Полімерні кон’югати найбластину та способи їх використання

1. Поліпептид, який містить амінокислотну послідовність щонайменше на 90 % ідентичну амінокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1, де поліпептид включає амінокислоту, що відрізняється від аспа 2 (19) 1 3 82983 4 b. одержання вказаного поліпептиду або злитого 18. Кон'югат за будь-яким з пп. 15-17, де поліпепбілка. тид глікозильований. 14. Димер, який містить два поліпептиди за будь19. Фармацевтична композиція, що містить поліяким з пп. 1-6 або два злитих білка за пп. 7 або 8. пептид за будь-яким з пп. 1-6, злитий білок за пп. 7 15. Кон'югат, який містить поліпептид за будь-яким або 8 або кон'югат за будь-яким з пп. 15-18, і фізіз пп. 1-6, кон'югований з поліалкіленгліколем, де ологічно прийнятний наповнювач. поліалкіленгліколь кон'югований з поліпептидом, в 20. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-6, злитий білок якому амінокислота замінена в положенні, яке відза пп. 7 або 8 або кон'югат за будь-яким з пп. 15-18 повідає положенню 95 в амінокислотній послідовдля застосування у терапії. ності SEQ ID NO: 1. 21. Застосування поліпептиду за будь-яким з пп. 116. Кон'югат, який містить злитий білок за пп. 7 або 6, злитого білка за пп. 7 або 8 або кон'югата за 8, кон'югований з поліалкіленгліколем, де поліалбудь-яким з пп. 15-18, для приготування лікарськокіленгліколь кон'югований із злитим білком, в якого засобу для лікування або профілактики захвому амінокислота замінена в положенні, яке відпорювання або розладу нервової системи. відає положенню 95 в амінокислотній 22. Застосування за п. 21, де захворюванням або послідовності SEQ ID NO: 1. розладом є периферична невропатія або синдром 17. Кон'югатза пп. 15 або 16, де поліалкіленгліконевропатичного болю. лем є поліетиленгліколь. Винахід, загалом, відноситься до поліпептидів і більш конкретно до модифікованих нейротрофічних поліпептидів і способів застосування вказаних модифікованих поліпептидів. Нейротрофічні фактори є білками природного походження, які підвищують життєздатність, підтримують фенотипічне диференціювання, запобігають дегенерації та підвищують активність нервових клітин і тканин. Нейротрофічні фактори виділяють з нервової тканини і з ненервової тканини, яка іннервована нервовою системою, та поділяють на функціонально і структурно споріднені групи, які також називаються сімействами, суперсімействами або підсімействами. Серед суперсімейств нейротрофічних факторів є суперсімейства фактора росту фібробластів, нейротрофіну і трансформуючого фактора росту b (TGF-b). Окремі види нейротрофічних факторів відрізняються за своєю фізичною структурою, їх взаємодією із спорідненими їм рецепторами та їх впливами на різні типи нервових клітин. До суперсімейства TGF-b відносять ліганди, подібні до нейротрофічного фактора, одержаного з лінії гліальних клітин, (GDNF), які включають GDNF, персефін (PSP) і нейртурин (NTN). Ліганди підсімейства GDNF володіють спільною здатністю індукувати передачу сигналу за допомогою тирозинкінази рецептора RET. Три вказаних ліганди підсімейства GDNF відрізняються за їх відносними афіностями відносно сімейства нейротрофічних рецепторів, рецепторів GFRa. Нещодавно описаним нейротрофічним фактором є «нейбластин» або «NBN». Нейбластин відносять до підсімейства GDNF, оскільки він має спільні ділянки гомології з іншими GDNF-лігандами і за його здатністю зв'язуватися та активува ти RET. На відміну від інших GDNF-лігандів нейбластин є високо вибірковим відносно комплексу GFRaS-рецептор RET. Крім того, NBN містить унікальні підділянки у своїй амінокислотній послідовності. На жаль нейбластин зазнає швидкого кліренсу в організмі. Вказаний швидкий кліренс може пере шкоджати використанню нейбластину у терапевтичних застосуваннях. Таким чином, існує необхідність в ідентифікації варіантів нейбластину, які мають підвищену біодоступність. Даний винахід частково базується на відкритті нових форм нейбластину, які виявляють підвищені фармакокінетичні властивості і біодоступність in vi vo. Вказані нові форми включають варіантні поліпептиди нейбластину, кон'юговані з полімерними молекулами. В одному аспекті відмітною ознакою винаходу є варіантний поліпептид нейбластину або мутеїн поліпептиду нейбластину, що містить амінокислотну послідовність, яка має одну або декілька амінокислотних замін у положеннях зрілого димеру нейбластину, що експонуються у розчинник. Дані заміни вводять у нативний поліпептид нейбластину один або декілька сайтів, в яких з поліпептидом можуть бути зв'язані такі речовини, як ті, що мають природне походження або синтетичні полімери, для того, щоб збільшити його розчинність і, отже, його біодоступність in vivo. Переважно дані варіантні поліпептиди містять амінокислотну послідовність, щонайменше, на 70% ідентичну амінокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1. Варіантний поліпептид нейбластину включає одну або декілька амінокислотних замін, при яких у положенні 14 в амінокислотній послідовності варіантного поліпептиду знаходиться амінокислота, що відрізняється від аргініну, у положенні 39 амінокислотної послідовності варіантного поліпептиду знаходиться амінокислота, що відрізняється від аргініну, у положенні 68 варіантного поліпептиду знаходиться амінокислота, що відрізняється від аргініну, або у положенні 95 варіантного поліпептиду знаходиться амінокислота, що відрізняється від аспарагіну, у тому випадку, коли положення амінокислот пронумеровані відповідно до поліпептидної послідовності SEQ ID NO: 1. «Нейбластин дикого типу» або «wt-NBN» у значенні, що використовується у даному описі, відноситься до послідовності поліпептиду нейбластину, яка має природне походження або є натив 5 82983 6 ною, такого як нейбластин щура, миші або людини важно амінокислотна послідовність варіантного (дивись, наприклад, SEQ ID NO: 2, 3 або 4). Конкполіпептиду нейбластину містить амінокислотну ретні варіантні поліпептиди нейбластину називапослідовність поліпептиду нейбластину щура, люються у даному описі «NBN-X1N1 X2» або «X1N1 X2дини або миші природного походження у положенNBN», де X1 відноситься до амінокислоти поліпепнях амінокислот 8-94 і 96-113 варіантного поліпептиду нейбластину дикого типу, N1 відноситься до тиду нейбластину. Наприклад, амінокислоти 8-94 і номера положення амінокислоти X1 у послідовнос96-113 варіантного поліпептиду нейбластину моті, яке нумерується відповідно до SEQ ID NO: 1. X2 жуть містити амінокислотну послідовність амінокивідноситься до амінокислоти, що замінює амінокислот 8-94 і 96-113 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 або слоту дикого типу у вказаному пронумерованому SEQ ID NO: 4. положенні у послідовності. Таким чином, наприТакож винахід відноситься до злитого білка клад, NBN-N95K означає варіантні поліпептиди або поліпептиду, який включає в себе варіантний нейбластину, в яких аспарагін у положенні 95 заполіпептид нейбластину або поліпептид нейбласмінений лізином. тину дикого типу, або білка, який є димером двох Варіантний поліпептид нейбластину може бути злитих білків нейбластину. Злиті білки нейбластиодержаний у вигляді мультимерного поліпептиду. ну також володіють посиленими фармакокінетичНаприклад, варіантний поліпептид нейбластину ними властивостями і підвищеною біодоступністю може бути одержаний у вигляді димеру, який місin vivo. тить, щонайменше, один варіантний поліпептид В іншому аспекті винахід відноситься до моленейбластину. У деяких випадках димер є гомодикули нуклеїнової кислоти, що кодує варіантний мером варіантного поліпептиду нейбластину. В поліпептид нейбластину. Нуклеїнова кислота, яка інших випадках димер є гетеродимером, який міскодує варіантний поліпептид нейбластину, перетить один варіантний поліпептид нейбластину і важно приготована у векторі, наприклад, в експреодин поліпептид нейбластину дикого типу. Інші суючому векторі. Нуклеїнова кислота варіантного димери можуть містити дві різні варіантні форми нейбластину або вектор, який її містить, можуть поліпептиду нейбластину. бути надані у клітині. Клітина може являти собою, У деяких варіантах варіантний поліпептид наприклад, клітину ссавця, клітину гриба, дріжнейбластину крім амінокислот 8-113 містить аміноджову клітину, клітину комахи або бактеріальну кислоти 1-7 SEQ ID NO: 1. клітину. Переважною клітиною ссавця є клітина У переважних варіантах варіантний поліпепяєчника китайського хом'ячка («клітина СНО»). Винахід також відноситься до способу одертид нейбластину при димеризації зв'язує GFRa3. У жання варіантного поліпептиду нейбластину за додаткових переважних варіантах варіантний поліпептид нейбластину при димеризації стимулює допомогою культивування клітини, яка містить нуклеїнову кислоту, що кодує варіантний нейбласфосфорилювання тирозину поліпептиду RET, або тин, в умовах, які забезпечують експресію варіантсам по собі, або у випадку зв'язування з GFRa3. ного поліпептиду нейбластину. За бажанням варіВ інших переважних варіантах варіантний поантний полі пептид нейбластину потім можна ліпептид нейбластину при димеризації підвищує дістати. Винахід, крім того, включає варіантний життєздатність нейрона, наприклад, підвищує житполіпептид нейбластину, що продукується клітитєздатність чутли вого нейрона. ною. Подібні нуклеїнові кислоти, вектори, клітиниВ інших переважних варіантах варіантний похазяї та способи одержання поліпептидів предсталіпептид нейбластину при димеризації нормалізує влені у даному описі для злитих білків (таких як патологічні зміни нейрона, такого як чутливий нейзлиті білки нейбластин-сироватковий альбумін) рон. відповідно до даного винаходу. У наступних переважних варіантах варіантний Винахід також відноситься до композиції, яка поліпептид нейбластину при димеризації підвищує містить поліпептид нейбластину або варіантний життєздатність нейрона, наприклад, автономного поліпептид нейбластину, зв'язаний з полімером нейрона або допамінергічного нейрона. неприродного походження. Варіантний поліпептид У деяких варіантах варіантний поліпептид міснейбластину у композиції переважно містить амітить дві, три або більше амінокислотних замін, нокислотну послідовність, щонайменше, на 70% вибраних з групи, яка складається з амінокислоти, ідентичну амінокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1, за що відрізняється від аргініну, у положенні 14 аміумови, що варіантний поліпептид нейбластину нокислотної послідовності варіантного поліпептимістить одну або декілька амінокислотних замін, ду, амінокислоти, що відрізняється від аргініну, у вибраних з групи, яка складається з амінокислоти, положенні 39 амінокислотної послідовності варіанщо відрізняється від аргініну, у положенні 14 амітного поліпептиду, амінокислоти, що відрізняється нокислотної послідовності варіантного поліпептивід аргініну, у положенні 68 варіантного поліпептиду, амінокислоти, що відрізняється від аргініну, у ду та амінокислоти, що відрізняється від аспарагіположенні 39 амінокислотної послідовності варіанну, у положенні 95 варіантного поліпептиду. тного поліпептиду, амінокислоти, що відрізняється У переважних варіантах амінокислотою в одвід аргініну, у положенні 68 варіантного поліпептиному або декількох положеннях 14, 39, 68 і 95 є ду та амінокислоти, що відрізняється від аспарагілізин. ну, у положенні 95 варіантного поліпептиду, при Переважно амінокислоти 8-94 і 96-113 варіанцьому положення амінокислот пронумеровані відтного поліпептиду нейбластину, щонайменше, на повідно до поліпептидної послідовності SEQ ID 90% ідентичні амінокислотам 8-94 і 96-113 SEQ ID NO: 1. NO: 1. Більш переважно послідовності амінокислот ідентичні, щонайменше, на 95%. Найбільш пере 7 82983 8 У переважних варіантах полімер містить комабо шляхом оцінки змін рівнів клітинних продуктів, понент, представлений поліалкіленгліколем, нащо секретуються або виділяються, або за допомоприклад поліетиленгліколевий компонент (ПЕГ). гою оцінки змін in vivo у виявленні, фізіологічно У переважних варіантах поліалкіленгліколевий властивому функції ураженого нейрона(нів). Накомпонент зв'язаний з аміногрупою поліпептиду приклад, у випадку патологічних змін, зв'язаних з нейбластину або лізином у варіантному поліпепсиндромом невропатичного болю, контролюють тиді нейбластину. такі виявлення болю, як гіперальгезію, гіпоальгеЗв'язування може здійснюватися за допомозію або алодинію. гою активованого складного ефіру NПід «підвищеною життєздатністю нейрона» гідроксилсукциніміду (NHS). Активований складний мають на увазі продовжене виживання ураженого ефір може являти собою, наприклад, сукцинімідинейрона понад період життєздатності, що спостелсукцинат (SS-ПЕГ), сукцинімідилбутират (SPBрігається у відповідному нейроні, ураженому тим ПЕГ), або сукцинімідилпропіонат (SPA-ПЕГ) ПЕГ. же типом захворювання, розладу, інсульту або Поліалкіленгліколевий компонент може, напошкодження, але не обробленому кон'югатом приклад, являтися собою карбоксиметил-NHS, нейбластину або злитим білком відповідно до винорлейцин-NHS, SC-ПЕГ, трезилат, альдегід, епонаходу. ксид, карбонілімідазол або карбонат PNP. У деяких варіантах полімер зв'язаний з поліУ деяких варіантах поліалкіленгліколевий компептидом у сайті нейбластину, який є N-кінцем. У понент зв'язаний з групою цистеїну поліпептиду деяких варіантах полімер зв'язаний з поліпептинейбластину або варіантного поліпептиду нейбладом у сайті у некінцевій амінокислоті поліпептиду стину. Наприклад, зв'язування може здійснюватинейбластину або варіантного поліпептиду нейблася за допомогою малеімідної групи, вінілсульфостину. нової групи, галогенацетатної групи та тіольної У переважних варіантах полімер зв'язаний з групи. амінокислотою поліпептиду нейбластину або варіУ деяких варіантах поліпептид нейбластину антного поліпептиду нейбластину, яка експонуєтьабо варіантний поліпептид нейбластину у компося у розчинник. зиції глікозильований. У тому випадку, коли поліУ переважних варіантах полімер зв'язаний з пептид нейбластину або варіантний поліпептид поліпептидом нейбластину або варіантним поліпеглікозильований, полімер може бути зв'язаний з птидом нейбластину біля залишку, вибраного з вуглеводним компонентом глікозильованого полігрупи, яка складається з амінокінцевої амінокислопептиду нейбластину або варіантного поліпептиду ти варіантного поліпептиду, положення 14 в амінонейбластину. Наприклад, полімер може бути зв'якислотній послідовності поліпептиду нейбластину заний з глікозильованим поліпептидом нейбластиабо варіантного поліпептиду нейбластину, полону або варіантним поліпептидом нейбластину пісження 39 в амінокислотній послідовності поліпепля окислення групи гідразолу або аміногрупи тиду нейбластину або варіантного поліпептиду глікозильованого поліпептиду нейбластину або нейбластину, положення 68 в амінокислотній поваріантного поліпептиду нейбластину, або окисслідовності поліпептиду нейбластину або варіантлення реакційно-здатної групи полімеру. ного поліпептиду нейбластину і положення 95 в У різних варіантах поліпептид нейбластину амінокислотній послідовності поліпептиду нейблаабо варіантний поліпептид нейбластину містить стину або варіантного поліпептиду нейбластину. один, два, три або чотири ПЕГ-компоненти. Винахід також відноситься до фармацевтичної У переважних варіантах поліпептид нейбласкомпозиції, яка включає фізіологічно прийнятний тину, варіантний поліпептид нейбластину або наповнювач, що містить або має диспергований у кон'югат з полімером має більш тривалий час наньому поліпептид нейбластину, варіантний поліпівжиття у сироватці у порівнянні з часом напівпептид нейбластину або кон'югат відповідно до життя поліпептиду або варіантного поліпептиду за даного винаходу. відсутності полімеру. У наступному аспекті винахід включає стабіУ переважних варіантах поліпептид нейбласльний водорозчинний кон'югований комплекс політину, варіантний поліпептид нейбластину або пептиду нейбластину або варіантного поліпептиду кон'югат з полімером у комплексі володіє фізіолонейбластину, що містить поліпептид нейбластину гічною активністю, вибраною з групи, яка складаабо варіантний поліпептид нейбластину, зв'язаний з поліетиленгліколевим компонентом, в якому поється з: зв'язування GFRa3, активації RET, нормалізації патологічних змін нейрона або підвищення ліпептид нейбластину або варіантний поліпептид нейбластину зв'язаний з поліетиленгліколевим життєздатності нейрона. компонентом за допомогою лабільного зв'язку. У Під «нормалізацією патологічних змін нейродеяких варіантах лабільний зв'язок розщеплюєтьна» мають на увазі, що даний кон'югат індукує зміся при біохімічному гідролізі, протеолізі або сульфну одного або декількох з наступних параметрів клітини: рівня експресії структурного білка, рецепгідрильному розщепленні. У переважних варіантах лабільний зв'язок розщеплюється в умовах in vivo. тора нейротрофічного фактора, іонного каналу або Винахід також відноситься до способу одернейромедіатора, або індукує зміну морфології кліжання модифікованого поліпептиду нейбластину, тини, у кожному випадку так, що значною мірою який володіє пролонгованою активністю in vitro або відновлює такий параметр до його рівня у нейроні такого ж або подібного фенотипу, який не порушеin vivo у порівнянні з нейбластином дикого типу, шляхом приготування поліпептиду нейбластину ний захворюванням, дегенерацією, інсультом або або варіантного поліпептиду нейбластину і зв'язупошкодженням. Нормалізацію патологічних змін вання поліпептиду або модифікованого варіантнонейрона можна контролювати імуногістохімічно 9 82983 10 го поліпептиду нейбластину з полімерним комповані для того, щоб посилити їх фармакокінетичні нентом неприродного походження з утворенням властивості і підвищити біодоступність. Переважні таким чином композиції поліпептиду нейбластину, варіантні поліпептиди нейбластину мають змінені зв'язаного з полімером. амінокислотні послідовності, які полегшують зв'яУ наступному аспекті винахід відноситься до зування з полімерним агентом, таким як полімер способу лікування або профілактики порушення поліалкіленгліколю. нервової системи у суб'єкта (такого як людина) за Варіантні поліпептиди нейбластину допомогою введення суб'єкту, який потребує цьоВинахід відноситься до поліпептидів нейбласго, терапевтично ефективної кількості варіантного тину, які мають варіантні амінокислотні послідовполіпептиду нейбластину, композиції, що містить ності у порівнянні з послідовністю поліпептиду поліпептид нейбластину або варіантний поліпепнейбластину дикого типу. Амінокислотні послідовтид нейбластину, зв'язаний з полімером, або комності поліпептидів нейбластину людини і миші плексу, який включає в себе стабільний водорозописані у [WO 00/01815]. Приклади варіантних чинний кон'югований комплекс поліпептиду поліпептидів нейбластину відповідно до винаходу нейбластину або варіантного поліпептиду, що міспредставлені у таблиці 1. тить поліпептид нейбластину або варіантний поліПереважно змінені залишки у варіантному попептид нейбластину, зв'язаний з поліетиленгліколіпептиді нейбластину вибрані для забезпечення левим компонентом. зв'язування полімеру, такого як полімер поліалкіПереважно розладом нервової системи є розленгліколю, у положенні модифікованої амінокислад периферичної нервової системи, такий як пелоти. Переважними сайтами модифікації поліпеприферична невропатія або синдром невропатичтиду нейбластину є сайга у доступних для ного болю. Переважними суб'єктами для лікування розчинника ділянках поліпептиду нейбластину. є люди. Такі сайти можна вибрати на основі перегляду Введення може бути, наприклад, системним кристалічної структури спорідненого нейротрофічабо локальним. ного фактора, GDNF, кристалічна структура якого Якщо не обумовлено особливо, всі технічні і описана у [Nat. Struct. Biol. 4: 435-38, 1997]. Сайти наукові терміни, що використовуються у даному також можна вибрати на основі структурноописі, мають таке ж значення, яке звичайно маєтьфункціональної інформації, одержаної для химерся на увазі фа хівцем в області, до якої відноситься них білків персефін/нейбластин. Вказані химери даний винахід. Хоча на практиці або при тестуванописані у [J. Biol. Chem. 275: 3412-20, 2000]. Прині даного винаходу можна використовувати способлизний список доступних для розчинника або би і речовини, подібні або еквівалентні приведеекспонованих на поверхні амінокислот нейбластиним у даному описі, придатні способи і речовини ну, ідентифікованих за допомогою вказаної метоописані нижче. Всі публікації, заявки на видачу дики, вказаний у таблиці 2. патентів, патенти та інші джерела інформації, які Винахід включає варіантний поліпептид нейбзгадуються у даному описі, включені у вигляді поластину, що містить амінокислотну послідовність, силання у повному обсязі. У випадку конфліктної яка, щонайменше, на 70% ідентична амінокислоситуації даний опис, включаючи визначення, буде там 8-113 SEQ ID NO: 1, що показана у таблиці 1. перевірений. Крім того, матеріали, способи і приУ деяких варіантах один або декілька аргінінів у клади є тільки ілюстративними і не розглядаються положенні 14, положенні 39, положенні 68 або асяк такі, що обмежують. парагін у положенні 95 амінокислотної послідовноІнші відмітні ознаки і переваги винаходу стасті поліпептиду замінюють амінокислотою, що віднуть зрозумілими з наступного докладного опису і різняється від аргініну або аспарагіну. Переважно формули винаходу. амінокислоту дикого типу замінюють лізином або Винахід відноситься до нових варіантних поліцистеїном. пептидів нейбластину, які можуть бути модифіко 11 82983 12 Консенсуальна послідовність: У таблиці 2 представлений список залишків та їх номери у нейбластині людини, які ймовірно є такими, що експонуються на поверхні. Залишки, що експонуються на поверхні, визначали за допомогою оцінки структури димеру GDNF щура, утвореного ланцюгами А і В (PDB код IAGQ), і визначення того, чи присутній залишок на поверхні структури. Потім дану стр уктур у порівнювали з вирівнюванням послідовностей GDNF і нейбластину у [Baloh et al., Neuron, vol.21, p.1291, 1998], щоб визначити придатні залишки у нейбластині. Схема нумерації являє собою схему, показану у таблиці 1. 13 82983 14 н/а вказує, що залишки не присутні у структурі GDNF. Це відбувається або внаслідок дизайну конструкції, гнучких ділянок, або вставок у нейбластині у порівнянні з GDNF (залишки 68-71): - вказує, що залишки приховані і не розташовані на поверхні або є залишками цистеїну, залученими до дисульфідного зв'язку. Оскільки даний білок є цисте 15 82983 16 їновим вузлом, величезна кількість залишків розташована на поверхні. + вказує, що даний залишок у структурі GDNF експонований на поверхні, і таким чином ймовірно експонований на поверхні нейбластину, хоча петля, що містить залишки 66-75, спостерігається тільки в одному з мономерів GDNF (ймовірно гнучкому). Вказана петля також містить вставку з 4 залишків у нейбластині у порівнянні з GDNF. У значенні, що використовується у даному описі, терміни «ідентичність» або «гомологічний», або «гомологія» використовуються взаємозамінно і відносяться до подібності послідовностей між двома поліпептидами, молекулами або між двома нуклеїновими кислотами. У тому випадку, коли положення в обох порівнюваних послідовностях зайняте однією і тією ж основою або мономерною амінокислотною субодиницею (наприклад, якщо положення у кожній з двох молекул ДНК зайняте аденіном або положення у кожному з двох поліпептидів зайняте лізином), то відповідні молекули є гомологічними по даному положенню. Процент гомології між двома послідовностями є функцією кількості співпадаючих або гомологічних положень, що є у дво х послідовностях, розділеної на кількість порівнюваних положень, х 100. Наприклад, якщо 6 з 10 положень у дво х послідовностях співпадають або є гомологічними, то дві послідовності гомологічні на 60%. Як приклад послідовності ДНК CTGACT і CAGGTT володіють 50% гомологією (3 із загальної кількості 6 положень співпадають). Звичайно порівняння виконують у тому випадку, коли дві послідовності вирівнюють, щоб одержати максимальну гомологію. Таке вирівнювання можна здійснити, використовуючи, наприклад, спосіб [Needleman et al., J. Моl Віоl. 48: 443-453 (1970)], що для зручності виконується за допомогою комп'ютерних програм, таких як програма Align (DNAstar, Inc.). «Подібними» послідовностями є послідовності, які при вирівнюванні мають ідентичні або подібні амінокислотні залишки, де подібні залишки є консервативними замінами або «допустимими точковими мутаціями» відповідних амінокислотних залишків у вирівняній еталонній послідовності. У цьому відношенні «консервативна заміна» залишку в е талонній послідовності є заміною залишком, який фізично або функціонально подібний до відповідного еталонного залишку, наприклад, який має подібний розмір, форму, електричний заряд, хімічні властивості, включаючи здатність утворювати ковалентні або водневі зв'язки, або тому подібне. Таким чином, «варіантною послідовністю з консервативними замінами» є послідовність, яка відрізняється від еталонної послідовності або послідовності дикого типу тим, що у ній присутня одна або декілька консервативних замін або допустимих точкових мутацій. У переважних варіантах поліпептид відповідно до винаходу на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% або 99% ідентичний амінокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1. У деяких варіантах амінокислотна послідовність варіантного поліпептиду нейбластину містить послідовність амінокислот поліпептиду нейбластину щура, людини або миші природного походження у положеннях амінокислот 1-94 і 96-113 варіантного поліпептиду нейбластину, наприклад, поліпептид має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2, 3 або 4 у вказаних положеннях. Варіантний поліпептид нейбластину, який відрізняється за послідовністю від поліпептидів, описаних у SEQ ID NO: 1-4, може містити одну або декілька консервативних амінокислотних замін. Альтернативно або додатково варіантний поліпептид нейбластину може відрізнятися однією або декількома неконсервативними амінокислотними замінами або делеціями, або інсерціями. Переважно заміни, інсерції або делеції не порушують біологічну активність виділеного білка. Консервативні заміни звичайно включають заміну однієї кислоти іншою з подібними характеристиками, такі як заміни у межах наступних гр уп: валін, аланін і гліцин; лейцин, валін та ізолейцин; аспарагінова кислота і глутамінова кислота; аспарагін і глутамін; серин, цистеїн і треонін; лізин та аргінін; і фенілаланін і тирозин. Неполярні гідрофобні амінокислоти включають аланін, лейцин, ізолейцин, валін, пролін, фенілаланін, триптофан і метіонін. Полярні нейтральні амінокислоти включають гліцин, серин, треонін, цистеїн, тирозин, аспарагін і глутамін. Позитивно заряджені (основні) амінокислоти включають аргінін, лізин і гістидин. Негативно заряджені (кислі) амінокислоти включають аспарагінову кислоту і глутамінову кислоту. Будь-яку заміну одного представника вказаної вище групи полярних, основних або кислих амінокислот іншим представником тієї ж групи можна вважати консервативною заміною. Інші заміни легко можуть ідентифікувати фа хівці у даній області. Наприклад, у випадку амінокислоти аланіну заміна може бути вибрана з будьякої заміни D-аланіном, гліцином, бета-аланіном, L-цистеїном і D-цистеїном. У випадку лізину заміною може бути будь-яка з амінокислот: D-лізин, аргінін, D-аргінін, гомо-аргінін, метіонін, D-метіонін, орнітин або D-орнітин. Як правило, замінами у функціонально важливих ділянках, які ймовірно можуть індукувати зміни властивостей ізольованих поліпептидів, є заміни, при яких: (і) полярний залишок, наприклад, серин або треонін, замінює гідрофобний залишок, наприклад, лейцин, ізолейцин, фенілаланін або аланін (або замінюється ними); (іі) залишок цистеїну замінює будь-який інший залишок (або замінюється ним); (ііі) залишок, що має електропозитивний бічний ланцюг, наприклад, лізин, аргінін або гістидин, замінює залишок, що має електронегативний бічний ланцюг, наприклад, глутамінову кислоту або аспарагінову кислоту (або замінюється ними); або (iv) залишок, що має великий бічний ланцюг, наприклад, фенілаланін, замінює залишок, що не має такого бічного ланцюга, наприклад, гліцин (або замінюється ним). Ймовірність того, що одна із згаданих вище неконсервативних замін може змінити функціональні властивості білка, також корелює з положенням заміни по відношенню до функціонально важливих ділянок білка: отже, деякі неконсервативні заміни можуть 17 82983 18 здійснювати невеликий або не здійснювати впливу нантної ДНК. Наприклад, молекулу нуклеїнової на біологічні властивості. кислоти, що кодує варіантний поліпептид нейбласВинахід також відноситься до мультимерних тину, можна вбудува ти у вектор, наприклад, векполіпептидів, які містять варіантний поліпептид тор, який експресує, і нуклеїнову кислоту можна нейбластину. Мультимерні поліпептиди переважно ввести у клітину. Відповідні клітини включають, готують у вигляді очищених м ультимерних поліпенаприклад, клітини ссавців (такі як клітини людини птидів. Приклади мультимерних комплексів вклюабо клітини яєчника китайського хом'ячка), клітини чають, наприклад, димерні комплекси. Мультимегрибів, дріжджові клітини, клітини комах і бактеріарний комплекс можна одержати у вигляді льні клітини. При експресії у рекомбінантній клітині гетеромерного або гомомерного комплексу. Таким клітину переважно культивують в умовах, що зачином, мультимерний комплекс може бути гетеробезпечують експресію варіантного поліпептиду димерним комплексом, що включає один варіантнейбластину. Варіантний поліпептид нейбластину ний поліпептид нейбластину і один неваріантний за бажанням можна дістати з клітинної суспензії. нейбластин, або гетеродимерним комплексом, що Термін «дістати» означає, що варіантний поліпепвключає два або більше варіантних поліпептидів тид видаляють з тих компонентів клітини або кульнейбластину. турального середовища, в яких він присутній до У деяких варіантах варіантний поліпептид діставання. Спосіб діставання може включати одну або декілька стадій згортання білка або очинейбластину зв'язує GFRa3. Переважно зв'язущення. вання варіантного поліпептиду нейбластину стиВаріантні поліпептиди нейбластину можна мулює фосфорилювання поліпептиду RET. Щоб сконструювати, використовуючи будь-який з деківизначити, чи зв'язує поліпептид GFRa3, можна лькох способів, відомих у даній області. Одним з провести аналіз, як описано у [WO 00/01815]. Натаких способів є сайт-специфічний мутагенез, при приклад, присутність нейбластину у середовищі у якому змінюють конкретний нуклеотид (або за банадосадах лінії клітин CHO можна описати з викожанням невелику кількість конкретних нуклеотидів) ристанням модифікованої форми аналізу потрійдля того, щоб змінити одну амінокислоту (або за ного комплексу, описаного [Sanicola et al. (Proc. бажанням невелику кількість заздалегідь визначеNatl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 6238)]. У даному них амінокислотних залишків) у поліпептиді, що аналізі можна оцінити GDNF-подібні молекули відкодується, нейбластину. Фахівцям у даній області носно їх здатності опосередковувати зв'язування зрозуміло, що сайт-специфічний мутагенез є звиміж позаклітинним доменом RET і різними корецечайним способом, який широко використовується. пторами, GFRa1, GFRa2 і GFRa3. Розчинні форми Насправді велика кількість наборів для сайтRET і корецептори створюють у вигляді злитих специфічного мутагенезу комерційно доступна. білків. Описаний злитий білок між позаклітинним Одним з таких наборів є «набір для сайтдоменом RET щура і плацентарною лужною фосспецифічного мутагенезу, що трансформує», який фатазою (RET-AP) і злитий білок між позаклітинпродається Clontech Laboratories (Palo Alto, Calif.). ним доменом GFRa-1 щура [описаний в опублікоПри здійсненні даного винаходу на практиці, ваній заявці W09744356; 27 листопада 1997, якщо не обумовлено особливо, будуть використані включеної у даний опис у вигляді посилання] і Fcзвичайні способи клітинної біології, культивування доменом IgGl людини rGFR(a1-Ig) [Sanicola et al., клітин, молекулярної біології, мікробіології, рекомProc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 6238]. бінантної ДНК, хімії білків та імунології, які відомі У деяких варіантах варіантний поліпептид фа хівцям у даній області. Такі способи описані у нейбластину підвищує життєздатність нейрона або літературі. Дивись, наприклад, [Molecular Cloning: нормалізує патологічні зміни нейрона або і те і A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch інше. Аналізи для визначення того, чи підвищує and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory поліпептид життєздатність нейрона або нормаліPress, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. зує патологічні зміни нейрона, описані, наприклад, Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. у [WO 00/01815]. Переважно нейрон є чутливим Gait, ed.), 1984; патент США No. 4683195 (Mullis et нейроном, автономним нейроном або допамінергіal.); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Haines and S. чним нейроном. J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation Синтез і виділення варіантних поліпептидів (B. D. Hames and S. J. Higgins, eds.), 1984; Culture нейбластину of Animal Cells (R. I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., Варіантні поліпептиди нейбластину можна ви1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, ділити, використовуючи способи, відомі у даній 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (13. області. Поліпептиди нейбластину природного Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 походження можна виділити з клітин або тканинand 155 (Wu et al., eds), Academic Press, New York; них джерел відповідно до придатної схеми очиGene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. щення з використанням стандартних способів Miller and M. P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring очищення білка. Альтернативно варіантні поліпепHarbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell тиди нейбластину можна синтезувати хімічно, виand Molecular Biology (Ma yer and Walker, eds.), користовуючи стандартні способи синтезу пептиAcademic Press, London, 1987; Handbook of дів. Синтез коротких амінокислотних Experiment Immunology, Volumes I-IV (D . M. Weir послідовностей добре розроблений в області пепand C. C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the тидів. Дивись, наприклад, [Stewart, et al., Solid Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Phase Peptide Synthesis (2d ed., 1984)]. Press, 1986]. В іншому варіанті варіантні поліпептиди нейбВаріантні злиті білки нейбластину ластину одержують способами на основі рекомбі 19 82983 20 За необхідності варіантний поліпептид нейбчної інженерії, при яких NBN зливають з геном ластину можна приготува ти у вигляді злитого білсироваткового альбуміну на його N-кінці, С-кінці ка. Злиті поліпептидні похідні білків відповідно до або на обох кінцях. винаходу також містять різні структурні форми Крім того, передбачається, що з використанпервинного білка, які зберігають біологічну активням подібної методики можна створити будь-який ність. «Злиття» у значенні, що використовується у кон'югат NBN, результатом якого є продукт з проданому описі, відноситься до колінеарного ковалонгованим часом напівжиття у тварин (включаюлентного зв'язку двох або більше білків або їх чи людину). фрагментів між їх окремими пептидними кістяками, Інші похідні варіантних нейбластинів включанайбільш переважно за допомогою генетичної ють ковалентно зв'язані або агреговані кон'югати експресії молекули полінуклеотиду, що кодує дані варіантного нейбластину або його фрагментів з білки в одній і тій же рамці зчитування (тобто, «у іншими білками або поліпептидами, наприклад, рамці»). Переважно, щоб білки або їх фрагменти шляхом синтезу у рекомбінантній культурі у виглябули з різних джерел. Таким чином, переважні ді додаткових N-кінців або С-кінців. Наприклад, злиті білки включають варіантний білок нейбласкон'югований пептид може являти собою сигнальтину або фрагмент, ковалентно зв'язаний з другим ну (або лідерну) поліпептидну послідовність у Nкомпонентом, який не є варіантним нейбластином. кінцевій ділянці білка, яка котрансляційно або Переважно другий компонент одержують з поліпепосттрансляційно керує перенесенням білка від птиду, який існує у вигляді мономеру і достатній місця його синтезу до місця його функціонування з для того, щоб додати властивості підвищеної розвнутрішньої або зовнішньої сторони клітинної чинності і/або біодоступності поліпептиду нейбламембрани або стінки (наприклад, лідер альфастину. фактора дріжджів). Рецепторні білки нейбластину Наприклад, «злиття варіантний нейбласможуть містити пептиди, що додаються для полетин/сироватковий альбумін людини» є білком, що гшення очищення або ідентифікації нейбластину містить варіантний поліпептид нейбластину відпо(наприклад, злиття гістидин/нейбластин). Амінокивідно до винаходу або його фрагмент, N-кінець слотна послідовність нейбластину також може або С-кінець якого зв'язаний у рамці з поліпептибути зв'язана з пептидом Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Aspдом сироваткового альбуміну людини [дивись Asp-Lys (DYKDDDDK) [Норр et al., Biotechnology 6: Syed et al, Blood, 1997, 89: 3243 і Yeh et al., 1204, 1988]. Остання послідовність є високо антиP.N.A.S. USA 1992, 89: 1904 і патенти США No. генною і дає епітоп, який оборотно зв'язується 5876969 і 5302697]. Термін «злитий білок» крім специфічним моноклональним антитілом, що затого включає в себе варіантний нейбластин, хімічбезпечує швидкий аналіз і просте очищення ексно зв'язаний за допомогою моно- або гетерофункпресованого рекомбінантного білка. ціональної молекули з другим компонентом, який Вказана послідовність також специфічно відне є варіантним білком нейбластину і одержаний щеплюється ентерокіназою слизової оболонки de novo з очищеного білка, як описано нижче. бика біля залишку, що безпосередньо слідує за Злиття нейбластин-сироватковий альбумін парою Asp-Lys. можна сконструювати з використанням способів, Варіантні поліпептиди нейбластину. кон'юговідомих у даній області. Будь-який з ряду перевані з полімером хресно зшивальних агентів, який містить відповідЗа необхідності можна використовувати одну ну гр упу, що реагує з аміногрупою, або групу, що молекулу полімеру для кон'югування з поліпептиреагує з тіолом, можна використовува ти для зв'ядом нейбластину, хоча також припускається, що зування нейбластину з сироватковим альбуміном. можна також зв'язувати декілька молекул полімеПриклади придатних лінкерів включають перехреру. Композиції кон'югованого нейбластину відповісно зшивальні агенти, реакційно-здатні по віднодно до винаходу можна використовува ти для зашенню до аміну, які вбудовують малеімід, що реастосувань як in vivo, так і не in vivo. Крім того, буде гує з тіолом. Вказані лінкери включають, зрозуміло, що у полімері, який кон'югується, можна наприклад, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, використовува ти будь-які інші групи, компоненти SMPB, SMPH, KMUS або GMBS. Інші придатні лінабо інші кон'юговані види, які підходять для кінцекери вбудовують гр уп у галогенацетату, яка реагує вого застосування. Як приклад при деяких застоз тіолом. Вказані лінкери включають, наприклад, суваннях корисним може бути ковалентне зв'язуSBAP, SIA, SIAB, а лінкери, які надають захищевання з полімером функціонального компонента, ний або незахищений тіол для реакції з сульфгідякий додає полімеру стійкість до деградації УФ рильними групами, щоб одержати зв'язок, який або антиоксидантні або інші властивості або харавідновлюється, включають SPDP, SMPT, SATA ктеристики. Як наступний приклад при деяких заабо SATP, всі з яких є комерційно доступними (настосуваннях може бути корисною функціоналізація приклад, Pierce Chemicals). Фахівець у даній облаполімеру для того, щоб зробити його реакційності може подібним чином представити альтернатиздатним або особливо здатним до перехресного вні методики, які дозволять зв'язати N-кінець зшивання, щоб посилити різні властивості або ханейбластину з сироватковим альбуміном. рактеристики кон'югованого матеріалу загалом. Також передбачається, що фахівець у даній Таким чином, полімер може містити будь-яку фунобласті може створити кон'югати з сироватковим кціональну груп у, групи, що повторюються, зв'язки альбуміном, для яких N-кінець NBN або тіольний або інші складові структури, які не заважають компонент сироваткового альбуміну не є мішенню. ефективності композиції кон'югованого мутеїну За бажанням злиття NBN-сироватковий альбумін нейбластину при одержанні планованого резульможна створити з використанням способів генетитату. 21 82983 22 Ілюстративні полімери, які можна успішно виактивованого складного ефіру Nкористовувати для одержання вказаних необхідгідроксилсукциніміду (NHS), такого як сукцинімідиних характеристик, приведені у даному описі нижлсукцинат (SS-PEG) і сукцинімідилпропіонат (SPAче у типових схемах реакцій. У випадку PEG) ПЕГ. Відповідні поліалкіленгліколеві композастосувань ковалентно зв'язаного пептиду поліненти включають, наприклад, карбоксиметил-NHS, мер може бути функціоналізований і потім зв'язанорлейцин-NHS, SC-ПЕГ, трезилат, альдегід, епоний з вільною амінокислотою(ами) пептиду(дів) з ксид, карбонілімідазол і карбонат PNP. утворенням лабільних зв'язків. Сукцинімідиловий компонент може бути заміУ деяких варіантах поліпептид нейбластину нений додатковими реагуючими з аміном лінкеразв'язують з полімером за допомогою кінцевої реами ПЕГ. Вказані лінкери включають, наприклад, кційно-здатної групи поліпептиду. Альтернативно ізотіоціанати, нітрофенілкарбонати, епоксиди і або додатково поліпептид нейбластину можна карбонати бензотриазолу. Переважно вибирають зв'язати через аміногрупу бічного ланцюга внутріумови, щоб максимізувати вибірковість і ступінь шнього залишку лізину, наприклад, залишку лізиреакції. Можна використовувати лінійні та розгану, введеного в амінокислотну послідовність полілужені форми ПЕГ, а також інші форми алкілу. пептиду нейбластину природного походження. Довжина ПЕГ може варіювати. Розмір найбільш Таким чином, кон'югати також можуть бути розгазвичайних форм варіює від 2кД до 100кД. Поряд з луженими від некінцевих реакційно-здатних гр уп. тим, що у даних прикладах повідомляється, що Полімер з реакційно-здатною групою(ами) у даноцілеспрямоване пегілювання на N-кінці не впливає му описі називають «активованим полімером». на фармакокінетичні властивості, той факт, що Реакційно-здатна група вибірково реагує з вільною речовина зберігала фізіологічну функцію, свідчить аміногрупою або іншими реакційно-здатними групро те, що модифікація у сайті або сайтах, вказапами білка. них у даному описі, не здійснює негативного вплиЗв'язування активованого полімеру може відву. Тому при створенні мутантних форм NBN, які буватися біля будь-якої доступної аміногрупи нейможуть забезпечувати додаткові сайти зв'язуванбластину, такої як альфа-аміногрупа або епсілоння, за допомогою інсерції залишків лізину, вважааміногрупа залишку лізину або залишків, введених ється допустимим, що можливим результатом був амінокислотну послідовність поліпептиду нейбде те, що вказані форми можуть бути пегільвані як ластину або його варіанту. Вільні карбоксильні біля лізину, так і на N-кінці. групи, відповідним чином активовані карбонільні За необхідності варіантні поліпептиди нейблагрупи, гідроксил, гуанідил, імідазол, окислені вугстину можуть містити мітку, наприклад, мітку, яку леводні компоненти і меркаптогрупи нейбластину згодом можна вивільнити за допомогою протеолі(якщо вони є) також можна використовува ти як зу. Таким чином, представлений лізином компомісця зв'язування. нент можна вибірково модифікувати спочатку внаЗвичайно використовують приблизно від 1,0 слідок реакції варіанту, що містить his-мітку, з до 10моль активованого полімеру на моль білка в лінкером з низькою молекулярною масою, таким залежності від концентрації білка. Кінцева кількість як реагент Траута (Pierce), який буде реагувати як являє собою баланс між максимізацією ступеня з лізином, так і з N-кінцем, і потім вивільняючи hisреакції при мінімізації неспецифічних модифікацій мітку. Потім поліпептид буде містити вільну SHпродукту і в той же час визначенням хімічних груп у, яку можна вибірково модифікувати ПЕГ, що складів, які будуть підтримувати оптимальну актимістить реагуючу з тіолом головну групу, таку як вність, одночасно з оптимізацією, якщо це можлигрупа малеіміду, вінілсульфонова група, галогенаво, часу напівжиття білка. Переважно зберігається, цетатна група або вільна або захищена група SH. щонайменше, приблизно 50% біологічної активноРеагент Траута можна замінити будь-яким лінсті білка і найбільш переважно зберігається близькером, який буде забезпечувати специфічний сайт ко 100%. для зв'язування ПЕГ. Як приклад реагент Траута Реакції можна здійснювати будь-яким відповіможна замінити SPDP, SMPT, SATA або SATP (всі дним способом, що використовується для здійсдоступні з Pierce). Подібним чином можна здійснення реакцій біологічно активних речовин з інертнювати реакцію білка з реакційно-здатним по відними полімерами, переважно приблизно при рН 5ношенню до аміну лінкером, який вбудовує малеі8, наприклад, рН 5, 6, 7 або 8, у тому випадку, якмід (наприклад, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, що реакційно-здатні групи являють собою альфаSMPB, SMPH, KMUS або GMBS), галогенацетатну аміногрупу на N-кінці. Загалом, спосіб полягає в груп у (SBAP, SIA, SIAB) або вінілсульфонову груодержанні активованого полімеру і потім здійсненпу, і здійснювати реакцію одержаного у результаті ні реакції білка з активованим полімером, щоб продукту з ПЕГ, який містить вільну SH. Єдине одержати розчинний білок, придатний для компообмеження розміру лінкеру, який використовують, зиції. Вказану вище реакцію модифікації можна полягає у тому, щоб він не міг блокувати подальздійснити декількома способами, які можуть вклюше видалення N-кінцевої мітки. чати одну або декілька стадій. Таким чином, в інших варіантах поліалкіленгПолімер можна зв'язати з варіантним поліпепліколевий компонент зв'язують з групою цистеїну тидом нейбластину з використанням способів, поліпептиду нейбластину або варіантного поліпепвідомих у даній області. Наприклад, в одному ватиду нейбластину. Зв'язування можна здійснити, ріанті поліалкіленгліколевий компонент зв'язують з наприклад, з використанням малеімідної групи, групою лізину поліпептиду нейбластину або варіавінілсульфонової групи, галогенацетатної групи і нтного поліпептиду нейбластину. Зв'язування з тіольної групи. групою лізину можна здійснити з використанням 23 82983 24 З полімером може бути зв'язаний один або дедосягнення необхідної біодоступної дози або конкілька сайтів варіантного поліпептиду нейбластицентрації in vivo. ну. Наприклад, з полімером можуть бути зв'язані Композиції включають композиції, придатні один, два, три, чотири або п'ять ПЕГ-компонентів. для парентерального, а також для непарентераУ деяких варіантах ПЕГ-компонент зв'язують з льного введення, і конкретні способи введення амінокінцем і/або амінокислотами 14, 39, 68 і 95 включають пероральне, ректальне, трансбукальполіпептиду нейбластину, пронумерованими, як не, місцеве, назальне, очне, підшкірне, внутріописано у таблиці 1. шньом'язове, внутрішньовенне, трансдермальне, У переважних варіантах варіантний поліпепінтратекальне, внутрішньосуглобове, внутрішньотид нейбластину у композиції має більш тривалий артеріальне, підарахноїдальне, бронхіальне, лімчас напівжиття у сироватці у порівнянні з часом фатичне, вагінальне та внутрішньоматкове ввенапівжиття варіантного поліпептиду за відсутності дення. Переважні композиції, придатні для полімеру. Альтернативно або додатково варіантаерозольного і парентерального введення, як лоний поліпептид нейбластину у композиції зв'язує кально, так і системно. GFRa3, активує RET, нормалізує патологічні зміни У тому випадку, коли варіантний нейбластин нейрона або підвищує життєздатність нейрона або використовують у композиції, яка містить рідкий виконує комбінацію вказаних фізіологічних функрозчин, композицію переважно можна вводити цій. перорально, бронхіально або парентерально. У У переважних варіантах композицію готують у випадку використання нейбластину у рідкій сувигляді стабільного водорозчинного кон'югованого спензійній композиції або у вигляді порошку у біокомплексу поліпептиду нейбластину або варіантсумісній композиції носія, композицію переважно ного поліпептиду нейбластину, що містить поліпеможна вводити перорально, ректально або бронптид нейбластину або варіантний поліпептид нейхіально. Альтернативно її можна вводити назальбластину, зв'язаний з поліетиленгліколевим но або бронхіально за допомогою розпилення покомпонентом. За бажанням поліпептид нейбласрошку у газі-носії, щоб утворити газоподібну тину або варіантний поліпептид нейбластину мождисперсію порошку, який вдихає пацієнт з дихальна зв'язати з поліетиленгліколевим компонентом ного контуру, що містить відповідний пристрій для за допомогою лабільного зв'язку. Лабільний зв'ярозпилення. зок можна розщепити, наприклад, при біохімічному Композиції, які містять білки відповідно до дагідролізі, протеолізі або сульфгідрильному розщеного винаходу, зручно можуть бути представлені у пленні. Наприклад, зв'язок можна розщепити в дозованих лікарських формах і можуть бути пригоумовах in vi vo (фізіологічних умовах). товані будь-яким із способів, добре відомих в обФармацевтичні композиції, що містять кон'югаласті фармації. Такі способи, як правило, включати варіантний нейбластин-полімер ють стадію введення активного інгредієнта(тів) в Також представлена фармацевтична компоасоціацію з носієм, до складу якого входить один зиція, що містить кон'югат варіантний нейбластинабо декілька додаткових інгредієнтів. полімер відповідно до даного винаходу. «ФармаЗвичайно композиції готують шляхом одерцевтичну композицію» у значенні, що використовужання однорідної і тісної асоціації активного інгреється у даному описі, визначають як композицію, дієнта(тів) і рідкого носія, тонко диспергованого яка містить білок або кон'югат нейбластину відпотвердого носія або обох носіїв і потім за необхідвідно до винаходу, диспергований у фізіологічно ності, формуванням продукту у вигляді дозованих прийнятному наповнювачі, яка необов'язково місформ необхідної композиції. тить один або декілька інших фізіологічно сумісних Композиції відповідно до даного винаходу, інгредієнтів. Таким чином, фармацевтична компопридатні для перорального введення, можуть бути зиція може містити ексципієнт, такий як вода, одну представлені у вигляді дискретних одиниць, таких або декілька неорганічних речовин, цукрів, детеряк капсули, облатки, таблетки або пастилки, кожна гентів і один або декілька носіїв, таких як інертний з яких містить заздалегідь визначену кількість акбілок (наприклад, гепарин або альбумін). тивного інгредієнта у вигляді порошку або гранул; Кон'югати полімер-нейбластин відповідно до або у вигляді суспензії у водному розчині або невинаходу можна вводити як такі, а також у формі їх водному розчині, такої як сироп, еліксир, емульсія фармацевтично прийнятних складних ефірів, соабо рідкі ліки, що дозуються. лей та інших фізіологічно функціональних похідКомпозиції, придатні для парентерального них. У таких фармацевтичних і лікарських комповведення, для зручності містять стерильний водзиціях кон'югат варіантного нейбластину ний препарат активного кон'югата, який переважно переважно використовують разом з одним або є ізотонічним крові реципієнта (наприклад, фізіодекількома фармацевтично прийнятними носіями і логічний розчин солі). Такі композиції можуть міснеобов'язково будь-якими іншими терапевтичними тити агенти, що суспендують, і загусники або інші інгредієнтами. системи мікрочастинок, які розроблені для цілеспНосій(ї) повинен бути фармацевтично прийнярямованої доставки сполуки до компонентів крові тним у значенні сумісності з іншими інгредієнтами або одного або декількох органів. Композиції мокомпозиції і не бути занадто небезпечним для режуть бути представлені у формі одноразової дози ципієнта. Варіантний нейбластин вводять у кількоабо у формі багаторазових доз. сті, ефективній для досягнення необхідної фармаКомпозиції назального спрею містять очищені кологічної дії або корисного лікарського ефекту, які водні розчини активного кон'югата з консервантаописані у даній заявці, і у кількості, придатній для ми і агентами для ізотонічності. Такі композиції 25 82983 26 переважно доводять до рН та ізотонічного стану, Пошкодження, зокрема, може відбутися у чутсумісного з мембранами слизової оболонки носа. ливих нейронах або клітинах ретинального ганглія, Композиції для ректального введення можуть включаючи нейрони у гангліях дорзальних корінців бути представлені у вигляді супозиторія з відповіспинного мозку, або у будь-якій з наступних ткадним носієм, таким як олія какао, гідрогенізовані нин: ганглій колінця, позачерепний ганглій і вузлужири або гідрогенізована жирна карбонова кисловатий ганглій; присінково-завитковий комплекс та. Очні композиції, такі як очні краплі, готують восьмого черепно-мозкового нерва; вентролатеспособом, подібним до способу одержання назаральний полюс верхньощелеповоїльного спрею, за винятком того, що рН і фактори нижньощелепової частки трійчастого ганглія; і медля ізотонічності переважно доводять так, щоб зенцефалічне ядро трійчастого нерва. вони підходили для ока. У переважному варіанті способу відповідно до Місцеві композиції містять кон'югати відповідвинаходу захворюванням або розладом є нейроно до винаходу, розчинені або суспендовані в оддегенеративне захворювання, до якого залучені ному або декількох середовищах, таких як мінерапошкоджені і травмовані нейрони, а саме травмальне масло, гас, багатоатомні спирти або інші тичні пошкодження периферичних нервів, довгасоснови, що використовуються для місцевих фартого мозку і/або спинного мозку, пошкодження мацевтичних композицій. нейронів при церебральній ішемії, невропатія і Крім вказаних вище інгредієнтів композиції особливо периферична невропатія, травма або відповідно до даного винаходу можуть додатково пошкодження периферичного нерва, ішемічний містити один або декілька допоміжних інгредієнтів, інсульт, гостре пошкодження головного мозку, госвибраних з розріджувачів, буферів, коригентів, тре пошкодження спинного мозку, пухлини нервоагентів, що дезінтегрують, поверхнево-активних вої системи, множинний склероз, вплив нейротокречовин, загусників, речовин, що ковзають, консесинів, метаболічні захворювання, такі як діабет рвантів (включаючи антиоксиданти) і тому подібноабо дисфункція нирок, і пошкодження, викликане го. Вказані вище міркування також застосовні до інфекційними агентами, нейродегенеративні роззлитих білків нейбластину відповідно до винаходу лади, що включають хворобу Альцгеймера, хво(наприклад, злиття нейбластин-HSA). робу Хантінгтона, хворобу Паркінсона, синдроми з Таким чином, даний винахід охоплює одервиявленнями хвороби Паркінсона, супрануклеаржання придатних злитих білків для стабілізації ний параліч, що прогресує (синдром Стілакон'югата варіантного нейбластину у розчині in Річардсона-Ольшевського), оливо-понтоvitro як переважне ілюстративне застосування вицеребелярну дегенерацію (ОПЦД), синдром Шаянаходу. Злиті білки можна використовувати, наДрейджера (множинна системна атрофія), комприклад, для того, щоб підвищити стійкість варіанплекс деменція-паркінсонізм (Гуам-тип), бічний тного поліпептиду нейбластину до деградаціїаміотрофічний склероз, або будь-яке інше прироферментами і надати способи підвищення терміну джене або нейродегенеративне захворювання, і зберігання, стабільності при кімнатній температурі погіршення пам'яті, зв'язане з деменцією. і тому подібного. Зрозуміло, що вказані вище мірУ переважному варіанті можна лікувати чутликування також застосовні до злитих білків нейблаві нейрони і/або нейрони автономних систем. Зокстин-сироватковий альбумін (включаючи злиті білрема, можна лікувати ноцицептивні та механореки нейбластин людини-сироватковий альбумін цептивні нейрони, більш конкретно нейрони з людини) відповідно до винаходу. дельта-волокнами і С-волокнами. Крім того, можна Способи лікування лікувати симпатичні і парасимпатичні нейрони авВаріантні поліпептиди нейбластину, а також їх тономної системи. злиті білки або кон'югати можна використовувати В іншому переважному варіанті можна лікувадля лікування або ослаблення розладу або захвоти захворювання мотонейронів, такі як бічний амірювання в організмі існуючих тварин, переважно отрофічний склероз («БАС») і спінальна аміотроссавця, більш переважно примата, включаючи фія. У ще одному переважному варіанті молекули людину, коли вказаний розлад або захворювання нейбластину відповідно до даного винаходу можна піддається впливу активності нейротрофічних агевикористовува ти для прискорення відновлення нтів. нервів після травматичного ураження. АльтернаКомпозиції відповідно до винаходу можна витивно або додатково у приведених у даному описі користовувати безпосередньо, наприклад, за доспособах можна використовувати канал керування помогою фармацевтичних композицій, які ін'єкунервом за допомогою матриксу, що містить варіають, проковтують або імплантують для лікування нтні поліпептиди нейбластину або злиття або патологічного процесу, що відповідає на поліпепкон'югати варіантних поліпептидів нейбластину. тиди нейбластину. Композиції можна використовуТакі канали керування нервами заявлені, напривати для ослаблення розладу або захворювання в клад, у [патенті США No. 5834029], включеному у організмі існуючих тварин, включаючи людину, даний опис у вигляді посилання. коли розлад або захворювання піддається впливу У переважному варіанті вказані у даному описі активності нейротрофічних агентів. Розладом або композиції (і фармацевтичні композиції, які їх місзахворюванням, зокрема, може бути пошкодження тять) використовують для лікування периферичних нервової системи, викликане травмою, хірургічною невропатій. Серед периферичних невропатій, які операцією, ішемією, інфекцією, метаболічними передбачається лікувати молекулами відповідно захворюваннями, недостатністю харчування, злодо даного винаходу, знаходяться індуковані травякісним новоутворенням або токсичними агентамами невропатії, наприклад, такі, які викликані ми, і генетичними або ідіопатичними процесами. фізичним пошкодженням або патологічним ста 27 82983 28 ном, фізичне пошкодження головного мозку, фізидомінував над збільшенням часу напівжиття, якого чне пошкодження спинного мозку, інсульт, зв'язаочікували при пегілюванні. ний з пошкодженням головного мозку, і неврологіПриклад 2 - Конструювання пегільованого мучні порушення, зв'язані з нейродегенерацією. теїну нейбластину N95K Також включені у даний винахід невропатії, які є Потім визначали біодоступність мутантних вторинними після інфекції, впливу токсину і вплиформ NBN, пегільованих по внутрішніх амінокисвів лікарського засобу. Крім того, у даний винахід лотних залишках. Конструювали серію з чотирьох включені невропатії, які є вторинними після системутантів із замінами залишків природного похомного або метаболічного захворювання. Заявлені дження у положеннях 14, 39, 68 і 95, щоб вбудувау даному описі композиції також можна використоти лізин у вибрані місця у послідовності. Вказані вувати для лікування невропатій, індукованих хілізини могли б забезпечувати альтернативні сайта міотерапією (таких як невропатії, викликані надходля зв'язування ПЕГ. Вказані сайти вибирали з дженням хемотерапевтичних засобів, наприклад, використанням кристалічної структури GDNF [Nat. таксолу або цисплатину); невропатій, індукованих Struct. Biol. 4: 435-8, 1997] як основи для ідентифітоксинами, невропатій, індукованих лікарськими кації поверхневих залишків і мутагенного дослізасобами, невропатій, індукованих недоліком відження химери персефін/нейбластин [J. Biol. тамінів; ідіопатичних невропатій; та діабетичних Chem. 275: 3412-20, 2000], щоб ідентифікувати невропатій. Дивись, наприклад, [патенти США функціонально важливі ділянки структури, які не 5496804 і 5916555], кожний з яких включений тут у треба зачіпати. вигляді посилання. Дві мутації (R39 і R68) були цілеспрямовано Додатковими станами, які можна лікувати з вивведені у ділянку, яка на основі розподілу позитикористанням приведених у даному описі композивних зарядів на поверхні, може являти собою сайт цій, є мононевропатії, множинні мононевропатії і зв'язування гепарину, властивість білка, яка ймополіневропатії, включаючи аксональну невропатію вірно здійснює внесок в його швидкий кліренс. і невропатію, що димієлінізує, з використанням Третій сайт був цілеспрямовано введений у N95, вказаних у даному описі композицій. сайт природного глікозилування NBN дикого типу. В іншому переважному варіанті композиції відДаний сайт модифікується у природних умовах повідно до винаходу (і фармацевтичні композиції, складною вуглеводною стр уктурою. Таким чином, які їх містять) використовують для лікування різних очікувалося, що ПЕГ-модифікація у вказаному захворювань ока, включаючи руйнування фоторесайті не порушить функцію. Четвертий сайт (R14) цепторів сітківки у пацієнтів, які страждають дегевибрали у ділянці, що не містить яких-небудь іннерацією жовтої плями, пігментним ретинітом, ших модифікацій. Для вказаних у даному описі глаукомою та подібними захворюваннями. досліджень вибрали мутант, в якому залишок асВинахід буде далі ілюстрований наступними парагіну у положенні 95 замінювали лізином («мунеобмежувальними прикладами. тант N95K»). Приклад 1 - Біодоступність пегільованого на NКонструювали чотири різних мутеїни нейбласкінці нейбластину тину щура, що містять одну або декілька змін у Виявили, що одержаний у клітинах CHO рекопослідовності поліпептиду нейбластину щура димбінантний нейбластин людини зазнає швидкого кого типу. Мутеїни включають мутеїн N95K з однікліренсу з циркуляції у випадку внутрішньовенного єю зміною і мутеїни, що містять одиничні заміни в введення щурам. Після підшкірного введення не інших сайтах амінокислотної послідовності нейбвиявляли білка у сироватці. Щоб підвищити біодоластину щура: R14K; R68K і R39K. У номенклатурі ступність нейбластину конструювали пегільовані «X1N1 X2» X1 відноситься до амінокислоти поліпепформи. тиду нейбластину дикого типу, N1 відноситься до Оскільки у послідовності NBN не зустрічаютьномеру положення амінокислоти X1 у послідовносся лізини, то результатом специфічних відносно ті, яка пронумерована відповідно до SEQ ID NO: 1. аміну хімічних реакцій пегілювання буде пегілюX2 відноситься до амінокислоти, яка заміщує амівання поліпептиду NBN по його амінокінцю. Отже, нокислоту дикого типу у вказаному пронумеровадля кожного димеру нейбластину необхідно зв'яному положенні послідовності. зати два ПЕГ-компоненти. Таким чином, спочатку Щоб сконструювати мутацію нейбластину безпосередньою мішенню ПЕГ-форм був N-кінець N95K, здійснювали сайт-специфічний мутагенез у за рахунок специфічних відносно аміну хімічних рСМВ020, плазміді, що кодує нейбластин щура реакцій. Несподівано навіть пегілювання двома дикого типу. Нуклеотидна послідовність нейбласзв'язаними ПЕГ з М.м. 20кД було мало корисним тину дикого типу і амінокислотна послідовність відносно часу напівжиття, що свідчить про те, що поліпептиду, що кодується нею, представлені нижмеханізм, який лежить в основі шляху кліренсу, че: 29 82983 Мутагенез рСМ020 з використанням олігонуклеотидів KD2-310 і KD3-211 приводив до утворення плазміди рСМВ027: KD2-310 5'GTATCTTTCATGGACGTAAAGTCTAC ATGGAGAA CCGTAGAТСАТСТАТСТССААСС-3' (SEQ ID NO: 6) KD2-311 5'GGTTGCAGATAGATGATCTACGGTTCTCC ATGTA GACTTTACGTCC ATGAAAGATAC-3' (SEQ ID NO: 7) У рСМВ027, кодон, що кодує аспарагін у положенні 95, замінили кодоном, який кодує лізин. Мутеїн нейбластину R14K утворювали заміною кодону, що кодує аргінін, у положенні 14 послідовності рСМВ020, яка кодує нейбластин, кодоном, що кодує лізин. Сайт-специфічний мутагенез здійснювали у рСМВ020 з використанням олігонуклеотидів KD3-254 і KD3-255: KD3-254 5'GCTGGAACTCGC AGCTCTCGTGCTCGTGC AACG GATGC AAAAGGCTGTCG-3' (SEQ ID NO: 8) KD2-255 5'CGAC AGCCTTTTGC ATCCGTTGCACGAGCACGAG AGCTGCGAGTTCCAGC-3' (SEQ ID NO: 9) Одержана у результаті конструкція була названа рСМВ029. Мутеїн нейбластину R68K утворювали заміною кодону, що кодує аргінін, у положенні 68 послідовності рСМВ020, яка кодує нейбластин, кодоном, що кодує лізин. Сайт-специфічний мутагенез здійснювали у рСМВ020 з використанням олігонуклеотидів KD3-258 і KD3-259: KD3-258 5'GGAGCCGGAGC ACTAAAATCTCCCCGGGATCTA GACC-3' (SEQ ID NO: 10) KD3-259 5'GGTCTAGATCCCGGGGGAGATTTTAGTGCTCCG GCTCC-3' (SEQIDNO: 11) 30 Одержана у результаті конструкція була названа рСМВ030. Мутеїн нейбластину R39K утворювали заміною аргініну лізином у положенні амінокислоти 39 послідовності рСМВ020, яка кодує нейбластин. Сайт-специфічний мутагенез рСМВ020 здійснювали з використанням олігонуклеотидів KD3-256 і KD3-257: KD3-256 5'GACGAATTAATTAAGTTTCGTTTTTGTTCAGG-3' (SEQ ID NO: 12) KD3-257 5'CCTGAAC AAAAACGAAACTTAATTAATTCGTC-3' (SEQ ID NO: 13) Для експресії і очищення плазміду, яка кодує мутеїн NBN N95K щура, експресували в E. соlі у вигляді міченого His злитого білка з сайтом розщеплення ентерокіназою, що безпосередньо прилягав до початку послідовності зрілого 113амінокислотного NBN. E. соlі вирощували у ферментері об'ємом 500л і готували заморожену клітинну масу. Клітини E. соlі лізували у прес-фільтрі Manton Gaulin, і NBN NK щурів діставали з нерозчинної промитої фракції осаду. NBN екстрагували з осаду гуанідинхлоридом, піддавали згортанню і his-мітку видаляли ентерокіназою. Потім продукт піддавали хроматографії на Ni NTA-агарозі (Qiagen) та на катіонообмінній смолі WP CBX Bakerbond. Оброблення ентерокіназою his-мІченого продукту приводило до аберантного розщеплення білка біля аргініну у положенні 7 зрілої послідовності. Одержаний у результаті продукт des-1-7NBN був повністю активним в ELISA KIRA і структурно не відрізнявся від зрілої форми за своєю чутливістю до індукованої гуанідином денатурації і тому був використаний для подальшої роботи. NBN N95K щура пегілювали у середньому 3,3 ПЕГ-компонентів/молекулу, використовуючи як реагент метоксиполі(етиленгліколь)сукцинімідилпропіонат (SPA-ПЕГ) з молекулярною масою 10000Д. Одержаний у результаті пегільований продукт всебічно характеризували, включаючи аналіз за допомогою електрофорезу у SDS-ПААГ, ексклюзійну хроматографію по розміру (SEC), обернено-фазову ВЕРХ, масспектрометрію з лазерною десорбцією/іонізацією з матриці (MALD/IMC), картування пептидів, оцінку активності в ELISA KIRA і визначення вмісту ендотоксину. Чистота продукту NBN N95K перед пегілюванням, виміряна за допомогою SDS-ПААГ і SEC, складала більше 95%. Продукт NBN N95K в умовах, які не відновлюють, мігрував у вигляді димеру, що відповідало його розрахованій структурі. Після пегілювання одержаний продукт складався з серії модифікованих аддуктів, що містять 2ПЕГ/молекулу - 5% продукту, 3ПЕГ/молекулу 60% продукту, 4ПЕГ/молекулу - 30% продукту і декілька мінорних форм більш високої маси. У пегільованому зразку не було ознак агрегатів. Залишкові рівні немодифікованого NBN у продукті були нижче меж кількісного вимірювання. Вміст ендотоксину у матеріалі звичайно складає менше 1EU/мг. Питома активність пегільованого NBN в ELISA KIR A складає 10нМ. Пегільований продукт готували при концентрації 1,1мг/мл у PBS, рН 6,5. 31 82983 32 Матеріал, який за ефективністю подібний до NBN ПААГ в 4-20% градієнтному гелі (OwI). Гель забадикого типу, можна постачати у вигляді заморожервлювали Кумасі яскраво-синім R-250. Паралельного розчину, який зберігають при -70°C. но розганяли маркери молекулярної маси (GIBCOМутеїни R14K, R39K і R68K експресували в E. BRL). соlі і їх можна піддавати таким же способам очиАналіз у SDS-ПААГ пегільованого NBN NK в щення, пегілювання та оцінки функції, які описані умовах, що не відновлюють, виявив серію смуг, які вище для N95K-NBN. відповідають модифікаціям 2, 3, 4 і більше Приготування пегільованого NBN 4ПЕГ/молекулу. Основна смуга з видимою масою 230мл підданого згортанню NBN N95K щура 98кД містить 3ПЕГ/молекулу. В очищеному пегі(2,6мг/мл), який одержували в E. соlі і зберігали льованому продукті немодифікований NBN не випри 4°С в 5мМ фосфаті натрію, рН 6,5, 100мМ являли. Наявність суміші продуктів з 2, 3 і 4 зв'яNaCl, розбавляли 77мл води, 14,4мл 1M HEPES, заними ПЕГ підтверджували за допомогою MALDIрН 7,5 і 2,8г (кінцева концентрація 10мг/мл) ПЕГ мас-спектрометричного аналізу. Співвідношення SPA, 10000Д (Shearwater Polymers, Inc.). Зразок продуктів, які містять 2, 3 і 4ПЕГ, визначали за інкубували при кімнатній температурі протягом 4 допомогою денситометрії і встановили, що воно годин у темряві, потім обробляли 5мМ імідазолу дорівнює 7, 62 і 30 процентів від сумарної кількос(кінцева концентрація), фільтрували і зберігали ті, відповідно. протягом ночі при 4°C. Продукт готували у двох Характеристика пегільованого NBN за допомопартіях, одна з яких містила 130мл NBN N95K по гою ексклюзійної хроматографії по розміру об'єму, а інша містила об'єм 100мл. Пегільований Пегільований NBN піддавали ексклюзійній NBN очищали від реакційної суміші на колонці хроматографії по розміру на аналітичній колонці Superose 6 HRl 0/30 FPLC з використанням як руFractogel EMD SO3- (M) (EM Industries). Розгонку на колонці проводили при кімнатній температурі. хомої фази 5мМ MES, рН 6,5, 300мМ NaCl. Розгонку на колонці проводили із швидкістю Всі буфери готували апірогенно. До реакційної 20мл/годину. Елюйовані фракції контролювали суміші додавали хлорид натрію до кінцевої концевідносно оптичної щільності при 280нм. Пегільовантрації 87мМ і зразок наносили на колонку ний NBN елюювали у вигляді окремого піку з виFractogel об'ємом 45мл (внутрішній діаметр 5см). Колонку промивали одним об'ємом колонки димою молекулярною масою приблизно 200кД відповідно до великого гідродинамічного об'єму 5мМ фосфату натрію, рН 6,5, 80мМ NaCl, потім ПЕГ. Не спостерігали ознак агрегатів. Вільний трьома аліквотами об'ємом, що дорівнює об'єму NBN, який елююється з видимою молекулярною колонки, 5мМ фосфату натрію, який містить 50мМ масою приблизно 30кД, у препараті не виявляли. NaCl. Смолу переносили на колонку діаметром 2,5см і пегільований NBN елюювали з колонки Аналіз пегільованого NBN обернено-фазовою ВЕРХ шістьма аліквотами об'ємом по десять мл, які місПегільований NBN NK піддавали оберненотять 5мМ фосфа т натрію, рН 6,5, 400мМ NaCl, фазовій ВЕРХ на колонці Vydac C4 (5мкм, трьома аліквотами, що містять 500мМ NaCl, і шіс1х250мм). Колонку обробляли, використовуючи тьма аліквотами, які містять 600мМ NaCl. Елюйовані фракції аналізували відносно вмісту білка по 60мм градієнт від 40 до 60% В (буфер А: 0,1% ТФУ, буфер В: 75% ацетонітрил/0,085% ТФУ). Пооптичній щільності при 280нм і потім відносно стутік, що витікає з колонки, контролювали відносно пеня модифікації за допомогою електрофорезу в оптичної щільності при 214нм і збирали фракції SDS-ПААГ. Вибрані фракції об'єднували, фільтрудля подальшого аналізу. Пегільований NBN NK вали через фільтр з діаметром пор 0,2мкм і розбавляли водою до 1,1мг пегільованого NBN щуфракціонували на його різні ди-(60,5мм), три(63,3мм) і тетра-(67,8мм) пегільовані компоненти рів/мл. Після оцінки рівнів ендотоксину в окремих обернено-фазовою ВЕРХ на колонці С4. Відносна партіях їх об'єднували і повторно фільтрували інтенсивність піків свідчить, що співвідношення через 0,2мкм-мембрану. Кінцеву речовину ділили компонентів складають 5,4; 60,5 і 30,1%, відповідна аліквоти і зберігали при -70°C. УФ-спектр очищеного пегільованого NBN NK но. Інтенсивності піків підтверджували за допомогою MALDI-MC. Не було ознак непегільованого УФ-спектр (240-340нм) пегільованого NBN NK NBN NK (елююється при 5-15 мм) у продукті. вимірювали на чистому зразку. Зразок аналізували Аналіз пегільованого NBN мас-спектрометрією у трьох повторах. Пегільований зразок виявляв Пегільований NBN NK знесолювали на С4 Zip максимум поглинання при 275-277нм і мінімум поглинання при 247-249нм. Одержаний результат Tip і аналізували мас-спектрометрією у часопролітному мас-спектрометрі з лазерною десорбціузгоджується з результатом, який спостерігається у випадку немодифікованої проміжної сполуки осєю/іонізацією з матриці (MALDI-TOF) Vo yager-DEÔ новної маси NBN. Концентрацію білка пегільованоSTR (PerSeptive Biosystems) з використанням як го продукту оцінювали на основі спектра, викорисматриці синапінової кислоти. 0,5мкл очищеного білка змішували з 0,5мкл матриці на пластині для товуючи коефіцієнт екстинкції S 2800,1%=0,50. мішеней. Мас-спектрометрія пегільованого NBN Концентрація білка основної маси пегільованого виявила форми трьох аддуктів з одним і двома NBN складала 1,1мг/мл. У зразку не було каламузарядами. Маси, що спостерігаються, 43803Д, тності, що очевидно, виходячи з відсутності погли54046Д і 64438Д відповідають модифікаціям 2, 3 і нання при 320нм. 4ПЕГ/молекулу. Характеристика пегільованого NBN NK за доАналіз пегільованого NBN за допомогою карпомогою електрофорезу в SDS-П ААГ тування пептиду Аліквоти пегільованого NBN, що містять 3; 1,5; 0,75 і 0,3мкг продукту, піддавали аналізу у SDS 33 82983 34 Специфічність реакції пегілювання оцінювали ТФУ). Потік, що витікає з колонки, контролювали за допомогою картування пептидів. Пегільований відносно оптичної щільності при 214нм. NBN розділяли на ди-, три- і тетрапегільовані комПослідовність NBN щурів містить чотири внутпоненти, які потім відновлювали, алкілували і далі рішніх аспарагінових кислоти і тому передбачаєтьрозділяли на їх одноланцюгові компоненти за дося, що вона дає простий профіль розщеплення у помогою ВЕРХ на колонці С4. Одержані компоненвипадку розщеплення ендопротеїназою Asp-N. Всі ти і відновлений та алкілований немодифікований піки з продукту розщеплення NBN NK щура ендоNBN NK як контроль розщеплювали Asp-Nпротеїназою Asp-N ідентифікували маспротеїназою і одержані у результаті продукти розспектрометрією і/або N-кінцевим секвенуванням за щеплення фракціонували обернено-фазовою Едманом і таким чином пептидну карту можна виВЕРХ на колонці Vydac C 18 (5мкм, 1х250мм), викокористовувати як простий засіб для дослідження ристовуючи 60мм-градієнт від 0 до 60% В (буфер сайтів модифікації по наявності або відсутності А: 0,1% ТФУ, буфер В: 75% ацетонітрил/0,085% піку. Іденти фікація різних піків сумарно показана у таблиці 3 нижче. Оскільки NBN існує у вигляді гомодимеру, продукт NBN NK щура містить чотири можливих сайти для пегілювання, два N-кінцевих аміни з кожного ланцюга і два сайти N95K, які були створені у конструкції. У пептидній карті дипегільованого ланцюга тільки пік, який містить пептид з мутацією NK, був змінений ПЕГ-модифікацією. ПЕГмодифікація не впливала ні на які інші піки. Таким чином, дані картування свідчать про те, що ПЕГкомпонент специфічно зв'язаний з даним пептидом і не зв'язаний ні з якими іншими пептидами, які піддавали скринінгу. Другий можливий сайт зв'язування, N-кінець, знаходиться на пептиді, який має довжину тільки з трьох амінокислот і не виявляється у пептидній карті. Припускається, що додаткове зв'язування ПЕГ відбувається у даному сайті. Відповідно до цієї точки зору невеликий процент NBN NK щура не укорочений і містить зрілу послідовність AIa-1. Даний пептид елююється при 30мкм і помітний на пептидній карті непегільованого продукту розщеплення, але відсутній у продуктах розщеплення пегільованого NBN NK. Приклад 3. Оцінка ефективності внутрішньо пегільованого нейбластину в ELISA активації кіназного рецептора (KIRA) Ефективність пегільованого NBN щура вимірювали з використанням NBN-залежної активаціі/фосфорилювання c-RET як репортера активності NBN в ELISA, який був специфічний відносно присутності фосфорильованого RET. Клітини NB41A3-mRL3 лінії адгезивних клітин нейробластоми мишей, яка експресує RET і GFRa3, висівали при концентрації 2х105 клітин на ямку у 24-ямкові планшети у середовище Ігла модифіковане Дульбеко (DMEM) з додаванням 10% фетальної сироватки теляти і культивували протягом 18 годин при 37°C і 5% CO2. Клітини промивали PBS і обробляли серійними розведеннями NBN в 0,25мл DMEM протягом 10хв. при 37°C і 5% CO2. Кожний зразок аналізували у дво х повторах. Клітини промивали 1мл PBS та лізували протягом 1 години при 4°C за допомогою 0,30мл 10мМ Трис-НСІ, рН 8,0, 0,5% Nonidet P40, 0,2% дезоксихолату натрію, 50мМ NaF, 0,1мМ Na3VO 4, 1мМ фенілметилсульфонілфториду при обережному струшуванні планшетів. Потім лізати додатково перемішували багаторазовим піпетуванням і 0,25мл зразку переносили у 96-ямкові планшети для ELISA, які були покриті 5мкг/мл анти-RET-мАт (AA.GE7.3) в 50мМ карбонатному буфері, рН 9,6, при 4°C протягом 18 годин, і блокували при кімнатній температурі протягом однієї години блокувальним буфером (20мМ Трис-НСІ, рН 7,5, 150мМ NaCl, 0,1% Твін-20 (TBST), що містить 1% нормальної сироватки миші і 3% бичачого сироваткового альбуміну). Після 2 годин інкубації при кімнатній температурі ямки 6 разів промивали TBST. Фосфорильований RET реєстрували, інкубуючи ямки при кімнатній температурі протягом 2 годин з 2мкг/мл кон'югованого з пероксидазою хрону (HRP) антитіла проти фосфотирозину 4G10 у блокувальному буфері, 6 разів промиваючи TBST і вимірюючи активність HRP при 450нм за допомогою реагенту для колориметричної реєстрації. Вимірювали зна 35 82983 36 чення оптичної щільності для ямок, оброблених діабетичних щурів STZ. NBN дикого типу го тували лізатом або буфером, що лізує, і скоригований у композиції для безпосереднього дослідження на відносно фону сигнал наносили на графік у вигляді тварині, тоді як NK-NBN готували для пегілювання функції концентрації NBN, який присутній в актиПЕГ-SPA 10кД. Для здійснення згортання і з метою ваційний суміші. Ефективність пегільованого NBN очищення розробили спосіб згортання з викорисв ELISA KIR A складала 10нМ, що не відрізняється танням ексклюзійної хроматографії по розміру від ефективності вихідної речовини NBN NK. Два (SEC), який дозволяє проводити ренатурацію NBN цикли заморожування-відтавання не впливали на з тілець включення E. соlі у великих кількостях і ефективність, і після вказаної обробки не було при високих концентраціях. Для підвищення чистоістотного збільшення каламутності зразка, що світи кінцевого білка додатково до SEC застосовувадчить про те, що зразки можна безпечно розмороли стадії хроматографії як на колонці з Ni-NTA, так жувати для дослідження. У незалежних досліі на колонці з діоксидом кремнію CM. Білки піддадженнях за оцінкою активності продукту з трьома і вали всебічній характеризації, включаючи аналіз чотирма 10кД-ПЕГ/молекулу окремо, визначили, за допомогою електрофорезу у SDS-ПААГ, ексщо аддукт з трьома ПЕГ був повністю активним, клюзійну хроматографію по розміру, ESMS, оцінку тоді як продукт з чотирма ПЕГ мав знижену активактивності в ELISA KIRA та визначення вмісту енність. дотоксину. SDS-ПААГ і SEC кінцевих білкових Приклад 4. Фармакокінетичні дослідження продуктів показав чистоту більше 95%. Рівень енвнутрішньо пегільованого нейбластину щура у дотоксину у кожному продукті складав 95% гуанідин-НСІ, 8,8мМ відновленим глутатіоном і для тестів на ефективність у моделі невропатії у 0,22мМ окисленим глутатіоном. Колонку обробля 37 82983 38 ли, використовуючи 0,5M гуанідин-НСІ при швидкістю 20мл за хвилину. Колонку промивали двакості 20мл за хвилину. Фракції, які містять ренатудцятьма об'ємами колонки буфера для промиванрований NBN дикого типу або NK-NBN, ідентифіня (5мМ фосфат, рН 6,5, 400мМ NaCl) і білок кували у SDS-ПААГ, об'єдн ували і зберігали при елюювали буфером, що елюює, який містить 5мМ 4°C аж до того, як було необхідно видалити Hisфосфа т, рН 6,5, але 1M NaCl. Елюйований білок мітку. діалізували протягом ночі проти одного фосфату, Концентрування NBN при Ni-NTAщоб знизити концентрацію солі до 100мМ у випадхроматограФії (TR5919-138) ку NK-NBN і 150мМ у випадку NBN дикого типу. Ренатурований NBN зберігали при 4°C, щоОбидва зразки фільтрували через фільтрувальну найменше, протягом 24 годин до здійснення очиустановку 0,2мк PES, аналізували у SDS-П ААГ і щення, щоб стимулюва ти дисульфідне утворення зберігали при 4°C аж до того, як була потрібна між мономерами NBN. За цей час утворювався подальша характеристика і/або пегілювання. осад, і його видаляли фільтруванням через фільтNBN дикого типу і NK-NBN піддавали аналізу рувальну установку 0,2мк PES. Щоб зменшити відносно УФ-спектрів, щоб оцінити їх поглинання неспецифічне зв'язування концентрацію імідазолу при 280. Використовуючи кварцову мікрокювету і у розчині білка доводили до 20мМ перед завантаобнуління у порівнянні з одним буфером, 100мкл женням на колонку Ni-NTA (Qiagen) об'ємом або NBN дикого типу, або NK-NBN безперервно 100мл, зрівноважену буфером для колонки (0,5M сканували від 230 до 330нм, використовуючи спекгуанідин і 20мМ імідазол) із швидкістю 50мл за трофотометр Beckman. Ha основі даного аналізу хвилину. Після нанесення білка колонку промивавизначили, що концентрація NBN дикого типу ли до встановлення базової лінії тим же самим складала 1,1мг/мл, а концентрація NK-NBN буфером. NBN елюювали зі смоли, використовую2,6мг/мл (для кожного білка використовували А280 чи приблизно 300мл буфер у, що елюює, який міснм-Е0,1%=0,5). Менше 1% осадженої речовини ідетить 0,5M гуанідин-НСІ і 0,4M імідазол. Після елюнтифікували на основі поглинання при 330нм. ювання NBN діалізували протягом ночі Щоб оцінити чистоту обох препаратів білка, (використовуючи діалізні трубки на 10кД) при кімкожний зразок (0,5мг) піддавали ексклюзійній хронатній температурі проти десяти об'ємів 5мМ HCl. матографії по розміру через колонку 16/30 Діаліз стимулював гідроліз забруднюючих речовин Superdex 75. Колонку зрівноважували 5мМ фосі знижував концентрації гуанідин-НСІ та імідазолу фатом, рН 6,5, що містить 400мМ NaCl, і оброблядо 0,05M і 0,04M, відповідно. ли при швидкості потоку 1,5мл за хвилину. На осВідщеплення His-мітки лізилендопептидазою нові поглинання при 280нм і NBN дикого типу, і або ентерокіназою NK-NBN мігрували у вигляді окремого піку з очікуНа наступний день будь-який осад, який утвованою молекулярною масою (23-24кД) і вони не рювався під час діалізу, видаляли фільтруванням. містили якого-небудь істотного забруднення білка. Концентрацію NaCl у зразку білка робили такою, І NBN дикого типу, і NK-NBN відновлювали у що дорівнює 0,1M додаванням 5M маткового роз2,5M гуанідин-НСІ, 60мМ Трис, рН 8,0 і 16мМ ДТТ. чину до кінцевої концентрації солі, при цьому він Відновлені зразки знесолювали на короткій колонмістив приблизно 150мМ залишкового гуанідинці С4 та аналізували в оперативному режимі за НСІ. Вказану концентрацію підтверджували з видопомогою ESMS, використовуючи потрійний квакористанням вимірника провідності. Крім того, додрупольний прилад. Вихідні дані ESMS піддавали давали 1M HEPES, рН 8, до кінцевої концентрації розгортці за допомогою програми MaxEnt, щоб 25мМ. Щоб відщепити мітку, до NBN дикого типу створити мас-спектр. Даний спосіб дозволяє звесдодавали лізилендопептидазу і до NK-NBN додати численні заряджені сигнали в один пік, який вали ентерокіназу, обидва ферменти приблизно прямо відповідає молекулярній масі у кілодальтопри співвідношенні протеази до NBN 1:300. У винах (кД). Розгорнутий мас-спектр для NBN дикого падку NK-NBN використовували ентерокіназу затипу показав, що переважний вигляд має М.м. мість лізилендо-пептидази через додатковий сайт 12046кД, яка відповідає розрахованій молекуляррозщеплення у мутантному білку біля Lys95. Зразній масі 12046,7кД для форми білка із 113 амінокики перемішували при кімнатній температурі протяслот. Також спостерігали мінорний компонент гом 2 годин і розщеплення контролювали за допо(12063кД), що свідчить про присутність продукту могою електрофорезу у SDS-ПААГ. окислення. У зразку NK-NBN ідентифікували три Видалення His-мітки Ni-NTA-хроматографією піки. Основний компонент показав видиму молекуОброблений протеазою NBN наносили на колярну масу 11345кД відповідно до розрахованої лонку Ni-NTA об'ємом 100мл, зрівноважену 0,5M маси для форми білка із 106 амінокислот. Два інгуанідин-НСІ і 20мМ імідазолом, із швидкістю 50мл ших піки мали масу 11362 і 12061кД, що свідчило за хвилину. Колонку промивали до встановлення про окислення NK-NBN і присутність форми із 113 базової лінії таким же буфером. Будь-який білок, амінокислот, відповідно. який вимивається з колонки, об'єднували з білком, Присутність у препараті NK-NBN форм із 106 і що протікає, який містить NBN без His-мітки. 113 амінокислот можна віднести до розщеплення Хроматографія на діоксиді кремнію CM ентерокіназою. Вказана протеаза від Biozyme є Після Ni-NTA-хроматографії білок відразу ж препаратом природного ферменту, очищеного із піддавали подальшому очищенню пропусканням слизової оболонки кишечнику теляти, і за повідомчерез смолу на основі діоксиду кремнію CM. На леннями містить невелику домішку трипсину колонку з діоксидом кремнію об'ємом 20мл, зрів(0,25нг трипсину на мкг ентерокінази). Таким чиноважену буфером для нанесення (5мМ фосфат, ном, трипсин може діяти на NK-NBN з карбоксикірН 6,5, 150мМ NaCl), завантажували NBN із швиднцевої сторони Arg7, продукуючи переважаючу 39 82983 40 форму із 106 амінокислот. З іншого боку лізиленОднозаміщений продукт очищали від реакційдопептидаза, яка використовується для розщепної суміші, піддаючи матеріал катіонообмінній лення NBN дикого типу, володіє єдиною протеазхроматографії та ексклюзійній хроматографії по ною активністю, діючи з карбоксикінцевої сторони розміру на колонці Superdex 200 (Pharmacia), по залишку лізину, що знаходиться у ділянці Hisсуті як описано для досліджень пегілювання, що мітки, даючи форму зрілого NBN із 113 амінокисобговорюються вище. Фракції з колонки при гельлот. Обидві форми NBN із 106 і 113 амінокислот фільтрації аналізували у SDS-ПААГ, і фракції, що однаково активні у всі х досліджених аналізах і вимістять однозаміщений продукт, аналізували відявляють подібність у тестах на стабільність у гуаносно вмісту білка по оптичній щільності при нідин-НСІ. 280нм. Оскільки маса БСА приблизно у два рази Активність NBN визначали за його здатністю вище маси нейбластину, уявн у концентрацію ділистимулювати фосфорилювання c-RET у клітинах ли на 3, щоб одержати еквівалент NBN. Вказану NB41A3-mRL3 з використанням ELISA KIR A, опифракцію піддавали аналізу відносно функції в саного у прикладі 3. Фосфорилювання RET визнаELISA KIR A. Значення ІС50 і для NBN дикого типу, чали при інкубації (2 години) іммобілізованого реі для БСА-кон'югованого NBN складали 3-6нМ, що цептора з кон'югованим з HRP антитілом проти свідчить про те, що кон'югація з БСА не заважає фосфо тирозину (4G10; 0,2мкг на ямку). Після інкуфункціонуванню. бації ямки шість разів промивали TBST і потім акХоча вказані попередні дослідження проводитивність HRP реєстрували при 450нм за допомоли з БСА, відповідні білки сироваткового альбуміну гою колориметричного аналізу. Вимірювали щурів і людини також містять вільну гр упу SH. Отзначення оптичної щільності для ямки, обробленої же, подібний спосіб можна застосовувати для лізатом або одним буфером, що лізує, коригували створення кон'югата сироватковий альбумін щуравідносно фону і дані наносили на графік у вигляді NBN щура для проведення досліджень ФК та ефефункції концентрації нейбластину, присутнього в ктивності у щурів і кон'югата сироватковий альбуактиваційний суміші. Дані показують, що очищений мін людини-NBN людини для проведення клінічних NBN приводив до появи фосфорильованого RET, випробувань. Подібним чином SMCC можна заміщо свідчить про те, що очищений NBN був активнити будь-яким з ряду агентів, що перехресно ним у даному аналізі. зшивають, які містять групу, що реагує з аміногруПриклад 6. Одержання кон'югата сироваткопою, з одного боку і груп у, що реагує з тіолом, з вий альбумін-нейбластин іншого боку. Прикладами агентів, які перехресно Нейбластин щура дикого типу у концентрації зшивають, що реагують з аміном, які вбудовують 1мг/мл у PBS обробляли 1мМ сульфо-SMCC малеімід, що реагує з тіолом, є AMAS, BMPS, (Pierce) та знесолювали, щоб видалити надлишок MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS або GMBS, приагента, який перехресно зшиває. Оскільки білок кладами агентів, які вбудовують галогенацетатну NBN дикого типу містить тільки єдиний амін на груп у, що реагує з тіолом, є SBAP, SIA, SIAB, і своєму N-кінці і не має вільних сульфгідрильних прикладами агентів, які надають захищений або груп, припускали, що результатом реакції з SMCC незахищений тіол для реакції з сульфгідрильними буде сайт-специфічна модифікація NBN за допогрупами з одержанням зв'язку, що відновлюється, могою SMCC, зв'язаним з N-кінцем. є SPDP, SMPT, SATA або SATP, які всі доступні з 60мкг кон'югата NBN-SMCC інкубували з Pierce. Такі агенти, що перехресно зшивають, є 120мкг бичачого сироваткового альбуміну та анатільки приблизними, і є допустимою велика кільлізували відносно ступеня перехресного зшивання кість альтернативних способів зв'язування N-кінця у SDS-ПААГ. БС А містить одну вільну SH-групу і, NBN з сироватковим альбуміном. Фахівець у даній отже, очікується, що реакція з кон'югатом NBNобласті також може створити кон'югати з сироватSMCC приведе до модифікації у вказаному сайті ковим альбуміном, мішенню в яких не є N-кінець за допомогою малеіміду на SMCC. При вказаних NBN або тіольний компонент сироваткового альумовах спостерігали дві додаткові смуги з більш буміну. Також передбачається, що функціональвисокою молекулярною масою, які відповідають за ними будуть злиття NBN-сироватковий альбумін, масою модифікації NBN одним БСА-компонентом і створені з використанням генетичної інженерії, двома молекулами БСА, оскільки кожна молекула коли NBN зливають з геном сироваткового альбуNBN містить два N-кінці, які можуть піддаватися міну на N-кінці, C-кінці або на обох кінцях. реакції і, отже, смуги узгоджуються з даною точкою Даний спосіб можна поширити за допомогою зору. Утворення вказаних смуг супроводжувало звичайного адаптування на будь-який кон'югат зменшення інтенсивності смуг NBN-SMCC і БСА. NBN-сироватковий альбумін, результатом якого На основі інтенсивності смуги NBN, що залишаможе бути продукт з пролонгованим часом напівється, реакція, можливо, протікала до завершення життя у тварин і, отже, у людини. на 70-80%. 41 82983 42 43 82983 44 45 82983 46 47 82983 48 49 82983 50 51 Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко 82983 Підписне 52 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601