Біологічно активна речовина поліфармакологічної дії рослинного походження

Реферат: Біологічно-активна речовина поліфармакологічної дії, отримана із зелених частин та колосків злакових рослин родини Gramineae, роду Calamagrostis Adans та/або роду Deshampsia Beauv, містить аглікони флавоноїдів трицину, апігеніну, лютеоліну, кварцетину, рамназину та/або флавоноїдні глікозиди трицину, апігеніну, лютеоліну, кварцетину, рамназину і допоміжні речовини. UA 99969 U (12) UA 99969 U UA 99969 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до медицини, а саме до фармакології і стосується складу біологічно-активної речовини БАР поліфармакологічної дії із рослинної сировини, яка містить сполуки агліконів флавоноїдів, флавоноїдні глікозиди та допоміжні речовини. БАР може використовуватись для отримання лікарських засобів для лікування та профілактики вірусних захворювань викликаних вірусами герпесу, грипу, гепатитів В і С, а також вірусіндукованих імунодефіцитів. В останні роки все більше уваги приділяється противірусним засобам з рослинної сировини, в яких ідентифіковано речовини, що діють безпосередньо на вірусний агент. Відомою молекулою, яка чинить антивірусну, в широкому спектрі, дію є така флавоноїдна сполука як трицин (tricin).(5,7,4'-тригідрокси-3',5'-диметоксифлавон). Відомо, що трицин є ефективним проти вірусу грипу, цитомегаловірусу та вірусу простого герпесу (Пат. Японії Р 2010-254649 А, Публ. 11.11.2010 р.; Пат. Японії Р 2006-265248 А, Публ. 05.10.2006 p.). Встановлено, що концентрація трицину отриманого із Sasa albo-marginata, яка інгібує на 50 % розвиток цитомегаловірусної інфекції на клітинному рівні (антивірусна дія) становить більше 0,42 мкМ (або 0,139 мкг/мл) (Antiviral Research 91 (2011), 296-303), а антивірусна дія синтетичного трицину на вірус грипу групи А (H1N1) наступає при концентраціях рівних і більших 3,3 мкМ (або 1,09 мкг/мл) (Противовирусная химия и химиотерапия 2011; 22: 111; Joi 103851/МР 1782). Хімічно-чисті аглікони трицину, або комплексні сполуки трицину в поєднанні зі сполуками апігеніну та/або лютеоліну та/або кверцетину отримують з рослинної сировини: листя бамбуку (Bamboo leaves), Sasa, листя рису. Хімічно-чисті флавоноїдні сполуки швидко окислюються і є гідрофобними, тому їх використання обмежено сферою наукових досліджень на клітинному рівні. (Microbes and Infection. 2012 p. V.14. Is. 12. p. 1086-1092). Комплексні сполуки: глікозиди агліконів трицину, апігеніну, лютеоліну, кверцетину та їх комплекси є гідрофільними і, на рівні цілісного організму, комплексам різномолекулярних флавоноїдних сполук властива синергічна дія та підвищення біодоступності в порівнянні із дією окремих чистих речовин. (In vivo, 2011, 25(5), 757-762, Journal of Food. Vol. 13, № 1, p. 140-150). Найбільш близькою за хімічним складом та походженням до запропонованої корисної моделі є біологічно активна речовина БАР із рослинної сировини для лікування та профілактики патологічних станів, яка отримана способом, наведено в патенті UA № 54362 7МПК А61К 35/78 від 17.02.2003 р. Бюл. № 2. Як рослинну сировину використовують суміш рослин роду Calamagrostis Adans та роду Deschampsia Beanu, які зібрані в період після викидання стебел і до закінчення цвітіння колосків. Така БАР визначається досить низькою токсичністю, забезпечує широкий спектр фармакологічного впливу на організм людини, але має невиявлений конкретний склад діючих речовин та невизначену активність до конкретних вірусів, наявна відсутність рекомендованих дозувань при створенні лікарських форм. Була поставлена задача удосконалення БАР із визначенням конкретних складів діючих речовин БАР, їх фізико-хімічних, біологічних властивостей, винайдення її оптимального складу для антивірусної дії до конкретних вірусів, дозувань при створенні лікарських форм при збереженні низької токсичності. Поставлена задача вирішується тим, що біологічно-активна речовина поліфармакологічної дії отримана із зелених частин та колосків злакових рослин родини Gramineae, роду Calamagrostis Adans та/або роду Deshampsia Beauv, містить флавоноїди, а саме, аглікони флавоноїдів трицину, апігеніну, лютеоліну, кварцетину, рамназину та/або флавоноїдні глікозиди трицину, апігеніну, лютеоліну, кварцетину, рамназину, допоміжні речовини і має такий склад, мас %: аглікон флавоноїду трицину від 0,016 до та/або його флавоноїдні 2,062 глікозиди аглікон флавоноїду апігеніну від 0,010 до та/або його флавоноїдні 1,393 глікозиди аглікон флавоноїду лютеолін та/або його від 0,01 до 4,979 флавоноїдні глікозиди аглікон флавоноїду від 0,001 до кверцетин та/або його 0,771 флавоноїдні глікозиди аглікон флавоноїду від 0,104 до 1 UA 99969 U рамназин та/або його флавоноїдні глікозиди 0,203 від 99,868 до 90,592. Краще, коли біологічно активна речовина як допоміжні речовини містить вуглеводні сполуки, амінокислоти, хлорофіли. Краще, коли біологічно активна речовина отримана із Війника наземного (Calamagrostis epigeios L. роду Calamagrostis Adans) та/або Щучки дернистої (Deshampsia caespitosa L. роду Deshampsia Beanu). Краще, коли у біологічно активній речовині вміст О-глікозидних форм флавоноїдів становить (53,545÷86,422)%, а С-глікозидних форм флавоноїдів становить (43,293÷4,910)% від загальної кількості флавоноїдних сполук, решта аглікони флавоноїдів. Для встановлення причинно-наслідкового зв'язку між конкретними діючими речовинами і властивостями БАР, її оптимального складу були проведені дослідження за допомогою стандартних методик (В.А. Миронов, С.А. Янковский. Спектроскопия в органической химии. Москва "Химия" 1985 г. - 230 с. К.С. Сенчев "Практическое руководство по жидкостной хроматографии. Москва. "Техносфера", 2010 г. - 272 с.) Коли аглікони флавоноїдів знаходяться в формі О- та/або С-глікозидів то при цьому збільшується розчинність БАР у водних середовищах, а також забезпечується синергізм дії та біодоступність суміші флавоноїдних глікозидів на рівні цілісного організму. Було виготовлено п'ять серій модельних екстрактів з трав різних сезонів збору. Серія модельних екстрактів складалася з сумарних екстрактів: суміші трав Війника наземного та Щучки дернистої, взятих у співвідношенні 1:1, та з кожної трави окремо при ваговому співвідношенні сировина: спирт етиловий в діапазоні від 1:10 до 3:1. П'ять серій екстрактів задіяні з метою отримання меж діапазону коливань вмісту досліджуваних речовин та визначення їх середніх значень. Модельні екстракти отримували відомими способами екстрагування, а саме: мацерації, перколяції, ультразвукової екстракції та поєднанням вказаних методів, (Иновационные технологии и оборудование фармацевтического производства (под редакцией Н.В. Меншутиной) т. 2 (стр. 33-88) Москва: "Бином", 2013 г. - 480 с.) причому в процесі екстрагування проводили періодичний контроль показника сухого залишку. В екстрактах з ваговим співвідношенням сировини до спирту 1:10 процес екстракції завершували при досягненні показником сухого залишку значення 0,5 % (середнє значення густини 0,8010 г/мл), при ваговому співвідношенні сировини до спирту 1:2 екстракцію завершували при досягненні показником сухого залишку значення 1,2 % (середнє значення густини 0,8100 г/мл), а при ваговому співвідношенні сировини до спирту 3:1 екстракцію завершували при досягненні показником сухого залишку значення 2,5 % (середнє значення густини 0,8250 г/мл). Спочатку визначали склад агліконів флавоноїдів, флавоноїдних глікозидів у сумарному екстракті, який виробляли при співвідношенні сировини до спирту 1:2. Визначення складу БАР проводили методами інструментальної аналітичної фізичної хімії, а саме: високоефективної швидкісної рідинної хроматографії із діодноматричним детектуванням (ВЕРХ, UPLC-PDA); газової хроматомас - спектрометрії із іонізацією електронним ударом (ГХМС); рідинної високоефективної хроматографії із мас-детектором при іонізації електронним спреєм (UPLC-MC/MC); методом ядерного магнітного резонансу (ЯМР). Після ідентифікації та визначення речовин у сумарному екстракті визначали якісний та кількісний вміст БАР в модельних екстрактах, отриманих з кожної трави окремо. Для визначення специфічної дії проводили порівняльне вивчення БАР сумарного екстракту та кожної з трав окремо. БАР міститься в рослинах в слідових кількостях на фоні макрокомпонентів: хлорофілів, рослинної клітковини, тому першим етапом, при виділенні БАР є видалення макрокомпонентів. Хлорофільну (жиророзчинну) фракцію, яка є гідрофобною, видаляють органічним розчинником, наприклад гексаном або хлороформом. Вуглеводні в рослинній сировині представлені моно- та поліцукрами як у вільному стані так і у поєднанні з агліконами, які мають гідроксильну групу. Вільні вуглеводні, яким властиві гідрофільні властивості, видаляють екстракційним методом, тобто аглікони екстрагують, а вуглеводні залишаються у водній фазі. Оскільки, аглікони флавоноїдів у рослинах присутні як у вільному стані, так і у вигляді глікозидних форм, тому, після видалення хлорофільної фракції, для проведення якісного та кількісного визначення необхідно всі аглікони (вільні та глікозидні) перевести в одну аналітичну форму - аглікони без вуглеводневих фрагментів. Ця задача вирішується шляхом кислотного гідролізу: в результаті дії водневих іонів на глікозидні форми флавоноїдів відбувається відщеплення вуглеводневих фрагментів. допоміжні речовини 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2 UA 99969 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Хімічна структура флавонолових та флавонових глікозидних сполук встановлюється шляхом вивчення продуктів гідролізу спектрофотометричними, хроматографічними, (ВЕРХ, ГХ з різними детекторами) методами. Суть корисної моделі ілюструють фігури, на яких зображено: Фіг. 1. ВЕРХ, UPLC-PDA хроматограма сумарного екстракту та спектри поглинання виділених сполук. Фіг. 2. ВЕРХ, UPLC-PDA хроматограма сумарного екстракту після гідролізу та спектри поглинання виділених сполук Фіг. 3. ВЕРХ, UPLC-PDA хроматограма препаративно виділених сполук домінуючого аглікону трицину та його спектри поглинання. Фіг. 4. ГХ-МС хроматограма TMS дериватів сполук домінуючого аглікону трицину. Фіг. 5. ЯМР спектри виділеного домінуючого аглікону трицину на вуглецевих та протоних ядрах. Фіг. 6. Домінуючі аглікони БАР та їх назви. Фіг. 7. Схема утворення О-глікозидів та С-глікозидів. Фіг. 8. Калібрувальний графік залежності площі піка маси 271 від концентрації. Фіг. 9. Калібрувальний графік залежності площі піка маси 331 від концентрації. Фіг. 10. Калібрувальний графік залежності площі піка маси 415÷416 від концентрації. Фіг. 11. Калібрувальний графік залежності площі піка маси 465 від концентрації. Фіг. 12. Вплив концентрації водневих іонів (М НСl) на стійкість гіперозида і вітексина при нагріванні розчинів впродовж 120 хв на киплячій водяній бані. Фіг. 13. UPLC-MC/MC. Де: 1 - PDA хроматограма сумарного екстракту; 2 - сумарна мас-хроматограма при скануванні по масах окремих іонів; 3 - сканування за масою 331, визначення площ хроматографічних піків; 4 - хроматограма сканування за масою 331. Фіг. 14. UPLC-MC/MC. Де: 1 - PDA хроматограма сумарного екстракту після гідролізу; 2 - сумарна мас-хроматограма при скануванні по масах окремих іонів; 3 - сканування за масою 331, визначення площ хроматографічних піків; 4 - хроматограма сканування за масою 331. Фіг. 15. ВЕРХ, UPLC-PDA хроматографа та спектри поглинання хроматографічних піків етанольного екстракту Війника наземного. Фіг. 16. ВЕРХ, UPLC-PDA хроматографа та спектри поглинання хроматографічних піків етанольного екстракту Щучки дернистої. Фіг. 17. Вилив БАР сумарного екстракту на ріст клітин Jurkat. Фіг. 18. Вміст гіподиплоїдніх клітин (у відсотках) у культурі Jurkat після інкубації з БАР екстракту. Фіг. 19. Вміст гіподиплоїдніх клітин у культурі Jurkat після інкубації з БАР екстракту протягом 2 діб та подальшої індукції апоптозу вепезідом. Фіг. 20. Вплив БАР екстракту на швидкість генерування супероксидрадикалів клітинами МТ4. Фіг. 21. Вплив БАР екстракту на швидкість генерування супероксидрадикалів клітинами Namalwa. Фіг. 22. Вплив БАР екстракту на швидкість генерування супероксидрадикалів гомогенатом клітин МТ-4. Фіг. 23. Хеміолюмінісценсія клітин МТ-4 індукована пероксидом водню, де а – клітини контрольної культури; б – клітини після інкубації з БАР екстракту протягом 4 год. Із-за великої кількості графічного матеріалу для кращого розуміння змісту назви фігур проставлені також і поруч з ними. Типова хроматограма сполук сумарного (вагове співвідношення сировина: спирт етиловий дорівнює 1: 2) екстракту розведеного етанолом 96 % у співвідношенні 1:1, яка отримана за допомогою ВЕРХ з діодно-матричним детектором надана на Фіг. 1. Аналіз виконаний за допомогою хроматографа UPLC Waters колонка ACQUITY ВЕНС18, 1,7 мкм, 2,1×150 мм при наступних умовах: об'єм введеної проби 1 мкл, температура термостату 30 °C, швидкість рухомої фази 0,3 мкл/хв., детектування при 350 нм. Рухома фаза, це (вода: ацетонітрил) = (60:40) в градієнтному режимі, вода при рН 2,2 (ортофосфорна кислота). На Фіг. 1. надані також спектри поглинання хроматографічно виділених сполук сумарного екстракту (Spectrum Index Fraction Plot). 3 UA 99969 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спектри поглинання хроматографічно виділених сполук Фіг. 1. з часом утримання в інтервалі від 5,0 хвилин (хв.) до 10 хв вказують на наявність у розчині набору сполук одного класу флавоноїдів, які мають однаковий "скелет" молекули. Різниця в спектрах обумовлена природою замісників в складі молекули. Для ідентифікації молекул використовують кислотний гідроліз, який у випадку О-глікозидів дозволяє виділити (вивільнити) аглікони. Кислотний гідроліз проводився наступним чином: до екстракту додають соляну кислоту до одержання розчину з рН - біля 2 (по 2 Молярний хлористо-водневій кислоті), колбу з розчином, під'єднану до зворотного холодильника, витримують протягом 2-х годин на водній бані при кипінні, охолоджують, виділяють прогідролізовані аглікони і глікозидні форми етилацетатом, видаляють органічний розчинник під вакуумом, а залишок розчиняють в етанолі (9:1) і аналізують. На хроматограмі (Фіг. 1.) (ВЕРХ з РДА детектором), отриманій до гідролізу, спостерігаються три роздільні групи сполук з часом утримання: 5-7 хв; (сполуки групи 1), 8-9,0 хв (сполуки групи 2) і сполуки після 9-ої хв. (сполуки групи 3). Хроматограма, отримана після гідролізу (Фіг. 2), показує, що сполуки групи 1 залишились, сполуки групи 2 виросли та збільшилась кількість сполук групи 3. Сполука з групи 2, яка є домінуючою та має типовий спектр флавону, була виділена за допомогою препаративного РХ "Waters" XBridge™ prep C18 10 m OBD™ 19×250 mm в режимі обернено фазної хроматографії (Рухома фаза: метанол - вода (1:9), швидкість потоку 15 мл/хв.) при багаторазовому введені і очищені хроматографічних фракцій. В результаті виділено 11 мг аглікону (ВЕРХ хроматограма на Фіг. 3). Для визначення брутто - формули і структури молекули аглікону було використано метод ГХ з мас-спектрометричним детектором. Оскільки флавоноїдні сполуки в своїй структурі містять гідроксильні групи, які протидіють їх летючості, тому для введення зразка в ГХ необхідно проводити їх дериватизацію. Як реагент використано N,N-триметелсиліл-трифторацетамід (TMS дериватизація). Хроматограма деривату аглікону (Фіг. 4.) вказує на те, що маса аглікону за виключенням маси фрагментів становить 330 D. За бібліотекою мас-спектрів це є трицин або рамназин. Для уточнення структури молекули використано метод ЯМР на протонних і вуглецевих ядрах. Отримані 13 наступні характеристики спектрів ЯМР (Фіг. 5): С (ДМСО-d6, 100 МГц):=56.33 (СН3 × 2), 94.13 (С-8), 98.78 (С-6), 103.49 (С-3), 103.59 (С-10), 104.28 (С-2' + С-6'), 120.27 (С-1'), 139.75 (С-4'), 148.06 (С-3' + С-5'), 157.20 (С-5), 161.25 (С-7), 163.48 (С-9), 164.14 (С-2), 181.60 (С-4) м.д (магнітної девіації). 1 Н (ДМСO-d6 400 МГц):=3.88 (6Н, с, СН3 × 2), 6.20 (1Н, д, J=2.0 Гц, Н-6), 6.56 (1Н, д, J=2.0 Гц, Н-8), 7.00 (1Н, с, Н-3), 7.33 (2Н, с, Н-2' + Н-6'), 12.98 (1Н, с,ОН-5) м.д. Сигнал при 12.98 м.д. обумовлений наявністю водневого зв'язку між атомом гідрогену гідроксильної групи і атомом кисню карбонільної групи. Всі інші гідроксильні групи (ОН-7 и ОН-4') в спектрі ЯМР не виявляються через їх обмін з водою. Аналіз отриманих даних спектрів ЯМР остаточно підтверджує автентичність трицину як основної складової сполуки 2. (Tricin/Трицин або 5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxy-3,5dimethoxyphenyl)-4H-сhromen-4-one або 5,7-Дигідрокси-2-(4-гідрокси-3,5-диметоксифеніл)-4Hхромен-4-он). Виявлена структура домінуючого аглікону (молекули трицину) підтверджена методами ЯМР з використанням стандарту трицину (Hangzhou Dayangchem Co., LTD. CAS Na: 520-32-1 Purity: 98,5 %), а також порівнянням виділеного трицину з рицином, виділеним із листя бамбуку за методикою китайських дослідників (J. Agric. Chem. 2007,55,10086-10092). За вищевказаною методикою у складі сумарного екстракту визначена наявність та проведена ідентифікація (окрім трицину) наступних агліконів флавоноїдів: флавони - апігенін, лютеолін; флавоноли - кверцетин, рамназин (Фіг. 6). Аглікони флавоноїдів, за відомими літературними даними, наприклад (Патент США № US 2008/0171708 від 17.06.2006 р.), та нашими дослідженнями, в рослинній сировині та екстрактах, отриманих з неї, міститься в переважній більшості у вигляді О- та/або С-глікозидів, (Фіг. 7)., а також окремі аглікони можуть бути у вигляді О- і С-глікозидів одночасно. Для роздільного визначення якісного та кількісного складу О- і С-глікозидів спочатку визначають та ідентифікують наявні в екстракті вуглеводні за допомогою ГХ з мас-детектором (використовуючи TMS дериватизацію а також за допомогою ВЕРХ з мас - спектрофотометричним детектором при іонізації спектроспреєм (цей метод дозволяє визначити найбільш інтенсивний фрагмент, який відповідає молекулярному іону (m/D). Сполуки вуглеводнів в модельних екстрактах, які були ідентифіковані (назва; молекулярна вага) наведені в таблиці 1. 4 UA 99969 U Таблиця 1 Ідентифіковані сполуки вуглеводнів в модельних екстрактах Війника наземного та Щучки дернистої. № п/п 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 5 10 15 Назва Мол. вага. 2 Глюкоза (маноза) 1,6-ангідро---глюкоза Арабіноза Ксилоза Рибоза Рамноза Глюкофуноза Глюкуронова кислота D- цукрова кислота Сорбоза 3-Оксипропіонова кислота 4-Оксипентанова кислота 1-Пропен-1,2,3-трикарбонова кислота 3-Гидроксибутанова кислота 2-Бутанен Сукцинова кислота Фумарова кислота Азелаїнова кислота 3-Метокси-4-гідроксибензойна кислота 3,4-Диметоксибензойна кислота Бензойна кислота 4- Пдроксибензойна кислота 3,4-Дигідроксибензойна кислота 2-Карбокси-4-гідроксибензойна кислота Бузкова кислота Корична кислота Кавова кислота Ферулова кислота (4-гідроксил-3-метоксил-корична кислота) Синалова Диметоксилкорична Альфа конідендрин Аконітинова кислота 3-(4-гидрокси-3-метоксифеніл) метиловий ефір 2-пропанової кислоти 3 180 162 150 150 150 164 180 196 210 180 90 118 174 104 72 118 116 188 168 182 122 138 154 182 198 118 180 194 224 208 356 174 208 Після визначення складу вуглеводнів необхідно визначити умови, за яких можна розрізнити О- і С-глікозиди, брутто-формули яких однакові, внаслідок чого їхні оптичні та хроматографічні характеристики мало відрізняються. Найбільш класичним є визначення динаміки вивільнення агліконів із глікозидних форм при їх деструкції під дією різних концентрацій водневих іонів. Кислотний гідроліз проводять описаним вище методом при різних концентраціях соляної кислоти. Осад після видалення етилацетату розчиняють в етиловому спирті (9:1) та аналізують. Гідролізати, отримані при різних концентраціях водневих іонів, аналізують методом мас спектрометрії UPLS - МС/МС. Кількісне визначення агліконів та/або глікозидів за масами окремих іонів проводять з використанням калібрувальних графіків за стандартами: трицину, апігеніну, лютеоліну, кверцетину, рамназину, вітексину, гіперозиду. На Фіг. 8, 9, 10, 11 наведені приклади калібрувальних агліконів Трицину, Апігеніну а також Гіперозиду (О-глікозиду) та 1,6Ангідро--D- глікозиду вітексину (С-глікозид). Вміст агліконів в екстракті та динаміка вивільнення агліконів з глікозидних форм в залежності від концентрації водневих іонів наведена в таблиці 2. 5 UA 99969 U Таблиця 2 Вплив концентрації водневих іонів на вихід агліконів Аглікон Екстракт із суміші трав (1:1) Лютеолін 1,5 Трицин 37,26 Кверцетин 0,60 Рамназин 0,072 Апігенін 0,835 1 - без бутилгідроксіанізолу (ВНА) 2 - в присутності ВНА 5 10 15 20 Вміст агліконів мг/л 0,08 Моль 1,2 Моль HCl HCl 1 2 1 2 2,0 2,0 2,1 1,9 50,3 52,3 52,8 54,9 3,2 2,7 1,4 1,7 0,45 0,32 0,50 0,53 0,88 0,97 1,40 1,40 1,6 Моль HCl 1 2 2,0 2,0 55,2 58,8 1,2 1,1 0,66 0,83 1,16 1,25 Найбільш оптимальними умовами для кількісного визначення О- та С-глікозидів є концентрація водневих іонів 0,08 Моль за хлористоводневою кислотою (НСl). За таких умов повністю руйнуються О-глікозиди а С-глікозиди залишаються (на 83 %). (Динаміка руйнування О- і С-глікозидів на прикладі вітексину та гіперозиду показана на Фіг. 12). Отже для отримання інформації стосовно кількісного вмісту агліконів, О- і С-глікозидних форм агліконів аналізують результати досліджень екстракту та продукту після гідролізу в середовищі 0,08 Моль HCl методом ВЕРХ, UPLC-MC/MC На Фіг. 13 наведений приклад PDA хроматограми (1) та сумарної мас-хроматограми при скануванні по окремих іонах (час утримання на приладі UPLC МС/МС трохи менший порівняно з часом утримання на приладі Waters UPLS-PDA при одній і тій самій колонці) сумарного екстракту до гідролізу. Також на Фіг. 13. наведений приклад сканування за масою 331 (трицин) з визначенням площ хроматографічних піків (3) та PDA хроматограми сканування за масою 331 (4). На Фіг. 14 наведено приклад сканування сумарного екстракту та приклад сканування за масою 331 сумарного екстракту після гідролізу. Для обчислення кількості О-глікозидів порівнювали результати аналізу сумарного екстракту та результати отримані після гідролізу: відсутність або зменшення піку після гідролізу вказує на присутність О-глікозиду, який може бути присутній як самостійно (окремий хроматографічний пік), так і в складі комплексу сполук (зменшення хроматографічного піку, який містить декілька сполук після гідролізу). Для розрахунків використовували теоретичне значення маси іонів глікозидних сполук з урахуванням мас екстрагованих агліконів, які наведені в таблиці 3, та ідентифікованих вуглеводів таблиця 1. Таблиця 3 Теоретично розраховані глікозиди досліджуваних агліконів Аглікон 1,6Час Мол. Ксилоза М Глюкоза Глюкуронова утримання маса. (рибоза, Ангідро-Рамноза + 1 (сорбоза) кислота (хв.) (М) арабіноза) D-глюкоза 7,56 270 271 433 403 415 447 417 6,9 286 287 449 419 431 463 433 7,15 302 303 465 435 447 479 449 Апігенін Лютеолін Кверцетин Трицин 7,82 (9,02) (Рамназин) 25 30 330 331 493 463 475 507 477 При цьому враховувались ті обставини, що у випадку О-глікозиду (наприклад, гіперозид) в результаті дії ектроспрею при мас-спектрометрії відбувається відрив молекули аглікону від вуглеводу і співвідношення між агліконом і вихідним глікозидом складає 100:1. У випадку Сглікозиду (наприклад вітексин) відбувається відрив від молекули вихідного глікозиду фрагмента ОН+1, тобто маси 18 і співвідношення площі піків вихідного глікозиду і продукту його деструкції (теж глікозид) дорівнює 3,23. За результатами досліджень виявлені можливі сполуки, які з'являються в досліджуваних мас-спектрах і утворюються в результаті деструкції С-глікозидів (таблиця 4). 6 UA 99969 U Таблиця 4 Продукти перетворення С-глікозидів флавоноїдів при проведенні мас-спектрометричного аналізу 15 Аглікон Вихідний глікозид 8-С-глюкозид трицину СТрицин глікозид з рамнозою Рамназин 8-С-ксилозид рамназину 8-С-глікозид апігеніну 8Апігенін С-ксилозид апігеніну Сглікозид з рамнозою 8-С-глікозид лютеоліну Лютеолін С-глікозид з ксилозою 8С-глікозид лютеоліну 8-С-глікозид кверцетину Кверцетин С-глікозид з ксилозою Сглікозид з рамнозою М+1 493 477 463 433 403 417 449 419 433 465 435 449 Продукт перетворення Ангідро С-глюкозид Ангідро С-глікозид Ангідро С-глікозид 8-С-{1,6-ангідро)--Д-глікозид апігеніну Ангідро С-глікозид Ангідро С-глікозид 8-С-(1,6-ангідро)--Д-глікозид лютеоліну Ангідро С-глікозид Ангідро С-глікозид 8-С-глюкоронід апігенину Ангідро С-глікозид Ангідро С-глікозид М+1 475 459 448 415 385 399 431 401 415 447 417 431 Таблиця 5 Вміст О - глюкозидів (мг/л) в перерахунку на гіперозид в сумарному екстракті із суміші трав (1:1) при ваговому співвідношенні сировини: спирт етиловий в діапазоні від 1:10 до 3:1 m/z 1 449 463 403 493 Час утримання, Вагове співвідношення сировина: спирт (сухий хв залишок %, густина г/мл) 1:10 1:2 3:1 2 (0,5;0,8010) (1,2;0,8100) (2,5;0,8250) 4,9 11,23 84,20 140,50 7,86 0,58 4,35 10,80 5,02 2,98 14,90 37,25 5,86 1,52 7,80 19,50 9,0 0,91 6,80 17,60 5,44 1,28 9,60 24,20 5,74 5,19 38,90 97,25 431 4,9 17,70 125,00 210,20 445 5,50 6,18 46,30 115,75 5,03 18,00 135,00 247,50 5,5 7,9 8,13 4,94 5,41 8,92 3,76 3,44 4,35 1,66 3,93 0,07 28,20 25,80 32,60 12,40 15,70 0,30 70,50 46,40 65,20 31,00 37,70 0,75 582 4,91 15,24 114,30 244,30 639 5,74 7,24 54,30 119,45 5,92 6,26 6,45 7,03 Всього, Оглікозидів (мг/л) 1,23 8,16 5,27 2,85 4,90 40,80 26,10 11,40 12,25 102,00 65,25 28,50 122,75 842,95 1726,25 419 479 465 689 7 Сполуки 4 7-О-глюкозид лютеоліну 3-О-рамнозид кверцетину 7-О-ксилозид рамназину 7-О-ксилозид апігеніну 7-О-глюкозид трицину 7-О-(1,6-ангідро)--Дглюкозид лютеоліну 7-О-(1,5-ангідро)--Дксилозид трицину 7-О-ангідроглюкоронід лютеоліну 7-О-ксилозид лютеоліну 3-О-глюкоронід кверцетину 3-О-глюкозид кверцетину 3-О-ксилозид кверцетину 7-О-рамнозид кверцетину 3-О-глюкозид, 7-Орамнозид лютеоліну 3-О-глюкозид, 7-Орамнозид трицину 3-О-(4-гідроксибензоїл) ксилозид кверцетину UA 99969 U Таблиця 6 Вміст С - глікозидів (мг/л) в перерахунку на гіперозид в сумарному екстракті із суміші трав (1:1) при ваговому співвідношенні сировини: спирт етиловий в діапазоні від 1:10 до 3:1 m/z Час утримання, хв. 1 2 465 403 463 493 507 415 4,94 5,29 5,51 5,51 9,12 9,12 9,0 9,0 5,02 5,35 5,47 5,47 5,57 9,15 5,75 5,97 5,97 9,16 9,11 8,95 9,08 9,16 5,47 5,65 7,89 4,86 4,86 5,33 433 5,33 9,06 9,06 7,22 7,89 479 8,09 9,0 9,14 4,9 5,02 5,02 449 7,86 8,01 8,06 9,12 4,9 431 5,33 9,06 5,62 671 9,08 Всього, С-глікозидів (мг/л) 447 Вагове співвідношення сировина: спирт (сухий залишок %, густина г/мл) 1:10 1:2 3:1 (0,5;0,8010) (1,2;0,8100) (2,5;0,8250) 0,36 2,02 4,95 0,28 2,23 5,58 0,12 1,00 2,48 0,11 1,06 2,43 1,24 8,60 19,78 1,89 11,30 27,69 10,26 66,75 166,87 0,32 1,83 4,09 1,15 6,90 17,25 1,20 9,00 24,30 1,80 11,70 28,08 0,02 0,09 0,22 0,98 6,86 16,81 1,65 10,00 23,70 1,08 7,00 17,50 2,12 15,90 36,57 1,54 10,00 23,17 0,68 4,15 10,17 4,94 34,60 89,96 0,11 0,65 1,69 1,44 10,0 24,51 1,78 10,50 25,73 0,38 2,02 0,64 0,31 0,24 1,98 3,04 3,85 1,56 0,12 0,97 0,85 0,72 0,73 3,12 4,95 3,12 1,54 не визнач. 2,46 2,60 8,04 4,27 4,5 2,30 13,10 3,20 1,85 1,08 12,70 18,40 27,20 8,40 0,70 6,80 6,15 4,40 4,60 20,30 37,10 20,30 10,70 0,041 16,05 14,50 56,30 25,60 27,80 1,60 4,10 5,64 31,40 7,36 4,45 2,82 31,12 44,20 62,56 17,82 1,75 15,23 15,98 9,94 8,75 56,35 89,04 49,74 23,84 0,09 40,43 35,67 129,50 62,72 63,94 4,00 9,27 577,36 1395,71 0,24 0,63 87,6 5 8 Сполуки 4 8-С-глюкозид кверцетину 8-С-гликозид апігеніну 8-С-ксилозид трицину 8-С-глюкуронід лютеоліну 8-С-глюкозид трицину 8-С-глюкозид рамназину 8-С-глюкуронід трицину 8-С-(1,6 ангідро)--Дглюкозид апігеніну 8-С-глюкуронід апігеніну 8-С-глюкозид апігеніну 8-С-глюкуронід кверцетину 8-С-глюкозид лютеоліну 7-О(1,6-ангідро)--Д глюкозид лютеоліну 8-С-(синапоїл)-глюкозид кверцетину UA 99969 U 5 10 15 20 Таким чином, на прикладі аналізу сумарного екстракту виконано якісне та кількісне визначення вмісту вільних агліконів (таблиця 2), а також глікозидних форм агліконів: Оглікозидів (таблиця 5); С-глікозидів (таблиця 6). Сполуки групи 1 (Фіг. 1) на хроматограмі ВЕРХ, з найменшим часом утримання, як найбільш гідрофільні, є сумішшю О- і С-глікозидів, визначених вище агліконів, з яких домінуючими є трицин, лютеолін, апігенін. Сполуки групи 2 (Фіг. 1) є сумішшю вільних агліконів. Сполуки групи 3 це ацильовані форми О-, С-, та біглікозидів. Викладені вище результати визначення якісного та кількісного складу агліконів та їх глікозидів в екстракті із суміші трав, для якого вивчена біологічна активність, дають можливість порівняти склад і біологічну активність екстрактів із кожної трави окремо. Модельні екстракти із кожної трави окремо, з метою визначення відмінностей у складі та для проведення порівняльних досліджень специфічної біологічної дії, виготовляли із каліброваним вмістом суми флавоноїдів та їх глікозидів, рівним 0,22 мг/мл, при ваговому співвідношенні сировини до спирту 1:4,5 та при отриманні показником сухого залишку значення, що дорівнює 0,7 % (середнє значення густини 0,8080 г/мл). Типові ВЕРХ хроматограми (детектування при 350 нм) за умов хроматографування, наведених вище за текстом, та спектри поглинання сполук етанольних екстрактів із трав Війника наземного та Щучки дернистої надані на Фіг. 15 та Фіг. 16. Із наведених хроматограм видно, що якісний склад екстрактів подібний. Відмінності у складі етанольних екстрактів полягають у різному кількісному вмісті окремих молекул флавоноїдів та їх О- і С-глікозидів. Таблиця 7 Порівняльний склад та межі коливань вмісту (мг/л) вільних агліконів, О- і С-глікозидів у модельних екстрактах із суміші трав (1:1) та із кожної трави окремо при ваговому співвідношенні сировини: спирт етиловий в діапазоні від 1:10 до 3:1. Екстракт із суміші трав Екстракт Війника Екстракт (1:1) наземного Щучки дернистої № Вагове співвідношення сировина:спирт етиловий (сухий залишок %;густина (г/мл)) п/ Сполуки 1:10 1:2 3:1 1:10 1:2 3:1 1:10 1:2 3:1 п 0,5;0,8 1,2;0,8 2,5;0,8 0,5;0,8 1,2;0,8 2,5;0,8 0,5;0,8 1,2;0,8 2,5;0,8 010 100 250 010 100 250 010 100 250 1 Трицин 4,000 37,260 95,000 0,900 9,450 24,00 0,600 6,800 14,000 Лютеолі 2 0,100 1,500 3,600 0,004 0,040 0,010 0,100 1,250 3,200 н 3 Апігенін 0,080 0,840 1,800 0,020 0,200 0,600 0,010 0,150 0,500 Кверцет 4 0,060 0,600 1,400 0,030 0,300 0,800 0,010 0,100 0,500 ин Рамназ 5 0,010 0,070 0,140 0,010 0,020 0,080 0,010 0,020 0,080 ин Всього, 6 вільних 4,250 40,270 101,94 0 0,964 10,010 25,490 0,730 8,320 18,280 агліконів Oглюкози 7 19,92 149,10 356,65 1,00 10,0 21,00 1,00 10,5 21,00 ди трицину Сглюкози 8 10,44 71,15 173,07 0,20 6,2 11,00 1,00 10,0 22,00 ди трицину Oглюкози 9 ди 0,91 6,80 17,60 0,60 8,9 22,00 1,00 11,35 24,00 апігені ну С10 26,38 167,30 402,63 0,05 0,53 1,20 0,04 3,70 9,00 глюкози 9 UA 99969 U 11 12 13 14 15 16 17 18 5 10 15 20 ди апігеніну О глюкоз иди лютеолі ну Сглюкози ди лютеолі ну Оглюкози ди кверцет ину Сглюкози ди кверцет ину Оглюкози ди рамнази ну Сглюкози ди рамнази ну Всього, Оглюкози дів Всього, Сглюкози дів 65,93 486,70 913,00 0,01 2,36 6,80 4,00 41,6 120,0 36,95 245,60 592,05 0,02 0,22 0,06 0,50 6,95 21,00 31,49 177,65 399,85 0,01 0,16 0,04 0,02 0,18 0,40 8,26 54,56 127,83 0,02 0,22 0,70 0,02 0,18 0,70 4,50 22,70 56,75 6,50 67,5 180,00 10,00 108,0 260,00 5,62 38,75 100,13 0,01 0,08 0,12 0,01 0,12 0,36 122,75 842,95 1726,25 8,31 70,02 227,84 16,02 171,63 454,40 87,65 577,36 1395,7 1 0,60 7,25 13,08 2,57 20,95 53,06 Користуючись методиками, які були задіяні для визначення складу сумарного екстракту з використанням ВЕРХ-МС/МС, визначають якісний та кількісний склад екстрактів із кожної трави окремо. Як видно із таблиці 7 вміст вільних агліконів в екстрактах Війника наземного складає від 9,5 % до 11,5 %, а в екстрактах Щучки дернистої складає від 3,8 % до 4,2 % від сумарної кількості флавоноїдних сполук і практично не залежить від співвідношення сировина:екстрагент у вказаному діапазоні. Наведені дані свідчать про сталість складу екстрагованих речовин в модельних екстрактах. Найбільший відсоток (концентрацію) суміші флавоноїдних сполук (агліконів та їх О- та/або С-глікозидів) містить екстрагент із суміші трав (1:1) при ваговому співвідношенні сировина:екстракт що дорівнює 3:1, який дорівнює 9,408 % (3223,9 мг/л) від величини сухого залишку: 30300 мг/л. Найменшу кількість флавоноїдних сполук (0,132 % або 9,870 мг/л при сухому залишку, рівному 6240 мг/л) містить екстракт Війника наземного при співвідношенні сировина: екстрагент, що дорівнює 1:10. При співвідношенні сировини до екстрагенту, яке менше за 1:10, флавноїдні сполуки лютеоліну, апігеніну та кверцетину не екстрагуються і речовина втрачає свою антивірусну активність. При збільшені співвідношення сировина:екстрагент за величину 3:1 кількість екстрагованих О- та/або С-глікозидів не збільшується, екстракти втрачають антивірусну дію оскільки є нестабільними у часі із-за випадання коагуляційного осаду 10 UA 99969 U 5 10 15 20 25 30 Порівняльні дослідження специфічної фармакологічної дії БАР проводились паралельно і одночасно використовуючи етанольний сумарний екстракт із суміші трав (1:1) та окремі екстракти із Війника наземного та Щучки дернистої з каліброваним вмістом суми флавоноїдів, яка дорівнювала 0,22 мг/мл. Наведені приклади ілюструють властивості БАР, але не обмежують дію патенту. Виявлені властивості відображені в таблицях №№ 1-16 і на фіг. фіг. 1-23. Терміни, що вживаються в заявці та їх скорочені версії, методики досліджень є офіційно прийнятими (Доклінічні дослідження лікарських засобів (методичні рекомендації) .За редакції член-кореспондента АМН України О.В. Стефанова-К.: Авіцена, 2001 p., - 528 с.). Приклад 1 Вивчення антигерпетичної активності модельних екстрактів в дослідах in vitro Для вивчення антивірусної активності екстрактів використовували перещеплювану культуру клітин Vero (клітини нирки мавпи). Клітини вирощували в плашках на середовищі RPMI1640+10 % фетальної сироватки (Nunclon, Surface, Denmark) при температурі 37 °C в термостаті з подачею СО2. Використовували вірус герпесу 2-го типу, штам ВН (ВПГ), інфекційний титр: 5,0÷7,0 lg ТЦД50/ 0,1мл(ТЦД50 тканинна цитопатогена доза вірусу, що спричиняє ураження 50 % моношару клітин). Для вивчення антивірусної активності використовували добові культури клітин Vero із суцільним моношаром клітин. Середовище росту зливали, на моношар клітин наносили екстракти у різних концентраціях, Через 1 годину контакту додавали вірус герпесу в дозі 100 ТЦД50 і в лунки вносили підтримуюче середовище (живильне середовище без сироватки). Культури інкубували в термостаті з подачею СО 2 протягом 5 діб щодня контролюючи за допомогою мікроскопа і відмічаючи репродукцію вірусу по цитопатичній дії ВПГ на клітини Vero у порівнянні з контрольними культурами, де моношар не піддавався обробці екстрактами (контроль вірусу). Цитопатична дія ВПГ на клітини морфологічно проявляється в утворенні симпластів або округлих клітин у поєднанні з проліферацією і гігантськими багатоядерними клітинами. Через 3 доби збирали культуральне середовище з лунок плашок і визначали інфекційний титр в кожній пробі при введені різних доз модельних екстрактів. Результати репродукції ВПГ-2 представлені в таблиці 8. Таблиця 8 Результати впливу експериментальних екстрактів на репродукцію ВПГ-2 в культурі клітини Vero та визначення мінімально активної концентрації (МАК) Концентрація суми флавоноїдів в розведених екстрактах, мкг/мл 0,272 0,136 0,068 0,034 0,017 Контроль вірусу. Назви екстрактів та їх вплив на інфекційні титри в lg ID50 Сумарний Екстракт Війника Екстракт Щучки екстракт (1:1) наземного дернистої 3,0 3,0 3,0 4,0 5,0 4,0 5,0 4,0 4,0 5,0 5,0 3,0 6,0 6,0 4,0 7,0 7,0 7,0 В Таблиці 9 наведені показники максимально переносимої концентрації (МПК), мінімально активної концентрації (МАК) та хіміотерапевтичного індексу (ХТІ). 35 Таблиця 9 Результати визначення МПК, МАК, ХТІ модельних екстрактів при їх дії на вірус герпесу другого типу в культурі клітин Vero. Показники МПК (мкг/мл) МАК (мкг/мл) ХТІ Показники МПК, МАК, ХТІ Екстракт Війника Сумарний екстракт (1:1) наземного 5,5 5,5 0,034 0,034 161,7 161,7 11 Екстракт Щучки дернистої 2,7 0,017 158,8 UA 99969 U 5 10 15 20 25 Досліджувані екстракти ефективно пригнічують вірус герпесу 2-го типу. Мінімально активна концентрація, при якій пригнічується розвиток вірус-специфічної дії на 2,0-3,0 lg ТЦД50, для екстракту Щучки дернистої становила 0,017 мкг/мл, що в два рази менше за значення мінімально активної концентрації (0,034 мкг/мл) для сумарного екстракту та екстракту Війника наземного. ХТІ всіх екстрактів становив 160. Приклад 2 Визначення антигрипозної активності екстрактів в дослідах in vitro Використовували вірус грипу, штам A/FM/1/47 (H1N1), інфекційний титр алантоїсної культури - 6,0 lg EID50/0,2 мл. Для визначення антивірусної активності екстрактів в умовах in vitro використовували добову перещеплювану культуру клітин MDCK (клітини нирки собаки) із суцільним шаром. Клітини вирощували в плашках на середовищі RPMI-1640+10 % фетальної сироватки (Nunclon, Surface, Denmark) при температурі 37 °С в термостаті з подачею СО2. Для підвищення чутливості клітин до зараження їх вірусом грипу проводили обробку трипсином. Маточний розчин трипсину готували додаючи до 3 г наважки ферменту 3 мл поживного середовища DMEM. Клітини тричі промивали цим розчином по 50 мл на лунку. Середовище росту зливали, до клітин додавали модельні екстракти у різних концентраціях і вносили вірус грипу в дозі 100 ТЦД50. Культури інкубували в термостаті з подачею СО 2 протягом 3 діб, щодня контролюючи за допомогою мікроскопа. Через 72 години інкубації клітин культуральну рідину збирали і в ній визначали інфекційний титр вірусу грипу титруванням в культурі клітин. В таблиці 10 представлені результати вивчення впливу модельних екстрактів на вірус грипу. Згідно з отриманими даними модельні екстракти в різних концентраціях пригнічують репродукцію вірусу грипу на 2,0-3,0 lg ID50, що свідчить про антигрипозну дію речовин як сумарного екстракту, так і екстрактів кожної трави окремо. Таблиця 10 Результати впливу експериментальних екстрактів на репродукцію вірусу грипу в культурі клітин MDCK та визначення мінімальної активної концентрації (МАК) Концентрація суми флавоноїдів в розведених екстрактах мкг/мл 0,055 0,0275 0,0137 0,0068 0,0034 0,0017 Контроль вірусу. 30 Назва екстрактів та їх вплив на інфекційні титри вірусу грипу в lg ID50 Сумарний екстракт Екстракт Війника Екстракт Щучки (1:1) наземного дернистої 3,0 4,0 3,0 2,0 4,0 3,0 3,0 7,0 3,0 3,0 6,0 2,0 5,0 6,0 3,0 5,0 6,0 7,0 6,0 6,0 6,0 Хіміотерапевтичний індекс (ХТІ) модельних екстрактів відносно до вірусу грипу визначали шляхом встановлення співвідношення максимально переносної концентрації (МПК) до мінімальної активної концентрації (МАК), при якій пригнічується розвиток вірус-специфічної цитопатичної дії на 2,0-3,0 lg ID50 (таблиця 11) Таблиця 11 Результати визначення МПК, МАК та ХТІ модельних екстрактів при їх дії на вірус грипу в культурі клітин MDCK. Показники МПК (мкг/мл) МАК (мкг/мл) ХТІ Показники МПК, МАК, ХТІ Екстракт Війника Сумарний екстракт (1:1) наземного 5,5 5,5 0,0068 0,0275 808,8 200,0 12 Екстракт Щучки дернистої 1,8 0,0034 52,9 UA 99969 U 5 10 Всі модельні екстракти є ефективними проти вірусу грипу. Інфекційний титр вірусу грипу найбільше знижується (на 3,0 lg ID50) при концентрації БАР, що дорівнює 0,0034 мкг/мл, під дією екстракту Щучки дернистої. Найбільша селективність дії на вірус грипу притаманна сумарному екстрактові, для якого ХТІ=808. Приклад 3 Вивчення активності екстрактів проти вірусу гепатиту С (ВГС). Як сурогатний вірус ВГС використовували вірус бичачої вірусної діареї (ВБВД), який є тестмоделлю вірусу гепатиту С. Антивірусну активність вивчали в культурі МДВК, яку оброблювали різними розведеннями екстрактів і додавали ВБВД в дозі 100 ТЦД 50. Культури інкубували в термостаті до специфічної цитопатогенної дії в контролі вірусу, а потім в культуральному середовищі визначали інфекційний титр вірусу. Результати представлені в таблиці 12. Таблиця 12 Результати впливу експериментальних екстрактів на репродукцію вірусу бичачої вірусної діареї та визначення мінімально-активної концентрації (МАК) на культурі клітин МДВК. Концентрація суми флавоноїдів в розведених екстрактах мкг/мл 0,275 0,137 0,068 0,034 Контроль вірусу Назва препаратів та їх вплив на інфекційний титр сурогатного вірусу ВГС в lg ID50 екстракт Щучки екстракт Війника Сумарний екстракт дернистої наземного 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 3,0 4,0 4,0 4,0 3,0 4,0 8,0 8,0 8,0 15 20 Аналізуючи одержані результати, слід відмітити, що екстракти пригнічували репродукцію сурогатного вірусу гепатиту С на 3-2 lg ID50. Результати визначення МПК, МАК, ХТІ дії сумарного екстракту, екстрактів Щучки дернистої, Війника наземного відносно до вірусу ВБВД в культурі клітин МДВК, представлені в таблицях 12 і 13. Таблиця 13 Результати визначення МПК, МАК та ХТІ екстрактів відносно до ВБВД в культурі клітин МДВК. Показники МПК МАК ХТІ 25 30 35 Показники МПК, МАК та ХТІ для модельних екстрактів Сумарний екстракт (1:1) екстракт Щучки дернистої екстракт Війника наземного 5,5 2,7 5,5 0,034 0,034 0,034 161,7 79,4 161,7 Результати досліджень встановлюють, що модельні екстракти є ефективними інгібіторами сурогатного вірусу гепатиту С (ВБВД) з високими показниками ХТІ. Всі екстракти пригнічують вірус бичачої діареї (тест-модель вірусу гепатиту С) на 4,0-5,0 lg ID50 при концентраціях БАР, які дорівнюють 0,0034 мкг/мл. Приклад 4 Інтерфероногенна активність модельних екстрактів in vivo Інтерфероногенна активність була вивчена в експериментах in vivo на білих безпородних мишах, яким модельні екстракти вводили внутрішньочеревно (по 0,1 мл) в концентрації: 55,5 мкг/кг. Через 24 години мишей виводили з експерименту шляхом евтаназії і визначали інтерферон (ІФН) в сироватках крові за загальноприйнятою методикою пригнічення цитопатогенної дії (ЦПД) вірусу везикулярного стоматиту (ВВС) в гомологічній культурі тканин L929. За маркером кислоточутливості визначали тип ІФНу. Для цієї мети сироватку крові ділили на дві рівні частини. В одній з них рН рідини за допомогою 4 N НСl доводили до 2,0, залишали при 4 °C на 24 години, а потім відновлювали рН рідини за допомогою 4 N NaOH до 7,2. Результати проведеного експерименту представлені в таблиці 14. 13 UA 99969 U Таблиця 14 Рівень інтерферону в сироватках крові мишей, які одержували модельні екстракти Активність інтерферону в од. акт. мл - рН + рН 320 0 320 0 1280 0 1280 1280 Модельні екстракти та еталонний індуктор Сумарний екстракт екстракт Щучки дернистої екстракт Війника наземного Роlі І:Роlі С Роlі І:Роlі С - еталонний індуктор ІФН (Calbiocheus, USA) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 За маркером чутливості до рН було визначено, що всі три екстракти індукують -інтерферон. Всім екстрактам притаманна властивість індукувати імунний -інтерферон. Екстракт Війника наземного індукує інтерферон на рівні еталонного індуктора Poly I: Poly C, а сумарний екстракт та екстракт Щучки дернистої індукують інтерферон на рівні 25 % від рівня індукції інтерферону еталонним індуктором. Приклад 5 Визначення апоптогенної та апоптоз-модулюючої активності БАР. Відомо, що флавоноїдні речовини досить активно досліджуються в плані індукції апоптозу та впливу на диференціювання клітини, оскільки вони мають вибіркову дію на лейкозні та нормальні клітини. Нами було проведено вивчення цитотоксичності БАР, здатності його до індукції апоптозу та взаємодії речовин екстракту з цитотоксичним апоптоз-індукуючим препаратом вепезидом в системі злоякісних лімфоїдних клітин людини Jurkat. Дослідження проводили на перещеплювальній лінії клітин Т-клітинного лімфобластного лейкозу людини Jurkat. Клітини культивували за загальноприйнятими методами. Для досліджень препарати вносили в культури на початку логарифмічної фази їх росту. Для аналізу цитотоксичності, індукції апоптозу та розподілу за фазами циклу речовинивносили в культуральне середовище суспензійних культур у зазначеній нижче за текстом концентрації. Життєздатність клітин визначали фарбуванням трипановим синім. По закінченні інкубування з відповідними речовинами цитоцентрифужні препарати клітин фарбували по Паппенгейму. Перед проведенням цитометричного аналізу клітини інкубували в розчині пропідію йодиду (50 мкг/мл) з 0,1 % цитрату натрію і 0,1 % тритону Х-100. Флуоресценцію клітин оцінювали, використовуючи проточний цитофлуориметр FACScan фірми "Becton Dickinson" (США). Апоптотичний індекс (АІ) розраховували за формулою: (кількість апоптичних клітин/загальна кількість клітин) х 100). Розподіл по фазах клітинного циклу вивчали в клітинах, забарвлених пропідія йодидом, за допомогою проточної цитометрії. Після проведення проточної цитометрії результати аналізували за допомогою комп'ютерних програм ModFit LT 2.0 ("Verity Software House", Topsham, ME, США) і CELLQuest ("BD Biosciences Pharmingen"). Вплив флавоноїдних речовин сумарного екстракту на ріст клітин Jurkat досліджували в концентраціях 5,5 та 55 мкг/мл. Результати наведені на Фіг. 17. Як видно з даних кінетики росту, досліджувана речовина є малотоксичною. Ці дані збігаються з відносною нетоксичністю екстрактів на інших, як суспензійних, так і моношарових культурах клітин, використаних при вивченні антивірусної дії. Слід зазначити, що значне гальмування росту клітин при дії флавоноїдних речовин екстракту в концентрації 55 мкг/мл практично не супроводжувалося масовою загибеллю клітин, навіть при повній затримці подальшого росту. Становило інтерес визначити внесок апоптогенного компонента в ефекти гальмування росту клітин. Як видно з даних, наведених на Фіг. 18, тривале (3 доби) культивування з флавоноїдними речовинами екстракту, навіть у дозі 5,5 мкг/мл, супроводжується невеликим збільшенням відсотка гіподиплоїдних клітин в популяції, за даними проточної цитометрії (на додаток до спонтанного апоптозу, помітного у контрольних культурах на пізніх етапах культивування). Вміст гіподиплоїдних клітин значно збільшується при збільшенні в 10 разів 14 UA 99969 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 концентрації фавоноїдих речовин. Вже на 2-у добу кількість апоптотичних клітин в порівнянні зі спонтанним апоптозом збільшується на 20 %. Отримані дані свідчать, що БАР екстракти викликають проапоптичну, а при збільшенні концентрації - апоптичну дію. Для визначення можливої модифікуючої дії флавоноїдних речовин на індукцію апоптозу клітин Jurkat вепезидом клітини спочатку інкубували з БАР екстракту, а потім через 2 або 3 доби в клітини вносили вепезид в дозі 1 мкмоль/л на 1 добу, тобто вепезид використовували в умовах достатніх, але не надмірних для індукції апоптозу. Результати наведені на Фіг. 19. Як бачимо, інкубація з БАР екстракту в нетоксичній дозі призводить до значного підвищення чутливості клітин Jurkat до дії типового індуктора апоптозу вепезиду. Практично в таких умовах досягається адитивний ефект щодо виходу гіподиплоїдних клітин при послідовній дії екстракту та вепезиду. Наведені результати досліджень вказують на те, що БАР має апоптозмодулюючу дію. Приклад 6 Визначення дії БАР на антиоксидантний статус клітин. Результати відомих досліджень, що стосуються біологічних і фармакологічних ефектів флавоноїдів у різноманітних експериментальних моделях, вказують на те, що одним з механізмів біологічної дії може бути його вплив на антиоксидантну систему клітин і організму, зокрема, на інтенсивність утворення та елімінації радикальних форм кисню. Відомо, що одним з пускових механізмів ланцюга вільнорадикальних процесів у живих системах є генерування супероксидного радикала-аніону, що несе за собою утворення гідроксильного радикал-аніону (О2-), NO-радикала і Н2О2, які викликають широкий ряд патологічних змін, залежно від того, чи спроможна система елімінації їх надлишку. Як об'єкт дослідження використовували культури перещеплювальних ліній злоякісних лімфоїдних клітин людини Namalwa і МТ-4, інкубовані з препаратом протягом 2, 4 або 24 годин до взяття зразка. Концентрація БАР була підібрана при антивірусних дослідженнях і становила в більшості експериментів 2,75 мкг/мл по глікозиду кверцетину. По закінченні інкубації з екстрактом, контролювали життєздатність клітин фарбуванням препаратів трипановим синім. Для подальших експериментів з аналізу антиоксидантних властивостей екстракту використовували лише ті зразки, в яких життєздатність клітин по закінченні інкубації становила не менше 90 %. Для вивчення впливу препарату на проантиоксидантний статус досліджуваних клітин використовували методи ЕПР-спектрометрії та хемілюмінесценсії. Швидкість генерування супероксидного радикала визначали на ЕПР-спектрометрі з використанням спінової пастки 2,2,6,6-тетраметилпіперидина-N-оксіла (TEMPO), що утворює з короткоживучим супероксидом стабільний ТЕМРО-радикал. Реакція накопичення стабільних ТЕМРО-радикалів у кюветі спектрометра ЕПР після введення в суспензію клітин пастки протікала лінійно протягом 5-6 хв. Спектри реєстрували із хвилинними інтервалами. За величиною амплітуд другого компоненти спектра ЕПР TEMPO - радикала реєстрували швидкість накопичення ТЕМРО-радикала, яка відповідає швидкості генерування супероксидного радикала аніону. Робочий об'єм кювети становив 170 мкл. Дослідження проводилися при кімнатній температурі. У кювету вводили або нативні (цілі) клітини, або гомогенізовані на крижаній бані безпосередньо перед внесенням до кювети спектрометра. Додатково досліджували клітини, або попередньо прогріті (5 хв., 60 °C), або після експозиції при 0-10 °C з метою інактивації або інгібування ферментів, які зазначені у ланцюзі перенесення електронів. Усі розчини готувалися ex tempore з перекристалізованих реактивів марки "ч.д.а.(чисті для аналізів)" і дистильованої води. Нативні клітини контрольної культури МТ-4 при кімнатній температурі генерували супероксидрадикал-аніон зі швидкістю в середньому 0.53 нмоль/100 тис. клітин за 1 хв (Фіг. 20). Після температурної обробки (60 °C і 0 °C) ЕПР сигнал освіти ТЕМРО - комплексу був відсутній, що свідчить про участь термолабільних компонентів у процесах генерації активного кисню і про відсутність впливу невраховуваних субстанцій на результати досліду. При інкубації клітин МТ-4 у присутності екстракту швидкість генерації супероксидрадикалуаніону знижувалася на 20-30 % після 2-х годин інкубації, і більше, ніж на половину після 4-х годинної інкубації. Через 24 години інкубації швидкість генерування цього радикала була близька до нуля. Активність генерації цього радикала клітинами лінії Namalwa була дещо нижчою, ніж клітинами МТ-4 (в середньому 0.33 нмоль/100 тис. клітин за 1 хв). При цьому в цих клітинах зазначалося практично повне гасіння генерації радикала після інкубації з екстрактом в усі терміни спостереження (Фіг. 21). 15 UA 99969 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Проведені випробування БАР свідчать про наявність антиоксидантних властивостей, а саме підтверджена дозозалежна кінетика пригнічення генерації супероксидрадикалу аніону, а також пригнічення інтенсивності вільнорадикальних процесів індукованих пероксидом водню. Вплив БАР на інтенсивність вільнорадикальних процесів, індукованих пероксидом водню (Н2О2) Інтенсивність вільнорадикальних процесів вивчали хемілюмінесцентним методом при кімнатній температурі. Як індуктор генерації радикальних форм кисню використовували пероксид водню, який вводили в осередок хемілюмінометра з розрахунку 0.5 мл 3 % Н2О2 на 1 мл суспензії клітин після попередньої реєстрації базового рівня світіння клітин при відкритій шторці ФЕУ. Клітини, відмиті від культурального середовища, вводили в концентрації від 1 до 8 млн./мл. Інкубація клітин МТ-4 з БАР значно змінювала інтенсивність хемілюмінесценції клітин, атакованих Н2О2. Типові хемілюмінограмми наведено на Фіг. 23. Для зразків клітин, інкубованих у присутності БАР, виявилося характерним зниження хемілюмінесценції в перші секунди після атаки Н2О2, в 2.2 разу порівняно із світінням клітин контрольної культури. Максимум світіння контрольних клітин реєструвався на 90-180 секундах, після чого реакція переходила в стаціонарну фазу з амплітудою світіння 62-75 у.о.(умовні одиниці). У зразках клітин, інкубованих з БАР, розвиток вільнорадикальних реакцій носив уповільнений характер - максимум світіння наступав на 270-300 секундах, а стаціонарний рівень - на 560-600 секундах (Фіг. 22). Виявлено, що досліджувана БАР проявляє антирадикальні властивості, тобто підвищує стійкість клітин до вільнорадикального стресу. Наведені приклади специфічної дії БАР свідчать, що БАР є речовиною поліфармакологічної дії. Біологічний спектр дії БАР, отриманої з суміші трав Війника наземного та Щучки дернистої (1:1), та спектр дії БАР, отриманих із кожної трави окремо, є однаковим і залежить тільки від концентрації речовин в перерахунку на сумарну кількість флавоноїдних сполук. Таким чином удосконалення БАР із визначенням конкретних складів діючих речовин БАР, їх фізико-хімічних, біологічних властивостей призводить до винайдення її оптимального складу для антивірусної дії до конкретних вірусів, дозувань при створенні лікарських форм. А саме визначено, що БАР є індуктором ендогенного інтерферону типу (ɣ), має апоптозмодулюючу дію, має антиоксидантні властивості та підвищує стійкість клітин до вільнорадикального стресу. Антивірусна дія до конкретних вірусів визначилась як антивірусна дію по відношенню до вірусу простого герпесу типу 2, вірусу грипу, вірусу бичачої діареї (вірусу гепатиту С). Сполуки, які входять до складу БАР мають здатність блокувати розвиток як ДНК-, так і РНКвмісних вірусів. Досліджувані екстракти ефективно пригнічують вірус герпесу 2-го типу. Мінімально активна концентрація при якій пригнічується розвиток вірус-специфічної дії на 2,0-3,0 lg ТЦД50, для екстракту Щучки дернистої становила 0,017 мкг/мл, що в два рази менше за значення мінімально активної концентрації (0,034 мкг/мл) для сумарного екстракту та екстракту Війника наземного. ХТІ всіх екстрактів становив 160. Всі модельні екстракти є ефективними проти вірусу грипу. Інфекційний титр вірусу грипу найбільше знижується (на 3,0 lg ID50) при концентрації БАР, що дорівнює 0,0034 мкг/мл під дією екстракту Щучки дернистої. Найбільша селективність дії на вірус грипу притаманна сумарному екстрактові, для якого ХТІ=808. Результати досліджень встановлюють, що модельні екстракти є ефективними інгібіторами сурогатного вірусу гепатиту С (ВБВД) з високими показниками ХТІ. Всі екстракти пригнічують вірус бичачої діареї (тест-модель вірусу гепатиту С) на 4,0-5,0 lg ID50 при концентраціях БАР, які дорівнюють 0,0034 мкг/мл. Концентрація БАР для отримання антивірусної дії 0,017÷0,068 мкг/мл значно менша такої для синтетичних речовин. Всім екстрактам притаманна властивість індукувати імунний -інтерферон. Екстракт Війника наземного індукує інтерферон на рівні еталонного індуктора Poly I: Poly C, а сумарний екстракт та екстракт Щучки дернистої індукують інтерферон на рівні 25 % від рівня індукції інтерферону еталонним індуктором. Наведені результати досліджень вказують на те, що БАР має апоптозмодулюючу дію. Проведені випробування БАР свідчать про наявність антиоксидантних властивостей, а саме підтверджена дозозалежна кінетика пригнічення генерації супероксидрадикалу аніону, а також пригнічення інтенсивності вільнорадикальних процесів індукованих пероксидом водню. До того ж запропонований БАР не має недоліків притаманних синтетичним антивірусним препаратам; надає можливість створення лікарських форм з точним дозуванням і цілеспрямованою фармакодинамічною дією. 60 16 UA 99969 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 1. Біологічно активна речовина поліфармакологічної дії, отримана із зелених частин та колосків злакових рослин родини Gramineae, роду Calamagrostis Adans та/або роду Deshampsia Beauv, що містить флавоноїди, яка відрізняється тим, що містить аглікони флавоноїдів трицину, апігеніну, лютеоліну, кварцетину, рамназину та/або флавоноїдні глікозиди трицину, апігеніну, лютеоліну, кварцетину, рамназину, допоміжні речовини і має такий склад, мас. %: аглікон флавоноїду трицину та/або його флавоноїдні глікозиди 0,016-2,062 аглікон флавоноїду апігеніну та/або його флавоноїдні глікозиди 0,010-1,393 аглікон флавоноїду лютеолін та/або його флавоноїдні глікозиди 0,01-4,979 аглікон флавоноїду кверцетин та/або його флавоноїдні глікозиди 0,001-0,771 аглікон флавоноїду рамназин та/або його флавоноїдні глікозиди 0,104-0,203 допоміжні речовини 99,868- 90,592. 2. Біологічно активна речовина за п. 1, яка відрізняється тим, що як допоміжні речовини містить вуглеводні сполуки, амінокислоти, хлорофіли. 3. Біологічно активна речовина за п. 1 або п. 2, яка відрізняється тим, що отримана із Війника наземного (Calamagrostis epigeios L. роду Calamagrostis Adans) та/або Щучки дернистої (Deshampsia caespitosa L. роду Deshampsia Beanu). 4. Біологічно активна речовина за будь-яким з пп. 1-3, яка відрізняється тим, що вміст Оглікозидних форм флавоноїдів становить (53,545÷86,422)%, а С-глікозидних форм флавоноїдів становить (43,293÷4,910)% від загальної кількості флавоноїдних сполук, решта аглікони флавоноїдів. 17 UA 99969 U 18 UA 99969 U 19 UA 99969 U 20 UA 99969 U 21 UA 99969 U 22 UA 99969 U 23 UA 99969 U 24 UA 99969 U 25 UA 99969 U 26 UA 99969 U 27 UA 99969 U 28