно-солевой раствор и 2,5мг агониста или антагониста ИЛ-10 Для увеличения времени полужизни сыворотки крови, агонист или антагонист ИЛ-10 можно инкапсулировать, введением в полость липосом, приготовленных в виде коллоида, или другим традиционным способом, который обеспечивает продление времени жизни полипептидов Поэтому, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения агонист или антагонист ИЛ-10 инкапсулировали в липосому Для приго 33 товления липосом применяют разнообразные способы, которые описаны например в (83), (84), (85) и (86) Таким образом, один из важных вариантов осуществления настоящего изобретения, при производстве фармацевтического препарата, необходимого для лечения или профилактики рака яичника и/или СПИД'а (87, 19), относится к использованию вещества, снижающего или нейтрализующего высокие концентрации чИЛ-10 и/или вИЛ-10, такого как используемое вещество, обладающее свойствами антагонистичными чИЛ10 В рамках объема настоящего изобретения представлен также способ лечения и/или предупреждения рака яичника и/или СПИД'а, способ включающий введение пациенту, нуждающемуся в нем, терапевтически или профилактически эффективного количества вещества антагониста чИЛ-10, также как и применение соединения, которое обладает активностью антагониста чИЛ10, используемого при производстве фармацевтического препарата, необходимого для лечения или профилактики рака яичника и/или СПИД'а Использование вещества в соответствии с настоящим изобретением Согласно настоящему изобретению, и как описано выше, установлено, что IT9302 и его аналоги и варианты пригодны для оказания защитного действия от цитокинов, которые, как известно, патогенетически вовлечены в течение вышеописанных патологических состояний В этой связи рассмотрены все потенциальные возможности лечения с применением полипептида настоящего изобретения или его аналогов при производных и необходимо проанализировать все заболевания, где можно было бы ожидать терапевтическое действие чИЛ-10 и/или ІДАР (смотри выше, Таблица 3) Очень важные варианты настоящего изобретения относятся к применению вещества или полипептида настоящего изобретения к лечению или профилактике одного или большего числа заболеваний, приведенных в Таблице 3, к применению вещества или полипептида, в соответствии с настоящим изобретением, для промышленного производства фармацевтического препарата, для лечения или профилактики одного или большего числа заболеваний, приведенных в Таблице 3, также, как и к способу лечения и/или предупреждения одного или большего числа заболеваний, приведенных в Таблице 3, к способу, включающему в себя введение пациенту, нуждающемуся в нем, терапевтически или профилактически эффективного количества вещества или полипептида в соответствии с настоящим изобретением Поэтому, важной целью настоящего изобретения является использование IT9302, или его функционального производного, для промышленного производства фармацевтического препарата, в значительной степени, подавляющего у человека биологический эффект, связанный с цитокином, таким как лимфокин, интерлейкин, монокин, хемокин, интерферон, колониестимулирующии фактор, простагландин и/или лейкотриен, для профилактики или лечения состояния 57702 34 связанного с нарушением цитокиновой системы, такой как система лимфокина, интерлейкина, монокина, хемокина, интерферона или колониестимулирующего фактора и/или нарушения в системе простагландина и/или лейкотриена Термин "фармацевтический препарат", как он используется здесь, включает в себя любой препарат, пригодный для применения человеку, как подробно описано выше Настоящее изобретение, в частности, относится к использованию ІТ9302 или его функциональных производных для существенного подавления у человека биологического эффекта, связанного с цитокином, при профилактике или лечении состояния, связанного с нарушением системы цитокина, и/или для существенного подавления у человека биологического эффекта, связанного с лимфокином, при профилактике или лечении состояния, связанного с нарушением системы лимфокина, и/или для существенного подавления у человека биологического эффекта, связанного с интерлейкином, при профилактике или лечении состояния, связанного с нарушением системы интерлейкина, и/или для существовенного подавления у человека биологического эффекта, связанного с монокином, при профилактике или лечении состояния, связанного с нарушением системы монокина, и/или для существенного подавления у человека биологического эффекта, связанного с хемокином, при профилактике или лечении состояния, связанного с нарушением системы хемокина, и/или для существенного подавления у человека биологического эффекта, связанного с лимфокином, при профилактике или лечении состояния, связанного с нарушением системы лимфокина, и/или для существенного подавления у человека биологического эффекта, связанного с интерфероном, при профилактике или лечении состояния, связанного с нарушением системы интерферона, и/или для существенного подавления у человека биологического эффекта, связанного с колониестимулирующим фактором, при профилактике или лечении состояния, связанного с нарушением системы колониестимулирующего фактора, и/или для существенного подавления у человека биологического эффекта, связанного с простагландином при профилактике или лечении состояния, связанного с нарушением системы простагландина, и/или для существенного подавления у человека биологического эффекта, связанного с лейкотриеном, при профилактике или лечении состояния, связанного с нарушением системы лейкотриена Пояснения к рисункам Фиг 1 иллюстрирует сравнение предсказанных аминокислотных последовательностей мИЛ 35 10, чИЛ-10 и BCRF1 Идентичные аминокислотные последовательности указаны вертикальными линиями Фиг 2 иллюстрирует СООН-концевые полипептидные последовательности ИЛ-10, включающие 9 аминокислот и сравниваемые белки свиньи, человека, BCRF1 и мыши ФигЗ представляет собой диаграмму, показывающую, что IT9302 подавляет спонтанное образование ИЛ-8 культурой выделенных человеческих моноцитов Фиг 4 представляет собой диаграмму, показывающую, что IT9302 ингибирует индуцированное ИЛ-1 (1нг/мл) образование ИЛ-8 мононуклеарными клетками периферической крови человека Фиг 5 иллюстрирует образование IRAP человеческими моноцитами, стимулированных IT9302 Фиг 6 иллюстрирует образование IRAP человеческими моноцитами, стимулированных ИЛ10 Фиг 7 иллюстрирует хе мота кс и чес кое действие IT9302 на СО8+-Т-клетки Фиг 8 иллюстрирует десенситизацию CD8+-Tклеток с помощью IT9302, влияющего на толерантность СО8*-Т-клеток по отношению к ИЛ-10 (Юнг/мл), вызывающего хемотаксис Фиг 9 иллюстрирует супрессию активности ИЛ-8 с помощью IT9302 Фиг 10 представляет собой диаграмму, показывающую, что IT9302 подавляет хемотаксис моноцитов, индуцированный MCAF/MCP-1 Фиг 11 показывает с помощью ECL-Вестернблоттинга образование ИЛ-4 в цитозольной фракции СО4+-Т-клеток Фиг 12 с помощью ECL-Вестерн-блоттинга показывает образование a-TNF в цитозольных фракциях смешанной культуры лейкоцитов человека Вестерн-блоттинг с a-TNF был выполнен, как описано в разделе Материалы и Методы для ИЛ-4, но с использованием кроличьих антител к анти-a-TNF человека (Pepro Tech, Inc , London, Англия) и вторичного антитела, меченого пероксидазой хрена (Cat no, p 211 ,Dako, Дания) Фиг 13 показывает, что действие LPS, вызывающего шок и лейкопению, модулируется IT9302, что выявляется при тотальном подсчете лейкоцитов Примеры Материалы и методы Цитокины и хемоаттрактанты Рекомбинантный чИЛ-10 получили из Рерго Tech , NJ, (Cat, no 20010) Рекомбинантный чИЛ10р и рекомбинантный чИЛ-8 любезно предоставила Damippon Pharmaceutical Company, Osaka, Япония Использовали культуральную среду RPMI 1640 GIBCO, без добавления LPS, протестированную лизатом амебоцитов Limulus (Sigma Е-ТОХАТЕ kit Cat №210-AL), рчМСАР/МСР-1 любезно предоставлен профессором KOUJI Matsushima, Kanazawa, Япония Анализ лейкоцитарного хемотаксиса Хемотаксис Т-клеток Субклассы Т-лимфоцитов CD4+ и Gd8+, характеризующиеся экспрессией CD4- или CD8 57702 36 антигенов, выделяли из гепаринизированной крови здоровых доноров Так, мононуклеарные клетки периферической крови (РМ/ВС) выделяли из гепаринизированной крови путем разведения 100мл крови со сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS), 1 1, а затем разделяли наслоением клеток на Lymphopac™ (Nycomed Pharma, Oslo, Норвегия) с последующим градиентным центрифугированием при 2000об/мин в течение 20мин Мононуклеарные клетки отмывали 3 раза в HBSS, а осадок клеток разбавляли 4мл HBSS, содержащем 1% околоплодной сыворотки теленка, и сортировали при 4°С, используя Динабусы, покрытые моноклональными антителами к CD4- или СО8-антигенам (Dynabeads M450 CD4 Cat, №111 16, Dynabeads M-450 CD8 Cat, №11108, DETACHaBEAD Cat, №125 04) Соотношение бусы клетки составляло 10 1, а время инкубации -1 час Бусинки отделяли путем добавления политональных анти-мышиных антител, согласно инструкциям изготовителя Анализ хемотаксиса проводили в 48луночной микрокамере для культивирования (Neuroprobe, Rockville, MD) как описано раньше (74, смотри ссылку 3 и ссылку 14) Хемоаттрактанты разбавляли средой RPMI 1640 (GIBCO Cat № 61870-010), содержащей 1% стерилизованной фильтрацией околоплодной сыворотки теленка, и помещали в нижнюю 25мкл ячейку Для определения хемотаксиса Т-клеток, Т-клетки суспендировали в среде и 50мкл суспензии помещали в верхнюю ячейку, отделенную от нижней ячейки поликарбонатным, не содержащем поливинилпирролидона, фильтром с размером пор 5мкм (Nucleopore Corp, Pleasonton, CA), покрытого коллагеном, тип IV Sigma Cat, № С 0543) Клетки мигрировали в течение 2 часов при 37°С, при 5% СОг Затем фильтры аккуратно удаляли, фиксировали в 70%-м метаноле и окрашивали в Кумасси бриллиантовом голубом Клетки, отслоенные с нижней поверхности фильтра, подсчитывали, путем измерения их площади, применяя видеокамеру, размещенную на- микроскопе, соединенной с компьютерной системой для численного анализа и снабженной программой для объективного определения хемотаксической миграции Примерно 5% Т-клеток, что соответствует количеству между 12000 и 13000 клеток, могут мигрировать спонтанно, эта величина могла изменяться изо дня в день и почти не меняться в день эксперимента Как описано ранее (ссылка 3 и ссылка 14), выборочные результаты представлены как отношение численности клеток в образце и в негативном контроле, что отражает спонтанную миграцию Это отношение рассматривается в качестве хемотаксического индекса (CI) Все образцы проанализировали трижды на трех участках и получили среднюю оценку значения площади В отдельных экспериментах хе мота кс и чес кую мембрану не покрывали коллагеном и по этой причине в данном опыте система мигрирующих клеток, стала иметь вид стекающих капель на дно нижней ячейки хемотаксической камеры В первом эксперименте хе мота кс и чес кое воздействие IT9302 на СО8+-Т-клеток осущест 37 вили, испытывая ряд разведении IT9302, добавленного в нижнюю ячейку, и оценивали хемотаксис как описано выше Во втором эксперименте изучали способность IT9302 десенситизировать миграцию CD8+Т-клеток как ответ на рчИЛ-10 (Юнг/мл), добавляя IT9302 к мышиным клеткам за 30 минут перед осуществлением хемотаксиса IT9302 добавляли в ряду концентраций и хемотаксический ответ рчИЛ-10 оценивали, как описано выше В третьем эксперименте изучали способность IT9302 супрессировать хемотаксический ответ СО4+-Т-клеток к рчИЛ-8 (Юнг/мл), добавляя IT9302 к мишенным клеткам за 30 минут до осуществления хемотаксиса IT9302 добавляли в виде ряда концентраций и хемотаксический ответ рчИЛ-8 оценивали как описано выше Хемотаксис моноцитов Хемотаксис моноцитов измеряли, используя ту же камеру Бойдена, подготовленную, как описано выше, для Т-клеток Хемоаттрактант разбавляли средой RPMI 1640, содержащей 0,5% БСА и вносили в нижнюю камеру в концентрации Юнг/мл Моноциты, полученные из нормальной РВМС человека, как описано выше, выделяли с помощью стандартной методики прилипания к пластику, суспендировали в среде ЯРМІ 1640, содержащей 0,5% БСА, и затем инкубировали в течение 30 минут в присутствии ІТ9302, при различных концентрациях В последующем, клетки добавляли в верхние хемотаксические камеры в концентрации 106 клеток/мл Верхняя и нижняя ячейки были разделены с помощью не содержащего поливинил пиррол идона поликарбонатного фильтра с размером пор 8мкм (Nucleopore, Pleasanton, CA) Камеру инкубировали при 37°С в течение 90 минут Мембраны, содержащие мигрирующие клетки, обрабатывали, как описано выше, и хемотаксический индекс вычисляли в соответствии с вышеописанной методикой Получение ИЛ-8 с помощью мононуклеарвых клеток периферической крови (РМВС) здоровых людей РМВС выделяли из гепаринизированной крови здоровых доноров человека После градиентного центрифугирования с Lymphopac™ (Nycomed Pharma, Oslo, Норвегия), мононуклеарные клетки разбавляли до концентрации 2x106 клеток/мл средой RPMI 1640 без LPS, содержащей 1% стерилизованной фильтрованием, инактивированной нагреванием околоплодной сыворотки теленка, а также пенициллин (10000 IU/мл), стрептомицин (10мг/мл и гентамицин (2,5мг/мл) Клетки культивировали в 24-луночном микропланшете Nunc (Nunc, Дания) в присутствии разных концентраций IT9302 (0,1 мкг, ЮОнг, Юнг, 1нг, 0,1 нг, 0,01нг/мл) в течение 24 часов После 24 часов инкубации добавляли очередную дозу IT9302, а 1 часом позже к клеточной культуре добавляли р-чИЛ-1р (1нг/мл) Супернанатны собирали после 48 часов непрерывной инкубации и с помощью ИЛ-8-ELISA, используя набор ИЛ-8ELISA (Daimppon Pharmaceutical Co , Ltd, Osaka, Япония) измеряли концентрацию секретированного ИЛ-8 Вкратце, стандарты и клеточные супернатанты инкубировали в течение одного часа, 57702 38 а дубли инкубировали при 20°С на микропланшетной мешалке Затем после отмывки добавляли вторичное антитело и выдерживали один час, после чего инкубировали в течение одного часа с мечеными пероксидазой антителами козы к анти-кроличьим IqG После отмывки реакцию развивали О-фенилендиамином Тридцатью минутами позже реакцию останавливали 1,6н серной кислотой Оптическую плотность (OD) измеряли на считывающем устройстве ELISA при 490нм Концентрацию ИЛ-8 вычисляли с помощью калибровочной кривой абсорбции неизвестного образца против концентраций стандартов ИЛ-8 Определение концентрации IRAP РВМС выделяли, как описано выше РВМС культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% стерильной, инактивированной нагреванием околоплодной сыворотки теленка (включающей пенициллин, 10000 IU/мл, стрептомицин 10мг/мл, гентамицин 2,5мг/мл), а концентрация клеток составляла 5x106 клеток/мл Затем выделяли моноциты по стандартной методике прилипания к пластику Затем моноциты культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 2% FCS (2,5x106 клеток/мл) и с разными разведениями рчИЛ-10 или IT9302 Клетки стимулировали в течение 24 часов, после чего собирали супернатанты для определения IRAP, IRAP-ELISA осуществляли с помощью закупленного у R & D Systems Europe Ltd (Cat, No DRA OO, Abmgton, Oxon, Англия) набора для количественного иммуноанализа ИЛ1га человека Определенные экспрессии антигена МНС класса П на моноцитах РВМС выделяли, как описано выше, а моноциты выделяли с помощью методики прилипания к пластику Затем моноциты культивировали в среде ЯРМІ 1640, содержащей 2% FCS, и включающей пенициллин 10000 IU/мл, стрептомицин 10мг/мл, гентамицин 2,5мг/мл при концентрации клеток 3x106 клеток/мл Клетки стимулировали в течение 40 часов в микролунках (Nunc, Дания) с рчИЛ-10 10Онг/мл или IT9302 1мкг/мл, 100нг/мл, Юнг/мл По окончании стимуляции супернатанты удаляли, я клетки снимали с пластика замораживанием при -20°С в течение 20 минут Клетки собирали в 1мл охлажденного HBSS, содержащего 1% FCS и сортировали при 20°С, используя 50мкл/мл Динабусинок М 450, покрытых моноклональными антителами к р-цепи HLA класса П (Cat, №210 03) После 20 минут инкубации, клетки отмывали 3 раза охлажденным RBSS, содержащим 1% FCS, и собирали на магнитном сепараторе Клетки разбавляли вышеуказанным буфером и окрашивали метиленовым синим, а розеткообразующие клетки (клетки, переносимые Динабусинками с мАт к HLA класса П) подсчитывали Определение образования ИЛ-4 с помощью С D4+-T-лимфоцитов Клеточные культуры CD4+-T-лимфоциты выделяли из гепаринизированной крови здоровых людей После градиентного центрифугирования с Lymphopac™ (Nycomed Pharma, Oslo, Норвегия), мононуклеарные 39 клетки сортировали при 4°С, испольузя Динабусинки (Dunal AS, Норвегия), покрытые моноклональными анти-С04+-антителами Бусинки отделяли добавлением анти-мышиного антитела (Dunal AS / Норвегия) Степень чистоты позитивно отселектированных клеток превышала 99%, судя по результатам FACS-анализа Для проверки образования ИЛ-4 de novo с помощью ИЛ-8стимулированных Т-клеток, Т-клетки культивировали при концентрации 5х106 клеток/мл в среде ЯРМІ 1640, без добавления LPS, содержащей 1% стерилизованной фильтрованием, инактивированной нагреванием околоплодной сыворотки теленка (FCS), пенициллин (10000 IU/мл), стрептомицин (10мг/мл) и гентамицин (2,5мг/мл) Тклетки стимулировали в течение 3 дней, используя рИЛ-8 (ЮОнг/мл), рИЛ-10 (ЮОнг/мл) , ІТ9302 (Юнг/мл) и у-ИФН (Юнг/мл) Рекомбинатный ИЛ-8 человека (рчИЛ-8) любезно предоставила Damippon Pharmaceuticals Co Ltd (Osaka, Япония), а уИФН закупили у Boehnnger Ingelgeim Am Rheim, Германия Для специфического ингибирования стимуляции ИЛ-8, применяли нейтрализацию моноклональным анти-ИЛ-8-антителом (WS 4) (любезно предоставил д-р К Matsushima, Япония) Рекомбинантный ИЛ-10 закупила у Рерго Тесп Іпс (Лондон, Англия) Приготовление клеточного материала и культурального супернанатна для гелевого электрофореза Культивированные Т-клетки и культуральную среду разделяли центрифугированием при 2000об/мин в течение 5 минут Полученные супернатанты высушивали замораживанием и растворяли в ЮОмкл лизирующего буфера Клетки ресуспендировали непосредственно в ЮОмкл гелевого лизирующего буфера (9) Материал хранили при -80°С для последующего анализа ECL-Вестерн-блоттинг белков, продуцированных СО4+-Т-клетками Клетки или высушенные замораживанием супернатанты клеточных культур использовали для определения содержания ИЛ-4-белков Белки из гелей одномерного 15%-го ДСН-ПАГЭ переносили с помощью блоттинга на нитроцеллюлозные мембраны Hybond -ECL (Amersham RPN 2020 D, Англия) и блокировали 5%-м бычьим сывороточным альбумином в трис-солевом буфере рН 7,8, содержащем 0,1% твина 20 Затем блоты инкубировали с политональными антителами козы к анти-ИЛ-4 человека (R&D Systems, Англия) и с мечеными пероксидазой хрена вторичными антителами, после чего детектировали иммуноокрашенные продукты, экспонируя пленку (Kodoak X-OMAT-S, США) в течение 90 секунд Специфичность аминокислотной последовательности IT9302 Информационный поиск возможной гомологии последовательности IT9302 с другими известными белками, производил в банке белков ЕМБО д-р Hennk Leffers из Institute for Medical Biochemistry, University of Aarhus, Дания Аминокислотная специфичность последовательности IT9302 Согласно информации, полученной из банка белков ЕМБО (Heidelberg) 10 июня 1994 года, 57702 40 IT9302 обладает 100% гомологией с последовательностью ИЛ-10 человека и 75%-с последовательностью белка, полученного из вируса Эпштейна-Барр, идентичного вИЛ-10 Другие вирусные белки, такие как белки фага Т7 и вирус скрученных желтых листьев томатов, обнаружили, соответственно, 75% и 85% идентичности Результаты Замысел настоящего изобретения сформировался в октябре-ноябре 1992 года, когда в соответствии со стратегией, представленной выше, был создан нонапептид, обозначенный IT9302, а решение о химическом синтезе первого прототипа (IT9302) назначили на 27 ноября 1992 года Предполагалось, что данный нонапептид должен был бы проявлять иммуномодуляторные свойства, и некоторые из них должны были бы имитировать ИЛ-10-подобную активность, после чего планировали сразу же поставить контрольные эксперименты (примеры) Химический синтез IT9302 осуществили с помощью автоматического полипептидного синтезатора, изготовленного Carlbiotech Ltd A/S, Дания и закупленного авторами Впоследствии белок очистили с помощью ЖХВД и подтвердили с еепомощью, что степень чистоты превышала 95% Тем самым подтвердили, что синтезированный продукт идентичен IT9302, названному так заявителями в октябре и ноябре 1992 года Пример 1 IT9302 индуцирует подавление спонтанного образования ИЛ-8 человеческими моноцитами Опыт проводили, как описано в разделе "Образование ИЛ-8 мононуклеарными клетками периферической крови здоровых людей (РМВС)" Моноциты выделяли с помощью методики прикрепления к пластику и при концентрации 3 х 10 6 клеток/мл стимулировали в течение 40 часов Как показано на ФигЗ, IT9302 подавляет образование ИЛ-8 моноцитами, а при концентрации IT9302 равной 0,1нг/мл супрессируется до 35% спонтанно образуемого ин витро ИЛ-8 Жизнеспособность клеток в культуре всегда превышала 80% спустя 1 день, а добавление IT9302 в данном или в последующим примерах не влияла на их жизнеспособность при любых концентрациях IT9302 между 0,1 и 1000нг/мл (мол масса IT9302 1127 дальтон, предсказанная мол масса рчИЛ10 18400 дальтон) Пример 2 IT9302 индуцирует подавление ИЛ-1р, индуцирующего образование ИЛ-8 мононуклеарными клетками периферической крови человека (РМВС) Опыт проводили, как описано в разделе "Образование ИЛ-8 мононуклеарными клетками периферической крови здоровых людей (РМВС)" Как показано на Фиг 4, ІТ9302 подавляет дозозависимым образом ИЛ-1р, индуцирующий образование ИЛ-8 мононуклеарными клетками периферической крови человека в условиях ин витро Стабильная супрессия образования ИЛ-8 наблюдается при концентрациях ІТ9302 между 0,01 и ЮОнг/мл Пример 3 ІТ9302 индуцирует образование человече 57702 42 41 скими моноцитами белка-антагониста (IRAP) речто рчИЛ-10 подавляет экспрессию МНС класса цептора интерлейкина-1 П, a IT9302, как показано ниже в Таблице 4, не Опыт проводили, как описано в разделе "Опподавляет ее ределение концентрации IRAP" Как показано на Фиг 5 IT9302 дозо-зависимо индуцирует образоТаблица 4 вание IRAP человеческими моноцитами Образование сильно увеличивается, когда используеЧисло розеткообразующих Стимуляция мые концентрации IT9302 превышают Юнг/мл моноцитов Фиг 6 иллюстрирует индукцию IRAP с помощью 12,0+1,ОхЮ 4 0 рчИЛ-10, а поскольку концентрация чИЛ-10 при4,6+1,4хЮ4 100нг/мл рчИЛ-10 мерно в 20 раз больше, чем IT9302, Юнг/мл 1мкг/мл IT9302 11,0 + 3,0хЮ 4 IT9302 соответствует 200нг/мл По этой причине ЮОнг/мл IT9302 14,4 + 2,4хЮ 4 при низких концентрациях активности IT9302 и Юнг/мл IT9302 11,2 + 3,2хЮ 4 рчИЛ-10 сопоставимы и примерно равны в отношении индукции IRAP При концентрациях Обсуждение, связанное с экспериментами IT9302, превышающих 10нг/мл, индукция IRAP Представленные данные демонстрируют досильно увеличивается и достигает величин около зо-зависимое ингибиторное действие синтетиче700нг/мл ского нонапептида IT9302 на процессы, которые Пример 4 отражают предвоспалительную активность, втом Хемотаксический эффект IT9302 на человечисле образование ИЛ-8 и миграцию моноцитов + ческие СО8 -Т-лимфоциты и/или Т-клеток Таким образом, ІТ9302 проявляет Эксперимент проводили, как описано в разспособность супрессировать спонтанное образоделе "Исследование лейкоцитарного хемотаксивание ИЛ-8 с помощью ночной культуры человеса" Как показано на Фиг IT9302 индуцирует хеческих моноцитов Это можно было бы объяс+ мотаксическую миграцию CD8 человеческих Тнить прямым ингибиторным воздействием на лимфоцитов ин витро и не действует на 4+ -Тобразование мРНК ИЛ-8 и/или образованием клеток (данные не показаны) И вновь, активи/или высвобождением белковой субпоследованость IT9302, показанная в данном экспериментельности Другой механизм мог бы поясняться те, сопоставима с активностью рчИЛ-10, покатем фактом, что моноциты, культивированные ин занной прежде (ссылка 14) витро, стали экспрессировать и продуцировать Пример 5 ИЛ-1, который затем в свою очередь индуцироИ Т9302 десенситизирует человеческие CD8+ вал образование ИЛ-8 Это подтверждается фак-Т-клетки, влияя на толерантность крчИЛ-10 том, который демонстрирует, что ІТ9302 сильно Эксперимент проводили как описано в разиндуцирует образование IRAP из моноцитов деле "Исследование лейкоцитарного хемотаксиВследствие этого IT9302 может также подавлять са" IT9302 добавляли к суспензии CD8+ -Тспонтанное образование ИЛ-8, расстраивая акклеток за 30 минут до того, как у этих клеток истивность ИЛ-1 Наблюдаемая индукция IRAP с пытывали их хемотаксический ответ на рчИЛ-10 помощью IT9302, проявляется как индукция биоКак показано на Фиг 8, преинкубация клеток с логически активного IRAP, поскольку IT9302, доIT9302 супрессирует толерантность CD8+ -Тбавленный в культуры нейтрализует образоваклеток к рчИЛ-10 Это указывает на то, что ние ИЛ-8, индуцированное ИЛ-1, но только тогда, IT9302 может действовать, связывая рчИЛ-10 с когда его добавляют не менее, чем за 16 часов рецептором ИЛ-10 до увеличения активности ИЛ-1 в культурах Это могло бы означать, что 1Т9302 подавляет обраПример 6 зование ИЛ-8, индуцированное ИЛ-1, в результаIT9302 супрессирует хемотаксический ответ те стимуляции образования IRAP, который в CD4+ -Т-лимфоцитов к ИЛ-8 свою очередь блокирует активность ИЛ-1 через Эксперимент проводили, как описано в разего рецептор Если бы 1Т9302 прямо подавлял деле "Исследование лейкоцитарного хемотаксиобразование ИЛ-8, следовало бы ожидать, что са" Как показано на Фиг 9, IT9302, добавленный добавление IT9302 к культуре за 1 час до внесек суспензии человеческих CD4+ -Т-лимфоцитов, ния ИЛ-1 должно было бы подавлять образовав дозо-зависимой форме подавляет ответ CD4+ ние ИЛ-8, чего не было в данном случае (данные Т-клеток к ИЛ-8 не показаны) Поэтому наблюдаемое с помощью Пример 7 IT9302 подавление образования ИЛ-8 вероятно IT9302 супрессирует хемотаксический ответ связано, скорее, с индукцией образования IRAP, человеческих моноцитов к MCAF/MCP-1 чем с прямым подавлением образования ИЛ-8 Эксперимент проводили, как описано в разЭти функции IT9302 обнаруживаются также и по деле "Хемотаксис моноцитов" Как показано на отношению кчИЛ-10, свидетельствуя тем самым, Фиг 9, IT9302, добавленный к суспензии человечто IT9302 управляет ИЛ-10-подобными активноческих моноцитов, в дозо-зависимой форме постями IT9302 имитирует также активность ИЛ-10, давляет хемотаксический ответ моноцитов к супрессируя способность CD4+ -Т-клеток мигриMCAF/MCP-1 ровать, как ответ на действие ИЛ-8 Поскольку Пример 8 ИЛ-8 связан со многими различными воспалиIT9302 не подавляет экспрессию молекул тельным состояниями и поскольку CD4+ -ТМНС класса П на человеческих моноцитах клетки появляются рано в инфильтрате аллергиЭксперимент проводили как описано в разделе "Материалы и Методы" и он показывает, 43 ческого воспаления, опосредованного Тклетками, такого как аллергия кожи, может оказаться, что данный показатель имеет большое терапевтическое значение для контроля аллергического воспаления, опосредованного Тклетками Проявление хемотаксической активности CD8+ -Т-клетками под воздействием IT9302 аналогично также воздействию ИЛ-10, и IT9302 может таким образом активировать Т-клеточные популяции с супрессорной активностью, содействующие прекращению аллергического воспаления, опосредованного Т-клетками По этой причине, и в соответствии с представленными выше примерами, IT9302 обладает терапевтической ценностью для заболеваний, в отношении которых ИЛ-10 и/или IRAP также имеют терапевтическое значение Кроме того, IT9302 может иметь терапевтическое значение для заболеваний, где ИЛ-8 и/или MCAF и/или ИЛ-1, как полагают, играют патогенную роль Пример 9 IT93O2 и ИЛ-10 индуцируют образование ИЛ4 в CD4+ -Т-лимфоцитах Предпосылка Подобно ИЛ-10, ИЛ-4 является продуктом CD4+ -Т-клеток Тн2-типа Его наблюдали, когда рекомбинантный ИЛ-10 человека индуцировал образование ИЛ-4 культивируемыми CD4+ -Тклетками Это означает, что ИЛ-10, помимо своих собственных иммуносупрессивных функций, индуцирует также образование другого имуносупрессивного цитокина, ИЛ-4 В этой связи выясняли, действительно ли Т9302 индуцирует также образование ИЛ-4 CD4+ -Т-клетками В соответствии с этим, CD4+ -Т-клетки, выделенные как описано в разделе "Способ осуществления хемотаксиса Т-клеток", и культивированные как описано в разделе "Определение образования ИЛ-4 CD4+ -T-лимфоцитами", стимулировали в течение 3 дней IT9302 (Юнг/мл) или ИЛ-10 (100нг/мл) Цитозольные фракции собирали и анализировали их на наличие ИЛ-4, применяя Вестерн-блоттинг (фиг 1) и политональные антитела козы к анти-ИЛ-4-человека Как показано на Фиг 11, ИЛ-10, также как и IT9302, индуцирует образование ИЛ-4 при культивировании CD4+ -Т-клеток здоровых людей Пример 10 IT9302 подавляет образование a-THF во время реакции смешанных лейкоцитов (MLR) Было показано, что реакция смешанных лейкоцитов частично зависит от образования a-TNF во время реакции Было также показано, что IT9302 не снижает существенно MLR, но установлено, что во время MLR происходит значительное снижение образования a-THF В соответствии с этим, MLR осуществляли путем выделения человеческих лейкоцитов и последующего культивирования 1 миллиона клеток/мл, полученных от аллогенных доноров в течение 4 дней Перед постановкой культур, одну группу клеток облучали в течение 2 минут, используя бета-излучение Выделяли цитозольные белковые фракции как описано в разделе "Определение образования ИЛ-4 CD4+ -Т 57702 44 лимфоцитами", а Вестерн-блоттинг осуществляли, используя кроличьи антитела к анти-a TNF человека Как показано на Фиг 12 во время реакции смешанных человеческих лейкоцитов наблюдали значительное снижение образования аTNF Пример 11 Использование IT9302 модулирует действие LPS, вызывающего шок и лейкопению у свиней Поскольку было обнаружено, что IT9302 модулирует образование цитокинов, в том числе аTNF и ИЛ-8, и подтверждено опубликованной последовательностью мышиного ИЛ-10 (Blancho et ol , 1995) (смотри Фиг 2 по гомологии СООНконценвого пептида), выясняли действительно ли IT9302 способен модулировать действие LPS , вызывающего лейкопению у свиней (Фиг 3) В предварительном эксперименте испытывали как внутривенная инъекция IT9302, 0,1мг/кг, модулирует у свиней (N=3) действие внутривенной инъекции 2мкг/кг LPS, IT9302 инъецировали за 30 минут до введения LPS, а время взятия образцов крови показано на Фиг 13 Определяли общее количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу, и на основании этих результатов подсчитывали общее количество нейтрофильных лейкоцитов Показано, что инъекция LPS вызывает скоротечную лейкопению Однако инъекция LT9302 предотвращает лейкопению каклпоказано на фигуре Пример 12 Антитела против синтетического полипептида IT9302 Синтетический полипептид IT9302 приобретали у Kem-En-Tec А/5, Копенгаген, Дания, со степенью очистки более 95% Этот полипептид конъюгировали с помощью Keyhole Limpet Hemocyamn (KLH), полученного от производителя Растворимый IT9302/KLH является более иммуногенным, чем лишь один полипептид, и его можно использовать также в качестве контрольного белка для ELISA или Вестерн-блоттинга Иммунизация кроликов 250мкг IT9302, конъюгированного с KLH, и в виде эмульсии с полным адъювантом Фрейнда, использовали для внутрикожных и подкожных инъекций Инъекции повторяли 4 раза с двухнедельными интервалами и после этого кроликам открывали кровь на 8 и 12дн После последнего кровопускания 250мкг IT9302/KLH с полным адъювантом Фрейнда инъецировали подкожно с одномесячными интервалами ОбразованиеIT9302антител контролировали с помощью дот-блот иммунотеста или Вестерн-блоттингом 1 Bendtzen К Lymphokines in inflammation Inflammation Basic Mechanisms Tissue Injuring Principles and Clinical Models (P Venge & A Lmdbom eds) 1985, Almgvist & Wiksell International Stockholm 187-217 2 Bendtzen К lnterleukin-1, lnterleukm-6, and tumor necrosis factor in infection, inflammation and immunity Immunol Lett 1988, 19 183-192 3 Larsen G G Leukocyte activating and chemotactic cytokmes in cell-mediated immune reactions of the human skin Acta Dermatovenerol 1991, Suppl 57702 46 45 160 1-48 Pearce, E, Mosmann, T 1991 Production of IL-10 by CD4+ lymphocytes correlates with down4 Fiorentmo D F , M W Bond, and T R Mosregulation of Thl cytokme synthesis in helminth inmann 1989 Two types of mouse helper T cell IV fection J Immunol 147 2713-16 Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokme production byThl clones J Exp Med , 170 2081 19 Clenci, M , Shearer, G M 1993 Immunology 5 Viera P, R de Wall-Malefyt, M -N Dang, К E Johnson, R Kastelem, D F Fiorentiono, J E de Vnes, M -G Roncarolo, T R Mosmann, and К W Moore 1991 Isolation and expression of human cytokme synthesis inhibitory factor (CSIF/IL-10) cDNA clones homology to Epstem-Barr virus open reading frame BCRFI Proc Natl Acad Sei (USA), 88 1172 6 Moore, KW , O'Garra A , de Waal Malefyt R , Vieira, Mosmann TR 1993 Interleukin-10, Annu Rev Immunol, 11 165-90 7 Kim, J M , Brannan, С I Copeland N G , Jenkins, N A , Khan, ТА , Moore, KW 1992 Structure of the mouse interleukin-10 gene and chromosomal localization of the mouse and human genes J Immunol 148 3618-23 8 Carter, D В , Deibel, M R-Jr, Dunn, С J et al 1990 Purification, cloning, expression and biological characterization of an interleukm-1 receptor antagonist protein NATURE 344 633-638 9 Hannum, С H , Wilcox, С J , Arend, W P et al 1990 Interleukm-1 receptor antagonist activity of a human interleukm-1 inhibitor Nature 343 336-40 10 Firestem, G S , Boyle, D L , Yu, С , et al 1994 Synovial interleukm-1 receptor antagonist and inter-leukm-1 balance in rheumatoid arthritis Arthritis Rheum 37 644-652 11 Fisher, С J -Jr, Slotman, G J , Opal, S M , Pnbble, J P et al 1994 Initial evaluation of recombmant interleukm-1 receptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome a randomized, open-label, placebo-controlled multicenter trial The IL-1RA Sepsis Syndrome Study Group Cnt-Care-Med 22 12-21 12 de Waal-Malefyt, R , Haanen J , Spits, H , et al 1991 IL-10 and viral IL-10 strongly reduce antigen-specific human T cell proliferation by diminishing the antigen-presenting capacity of monocytes via down-regulation of class II MHC expression J Exp Med 174 915-24 13 Gazzmelh, R T , Oswald, I P , James, S L , Sher, A, 1992 IL-10 inhibits parasite killing and nitric oxide production by IFN-Vactivated macrophages J Immunol 148 1792-96 14 Jmquan, T, Larsen, C G , Gesser, B, Matsushima, K, Thestrup-Pedersen, К 1993 Human IL-10 is a chemo-attractant for CD8+ T lymphocytes and an inhibitor of IL-8- induced CD4+ T lymphocyte Migration Journal of Immunology, 151 4545-4551 15 Rousset F, E Garcia, T Defrance, С Реronne, D -H Hsu, R Kastelem, К W Moore, and J Banchereau 1992 IL-10 is a potent growth and differentiation factor for activated human В lymphocytes Proc Natl Acad Sei USA, 175 671 16 Howard, M , O'Garra, A , Ishida, H , de Waal Malefyt, R, de Vnes, J 1992 Biological properties of Interleukin-10 J Clm Immunol 12 239-47 17 Kuhn, R , Lohler, J , Renmck, D , Rajewsky, K, Muller, W 1993 lnterleukm-10-deficient mice develop chronic enterocohtis Cell 75 263-74 18 Sher, A, Fiorentmo, D F , Caspar, P, Today 14 107-111 20 Bry, K, Lappalamen, U 1994 lnterleukm-4 and transforming growth factor-beta 1 modulate the production of interleukm-1 receptor antagonist and prostaglandm E2 by decidual cells Am-J-obstetGynecol 170(4) 1194-1198 21 Firestem, G , S , Boyle, D L , Yu, С , Paine, M M , Whisenand, T D , Zvaifler, N J , Arend, W P 1994 Synovial interleukm-1 receptor antagonist and interleukm-1 balance in rheumatoid arthritis Arthritis-Rheum, 37/5 644-652 22 Roberge, С J , De-Medicis, R , Dayer, J M , Rola-Pleszcyczynski, M , Naccahe, P H , Poubelle, P E 1994 Crystal-induced neutrophil activation V Differential production of biologically active IL-1 receptor antagonist J Immunol 152/11 5485-5494 23 McCall, R D , Haskill, S , Zimmermann, E M, Lund, P K, Thompson, R C, Sartor, R В 1994 Tissue mter-leukm 1 and interkeukm-1 receptor antagonist expression in entercohtis in resistant and susceptible rats Gastroenterology (4) 960-72 25 Kimble, R В , Vanmce, J L, Bloedow, D С , Thompson, R С , Hopfer, W , Kung, V T, Brownfield, C, Paci-fici, R 1994 Interleukm-1 receptor antagonist decreases bone loss and bone resorption in ovanectomized rats J Clm Invest 93/5 19591967 26 Kline, J N , Geist, L J , Momck, M M , Stmski, M F, Hunnmghake, G W , 1994 J Immunol 152(5) 2351-7 27 Tompkms, R G 1994 Human recombmant interleukm-1 receptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome (editorial, comment) Cnt-CareMed 22(1) 3, 22(1) 12-21 28 Everaerdt, В, Brouckaert, P, Fiers, W 1994 Recombination IL-1 receptor antagonist protects against TNF-mduced lethality in mice J Immunol 152/10 5041-5049 29 Fischer, С J Jr, Slotman, G J , Opal, S M , Pnbble, J P , Bone, R С , Emmanuel, G , Ng, D, Bloedow, D C, Catalano, M A 1994 Initial evalutaion of human recombination interleukm-1 receptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome a randomized, open-label, placebocontrolled multicenter trial The IL-1RA Sepsis Syndrome Study Group (see comments) Cnt-Care-Med 22(1) 12-21, 22(1) 3 30 Gomez-Remo-Carnoto, J J 1994 New terapies in rheumatoid arthritis Med-Clm 543-545 32 Nishihara, T, Ohsaki, Y , Ueda, N , Saito, N , Mundy, G R 1994 Mouse interleukm-1 receptor antagonist induced by actmobacillus actmomycetemcomitans hpo-polysacchande blocks the effects of interleukm-1 om bone resorption and osteoclast-hke cell formation Infect-lmmun 62(2) 390-7 33 Simon, С , Frances, A , Piquette, G N , elDanasoun, I , Zurawski, G , Dang, W , Polan, M L 1994 Embryonic implantation in mice is blocked by interleukm-1 receptor antagonist (see comments) Endocrinology 134(2) 521-8,134(2) 519-20 34 Baergen, R, Benirschke, K, Uhch, T R, 57702 48 47 1994 Cytoki-ne expression in the placenta The role sponse J Immunol 151 (7) 3654-3662 of mterleukm 1 and mterleukm 1 receptor antagonist 50 Bowyer, J F , Davies, D L , Schmued, L , expression in chorioamniomtis and parturition ArchBroenmg, H W , Newport, G D , Shkker, W Jr, HolPathol-Lab-Med 118(1) 52-5 son, R R 1994 Further studies of the role f hyper35 Tang, W W , Feng, L, Vannice, J L, Wilson, С В 1994 lnterleukm-1 receptor antagonist ameliorates experimental antiglomerular basement membrane antibody-associated flomeulonephntis J Clm-lnvest 93(1) 279-9 36 Cassatella, M A, Meda, L , Gaspenm, S , Calzetti, F , Bonara, S 1994 37 Interleukm 10 (IL-10) upregulates IL-1 receptor antagonist production from hpopolysacchande-stimulated human polymorphonuclear leukocytes by delaying mRNA degradation J Exp-Med 179/5 1695-1699 38 Mancim, R, Bendetti, A, Jezeguel, A M 1994 An interleukm-1 receptor antagonist decreases fibrosis induced by dimethylnitrorsamme in rat liver Virchows-Arch 424/1 25-31 39 Lukacs, N W , Kunkel, S L , Burdick, M D , Lincoln, P M , Stneter, R M 1993 40 lnterleukm-1 receptor antagonist blocks chemokme production in the mixed lymphocyte reaction Blood 82(12) 3668-74 41 Bandara, G , Mueller, G M , Galea-Laun, J , Tmdal, M H, Georgescu, H I, Suchanek, M K, Hung, G L , Glonso, J С , Robbms, P D , Evans, С H 1993 42 Intraarticular expression of biologically active mter-leukm 1-receptor-antagonist protein by ex vivo transfer Proc-Natl-Acad-Sci-U-S-A 90(22) 10764-8 43 Dmarello, С А 1994 Ant i-interleukm-1 strategies in the treatment of the septic shock syndrome Can-J-m-fect-Dis 5 (suppl A) 9A-16A 44 Oelmann, E , Topp, M S , Reufi, В , Papadimitrnou, С , Koenmgsmaim, M , Oberberg, D , Thiel, E, Berdel, W E 1994 Int-J-Oncol 4/3 555558 45 Estrov, Z 1993 Interruption of autocnne and paracrme growth-stimolatory mechaisms a new therapeutic stratefy for chronic myelogenous leukemia Semm-Hematol 30 (3 suppl 3) 35-6 46 Wooley, P H , Whalen, J D , Chapman, D L , Berger, A E , Richard, К A , Aspar, D G , Staite, N D 1993 The effect of an interleukm-1 receptor antagonist protein on type II collagen-induced arthritis and antigen-induced arthritis in mice Arthritis Rheum 36 (9) 1305-1314 47 Peterson, С M , Hales, H A , Hatasaka, H H , Mitchell, M D , Rittenhouse, L , Jones, К Р 1993 lnterleukm-1 beta (IL-1 beta) modulates prostaglandin production and the natural IL-1 receptor antagonist inhibits ovulation in the optimally stimulated rat ovarian perfusion model Endocrinology 133(5) 2301-2306 48 Estrov, Z, Kurzrock, R, Talpaz, M 1993 Role of mterleukin-1 inhibitory molecules in therapy of acute and chronic myelogenous leukemia Leuk LymphomalO (6) 407-418 49 Chensue, S W , Bienkowski, M, Eessalu, T E , Warming-ton, KS , Hershey, S D , Lukacs, N W , Kunkel, S L 1993 nous IL-1 receptor antagonist protein (IRAP) regulates schistosome egg granuloma formation and the regional lymphoid re thermia in methampheta-mme neurotoxicity J Pharmacol Exp Ther 268/3 1571-1580 51 Cole, О F , Sullivan, M H F , Elder, M G 1993 The 'interleukm-1 receptor antagonist' is a partial agonist of prostaglandm synthesis by human decidual cells Prostag land ins 46/6 493-498 52 Jenkins, J K, Arend, W P 1993 Interleukm 1 receptor antagonist production in human monocytes is induced by IL-lalpha, IL-3, and IL-4 and GMCSF Cytokme5/5 407-415 53 Coceam, F , Lees, J , Redford, J , Bishai, I 1992 lnterleukm-1 receptor antagonist effectiveness against interleukm-1 fever Can J Pharmacol 70(12) 1590-1596 54 Schiro, R , Longom, D , Rossi, V , Magha, 0 , Dom, A , Arsura, M , Carrara, G , Masera, G , Vanmer, В , Dmarello, С A , Rambaldi, A , Biondi, A 1994 Suppression of juvenile chronic myelogenous leukemia colony growth by interleukm-1 receptor antagonist Blood 83/2 460-465 55 Watson, M L , Smith, D , Bourne, A D , Thompson, R С , Westwick, J 1993 Cytokmes contribute to airway dysfunction hyperreactivity, pulmonary eosmophil accumulation and tumor necrosis factor generation by pre-treatment with an mterleukm-1 receptor antagonist Am J Respir Cell Мої Biol 8 (4) 365-369 56 Abhyankar, B, Gilhland, D G , Ferrara, J L M 1993 lnterleukm-1 is a critical effector molecule during cytokme dysregulation in graft-versushost disease to minor histocompatibihty antigens Transplantation 56/6 1518-1523 57 Lan, H Y , Nikohc Paterson, D J , Zarama, M , Vannice, J L , Atkins, R С 1993 Suppression of experimental crescentic glomerulonephitis by the interleukm-1 receptor antagonist Kidney Int 43 (2) 479-485 58 Herve, P 1993 Prevention and treatment of acute GvHD - New modalities Nouv Rev Fr Hematol 35/3 295-297 59 Conti, P , Panara, M R , Barbacane, R С , Placido, F С , Bongrazio, M , Reale, M , Dempsey, R A , Fiore, S 1992 Blocking the interleukm-1 receptor inhibits leukotnene B4 and prostaglandm E2 generation in human monocyte cultures Cell Immunol 145(1) 199-209 60 Knstensen, M, Deleuran, B, Eedy, D J , Feldmann, M , Breathnach, S M , Brennan, F M 1992 Distribution of mterleukin-1 receptor antagonist protein (IRAP), interleukm-1 receptor, and mterleukm-1 alpha in normal and psonatic skin, Decreased expression of IRAP in psona-tic lesional epidermis Br J Dermatol 127(4) 305-311 61 Romero, R , Sepulveda, W , Mazor, M , Brandt, F , Cotton, D В , Dmarello, С А , Mitchell, M D 1992 The natural interleukm-1 receptor antagonist in term and pre-term parturition Am J Obstet Gynecol 167 (4 R 1 ) 863-872 62 Dmarello, С А 1992 Reduction of inflammation by decreasing production of interleukm-1 or by specific receptor antagonism Int J Tissue React 14(2) 65-75 49 63 Conti, P , Panara, M R , Barbacane, R С , Bongrazio, M, Dempsey, R A , Reale, M 1993 Human recombmant IL 1 receptor antagonist (IL-IRa) inhibits leukotnene B4 generation from human monocyte suspensions stimulated by hpopolysacchande (LPS) Clm Exp Immunol 91/3 526-531 64 DeForge, L E , Tracey, D E , Kenney, J S , Remick, D G 1992 lnterleukm-1 receptor antagonist protein inhibits mterleukin-8 expression in hpopolysacchande-stimuled human whole blood Am J Pathol 140(5) 1045-1054 65 Porat, R , Poutsiaka, D D , Miller, L С , Granowitz, E V , Dmarello, С А 1992 lnterleukm-1 (IL-1) receptor blockade reduces endotoxm and Borreaha burgdor-fen-stimulated IL-8 synthesis in human monoclear cells Faseb J 6(7) 2482-2486 66 Boermeester, M A , van Leeuwen, Р А М , Schneider, A J , Houdijk, A P J , Ferwerda, С С , Wesdorp, R I C 1993 lnterleukm-1 receptor antagonist A new therapeutic agent in the treatment of septic syndrome Ned Tijd-SChr Geneesks 137/7 337-342 67 Smith, R J , Chin, J E , Sam, L M , Justen, J M 1991 Biologic effects of an interleukm-1 receptor antagonist protein on interleukm-1-stimulated cartilage erosion and chondrocyte responsiveness Arthsitis Rheum 34(1) 78-83 68 Conti, P Barbacane, R С , Panara, M R , Reale, M , Placido, F С , Fndas, S , Bongrazio, M , Dempsey, RA 1992 Human recombmant mterleukm-1 receptor antagonist (hrlL-Ira) enhances the stimulatory effect of interleukm-2 on natural killer cell activity against MOLT-4 target cells Int J Immunopharm 14/6 987-993 69 Sehg, W , Tocker, J 1992 Effect of mterleukm-1 receptor antagonist on antigen-induced pulmonary responses in guinea pigs Eur J Pharmacol 213/3 331-336 70 McCarthy, P L Jr, Abhyankar, S , Neben, S , Newman, G , Sieff, С , Thompson, R С , Burakoff, S J , Ferrara, J L M 1991 Inhibition of mterleukm-1 by an interleukm-1 receptor antagonist prevents graft-versus-host diseases Blood 78/8 19151918 71 Estrov, Z, Kurzrock, R , Wetzler, M , Kantarjian, H , Blake, M , Harris, D , Gutterman, J U , Talpaz, M 1991 Suppression of chronic myelongenous leukemia colony growth by interleukm-1 (IL-1) receptor antagonist and soluble IL-1 receptors A novel application for inhibitors of IL-1 activity Blood 78/6 1476-1484 72 Thomas, T К , Will, P С , Snvastava, A , Wilson, С L , Harbison, M , Little, J , Chesoms, R S , Pignatello, M , Schmolze, D , Symington, J , Kilm, P L , Thompson, R С 1991 Evaluation of an mterleukm-1 receptor antagonist in the rat acetic acidmduced colitis model Agents Actions 34/1-2 187190 73 Carter, D B , Deibel, M R Jr, Dunn, C J , Tomich, C S C , Laborde, A L , Shghtom, J L , Berger, A E , Bienkowski, M J , Sun, F F , McEwan, R N , Harris, / ' P К W , Yem, A W , Waszak, G A , Chosay, J G , Sieu, L С , Hardee, M M , Zurcher Neely, H A , Reardon, I M , Hemnkson, R L et al 1990 Purification, cloning expression and biological characterization of an interleukm-1 receptor antago 57702 50 mst protein Nature 344/6267 633-638 74 Larsen С G, Anderson A O, Apella E , Oppenheim J J , Matsushima K, 1989 Science 243 1464, 75 Larsen G G , Jmquan T, Deleurant В , Thestrup-Pedersen К 1993, IL-10 is a potent regulator of the chemotactic response of mononuclear cells, but not of granulocytes J Invest Dermatol Vol 100, No 6 76 Sankoff and Kruskal in chapter 1 of "Time Warps, String Edits, and Macromolecules The Theory and Practice of Sequence Comparison" (Addison-Wesley, Reading, Mass 1983) 77 Berzofsky, Science 229, (1985) 932-940 78 Bowie et al , Science 247, (1990) 1306-1310 79 Wasserman et al , J Inmunol 87, 1961, 290-295 80 Levme et al , Methods in Enzymology 11, 1967, 928-936 81 Lewis et al , Biochemistry 22, 1983, 948-954 82 Rene de Waal Maletyt, John Abrahams, Bruce Bennet, Carl G Figdor and Jan E de Vnes (1991), Interleukm 10 (IL-10) Inhibits Cytokme Synthesis by Human Monocytes An Autoregulatory Role of IL-10 Produced by Monocytes J Exp Med 174, 12091220 83 Szoka et al , Ann Rev Biophys Bioeng 9, 1980, 467 84 US Patent No 4,235,871 85 US 4,501,728 86 US 4,837,028 87 Walter H Gotheb, John S Abrams, Joanna M Watson, Thierry J Velu, Jonathan S Berek, Otomel Martinez-Meza (1992), Presence of interleukm 10 (IL-10) in the ascites of patients with ovarian and other intra-abdommal cancers Cytokme 4, No 5, 385-390 88 Blancho G , P Gianello, Sh Germana, M Baetscher, DH Sachs and Chr LeGuern (1995), Molecular identification of porcine interleukm 10 Regulation of expression in kidney allograf model Proc Natl Acad Sei USA 92, 2800-2804 СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ (і) ЗАЯВИТЕЛЬ (A) ИМЯ Necomed DAK A/S (B) УЛИЦА Р О Box 1911, Lergraversvej 59 (C) ГОРОД Копенгаген 8 (D) СТРАНА Дания (F) ПОЧТОВЫЙ КОД (ZIP) 2300 (м) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Иммуномодуляторы (ш) ЧИСЛЕННОСТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 23 (iv) ФОРМА КОМПЬЮТЕРНОГО СЧИТЫВАНИЯ (A) ТИП СРЕДЫ Гибкий диск (B) КОМПЬЮТЕР IBM PC-совместимый (C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА PCDOS/MS-DOS (D) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ Патент, Редакция #1 0, Версия #1 ЗО (ЕРО) (2) ИНФОРМАЦИЯ О SEQ ID NO 1 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (А) ДЛИНА 9 аминокислот 57702 52 51 (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (B) ВИД аминокислота (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (C) НИТЬ (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (D) ТОПОЛОГИЯ линейная SEQ ID NO 6 (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид Ала Фен Мет Тре Мет Лиз Иле Apr Асп (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 1 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ Ала Тир Мет Тре Мет Лиз Иле Apr Асн SEQ ID NO 7 1 5 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬ(2) ИНФОРМАЦИЯ О SEQ ID NO 2 НОСТИ (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 9 аминокислот (B) ВИД аминокислота (A) ДЛИНА 9 аминокислот (C) НИТЬ (B) ВИД АМИНОКИСЛОТА (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (C) НИТЬ (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид SEQ ID NO 7 (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 2 Ала Тир Иле Тре Мет Лиз Иле Apr Асп Ала Тир Мет Тре Иле Лиз Мет Apr Асн 1 5 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 8 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 3 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬ(A) ДЛИНА 9 аминокислот НОСТИ (B) ВИД аминокислота (A) ДЛИНА 9 аминокислот (C) НИТЬ (B) ВИД аминокислота Р) ТОПОЛОГИЯ линейная (C) НИТЬ (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 8 (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 3 Ала Тир Лей Тре Мет Лиз Иле Apr Асп Ала Фен Мет Тре Лей Лиз Лей Apr Асн 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 1 5 SEQ ID NO 9 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 4 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 9 аминокислот (B) ВИД аминокислота (A) ДЛИНА 9 аминокислот (C) НИТЬ (B) ВИД аминокислота (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (C) НИТЬ (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 9 (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ Ала Тир Вал Тре Мет Лиз Иле Apr Асп SEQ ID NO 4 Ала Тир Мет Тре Мет Лиз Вал Apr Глу 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 1 5 SEQIDNO 10 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬSEQ ID NO 5 НОСТИ (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 9 аминокислот (B) ВИД аминокислота (A) ДЛИНА 9 аминокислот (C) НИТЬ (B) ВИД аминокислота (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (C) НИТЬ (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 10 (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 5 Ала Тир Мет Тре Иле Лиз Иле Apr Асп Гли Тир Мет Тре Мет Лиз Иле Apr Асп 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 1 5 SEQIDNO 11 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 6 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 9 аминокислот (B) ВИД аминокислота (A) ДЛИНА 9 аминокислот (C) НИТЬ (B) ВИД аминокислота (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (C) НИТЬ 53 (и) ТИП МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO11 Ала Тир Мет Тре Лей Лиз Иле Apr Асп 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 12 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 9 аминокислот (B) ВИД аминокислота (C) НИТЬ (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 12 Ала Тир Мет Тре Вал Лиз Иле Apr Асп 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 13 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 9 аминокислот (B) ВИД аминокислота (C) НИТЬ (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 13 Ала Тир Мет Тре Мет Лиз Иле Apr Асп 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 14 (м) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 9 аминокислот (B) ВИД аминокислота (C) НИТЬ (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 14 Ала Тир Мет Тре Мет Лиз Мет Apr Асп 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 15 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 9 аминокислот (B) ВИД аминокислота (C) НИТЬ (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 15 Ала Тир Мет Тре Мет Лиз Вал Apr Асп 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 16 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 9 аминокислот (B) ВИД аминокислота (C) НИТЬ (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид 57702 54 (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 16 Ала Тир Мет Тре Мет Лиз Иле Apr Глн 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 17 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 9 аминокислот (B) ВИД аминокислота (C) НИТЬ (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 17 Ала Тир Мет Тре Мет Лиз Иле Apr Глу 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 18 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 9 аминокислот (B) ВИД аминокислота (C) НИТЬ (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 18 Сер Про Гли Глн Гли Тре Глн Сер Глу 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 19 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 6 аминокислот (B) ВИД аминокислота (C) НИТЬ (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQIDNO 19 Тре Хаа Лиз Хаа Apr Xaa 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 20 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 7 аминокислот (B) ВИД аминокислота (C) НИТЬ, (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 20 Хаа Тре Хаа Лиз Хаа Apr Xaa 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 21 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 8 аминокислот (B) ВИД аминокислота (C) НИТЬ (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 55 SEQ I NO 21 D Xaa Xaa Тре Xaa Лиз Xaa Apr Xaa 1 5 57702 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 22 (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 9 аминокислот (B) ВИД аминокислота (C) НИТЬ Р) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ пептид (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 22 >иг. 1 56 Xaa Xaa Xaa Tpe Xaa Лиз Xaa Apr Xaa 1 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 23 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА 27 пар оснований (B) ВИД нуклеиновая кислота (C) НИТЬ одиночная (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ВИД МОЛЕКУЛЫ ДНК (геномная) (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO 23 GCCTACATGA CAATGAAGAT ACGAAAC 58 57702 57 тш рецептора и зшрсшю ш&рааилйСк. в Фиг ! •В 00 О 0.01 0,1 1 10 100 1Q GQ | IT9302 (нг/мл) 1І) IT9302 подавляет спонтанное образование ИЛ-8 культуро моноцитов ( ) указывает уровень ИЛ-8 оря использовании рчИЛ-Ш (100 нгімя) Фиг 3 59 57702 60