Полімерні кон’югати із зменшеною антигенністю, способи їх отримання та їх застосування

1. Кон’югат, що містить один чи кілька біологічно активних компонентів, ковалентно зв’язаних, принаймні, з одним лінійним або розгалуженим поліалкіленгліколем, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь не має алкоксильної групи на жодному зі своїх кінців і зазначений поліалкіленгліколь приєднаний до одного біологічно активного компонента в одному місці на поліалкіленгліколі. 2. Кон’югат за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений кон’югат має зменшену або істотно зменшену антигенність порівняно із кон’югатом, що включає такий (такі) самий (самі) біологічно активний (активні) компонент (компоненти), з’єднаний (з’єднані) у тому самому місці на біологічно активному (активних) компоненті (компонентах) із такою самою кількістю поліалкіленгліколів такого самого розміру і лінійної чи розгалуженої структури, що містять одну або кілька кінцевих алкоксильних груп. 3. Кон’югат за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений лінійний або розгалужений поліалкіленгліколь вибирають із групи, що складається з полі(етиленгліколю) та співполімеру етиленоксиду і пропіленоксиду. 4. Кон’югат за п. 3, який відрізняється тим, що зазначений лінійний або розгалужений поліалкіленгліколь являє собою полі(етиленгліколь) ("PEG"). 5. Кон’югат за п. 1, який відрізняється тим, що приєднання зазначеного поліалкіленгліколю до зазна 2 (19) 1 3 14. Кон’югат за п. 13, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь має молекулярну масу від приблизно 18 кДа до приблизно 22 кДа. 15. Кон’югат за п. 14, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь має молекулярну масу приблизно 20 кДа. 16. Кон’югат за п. 13, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь має молекулярну масу від приблизно 27 кДа до приблизно 33 кДа. 17. Кон’югат за п. 1, який відрізняється тим, що названий кон’югат включає від приблизно однієї до приблизно 100 ниток зазначеного поліалкіленгліколю. 18. Кон’югат за п. 17, який відрізняється тим, що названий кон’югат включає від приблизно однієї до приблизно п’яти ниток зазначеного поліалкіленгліколю. 19. Кон’югат за п. 18, який відрізняється тим, що названий кон’югат включає приблизно одну або приблизно дві нитки зазначеного поліалкіленгліколю. 20. Кон’югат за п. 17, який відрізняється тим, що названий кон’югат включає від приблизно п’яти до приблизно 100 ниток зазначеного поліалкіленгліколю. 21. Кон’югат за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь вибирають з групи, що складається з моногідроксиPEG-кислоти і дигідроксиPEG-кислоти, такої як дигідроксиPEG-лізин. 22. Кон’югат за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь у разі, якщо він лінійний, має гідроксильну групу на кінці, що не приєднаний до біологічно активного (активних) компонента (компонентів) ("дистальний кінець"), або, якщо він розгалужений, має гідроксильну групу на кожному дистальному кінці. 23. Кон’югат за п. 5, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь являє собою реакційноздатну похідну названого лінійного дигідроксиPEG. 24. Кон’югат за п. 5, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь являє собою реакційноздатну похідну названої гідроксиPEGмонокарбонової кислоти. 25. Кон’югат за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений біологічно активний компонент вибирають з групи, яка складається з пептиду, білка, глікопротеїну, органічної сполуки, амін-вмісної сполуки, карбоксил-вмісної сполуки, гідроксилвмісної сполуки та тіол-вмісної сполуки. 26. Кон’югат за п. 25, який відрізняється тим, що зазначений біологічно активний компонент вибирають з групи, яка складається з пептиду, білка та глікопротеїну. 27. Кон’югат за п. 26, який відрізняється тим, що зазначений пептид, білок або глікопротеїн вибирають з групи, яка складається з ферменту, сироваткового білка, сироваткового глікопротеїну, білка клітин крові, пігментного білка, гемоглобіну, вірусного білка, пептидного гормону, білкового гормону, глікопротеїнового гормону, гіпоталамічного вивільнюючого гормону, цитокіну, фактора росту та пептидів, білків і глікопротеїнів, міметичних або функціонуючих як антагоністи до будь-якого елемента з зазначеної вище групи. 86002 4 28. Кон’югат за п. 27, який відрізняється тим, що зазначений сироватковий білок вибирають з групи, яка складається з альбуміну, імуноглобуліну, фактора згортання крові та пептидів, білків і глікопротеїнів, міметичних або функціонуючих як антагоністи до будь-якого з зазначених вище сироваткових білків. 29. Кон’югат за п. 27, який відрізняється тим, що зазначенийпептидний гормон, білковий гормон або глікопротеїновий гормон вибирають з групи, яка складається з антидіуретичного гормону, хоріонічного гонадотропіну, лютеїнізуючого гормону, фолікулостимулюючого гормону, інсуліну, пролактину, соматомедину, гормону росту, тиреостимулюючого гормону, плацентарного лактогену та пептидів, білків і глікопротеїнів, міметичних або функціонуючих як антагоністи до будь-якого з зазначених вище гормонів. 30. Кон’югат за п. 27, який відрізняється тим, що зазначений фактор росту вибирають з групи, яка складається з колонієстимулюючого фактора, фактора росту епідермісу, фактора росту фібробластів, інсулінподібного фактора росту, трансформуючого фактора росту, похідного фактора росту тромбоцитів, фактора росту нервів, фактора росту гепатоцитів, нейротрофічного фактора, ціліарного нейротрофічного фактора, нейротрофічного фактора мозкового походження, гліального нейротрофічного фактора або кісткового морфогенетичного пептиду та пептидів, білків і глікопротеїнів, міметичних або функціонуючих як антагоністи до будьякого з зазначених вище факторів росту. 31. Кон’югат за п. 27, який відрізняється тим, що зазначений цитокін вибирають з групи, яка складається з еритропоетину, лімфокіну, інтерлейкіну, інтерферону, фактора некрозу пухлини, фактора інгібування лейкемії та тромбопоетину та пептидів, білків і глікопротеїнів, міметичних або функціонуючих як антагоністи до будь-якого з зазначених вище цитокінів. 32. Кон’югат за п. 27, який відрізняється тим, що зазначений цитокін вибирають з групи, яка складається з гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора та його фрагментів, варіантів і похідних. 33. Кон’югат за п. 27, який відрізняється тим, що зазначений фермент вибирають з групи, що складається з вуглевод-специфічного ферменту, протеолітичного ферменту, оксидоредуктази, трансферази, гідролази, ліази, ізомерази та лігази. 34. Кон’югат за п. 33, який відрізняється тим, що зазначений фермент - оксиредуктаза являє собою уриказу. 35. Кон’югат за п. 33, який відрізняється тим, що зазначений протеолітичний фермент являє собою активатор плазміногена. 36. Кон’югат за п. 26, який відрізняється тим, що зазначений пептид, білок або глікопротеїн є алергеном. 37. Кон’югат за п. 1, який відрізняється тим, що зазначена біологічно активна сполука є таксаном або його похідною. 38. Кон’югат за п. 1, який відрізняється тим, що зазначена біологічно активна сполука є антибіотиком або його похідною. 5 39. Фармацевтична композиція, яка містить кон’югат за п. 1 та фармацевтично прийнятний наповнювач або носій. 40. Спосіб запобігання, діагностики або лікування фізичного розладу у тварини, який включає введення такій тварині ефективної кількості кон’югата за п. 1 або композиції за п. 39. 41. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що зазначеною твариною є ссавець. 42. Спосіб за п. 41, який відрізняється тим, що зазначеним ссавцем є людина. 43. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що зазначений фізичний розлад вибраний з групи, яка складається з раку, артриту, інфекційної хвороби, генетичного розладу, неврологічного розладу, метаболічного розладу, ферментного розладу, серцево-судинного захворювання та підвищеного кров’яного тиску. 44. Спосіб за п. 43, який відрізняється тим, що зазначений рак вибраний з групи, що складається з раку молочної залози, раку матки, раку яєчників, раку простати, раку яєчок, ріку легень, лейкемії, лімфоми, раку товстої кишки, шлунково-кишкового раку, раку підшлункової залози, раку міхура, раку нирок, раку кісток, неврологічного раку, раку голови та шиї, раку шкіри, та інших карцином, сарком, аденом та мієлом. 45. Спосіб за п. 43, який відрізняється тим, що зазначена інфекційна хвороба вибрана з групи, що складається з бактеріального захворювання, грибкового захворювання, вірусного захворювання та паразитарного захворювання. 46. Спосіб за п. 45, який відрізняється тим, що зазначене вірусне захворювання вибране з групи, що включає ВІЛ/СНІД і гепатит. 47. Спосіб за п. 43, який відрізняється тим, що зазначений генетичний розлад вибраний з групи, що складається з бокового аміотрофічного склерозу, кістозного фіброзу, хвороби Гоше, гемофілію та інші спадкові захворювання крові, хворобу Помпе та важкий комбінований імунодефіцит ("SCID"). 48. Спосіб за п. 43, який відрізняється тим, що зазначений неврологічний розлад вибраний з групи, що включає хворобу Альцгеймера та розсіяний склероз. 49. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що зазначеним введенням є парентеральне введення. 50. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим,що зазначене парентеральне введення є внутрішньовенним. 51. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що зазначеним введенням є пероральне введення. 52. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що зазначеним введенням є місцеве введення. 53. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що зазначене введення здійснюється шляхом інгаляції. 54. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що зазначеним введенням є ректальне введення. 55. Спосіб отримання кон’югата між біологічно активною сполукою та поліалкіленгліколем, активованим лише з одного кінця ("моноактивованим поліалкіленгліколем"), який включає: (a) отримання поліалкіленгліколю, що не містить жодної кінцевої групи, яка являє собою стабільно зв’язану алкоксильну групу; 86002 6 (b) необов’язково, перед перетворенням поліалкіленгліколю з етапу (а) на монофункціонально активований поліалкіленгліколь, захист усіх крім однієї кінцевих груп шляхом додавання однієї чи кількох блокуючих груп, що можуть вилучатись, таких як t-бутоксильна група (t-бутоксильні групи), арилоксильна група (арилоксильні групи) або трифенілметильна група (трифенілметильні групи) ("тритильна група (тритильні групи)"); (c) отримання монофункціонально активованої похідної зазначеного поліалкіленгліколю шляхом проведення його реакції з дериватизуючою сполукою або дериватизуючими сполуками за таких умов, що названий поліалкіленгліколь дериватизується однією дериватизуючою групою на кінці, де немає зазначеної (зазначених) блокуючої (блокуючих) групи (груп), що може (можуть) вилучатись; (d) у разі, якщо для захисну кінцевої групи (кінцевих груп) додавали блокуючу групу, як описано в етапі (b) вище, вилучення зазначеної блокуючої групи за один чи кілька етапів без вилучення активуючої групи, приєднаної, як описано в пункті (с) вище, з отриманням монофункціонально активованого поліалкіленгліколю, в якому дистальний кінець або дистальні кінці є гідроксильними групами; і (e) введення в контакт монофункціонально активованого поліалкіленгліколю з принаймні одним біологічно активним компонентом в умовах, що сприяють ковалентному зв’язуванню названого монофункціонально активованого поліалкіленгліколю із названим біологічно активним компонентом, або (f) альтернативно, виконання дій етапу (e) перед виконанням дій етапу (d). 56. Спосіб за п. 55, який відрізняється тим, що зазначену дериватизуючу групу вибирають з групи, що складається з альдегіду та карбоксильної групи. 57. Спосіб за п. 55, який відрізняється тим, що зазначену блокуючу групу вибирають з групи, що складається з тритильної групи, арилоксильної групи та t-бутоксильної групи. 58. Спосіб відділення лінійного моногідроксиPEGмоноальдегіду від відповідного PEG-діальдегіду, що включає: (a) перетворення усіх гідроксильних груп на PEGальдегіді на тритильні похідні; (b) відділення монотритилPEG-моноальдегіду від PEG-діальдегіду та будь-якого дитритилPEG шляхом хроматографії із оберненою фазою, та (c) перетворення монотритилPEG-моноальдегіду на моногідроксиPEG-моноальдегід шляхом гідролітичного вилучення тритильної групи у кислотному середовищі. 59. Спосіб за п. 58, який відрізняється тим, що зазначений альдегід або зазначені альдегіди перебувають у формі ацетальних похідних. 60. Кон’югат, отриманий у спосіб за п. 55. 61. Кон’югат за п. 60, який відрізняється тим, що зазначений кон’югат має зменшену або істотно зменшену антигенність порівняно із кон’югатом, що включає такий самий біологічно активний компонент, з’єднаний у тому самому місці чи місцях на біологічно активному компоненті із такою самою 7 кількістю молекул поліалкіленгліколю такого самого розміру і лінійної чи розгалуженої структури, що містять алкоксильну групу на дистальному кінці, якщо поліалкіленгліколь є лінійним, або містять дві чи більше алкоксильних груп на дистальних кінцях, якщо поліалкіленгліколь є розгалуженим. 62. Кон’югат за п. 60, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь вибирають із групи, що складається з полі(етиленгліколю) та співполімеру етиленоксиду і пропіленоксиду. 63. Кон’югат за п. 60, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленглікольний компонент вибирають із групи, що складається з лінійного полі(етиленгліколю) та розгалуженого полі(етиленгліколю). 64. Кон’югат за п. 60, який відрізняється тим, що кожен зазначений поліалкіленгліколь має молекулярну масу від приблизно 1кДа до приблизно 100кДа. 65. Кон’югат за п. 64, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь має молекулярну масу від приблизно 2 кДа до приблизно 60 кДа. 66. Кон’югат за п. 65, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь має дві гілки, кожна із молекулярною масою від приблизно 2 кДа до приблизно 30 кДа. 67. Кон’югат за п. 66, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь має дві гілки, кожна із молекулярною масою від приблизно 5 кДа до приблизно 20 кДа. 68. Кон’югат за п. 65, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь має молекулярну масу від приблизно 10 кДа до приблизно 20 кДа. 69. Кон’югат за п. 68, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь має молекулярну масу приблизно 12 кДа. 70. Кон’югат за п. 65, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь має молекулярну масу від приблизно 18 кДа до приблизно 60 кДа. 71. Кон’югат за п. 70, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь має молекулярну масу від приблизно 18 кДа до приблизно 22 кДа. 72. Кон’югат за п. 71, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь має молекулярну масу приблизно 20 кДа. 73. Кон’югат за п. 70, який відрізняється тим, що зазначений поліалкіленгліколь має молекулярну масу від приблизно 27 кДа до приблизно 33 кДа. 74. Кон’югат за п. 60, який відрізняється тим, що названий кон’югат включає від однієї до приблизно 100 ниток зазначеного поліалкіленгліколю. 75. Кон’югат за п. 74, який відрізняється тим, що названий кон’югат включає від приблизно однієї до приблизно п’яти ниток зазначеного поліалкіленгліколю. 76. Кон’югат за п. 75, який відрізняється тим, що названий кон’югат включає приблизно одну або приблизно дві нитки зазначеного поліалкіленгліколю. 77. Кон’югат за п. 74, який відрізняється тим, що названий кон’югат включає від приблизно п’яти до приблизно 100 ниток зазначеного поліалкіленгліколю. 78. Кон’югат за п. 60, який відрізняється тим, що зазначений монофункціонально активований полі 86002 8 алкіленгліколь, що використовується у синтезі названого кон’югата, вибирають із групи, що складається з гідроксиPEG-моноальдегіду та реакційноздатного складного ефіру гідроксиPEGмонокислоти. 79. Кон’югат за п. 60, який відрізняється тим, що зазначений монофункціонально активований поліалкіленгліколь, що використовується у синтезі названого кон’югата, має гідроксильну групу на своєму дистальному кінці у разі, якщо він лінійний, або по гідроксильній групі на кожному дистальному кінці у разі, якщо він розгалужений. 80. Кон’югат за п. 60, який відрізняється тим, що зазначений монофункціонально активований поліалкіленгліколь, що використовується в його синтезі, походить від лінійного дигідроксиPEG. 81. Кон’югат за п. 60, який відрізняється тим, що зазначений біологічно активний компонент вибирають з групи, яка складається з пептиду, білка, глікопротеїну, органічної сполуки, амін-вмісної сполуки, карбоксил-вмісної сполуки, гідроксилвмісної сполуки та тіол-вмісної сполуки. 82. Кон’югат за п. 81, який відрізняється тим, що зазначений біологічно активний компонент вибирають з групи, яка складається з пептиду, білка та глікопротеїну. 83. Кон’югат за п. 82, який відрізняється тим, що зазначений пептид, білок або глікопротеїн вибирають з групи, яка складається з ферменту, сироваткового білка, сироваткового глікопротеїну, білка клітин крові, пігментного білка, гемоглобіну, вірусного білка, пептидного гормону, білкового гормону, глікопротеїнового гормону, гіпоталамічного вивільнюючого гормону, цитокіну, фактора росту та пептидів, білків і глікопротеїнів, міметичних або функціонуючих як антагоністи до будь-якого елемента з зазначеної вище групи. 84. Кон’югат за п. 83, який відрізняється тим, що зазначений сироватковий білок вибирають з групи, яка складається з альбуміну, імуноглобуліну, фактора згортання крові та пептидів, білків і глікопротеїнів, міметичних або функціонуючих як антагоністи до будь-якого з зазначених вище сироваткових білків. 85. Кон’югат за п. 83, який відрізняється тим, що зазначений пептидний гормон, білковий гормон або глікопротеїновий гормон вибирають з групи, яка складається з антидіуретичного гормону, хоріонічного гонадотропіну, лютеїнізуючого гормону, фолікулостимулюючого гормону, інсуліну, пролактину, соматомедину, гормону росту, тиреостимулюючого гормону, плацентарного лактогену та пептидів, білків і глікопротеїнів, міметичних або функціонуючих як антагоністи до будь-якого з зазначених вище гормонів. 86. Кон’югат за п. 83, який відрізняється тим, що зазначений фактор росту вибирають з групи, яка складається з колонієстимулюючого фактора, фактора росту епідермісу, фактора росту фібробластів, інсулінподібного фактора росту, трансформуючого фактора росту, похідного фактора росту тромбоцитів, фактора росту нервів, фактора росту гепацитів, нейротрофічного фактора, ціліарного нейротрофічного фактора, нейротрофічного фактора мозкового походження, гліального нейротро 9 86002 10 фічного фактора або кісткового морфогенетичного пептиду та пептидів, білків і глікопротеїнів, міметичних або функціонуючих як антагоністи до будьякого з зазначених вище факторів росту. 87. Кон’югат за п. 83, який відрізняється тим, що зазначений цитокін вибирають з групи, яка складається з еритропоетину, лімфокіну, інтерлейкіну, інтерферону, фактора некрозу пухлини, фактора інгібування лейкемії та тромбопоетину та пептидів, білків і глікопротеїнів, міметичних або функціонуючих як антагоністи до будь-якого з зазначених вище цитокінів. 88. Кон’югат за п. 83, який відрізняється тим, що зазначений цитокін вибирають з групи, яка складається з гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора та його фрагментів, варіантів і похідних. 89. Кон’югат за п. 83, який відрізняється тим, що зазначений фермент вибирають з групи, що складається з вуглевод-специфічного ферменту, протеолітичного ферменту, оксидоредуктази, трансферази, гідролази, ліази, ізомерази та лігази. 90. Кон’югат за п. 89, який відрізняється тим, що зазначений фермент-оксиредуктаза являє собою уриказу. 91. Кон’югат за п. 89, який відрізняється тим, що зазначений протеолітичний фермент являє собою активатор плазміногена. 92. Кон’югат за п. 82, який відрізняється тим, що зазначений пептид, білок або глікопротеїн є алергеном. 93. Кон’югат за п. 60, який відрізняється тим, що зазначена біологічно активна сполука є таксаном або його похідною. 94. Кон’югат за п. 60, який відрізняється тим, що зазначена біологічно активна сполука є антибіотиком або його похідною. 95. Фармацевтична композиція, яка містить кон’югат за п. 60 та фармацевтично прийнятний наповнювач або носій. 96. Набір, що включає кон’югат за п. 1. 97. Набір, що включає фармацевтичну композицію за п. 39. 98. Набір, що включає кон’югат за п. 60. 99. PEG-ліпосомна композиція, яка відрізняється тим, що PEG компонент не має алкоксильної групи на жодному кінці, і кожна молекула PEG приєднана до єдиної ліпідної молекули в одному місці на ліпідній молекулі та молекулі PEG. 100. Композиція за п. 99, яка відрізняється тим, що зазначене місце приєднання являє собою аміногрупу фосфатиділетаноламіну. 101. Композиція за п. 99, яка відрізняється тим, що зазначене місце приєднання являє собою гідроксильну групу діацилгліцерину. 102. Композиція за п. 99, яка відрізняється тим, що зазначена композиція має зменшену або істотно зменшену імунореактивність порівняно з PEGліпосомною композицією, що містить принаймні один алкоксиPEG або PEG, приєднаний до ліпіду у більш ніж одному місці або до більш ніж однієї молекули ліпіду. Даний винахід відноситься до областей хімії білків та фармацевтичних і медичних наук. Зокрема, даний винахід забезпечує способи отримання кон'югатів водорозчинних полімерів (наприклад, полі(етиленгліколю) та його похідних) і біологічно активних компонентів, причому ці кон'югати мають меншу антигенність та імуногенність порівняно із стандартними кон'югатами полімерів та біологічно активних компонентів. Даний винахід також забезпечує кон'югати, отримані в такі способи, композиції, які містять зазначені кон'югати, набори, які включають такі кон'югати і композиції, та способи використання кон'югатів і композицій у запобіганні, діагностиці та лікуванні різних медичних та ветеринарних станів. Двома основними факторами, що ускладнюють розробку і застосування рекомбінантних білків як терапевтичних засобів, є їх, як правило, короткий час напівжиття у кровообігу та їх потенційна антигенність та імуногенність. У галузі техніки взагалі і тут зокрема термін "антигенність" означає здатність молекули зв'язуватись з вже існуючими антитілами, а термін "імуногенність" - спроможність викликати імунну реакцію in vivo, незалежно від того, чи включає ця реакція утворення антитіл ("гуморальну реакцію"), чи стимулює клітинні імунні реакції. Для введення рекомбінантних терапевтичних білків часто бажаним є внутрішньовенне (і.ν.) введення, оскільки воно забезпечує найвищу циркуляційну активність і мінімізує проблеми із біодоступністю та розкладанням. Проте, після i.v. введення час напівжиття дрібних білків, як правило, дуже нетривалий [див. приклади у Mordenti, J., та ін., (1991) Pharm Res 8:1351-1359; Kuwabara, Т., та ін. (1995) Pharm Res 12:1466-1469]. Здорові нирки зазвичай залишають у кровообігу білки, гідродинамічні радіуси яких перевищують радіус сироваткового альбуміну, для якого радіус Стокса становить с 36 А, а молекулярна маса - с 66000 Дальтон (66кДа). Проте, дрібніші білки, такі як гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор ("GCSF") та рибонуклеаза, швидко виводяться з кровотоку в процесі клубочкової фільтрації [Brenner, В.М., та ін. (1978) Am J Physiol 254:F455-F460; Venkatachalam, M.A., та ін. (1978) Circ Res 43:337347; Wilson, G., (1979) J Gen Physiol 74:495-509]. Внаслідок цього, підтримання терапевтично корисних концентрацій дрібних рекомбінантних білків у кровотоку після i.v. введення являє собою проблему. Отже, доводиться підвищувати концентрації таких білків та робити ін'єкції частіше. Високі дози збільшують вартість лікування, зменшують ймовірність виконання пацієнтом вимог та підвищують ризик негативних явищ, наприклад, імунних реакцій. Клітинні та гуморальні імунні реакції здатні зменшувати циркулюючі концентрації рекомбінантних білків, введених ін'єкцією, до рівня, що може унеможливити введення ефективної дози чи 11 призвести до явищ, що обмежуватимуть лікування, таких як анафілаксія [Pui, С.-Н., та ін. (2001) J Clin Oncol 19:697-704]. Інші шляхи введення, такі як підшкірні (s.c.) чи внутрішньом’язові (i.m.) ін’єкції, можуть подолати деякі з зазначених проблем, забезпечуючи більш поступове потрапляння рекомбінантних білків до кровообігу. Проте, біодоступність може виявитись досить низькою, що ускладнює забезпечення ефективних циркулюючих концентрацій таких ліків. Ще одна можлива проблема, пов'язана з низькою біодоступністю ліків, що вводяться s.c. або і.m., - це підвищення ймовірності розпадання терапевтичного білка у місці ін'єкції. Модифікація рекомбінантних білків шляхом ковалентного приєднання похідних полі(етиленгліколю) ("PEG") активно вивчалась із метою усунення зазначених вище недоліків [огляд у Sherman, M.R., та ін. (1997) в: Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications [Полі(етиленгліколь): Хімія та біологічне застосування], Harris, J.M., та ін., eds., American Chemical Society, Washington, D.C., стор. 155-169; Roberts, M.J., та ін. (2002) Adv Drug Deliv Res 54:459-476]. Було показано, що приєднання похідних PEG до білків стабілізує їх, покращує біодоступність і/або зменшує їх імуногенність in vivo. (Ковалентне приєднання похідних PEG до білка чи іншого субстрату називається тут, як і в галузі техніки, "РЕGілуванням"). Крім того, РЕGілування може привести до значного збільшення гідродинамічних радіусів білків. Якщо дрібний білок, такий як цитокін або поліпептидний гормон, приєднати до однієї довгої нитки PEG (яка, наприклад, має молекулярну масу, принаймні, 18кДа), то отриманий кон'югат матиме більший гідродинамічний радіус, ніж у сироваткового альбуміну, і його кліренс через ниркові клубочки значно затримуватиметься. Такі комплексні результати РЕGілування - зменшення протеолізу, зниження імунного розпізнавання та зменшення швидкості ниркового кліренсу - надають значні переваги щодо застосування РЕGілованих білків як лікувальних засобів. З 1970-х років робилися спроби використання ковалентного приєднання полімерів з метою підвищення безпечності та ефективності різних білків для їх фармацевтичного застосування [див., наприклад, патент США №4,179,337]. Деякі приклади включають приєднання PEG або полі(етиленоксиду) (РЕO) до аденозиндезамінази (EC 3.5.4.4) для використання у лікуванні важкого комбінованого імунодефіциту [Davis, S., та ін. (1981) СІіп Exp Immunol 46649-652; Hershfield, M.S., та ін. (1987) N Engl J Med 3/6589-596]. Інші приклади включають приєднання PEG до супероксиддисмутази (EC 1.15.1.1) для лікування запальних станів [Saifer, Μ., та ін., патенти США №№5,006,333 і 5,080,891] та до уратоксидази (ЕС 1.7.3.3) для усунення надлишку сечової кислоти з крові та сечі [Inada, Υ., заявка на патент Японії 55099189; Kelly, S.J., та ін., (2001) J Am Soc Nephrol 72:1001-1009; Williams, L.D., та ін. РСТ публікація WO 00/07629 A3, що відповідає патенту США №6,576,235; Sherman, M.R., та ін., РСТ публікація WO 01/59078 А2]. 86002 12 РЕО і PEG - це полімери, що складаються з ковалентно зв'язаних етиленоксидних ланок. Ці полімери мають таку загальну структуру: де R2 може бути гідроксильною групою (або її реакційноздатною похідною), a R1 може являти собою водень, як у "PEG діолі", метильну групу, як у монометоксиРЕС ("mPEG"), або іншу групу нижчого алкілу, як, наприклад, у ізо-пропоксиPEG або трет-бутоксиРЕG. Параметр n у загальній структурі PEG означає кількість етиленоксидних ланок в полімері та в галузі техніки і тут називається "ступінь полімеризації". PEG і РЕО можуть бути лінійними, розгалуженими [Fuke, І., та ін., (1994) J Control Release 30:27-34] або у формі зірки [Merrill, E.W. (1993) J Biomater Sci Polym Ed 5:1-11]. PEG та РЕО амфіпатичні, тобто вони розчинні у воді та деяких органічних розчинниках і можуть прилипати до ліпід-вмісних матеріалів, у тому числі вірусів, що містять оболонку, та мембран тваринних та бактеріальних клітин. Певні випадкові співполімери, блок-співполімери або переміжні співполімери етиленоксиду (ОСН2СН2) і пропіленоксиду структури: мають властивості, достатньо подібні до властивостей PEG, так що ці співполімери розглядають як придатні замінники PEG у деяких галузях застосування [див., наприклад, патенти США №№4,609,546 та 5,283,317]. Термін "поліалкіленоксиди" та скорочення "РАО" вживаються тут для позначення таких полімерів, так само як і для PEG чи РЕО та співполімерів полі(оксіетиленоксиметилен) [патент США №5,476,653]. Термін "поліалкіленгліколі" та скорочення "PAG" вживаються тут для загального позначення полімерів, придатних для використання у кон'югатах відповідно до винаходу, зокрема, PEG, а більш конкретно - PEG, що містять одну реакційноздатну групу ("монофункціонально активовані PEG"). Зазвичай, кілька (наприклад, від 5 до 10) ниток одного чи кількох PAG, наприклад, одного чи кількох mPEG із молекулярною масою від приблизно 5кДа до приблизно 10кДа, приєднуються до цільового білка через первинні аміногрупи (епсілонаміногрупи лізинових залишків та альфааміногрупу N-кінцевої амінокислоти). Недавно вдалося синтезувати кон'югати, що містять одну нитку mPEG із більшою молекулярною масою, наприклад, 12кДа, 20кДа або 30кДа. Було продемонстровано пряму залежність між часом напівжиття кон'югатів в плазмі та збільшенням молекулярної маси і/або збільшенням кількості приєднаних ниток PEG [Clark, R., та ін. (1996) J Biol Сhеm 277:21969-21977]. З іншого боку, із збільшенням кількості ниток PEG зростає і ймовірність того, що аміногрупа на суттєвій ділянці біологічно активного компонента (особливо, якщо біологічно активний компонент є білком) буде модифікована, що послабить його біологічну функцію (наприклад, каталіз для ферменту або рецепторне зв'язування для цитокіну). Для більших білків, що 13 містять багато аміногруп, та для ферментів із субстратами з малою молекулярною масою цей компроміс між подовженою тривалістю дії та зменшеною питомою активністю може бути прийнятним, оскільки він забезпечує чисте збільшення біологічної активності in vivo кон'югатів, що містять PEG. Проте, для дрібніших білків, таких як поліпептидні гормони і цитокіни, відносно високий ступінь заміщення ймовірно призведе до такого зменшення функціональної активності, коли нанівець буде зведена перевага подовженого часу напівжиття в кровотоку [Clark, R., та ін., див. вище]. Деякі з винахідників, названих у цій заявці, свого часу відкрили різні стратегії РЕGілування та застосували їх до деяких білків з метою отримання бажаного поєднання доброї фармакокінетики та більшої активності in vivo. Серед цих білків був гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор ("GM-CSF") [Saifer, M.G.P., та ін. (1997) Polym Preprints 38:576-577; Sherman, M.R., та ін. (1997) див. вище] та рекомбінантна уратоксидаза ссавців [див. РСТ публікації WO 00/07629 і WO 01/59078; Kelly, S.J., та ін., див. вище; патент США №6,576,235]. Використовуючи GM-CSF як цитокін-модель, деякі з названих тут винахідників показали, що приєднання одної чи кількох ниток mPEG із високою молекулярною масою (близько 36кДа) є достатнім для істотного збільшення активності рекомбінантного мишачого GM-CSF in vivo [Saifer, M.G.P., та ін. (1997) див. вище; Sherman, M.R., та ін. (1997) див. вище]. Також були проведенні дослідження, в яких рекомбінантну уратоксидазу (уриказу) ссавця модифікували та вивчали як потенційні ліки проти важковиліковної подагри [див. РСТ публікації WO 00/07629, що відповідає патенту США №6,576,235, та WO 01/59078, повне викладення яких включено сюди шляхом посилання]. При використанні PEGурикази для лікування миші з дефіцитом урикази (uox-/-), у якої спостерігали сильну викликану сечовою кислотою нефропатію, було виявлено, що ліки добре переносились, були ефективними і, по суті, неімуногенними. У миші, яку лікували, спостерігали покращення функції нирок протягом часу лікування (10 тижнів) та значно менше ураження нирок, пов'язане із сечовою кислотою, ніж у миші uох-/-, яку не лікували. Це підтвердили результати мікроскопічної магнітно-резонансної візуалізації [Kelly, S.J., та ін. (2001) див. вище]. Ковалентне зв'язування ниток PEG із молекулою поліпептиду розкрито у патенті США №4,179,337, виданому Davis, F.F., та ін., а також у Abuchowski, Α., та ін. (1981) в: Enzymes as Drugs [Ферменти - ліки], Holcenberg, J.S., та ін., eds., John Wiley and Sons, New York, стор.367-383. В цих джерелах показано, що ферменти та інші білки, модифіковані mPEG, мають зменшену імуногенність та антигенність та характеризуються більш тривалим часом життя у кровотоку порівняно із відповідними немодифікованими білками. Ці покращенні властивості хімічно модифікованих кон'югатів дуже корисні у різних видах терапевтичного застосування. Для здійснення ковалентного приєднання PEG або поліалкіленоксидів до білка принаймні одну з 86002 14 гідроксильних кінцевих груп полімеру необхідно спочатку перетворити на реакційноздатну функціональну групу. Цей процес часто називають "активацією", а продукт - "активованим PEG" або активованим поліалкіленоксидом. Як правило, використовують монометоксиРЕG, кепований на одному кінці нереакційноздатним, хімічно стабільним метиловим ефіром ("метоксильна група") а на другому кінці - функціональною групою, що може реагувати з аміногрупами на молекулі білка. Менш часто застосовують так звані "розгалужені" mPEG, що містять дві чи більше метоксильні групи, розташовані по периферії від активованої функціональної групи. Прикладом може служити ди-mPEGлізин, в якому карбоксильна група лізину частіше за все активується шляхом естерифікації Nгідроксисукцинімідом [Harris, J.M., та ін., патент США №5,932,462]. Активовані полімери реагують із терапевтичним засобом, що має нуклеофільні функціональні групи, які служать сайтами приєднання. Однією з нуклеофільних функціональних груп, що зазвичай використовуються як сайти приєднання, є епсілонаміногрупа лізинових залишків. Також в якості сайтів приєднання використовують вільні карбоксильні групи, прийнятним чином активовані карбонільні групи, окислені вуглеводні частини та групи тіолу. Гідроксильну групу mPEG активували ціанурхлоридом, а потім отриману сполуку зв'язували з білками [Abuchowski, Α., та ін. (1977) J ВіоІ Сhеm 252:3582-3586; Abuchowski, Α., та ін. (1981) див. вище]. Проте, використання цього метода має недоліки, такі як токсичність ціанурхлориду та його неспецифічна реакційна здатність із білками, що мають відмінні від амінів функціональні групи, такі як доступні із розчинником цистеїнові чи тирозинові залишки, котрі можуть бути незамінними для функціонування. Для подолання цих та інших недоліків були запропоновані інші активовані PEG, такі як сукцинімідилсукцинатні похідні mPEG ("SS-PEG") [Abuchowski, Α., та ін. (1984) Cancer Biochem Biophys 7:175-186]. У м'яких умовах SS-PEG швидко реагує із білками (протягом 30 хвилин) із одержанням активних і сильно модифікованих кон'югатів. М. Saifer, та ін. у патенті США №5,468,478 розкриває поліалкіленгліколь-моно-Nсукцинімідилкарбонати та отримані з них кон'югати. S. Zalipsky в патенті США №5,612,460 розкриває способи приготування полі(етиленгліколь)-Nсукцинімідилкарбонатів. Ця форма полімеру ("SCPEG") швидко реагує з аміногрупами білків, а також пептидами із низькою молекулярною масою та іншими матеріалами, що містять вільні аміногрупи, з якими він утворює уретанові зв'язки. З рівня техніки також відомо, що уретанові (або карбаматні) зв'язки між аміногрупами білка та PEG отримують, виходячи з інших PEGкарбонатних похідних [Beauchamp, С, та ін. (1983) Anal Biochem 131:25-33; Veronese, F.M., та ін. (1985) Appl Biochem Biotechnol 77:141-152]. З рівня техніки також відомі реакційноздатні проміжні продукти mPEG та способи їх використання у синтезі PEG-кон'югатів біологічно активних компонентів із 15 приєднанням амідними зв'язками, складноефірними зв'язками, вторинними амінними та тюефірними зв'язками та ін. Т. Suzuki та ін. [(1984) Biochim Biophys Acta 788:248-255] ковалентно приєднали імуноглобулін G ("IgG") до mPEG, активованого ціанурхлоридом. Вони вивчали біологічні та фізико-хімічні властивості, такі як антигензв'язуваль'на активність та молекулярна структура, хроматографічна поведінка із виключенням за розміром, поверхнева активність, міжповерхнева здатність до агрегації та здатність до агрегації при нагріванні, що спричиняє неспецифічну активацію комплементу кон'югатами PEG-lgG. Приєднання PEG до IgG збільшило радіус Стокса, що спостерігається, та поверхневу активність IgG, a також стабілізувало IgG до дії нагрівання і/або відкривання поверхні поділу. При цьому структурної денатурації IgG не спостерігали. Причину пригнічення неспецифічної здатності до агрегації, в основному, вбачають у стеричному інгібуванні асоціації РЕGілованих молекул IgG. Ці результати демонструють корисність з'єднаного з mPEG IgG в якості внутрішньовенного препарату, а також показали можливу корисність PEG як допоміжної речовини для стабілізації немодифікованого IgG при внутрішньовенному застосуванні. К.А. Sharp та ін. [(1986) Anal Biochem 754:110117] досліджували можливість отримання лігандів із біоспецифічною спорідненістю для поділу клітин у водних двофазних полімерних системах на основі антигенів клітинної поверхні. Кролячий IgG проти еритроцитів людини реагував із активованими ціанурхлоридом mPEG з молекулярними масами приблизно 0,2, 1,9 та 5кДа при різних молярних відношеннях PEG до лізинових груп на білку. Коефіцієнт розподілу білка у двофазній системі, що містить декстран та PEG, збільшувався із зростанням ступеню модифікації та збільшенням молекулярної маси mPEG. Спостерігається супутня втрати здатності до аглютинації еритроцитів людини. R.H. Tullis у патенті США №4,904,582 розкриває олігонуклеотидні кон'югати, в яких олігонуклеотиди з'єднуються через з'єднувальну ділянку із гідрофобною частиною, що може являти собою поліоксиалкіленову групу. Повідомляється, що отримані кон'югати є більш ефективними у мембранному транспорті, оскільки здатні перетинати мембрану та ефективно модулювати транскрипційну систему. Таким чином, композиції можуть використовуватись in vitro та in vivo для вивчення клітинних процесів, захисту хазяїнів-ссавців від патогенних організмів, розвитку генної терапії тощо. Проте, надмірна кон'югація полімерів та/або кон'югація, що зачіпляє активну ділянку лікувальної частини, де розташовані групи, пов'язані із біологічною активністю, часто може призводити до втрати активності, а отже і терапевтичної дії. Так часто і відбувається з пептидами із низькою молекулярною масою, що мають кілька сайтів взаємодії, які не пов'язані із біологічною активністю. Наприклад, І. Benhar та ін. [(1994) Bioconjug Сhеm 5:321-326] спостерігали, що РЕGілування рекомбінантного одноланцюжкового імунотоксину призве 86002 16 ло до втрати специфічної цільової імунореактивності імунотоксину. Втрата активності імунотоксину стала результатом приєднання PEG до двох лізинових залишків на ділянці взаємодії з антигеном імунотоксину. Хоча ковалентне приєднання PAG і РАО (наприклад, PEG, PEO тощо) до терапевтичних білків має на меті усунути їх імунореактивність, PEGіловані білки залишаються слабко імуногенними. Вважається, що ця імуногенність спричинена, принаймні частково, тим фактом, що полімери PEG та РАО самі по собі дещо антигенні та імуногенні. Наприклад, кролів імунізували до різних PEG шляхом введення тваринам кон'югатів, в яких PEG було приєднано до імуногенного білка-носія [Richter, A.W., та ін. (1983) Int Arch Allergy Appl Immunol 70:124-131]. Крім того, було продуковане моноклональне антитіло, що реагує з поліефірним основним ланцюгом PEG, шляхом ін'єкування миші mPEG кон'югата β-глюкуронідази та вибору клону гібридоми, що виділяє анти-PEG антитіло [Cheng, T.-L, та ін. (1999) Bioconjug Chem 10:520528; Cheng, T.-L, та ін. (2000) Bioconjug Chem 11:258-266; Tsai, N.-M., та ін. (2001) Biotechniques 30:396-402; Roffler, S., та ін., патенти США №№6,596,849 і 6,617,118; розкриття усіх їх включено сюди шляхом посилання у всій повноті]. Інше моноклональне антитіло, що реагує із поліефірним основним ланцюгом PEG, було нещодавно розкрите Roberts, M.J., та ін. у патентній заявці США № 2003/001704 А1. Кілька дослідників розкрили отримання лінійних або розгалужених "неантигенних" PEG полімерів та їх похідних чи кон'югатів [див., наприклад, патенти США №№5,428,128; 5,621,039; 5,622,986; 5,643,575; 5,728,560; 5,730,990; 5,738,846; 5,811,076; 5,824,701; 5,840,900; 5,880,131; 5,900,402; 5,902,588; 5,919,455; 5,951,974; 5,965,119; 5,965,566; 5,969,040; 5,981,709; 6,011,042; 6,042,822; 6,113,906; 6,127,355; 6,132,713; 6,177,087 та 6,180,095; див. також РСТ публікацію WO 95/13090 та опубліковані патентні заявки США №№2002/0052443, 2002/0061307 та 2002/0098192]. У більшості прикладів з зазначених вище патентів та патентних заявок використовуються полімери, що містять одну чи кілька ниток mPEG, наприклад, ди-mРЕG-лізин. Проте, досі не було розкрито механізму позбавлення PEG антигенних властивостей у таких полімерах чи кон'югатах. Отже, існує потреба в ідентифікації методів отримання РАО-вмісних (наприклад, PEG- і/або РЕО-вмісних) кон'югатів, зокрема, кон'югатів між такими водорозчинними полімерами та терапевтичними білками, що мають зменшену, істотно зменшену антигенність або антигенність, що не піддається виявленню. Ці кон'югати матимуть переваги, що їх забезпечує полімерний компонент і які полягають у підвищеній стійкості та біодоступності in vivo, але не викликатимуть істотної імунної реакції в організмі тварини, якій ці кон'югати ввели к лікувальною чи діагностичною метою. Даний винахід спрямовано на вирішення поставлених вище питань. Винахід забезпечує способи отримання кон'югатів водорозчинних полімерів 17 (наприклад, полі(етиленгліколю) та його похідних) і біологічно активних компонентів, зокрема, терапевтичних біологічно активних компонентів, таких як білки. Винахід також забезпечує полімери та їх кон'югати, отримані у такі способи, причому зазначені полімери та їх кон'югати характеризуються меншою антигенністю та імуногенністю порівняно з алкоксил-вмісними полімерами і кон'югатами такого самого біологічно активного компонента, отриманими із використанням алкоксиРЕG, наприклад, mPEG. Винахід також забезпечує композиції, які містять зазначені кон'югати, набори, які містять такі кон'югати і композиції, та способи використання кон'югатів і композицій у різноманітних терапевтичних і діагностичних режимах. В одному аспекті винахід забезпечує кон'югат, що містить один чи кілька біологічно активних компонентів, ковалентно зв'язаних, принаймні, з одним лінійним або розгалуженим монофункціонально активованим поліалкіленгліколем, причому цей монофункціонально активований поліалкіленгліколь не має метоксильної групи, іншої алкоксильної чи арилоксильної групи на жодному з своїх кінців. У певних таких варіантах втілення кон'югат має зменшену або істотно зменшену антигенність порівняно з кон'югатом, отриманим із використанням алкоксиполі(етиленгліколю), наприклад, mPEG, або розгалуженого полімеру, що містить mPEG, такого як ди-mРЕG-лізин. Поліалкіленгліколі, що особливо підходять для використання в синтезі кон'югатів відповідно до цього винаходу, включають (не обмежуючись названим) полі(етиленгліколі) та співполімери етиленоксиду та пропіленоксиду; особливо прийнятними є PEG, а ще більш прийнятними - монофункціонально активовані PEG (наприклад, PEG, активовані на одному кінці, включаючи гідроксиРЕGмоноальдегіди, гідроксиРЕG-моновінілсульфони, реакційноздатні складні ефіри гідроксиРЕGмонокарбонових кислот та гідроксиРЕGмонофенілкарбонатні похідні). Інші проміжні сполуки, які можуть використовуватись у синтезі реакційноздатних полімерних похідних, включають інші гідроксиРЕG-монокислоти та гідроксиРЕGмоноацеталі. У деяких таких варіантах втілення поліалкіленгліколь має молекулярну масу від приблизно 1000 Дальтон до приблизно 100кДа, більш прийнятно від приблизно 2кДа до приблизно 60кДа; від приблизно 2кДа до приблизно 30кДа, від приблизно 5кДа до приблизно 20кДа; від приблизно 10кДа до приблизно 30кДа; від приблизно 10кДа до приблизно 20кДа; дві гілки, кожна із молекулярною масою від приблизно 2кДа до приблизно 30кДа; а більш прийнятно - дві гілки, кожна з яких має молекулярну масу від приблизно 18кДа до приблизно 22кДа. Кон'югати відповідно до цього аспекту винаходу можуть містити одну чи кілька ниток поліалкіленгліколю, у деяких варіантах втілення, більш прийнятно, від приблизно однієї до приблизно 10 ниток, від приблизно однієї до приблизно п'яти ниток, ще більш прийнятно, від приблизно однієї до приблизно трьох ниток і, найбільш прийнятно, від приблизно однієї до приблизно двох ниток; в інших варіантах втілення, більш прийнятно, від приблизно 86002 18 п'яти до приблизно 100 ниток, від приблизно 10 до приблизно 50 ниток і, ще більш прийнятно, від приблизно шести до приблизно 20 ниток на субланку білка-ферменту із високою молекулярною масою. У особливо прийнятному такому варіанті втілення поліалкіленгліколь, що використовується в кон'югаті, включає одну чи дві нитки монофункціонально активованого полі(етиленгліколю) (наприклад, реакційноздатний складний ефір гідроксиРЕG-монокислоти, гідроксиРЕG-моноальдегід, гідроксиРЕG-моновінілсульфон або гідроксиРЕGмонофенілкарбонатна похідна) із молекулярною масою від приблизно 18кДа до приблизно 22кДа або від приблизно 27кДа до приблизно 33кДа. Біологічно активні компоненти, підхожі для використання у кон'югатах або композиціях відповідно до винаходу, включають (не обмежуючись названим) різні пептиди, білки, глікопротеїни, органічні сполуки, амін-вмісні сполуки, карбоксилвмісні сполуки, гідроксил-вмісні сполуки та тіолвмісні сполуки. Винахід також надає способи отримання кон'югатів між біологічно активною сполукою та монофункціонально активованим поліалкіленгліколем, які, наприклад, включають: (а) отримання або приготування лінійного чи розгалуженого поліалкіленгліколю, що містить принаймні одну нереагуючу блокуючу групу, яку можна потім вилучити, таку як одна чи кілька трифенілметильних груп ("тритильних груп"); (b) отримання похідної поліалкіленгліколю шляхом проведення його реакції із принаймні одною дериватизуючою сполукою за таких умов, що поліалкіленгліколь дериватизується однією дериватизуючою групою (такою, як карбоксильна група) на кінці, де немає блокуючої (блокуючих) групи (груп); (с) вилучення блокуючої (блокуючих) групи (груп) без вилучення дериватизуючої групи з отриманням, за один чи кілька етапів, монофункціонально активованого поліалкіленгліколю; та (d) введення в контакт монофункціонально активованого поліалкіленгліколю з принаймні одним біологічно активним компонентом в умовах, що сприяють ковалентному зв'язуванню біологічно активного компонента із монофункціонально активованим поліалкіленгліколем. Більш прийнятно, кон'югати, отримані в такі способи, мають зменшені, істотно зменшені антигенність та імуногенність або антигенність та імуногенність, що не піддаються виявленню, порівняно із кон'югатами, дериватизованими такою самою мірою, із mPEG подібного розміру, структури та зв'язку із біологічно активним агентом. Винахід також забезпечує кон'югати, отримані в такі способи. Винахід також забезпечує фармацевтичні або ветеринарні композиції, які містять кон'югати відповідно до винаходу та принаймні один наповнювач або носій, що є прийнятним для фармацевтичного або ветеринарного застосування. У додаткових варіантах втілення винахід також забезпечує способи запобігання, діагностики або лікування фізичних розладів у тварин (таких як ссавці, в тому числі і люди) із використанням кон'югатів чи композицій відповідно до цього винаходу. Один такий спосіб включає, наприклад, введення тварині, яка страждає на або має схильність 19 до фізичного розладу (такого, як анемія, артрит, рак, хвороба Альцгеймера, ферментна недостатність, серцево-судинне захворювання, підвищений кров'яний тиск, інфекційні хвороби, порушення обміну речовин, неврологічні розлади, нейтропенія, гіперурикемія та її прояви (наприклад, подагра), захворювання чи розлади, спричинені генетично зумовленою недостатністю, тощо), ефективної кількості одного чи кількох кон'югатів або композицій відповідно до винаходу, що можуть вводитись тварині, зокрема, ссавцю і, головним чином, людині перорально, локально або парентерально, наприклад, внутрішньовенно, внутрішньом'язово або підшкірно. У додаткових варіантах втілення даний винахід забезпечує композиції, які включають один чи кілька кон'югатів із зменшеною антигенністю відповідно до винаходу, та можуть ще включати один чи кілька додаткових компонентів або реагентів, таких як одна чи кілька буферних солей, один чи кілька вуглеводних наповнювачів, один чи кілька білків-носіїв, один чи кілька ферментів, один чи кілька детергентів, одна чи кілька молекул нуклеїнових кислот, один чи кілька полімерів, таких як PEG, тощо. Винахід також забезпечує набори, що містять кон'югати із зменшеною антигенністю і/або композиції відповідно до винаходу. У додаткових варіантах втілення винахід забезпечує PEG-ліпосоми із зменшеною імунореактивністю, отримані із використанням монофункціонально активованих поліалкіленгліколів, що не мають метоксильних або інших алкоксильних груп, а не монофункціонально активованого mPEG. Інші більш прийнятні варіанти втілення даного винаходу будуть очевидними для спеціалістів із звичайним рівнем знань у цій галузі техніки у світлі наведених далі креслень, опису винаходу та формули винаходу. На Фіг.1 подані результати конкурентного ферментного імуносорбентного аналізу ("ELISA"). У цьому дослідженні mPEG кон'югат одного білка зв'язували із 96-лунковим аналітичним планшетом та визначали інгібування зв'язування кролячих антитіл з mPEG кон'югатом іншого білка розчинами mPEG або t-бутоксиРЕG. На Фіг.2а подані результати конкурентного ELISA, проведеного як пояснено для Фіг.1 із використанням PEG різного розміру та структури, що містять одну або дві метоксильні групи. Результати зв'язування антитіл наведено у вигляді графіка - функції молярної концентрації метоксильних груп у кожному зразку. На Фіг.2b подані ті самі дані, що і на Фіг.2а, але у вигляді функції не молярної концентрації метоксильних груп, а масової концентрації PEG (мкг/мл). На Фіг.3 подані деякі з даних на Фіг.1, 2а та 2b у форматі, що демонструє пряму залежність антигенності від числа метоксильних груп на молекулу PEG. Ці зразки включають 10-кДа PEG, один з яких не має метоксильної групи (t-бутоксиРЕG), один містить одну метоксильну групу (mPEG) і один містить дві метоксильні групи [Ди-(5-кДа) mPEG-лізин]. 86002 20 На Фіг.4 проілюстровано конкурентний ELISA, такий як описано для Фіг.1, в якому 4,8-кДа mPEG порівнюють із трьома PEG відповідно до винаходу, які не мають метоксильних груп на кінцях лінійного полімеру (позначені як "PharmaPEG"). Відстань між кривими по горизонтальній осі показує, що антигенності усіх трьох PEG відповідно до винаходу приблизно у 100 разів менші, ніж у mPEG при проведенні аналізу із анти-mPEG антитілами. На Фіг.5а показані результати дослідження, в якому зразки ізомеру карбоангідрази ("СА II") і такої самої карбоангідрази, з'єднаної із, в середньому, 3-4 нитками 5-кДа rnPEG, аналізували методом електрофорезу в поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію ("SDSPAGE"). Смужки 1 та 2 у гелі показують результати, отримані із забарвленням білка Рубіновим марки SYPRO® та фотографуванням у темній шафі із освітленням 302нм. Смужки 3 та 4 показують результати вестерн-блоттингу кон'югатів mPEG та неРЕGілованого ферменту, відповідно, в якому в якості первинних антитіл використовували поліклональні кролячі анти-mPEG антитіла. Смужка 5 показує положення попередньо забарвлених білкових стандартів. На Фіг.5b подано кількісний аналіз інтенсивностей смуг у гелі та вестерн-блотингу, показаних на Фіг.5а. Аналіз проведено із використанням фотоапарата Kodak та програмного забезпечення для цифрової обробки зображень. Горизонтальна вісь представляє відстань переміщення відносно фронту барви, а вертикальна вісь - відносні інтенсивності забарвлення білка або забарвлення антиmPEG. Нижня крива являє собою смуги попередньо забарвлених стандартних білків із середньою молекулярною масою (зліва направо) 203,8, 110,9, 68,8, 51,5, 40,2, 28,9, 20,7 і 14,9кДа. Друга крива знизу відповідає забарвленню антитілами антиmPEG РЕGілованої карбоангідрази. Третя крива знизу відповідає забарвленій білком смузі карбоангідрази, а верхня крива - забарвленим білком смугам mPEG кон'югатів карбоангідрази. На Фіг.6а та 6b подані результати ELISAаналізів сироватки з груп з трьох кроликів, яких імунізували кон'югатами свинячої урикази, що містить, в середньому, приблизно дві нитки mPEG або гідроксиРЕG ("PharmaPEG") на субланку урикази. Антитіла проти урикази визначали за допомогою аналітичних планшетів, покритих свинячою уриказою. Антитіла проти PEG визначали за допомогою чашок, покритих кон'югатами неспорідненого білка, приєднаного до mPEG. На Фіг.6а подані дані другого взяття крові кроликів, яким було зроблено чотири ін'єкції PEG-урикази в неповному ад'юванті Фрейнда. На Фіг.6b подані дані третього взяття крові тих самих кроликів після того, як їм було зроблено п'ять ін'єкцій PEG-урикази в неповному ад'юванті Фрейнда. Якщо не визначено інакше, усі технічні та наукові терміни, які вживаються тут, мають значення, що відповідають звичайному розумінню їх спеціалістом із звичайним рівнем знань у галузі техніки, до якої належить цей винахід. Хоча у практиці даного винаходу або для його тестування можуть використовуватись будь-які способи і матеріали, 21 аналогічні або еквівалентні описаним тут, нижче будуть описані більш прийнятні методи та матеріали. Приблизно: Термін "приблизно", що вживається стосовно будь-якої числової величини, означає діапазон ±10% від зазначеної величини (наприклад, "приблизно 50°С" охоплює діапазон температур від 45°С до 55°С, включно; аналогічно, "приблизно 100мМ" охоплює діапазон концентрацій від 90мМ до 110мМ, включно). Біологічно активний компонент: Термін "біологічно активний компонент", що вживається тут, означає сполуку, молекулу, частину або комплекс, який має певну біологічну активність in vivo, in vitro чи ex vivo на клітину, тканину, орган або організм і який може з'єднуватись із одним чи кількома поліалкіленгліколями із утворенням кон'югатів відповідно до винаходу. Більш прийнятні біологічно активні компоненти докладно описані нижче. Зв'язок: Термін "зв'язок", що вживається тут, означає приєднання чи зв'язок, що може бути ковалентним, наприклад, хімічний зв'язок, або нековалентним, наприклад, міжіонні взаємодії, гідрофобні взаємодії, водневі зв'язки тощо. Ковалентні зв'язки можуть бути, наприклад, складноефірними, ефірними, фосфоскладноефірними, тіоскладноефірними, тіоефірними, уретановими, амідними, пептидними, імідними, вуглець-сірковими зв'язками, вуглець-фосфорними зв'язками тощо. Термін "зв'язок" є ширшим від понять "приєднаний", "з'єднаний" і "прикріплений" та включає їх. (2) З'єднаний: Термін "з'єднаний", що вживається тут, означає приєднання ковалентними зв'язками або сильними нековалентними взаємодіями, але, як правило і більш прийнятно, - приєднання ковалентними зв'язками. Будь-який спосіб, що зазвичай використовується спеціалістами у цій галузі техніки для приєднання біологічно активних матеріалів, може застосовуватись у даному винаході. Захворювання, розлад, стан: Терміни "захворювання" або "розлад", що вживаються тут, означають будь-який несприятливий стан людини або тварини, що включає пухлини, рак, алергії, залежність, аутоімунність, отруєння або погіршення розумових чи фізичних функцій порівняно з оптимальним рівнем. "Стани" включають тут хвороби та розлади, а також стосуються фізіологічних станів. Наприклад, фертильність є фізіологічним станом, але не захворюванням і не розладом. Композиції відповідно до винаходу, що придатні для запобігання вагітності шляхом зменшення фертильності, будуть описані як такі, що призначені для лікування стану (фертильності), але не для лікування захворювання чи розладу. Спеціалісти із звичайним рівнем знань у цій галузі техніки зрозуміють інші стани. Ефективна кількість: Термін "ефективна кількість", що вживається тут, означає кількість того чи іншого кон'югата або композиції, яка є необхідною чи достатньою для одержання бажаної біологічної дії. Ефективною кількістю названого кон'югата або композиції відповідно до цього винаходу буде кількість, яка забезпечує досягнення вибраного результату. Спеціаліст у цій галузі техніки у звичайний спосіб може визначити цю кількість. 86002 22 Наприклад, ефективною кількістю для лікування недостатності імунної системи буде кількість, необхідна для активації імунної системи, що призведе до появи антиген-специфічної імунної реакції у відповідь на появу антигену. Цей термін є синонімом поняття "достатня кількість". Для того чи іншого застосування ефективна кількість може бути різною, залежно від таких чинників, як захворювання чи стан, які лікують, конкретна композиція, що вводиться, розмір пацієнта і/або важкість захворювання чи стану. Спеціаліст із звичайним рівнем знань у цій галузі техніки може емпіричним шляхом визначити ефективну кількість конкретного кон'югата або композиції відповідно до даного винаходу без необхідності в зайвому експериментуванні. Імунна реакція: Термін "імунна реакція", що вживається тут, означає гуморальну імунну реакцію (тобто, утворення антитіл) і/або клітинну імунну реакцію, що веде до активації або проліферації В- і/або Т-лімфоцитів і/або антиген-презентуючих клітин. Однак, у деяких випадках імунні реакції можуть бути слабкими і виявлятись лише при використанні принаймні однієї речовини, що відповідає цьому винаходу. "Імуногенний" є характеристикою агента, що означає його здатність стимулювати імунну систему живого організму таким чином, що одна чи кілька функцій імунної системи посилюються і спрямовуються проти імуногенного агента. "Один", відсутність чіткої вказівки "цей, даний" чи вказівки щодо кількості: Термін "один" та відсутність чіткої вказівки "цей, даний" чи вказівки щодо кількості у даному описі означають "принаймні один" або "один чи кілька", якщо не зазначено іншого. Поліпептид: Термін "поліпептид", що вживається тут, означає молекулу, яка складається з мономерів (амінокислот), лінійно з'єднаних амідними зв'язками (які також називаються пептидними зв'язками). Термін позначає молекулярний ланцюжок амінокислот, але не зазначає конкретної його довжини. Таким чином, визначення поліпептиду охоплює дипептиди, трипептиди, олігопептиди, пептиди невизначеної довжини та білки. Цей термін також вживається щодо продуктів постекспресійних модифікацій поліпептиду, наприклад, глікозилування, ацетилування, фосфорилування тощо. Поліпептид може бути рекомбінантним або отриманим з природного біологічного джерела, але не обов'язково трансльованим з названої амінокислотної послідовності. Він може бути створеним у будь-який спосіб, включаючи й хімічний синтез. Білок та глікопротеїн: Термін "білок", що вживається тут, означає поліпептид, який, як правило, має розмір завбільшки від приблизно 5 чи більше, 10 чи більше, 20 чи більше, 25 чи більше, 50 чи більше, 75 чи більше, 100 чи більше, 200 чи більше, 500 чи більше, 1000 чи більше або 2000 чи більше амінокислот. Взагалі, білки мають визначену тривимірну структуру, хоча це і не обов'язково, і їх часто називають упорядкованими, на відміну від пептидів та поліпептидів, які часто не мають визначеної тривимірної структури, а можуть набува 23 ти великої кількості різних конформацій і називаються неупорядкованими. Проте, пептиди можуть мати визначену тривимірну структуру. Термін "глікопротеїн", що вживається тут, означає білок, що містить принаймні одну цукрову частину, приєднану до білка через кисень-вмісний або азот-вмісний боковий ланцюжок амінокислоти, наприклад, серин або аспарагін. Очищений: Термін "очищений", що вживається тут стосовно молекули, означає, що концентрацію очищених молекул було збільшено порівняно із молекулами, пов'язаними з їх природним середовищем або середовищем, в якому їх було отримано, виявлено чи синтезовано. Пов'язані з природним середовищем молекули включають білки, нуклеїнові кислоти, ліпіди та цукри, але, в загальному випадку, не включають воду, буфери і реагенти, які додаються для підтримання цілісності або сприяння очищенню молекул, що піддаються очищенню. Наприклад, навіть якщо потрібний білок у неочищеному екстракті розбавляється водним розчинником при проведенні колонкової хроматографії, молекули білка вважаються очищеними зазначеною хроматографією, якщо природно пов'язані нуклеїнові кислоти, небажані білки та інші біологічні молекули відділяються від молекул потрібного білка. Згідно з цим визначенням, речовина може бути чистою на 5% чи більше, 10% чи більше, 20% чи більше, 30% чи більше, 40% чи більше, 50% чи більше, 60% чи більше, 70% чи більше, 80% чи більше, 90% чи більше, 95% чи більше, 98% чи більше, 99% чи більше або чистою на 100% при розгляданні відносно забруднювачів. Залишок: Термін "залишок", що вживається тут, означає конкретну амінокислоту, як правило, дегідратовану внаслідок її участі в утворенні одного чи кількох пептидних зв'язків, у поліпептидному остові або боковому ланцюжку. Лікування: Терміни "лікування", "лікувати", "якого лікують" або "процес лікування", що вживаються тут, стосуються профілактики і/або терапії. При використанні терміну стосовно, наприклад, інфекційної хвороби, він може означати профілактичне лікування, яке підвищує стійкість пацієнта до інфекції, викликаної патогенними організмами, або, іншими словами, зменшує ймовірність того, що пацієнта буде інфіковано патогенами, або в нього виявляться ознаки хвороби, спричиненої такою інфекцією, а також лікування вже інфікованого пацієнта з метою боротьби з інфекцією, наприклад, зменшення, усунення інфекції або запобігання її погіршенню. Кілька дослідників, які раніше вивчали це питання, розкрили отримання лінійних або розгалужених неантигенних PEG полімерів або їх кон'югатів [див., наприклад, патенти США №№5,428,128; 5,621,039; 5,622,986; 5,643,575; 5,728,560; 5,730,990; 5,738,846; 5,811,076; 5,824,701; 5,840,900; 5,880,131; 5,900,402; 5,902,588; 5,919,455; 5,951,974; 5,965,119; 5,965,566; 5,969,040; 5,981,709; 6,011,042; 6,042,822; 6,113,906; 6,127,355; 6,132,713; 6,177,087 та 6,180,095; див. також РСТ публікацію WO 95/13090 та опубліковані патентні заявки США №№2002/0052443, 2002/0061307 та 2002/0098192; 86002 24 розкриття усіх їх включено сюди шляхом посилання у всій їх повноті]. Проте, PEG і кон'югати, відповідно до зазначених попередніх відомостей, залишаються, принаймні, слабко імуногенними, а це може мати небажані наслідки у вигляді появи антитіл до PEG компонента кон'югатів при введенні цих кон'югатів тварині з профілактичною, діагностичною або терапевтичною метою. Ці антитіла можуть призводити до швидкого виведення PEGвмісних біологічно активних кон'югатів, що зменшує біодоступність лікувальних композицій [Cheng, T.-L, та ін. (1999), див. вище], а також може спричинити опосередкований імунним комплексом розлад. Крім того, досі ще не було розкрито механізму того, як зробити заявлені PEG або їх кон'югати, по суті, неантигенними або неімуногенними. Даний винахід покликаний подолати наявні в рівні техніки обмеження. Загалом, цей винахід забезпечує стабільні композиції та способи, що можуть використовуватись у профілактиці, діагностиці та лікуванні різних фізичних розладів. Більш конкретно, цей винахід забезпечує способи отримання реакційноздатних полімерів із зменшеною антигенністю та стабілізованих полімерних кон'югатів білків, зокрема, терапевтичних білків, що мають зменшену, істотно зменшену антигенність або антигенність, що не піддається виявленню. В інших варіантах втілення даний винахід забезпечує кон'югати, отримані у названі способи відповідно до винаходу, і композиції, зокрема, фармацевтичні композиції, що містять ці кон'югати. У додаткових варіантах втілення цей винахід забезпечує способи використання зазначених кон'югатів і композицій для запобігання, діагностики і лікування різних фізичних розладів. Винахід також забезпечує набори, що включають один чи кілька кон'югатів і/або композицій відповідно до винаходу. В одному аспекті даний винахід забезпечує способи отримання кон'югатів із зменшеною, істотно зменшеною антигенністю або антигенністю, що не піддається виявленню, шляхом ковалентного приєднання водорозчинних полімерів до однієї чи кількох біологічно активних або компонентів, таких як один чи кілька білків і, зокрема, один чи кілька терапевтичних білків. У таких кон'югатах вибрані полімери самі по собі мають зменшену, істотно зменшену антигенність або антигенність, що не піддається виявленню, порівняно із стандартними полімерами, які зазвичай використовуються для отримання білок-полімерних кон'югатів. Термін "зменшена антигенність", що вживаються тут, стосується полімеру (наприклад, РАО чи PAG, зокрема, PEG, а ще більш конкретно - монофункціонально активованого PEG), кон'югата або композиції, що містить такий полімер або його/її було синтезовано із використанням такого полімеру, причому здатність названого полімеру реагувати із антитілами, виробленими проти більш антигенних полімерів (наприклад, mPEG), зменшена на будь-яку величину. У більш прийнятному випадку антигенність зменшена, принаймні, приблизно на 90%, ще більш прийнятно -принаймні, приблизно на 50%, а найбільш прийнятно - більше ніж на приблизно 75% порівняно із більш антигенним полімером. Аналогічно, полімер (або кон'югат чи композиція, 25 що містять такий полімер або синтезовані з його використанням) має "істотно зменшену антигенність", якщо цей полімер (кон'югат або композиція) має антигенність на рівні приблизно 20% чи менше, більш прийнятно - приблизно 15% чи менше, ще більш прийнятно - приблизно 10% чи менше і найбільш прийнятно - приблизно 1% чи менше від антигенності відповідного антигенного полімеру (наприклад, mPEG). І, нарешті, полімер (або кон'югат чи композиція, що містять такий полімер або синтезовані з його використанням) має "антигенність, що не піддається виявленню", якщо дослідження цього полімеру, кон'югата або композиції відомими в рівні техніки методами (наприклад, ELISA чи інші способи виявлення антигенності, такі як відомі з рівня техніки і описані тут у Прикладах) не виявляє антигенності. Поліалкіленгліколі, що особливо підходять для використання у приготуванні кон'югатів відповідно до цього винаходу, включають (не обмежуючись названим) полі(етиленгліколі) та співполімери етиленоксиду та пропіленоксиду; особливо прийнятними є PEG, а ще більш прийнятними - монофункціонально активовані гідроксиPEG (наприклад, гідроксиPEG, активовані на одному кінці, включаючи реакційноздатні складні ефіри гідроксиРЕGмонокарбонових кислот, гідроксиРЕGмоноальдегіди, гідроксиРЕG-моноаміни, гідроксиРЕG-моногідразиди, гідроксиРЕб-монокарбазати, гідроксиРЕG-монойодацетаміди, гідроксиРЕGмономалеіміди, гідроксиРЕGмоноортопіридилдисульфіди, гідроксиРЕGмонооксими, гідроксиPEG-монофенілкарбонати, гідрокси PEG-монофенілгліоксалі, гідроксиРЕGмонотіазолідин-2-тіони, гідроксиРЕGмонотіоефіри, гідроксиРЕG-монотіоли, гідроксиРЕG-монотриазини і гідроксиРЕGмоновінілсульфони). Особливо прийнятними для використання при отриманні кон'югатів відповідно до цього винаходу полімерами із зменшеною, істотно зменшеною антигенністю або антигенністю, що не піддається виявленню, є монофункціонально активовані PEG, що не містять метоксильних груп, інших алкоксильних груп або арилоксильних груп. Застосування таких монофункціонально активованих PEG замість монофункціонально активованих mPEG у синтезі кон'югатів відповідно до цього винаходу надає отримуваним кон'югатам несподівано зменшеної антигенності, тобто зменшеної здатності взаємодіяти із антитілами, виробленими проти mPEG кон'югатів того самого біологічно активного компонента. Отримані кон'югати також характеризуються зменшеною імуногенність, тобто зменшеною здатністю викликати імунну реакцію. В одному аспекті винаходу монофункціонально активовані PEG можуть бути синтезовані із використанням підхожих оборотно блокованих похідних активуючої групи в якості ініціатора полімеризації етиленоксиду [Akiyama, Υ:, та ін. (2000) Bioconjug Chem, 17:947-950]. Akiyama та ін. запропонували умови синтезу моногідроксильної, моноацетальної похідної PEG із використанням 3,3-діетоксипропанолату калію в якості ініціатора полімеризації етиленоксиду. Оскільки Akiyama та 86002 26 ін. не визначили найбільш бажану зменшену антигенність чи імуногенність цього проміжного продукту, вони перетворили кінцеву гідроксильну групу на тіол шляхом припинення полімеризації додаванням метансульфонілхлориду і, таким чином, отримали гетеробіфункціональний PEG замість PEG похідної відповідно до цього винаходу. Додатковим свідченням того, що ця група дослідників не побачила корисність монофункціонально активованого PEG із гідроксилом на кінці, є те, що вони опублікували й запатентували способи синтезу інших гетеробіфункціональних PEG з моногідроксильних, монофункціонально активованих PEG, а в деяких випадках навіть "кепували з кінця" гідроксиРЕЄ метоксильними групами. Аналогічно, Bentley, M.D., та ін. в опублікованій патентній заявці США № 2002/0072573 А1 розкривають полімерні композиції та способи, які не відбивають розуміння імунологічної переваги монофункціонально активованих полімерів із гідроксилом на кінці, а говорять про бажаність перетворення кінцевих гідроксильних груп таких полімерів на метоксильні групи. В іншому аспекті даного винаходу монофункціонально активовані PEG можна синтезувати шляхом контролювання міри активації лінійних PEG, що містять гідроксильні групи на обох кінцях ("PEG діоли"), щоб обмежити кількість б/сактивованих PEG прийнятно низьким рівнем, наприклад,