Трансгенна рослина, яка містить днк, що кодує білок cry1da, і днк, що кодує білок cry1ca, для керування стійкими комахами spodoptera frugiperda

Реферат: Даний винахід включає рослини і способи для контролювання комах кукурудзяної листової совки, де вказані трансгенні рослини містять білок Cry1Da, який має інсектицидну дію, і білок Сrу1Са, який має інсектицидну дію, а також комбінації білків, що містять вказану пару білків, для уповільнення або запобігання розвитку стійкості в комах Spodoptera frugiperda. UA 112409 C2 (12) UA 112409 C2 UA 112409 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Рівень техніки Люди вирощують кукурудзу для використання при виробництві їжі й енергії. Люди також вирощують велику кількість інших видів зернових, включаючи сою і бавовну. Комахи поїдають і пошкоджують рослини і, тим самим, підривають зусилля людей. Мільярди доларів щорічно витрачаються на контроль комах-шкідників і, крім цього, мільярди доларів губляться у вигляді збитку, нанесеного комахами. Синтетичні органічні хімічні інсектициди є основним інструментом контролю комах-шкідників, але біологічні інсектициди, наприклад, білки, які мають інсектицидну дію, отримані з Bacillus thuringiensis (Bt), відіграють важливу роль у тих же галузях застосування. Можливість одержання стійких до комах рослин шляхом трансформації генами Bt білків, які мають інсектицидну дію, зробила революцію в сучасному сільському господарстві і підвищила важливість і цінність білків, які мають інсектицидну дію, і їхніх генів. Декілька Bt білків були використані для створення стійких до комах трансгенних рослин, що до даного часу успішно зареєстровані і виведені на ринок. Вказані білки включають Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F і Cry3Bb у кукурудзи, Cry1Ac і Cry2Ab у бавовни і Cry3A у картоплі. Комерційні продукти, які експресують ці білки, експресують один білок за винятком випадків, коли бажаний комбінований інсектицидний спектр дії двох білків (наприклад, Cry1Ab і Cry3Bb у кукурудзи комбінують для забезпечення стійкості, відповідно, до лускокрилих комах-шкідників і кореневих хробаків), або коли незалежна дія білків дозволяє використовувати їх як засіб, що сповільнює розвиток стійкості в цільовій популяції комах (наприклад, Cry1Ac і Cry2Ab у бавовни комбінують для забезпечення контролю розвитку стійкості в тютюнової листовійки-брунькоїда). Див. також публікацію заявки на патент США № 2009/0313717, що стосується білка Cry2 плюс Vip3Aa, Cry1F, або Cry1A для контролю Helicoverpa zea або armigerain. WO 2009/132850 стосується використання Cry1F або Cry1A і Vip3Aa для контролю Spodoptera frugiperda. Публікація заявки на патент США №2008/0311096 частково стосується використання Cry1Ab для контролю ECB, стійкого до Cry1F. Таким чином, деякі властивості трансгенних рослин, стійких до комах, що привели до швидкого і широкого впровадження цієї технології, також викликали побоювання, що популяції комах-шкідників вироблять стійкість до білків, які мають інсектицидну дію, які продукуються цими рослинами. Було запропоновано кілька стратегій для збереження утилітарності пов'язаних зі стійкістю до комах ознак, основаних на Bt, які включали введення білків у високих дозах у комбінації з організацією сховищ, і почергове або одночасне введення різних токсинів (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management, ” Nature Biotechnol, 16:144-146). Білки, вибрані для використання в наборі для керування стійкістю комах (IRM) повинні виявляти свою ісектицидну дію незалежно таким чином, щоб стійкість, що розвилася до одного білка, не викликала появи стійкості до другого білка (тобто, щоб була відсутня перехресна стійкість до білків). Наприклад, якщо популяція комахи-шкідника, що виявляє стійкість до "Білка А", є чутливою до "Білка В", можна зробити висновок, що перехресна стійкість відсутня і, що комбінація Білка А і Білка В буде ефективною для уповільнення розвитку стійкості до Білка А, застосовуваному ізольовано. При відсутності популяцій комах, які мають стійкість, може бути проведений аналіз на основі інших характеристик, що, як передбачається, пов'язані з механізмом дії і потенціалом розвитку перехресної стійкості. Були висунені припущення, згідно з якими для ідентифікації білків, що мають інсектицидну дію, що, ймовірно, не мають властивості перехресної стійкості, можна використовувати рецептор-опосередковане зв'язування (van Mellaert et al. 1999). Ключовий прогнозуючий параметр відсутності перехресної стійкості, природно властивий такому підходу, полягає в тому, що білки, які мають інсектицидну дію, не конкурують за рецептори в чутливих до них видів комах. Якщо два Bt токсини конкурують за той самий рецептор, то у випадку мутації цього рецептора в комахи, при якій один з токсинів більше не зв'язується з цим рецептором і, отже, більше не має інсектицидної дії відносно цієї комахи, ця комаха може статистійкою також і до другого токсину (який конкурентно зв'язується з тим же рецептором). При цьому комаха розглядається як така, що має перехресну стійкість до обох Bt токсинів. Однак якщо два токсини зв'язуються з різними рецепторами, це може служити вказівкою на те, що комаха може не бути одночасно стійкою до цим двох токсинів. Наприклад, білок Cry1Fa застосовний для контролю багатьох лускокрилих комах-шкідників, включаючи метелика кукурудзяного (ECB; Ostrinia nubilalis (Hubner)) і кукурудзяну листову совку (FAW; Spodoptera frugiperda), і виявляє активність відносно вогнівки цукрової тростини (SCB; Diatraea saccharalis). Білок Cry1Fa, який виробляється у трансгенних рослинах кукурудзи, що містять фактор TC1507, є відповідальним за розвиток стійкості до домінуючих в даній галузі 1 UA 112409 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 комах, тобто для контролю FAW. Cry1Fa також використовується в продуктах Herculex®, SmartStax™ і WideStrike™. Додаткові Cry токсини перераховані на веб-сайті офіційного комітету з номенклатури B.t. (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). В даний час існує приблизно 60 основних груп "Cry" токсинів (Cry1-Cry59) з додатковими Cyt токсинами, VIP токсинами і т. п. Багато груп з числовими позначеннями мають підгрупи, позначені великими буквами, а позначені великими буквами підгрупи мають підгрупи, позначені малими буквами. (Наприклад, Cry1 має підгрупи A-L, а Cry1A має підгрупи a-i). Короткий опис винаходу Даний винахід частково стосується несподіваного відкриття, яке полягає в тому, що Cry1Da і Cry1C не конкурують за ділянки зв'язування в мембранних препаратах, отриманих із клітин кишечнику кукурудзяної листової совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Фахівець у даній галузі техніки зрозуміє, з урахуванням даного розкриття, що рослини, які виробляють обидва ці білки (включаючи частини повнорозмірних білків, що мають інсектицидну дію) можуть сповільнити або запобігти розвитку стійкості до білків, які мають дану інсектицидну дію, окремо. Таким чином, даний винахід частково стосується застосування білка Cry1Da у комбінації з білком Cry1Ca. Рослини (і площа угідь, засіяних такими рослинами), що виробляють обидва ці білки, включені в об'єм даного винаходу. Даний винахід також стосується пакетів або "пірамід" із трьох (або більше) токсинів, у яких Cry1Da і Cry1Ca є основною парою. У деяких переважних варіантах здійснення пірамід комбінація вибраних токсинів забезпечує активність стосовно FAW без розвитку перехресної стійкості. Деякі переважні комбінації-піраміди з "трьома місцями дії" включають основну пару білків, плюс Cry1Fa, Vip3Ab, Cry1Be або Cry1E як третій білок, що впливає на FAW. Ці конкретні потрійні пакети, згідно із даним винаходом, несподівано забезпечують три місця дії в FAW. Це може сприяти пом'якшенню або усуненню вимоги до площі сховищ (рефугій). Відповідно до даного винаходу також можуть бути додані додаткові токсини/гени. Наприклад, якщо Cry1Fa або Cry1Be входять у пакет разом з парою білків за винаходом (обидва білки Cry1Fa і Cry1Be виявляють активність як стосовно FAW, так і стосовно метелика кукурудзяному (ECB)), то додавання двох додаткових білків у цей потрійний пакет, у якому два додаткових білки націлені на ECB, забезпечить три місця дії в FAW і три місця дії в ECB. Вказані два доданих білки (четвертий і п'ятий білки) можуть бути вибрані з групи, яка складається з Cry2A, Cry1I, DIG-3 і Cry1Ab, що дає в результаті пакет з п'яти білків, які мають по три місця дії у двох комах (ECB і FAW). Докладний опис винаходу Даний винахід частково стосується несподіваного відкриття, яке полягає в тому, що Cry1Da і Cry1Ca не конкурують один з одним за ділянки зв'язування в мембранних препаратах, отриманих із клітин кишечнику кукурудзяної листової совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Таким чином, білок Cry1Da може бути використаний у комбінації з білком Cry1Ca у трансгенній кукурудзі (і інших рослинах, наприклад, бавовні і сої) для уповільнення або запобігання розвитку в FAW стійкості до кожного з вказаних білків окремо. Розглянута пара білків може бути ефективною при захисті рослин (таких рослин, як маїс і соя) від ушкоджень, які наносяться кукурудзяною листовою совкою, стійкою до Cry. Іншими словами, одна з галузей застосування даного винаходу стосується захисту кукурудзи й інших економічно важливих видів рослин від ушкоджень і утрати врожаю, викликаних популяціями кукурудзяної листової совки, у яких може розвитися стійкість до Cry1Da або Cry1Ca. У даному винаході, таким чином, розкривається пакет для керування стійкістю комахами (IRM), що містить Cry1Da і Cry1Ca, призначений для запобігання або ослаблення розвитку в FAW стійкості до кожного або обох цим білків. Даний винахід забезпечує композиції для контролю лускокрилих комах-шкідників, які містять клітини, які продукують білок Cry1Da, який має інсектицидну дію, і білок Cry1Ca, який має інсектицидну дію. Винахід також стосується хазяїна, трансформованого для продукування як білка Cry1Da, який має інсектицидну дію, так і білка Cry1Ca, який має інсектицидну дію, причому вказаний хазяїн являє собою мікроорганізм або клітину рослини. Розглянутий полінуклеотид(и), переважно, знаходиться в генетичній конструкції під керуванням промотору(ів), який не належить Bacillus thuringiensis. Розглянуті полінуклеотиди можуть містити кодони, які використовуються для посиленої експресії в рослинах. Додатково передбачається, що винахід забезпечує спосіб контролю лускокрилих комахшкідників, що містить приведення в контакт вказаних комах-шкідників з ефективною кількістю 2 UA 112409 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 композиції, яка містить білок, що містить ядро токсину Cry1Da, і білок, що містить ядро токсину Cry1Са. Один з варіантів здійснення винаходу містить рослину маїсу, що містить експресований у рослині ген, який кодує білок Cry1Са, який має інсектицидну дію, і експресований у рослині ген, що кодує білок Cry1Da, який має інсектицидну дію. Інший варіант здійснення винаходу містить рослину маїсу, у якому експресований у рослині ген, що кодує білок Cry1Са, який має інсектицидну дію, і експресований у рослині ген, що кодує білок Cry1Da, який має інсектицидну дію, були введені в вказану рослину маїсу шляхом інтрогресії. Як описано в Прикладах, дослідження конкурентного зв'язування з рецептором з використанням міченого радіоактивним ізотопом білка Cry1Da показали, що білок Cry1Са не конкурує за зв'язування в тканинах FAW, у яких відбувається зв'язування Cry1Da. Ці результати також указують на те, що комбінація білків Cry1Da і Cry1Са може являти собою ефективний засіб для ослаблення розвитку стійкості в популяціях FAW до кожного з цих білків. Таким чином, частково ґрунтуючись на даних, представлених у даному документі, можна припустити, що спільне продукування (пакетування) білків Cry1Са і Cry1Da може бути використане для одержання IRM пакета з високими дозами для FAW. До цієї пари можуть бути додані інші білки. Наприклад, розглянутий винахід також частково стосується потрійних пакетів або "пірамід", що складаються з трьох (або більше) токсинів, де Cry1Da і Cry1Са є основною парою. У деяких переважних варіантах здійснення піраміди, вибрані токсини мають три окремих місця дії в FAW. Деякі переважні комбінації для піраміди з "трьома місцями дії" включають розглянуту основну пару білків плюс Cry1Fa, Vip3Ab, Cry1Be або Cry1E як третій білок для впливу на FAW. Під "окремими місцями дії" мається на увазі те, що кожен з даних білків не викликає розвитку перехресної стійкості з іншими білками. Ці конкретні потрійні пакети за даним винаходом несподівано забезпечують три місця дії в FAW. Це може сприяти пом'якшенню або усуненню вимоги до площі сховищ. Згідно із даним винаходом також можуть бути додані додаткові токсини/гени. Наприклад, якщо Cry1Fa або Cry1Be вводять у пакет разом з парою білків за винаходом (обидва білки Cry1Fa і Cry1Be виявляють активність як стосовно FAW, так і стосовно метелика кукурудзяного (ECB)); при цьому додавання двох додаткових білків у цей потрійний пакет, у якому два додаткових білки націлені на ECB, забезпечить три місця дії в FAW і три місця дії в ECB. Ці два доданих білки (четвертий і п'ятий білок) можуть бути вибрані з групи, яка складається з Cry2A, Cry1I, DIG-3 (див. заявку на патент США № 61/284278 (подана 16 грудня 2009 року) і US 2010 00269223) і Cry1Ab. У результаті, виходить пакет з п'яти білків, що має по три місця дії у двох комах (ECB і FAW). Таким чином, одна з можливих схем обробки являє собою використання розглянутої пари білків у комбінації з третім токсином/геном і використання цього потрійного пакета для ослаблення розвитку в FAW стійкості до кожного з цих токсинів. Відповідно, розглянутий винахід також стосується потрійних пакетів або "пірамід", що складаються з трьох (або більше) токсинів. У деяких переважних варіантах здійснення піраміди, вибрані токсини мають три окремих місця дії в FAW. Серед інших схем обробки за даним винаходом можуть бути використані два, три або більше білків з розглянутих білків у регіонах виростання кукурудзи, у яких FAW може формувати популяції з розвиненою стійкістю. Що стосується використання Cry1Fa плюс Cry1C, у заявці на патент США № 61/284281 (подана 16 грудня 2009 року) показано, що Cry1C активне стосовно FAW, стійкої до Cry1F. Що стосується використання Cry1Fa плюс Cry1D, у заявці на патент США № 61/284252 (подана 16 грудня 2009 року) показано, що Cry1D активне стосовно FAW, стійкої до Cry1F. У цих двох заявках також показано, що Cry1C не конкурує з Cry1F за зв'язування в мембранних препаратах FAW, і що Cry1D не конкурує з Cry1F за зв'язування в мембранних препаратах FAW. З урахуванням того, що Cry1Fa активне стосовно FAW і ECB, Cry1Da плюс Cry1Са плюс Cry1Fa несподівано забезпечують, згідно із даним винаходом, три місця дії в FAW. Це може сприяти пом'якшенню або усуненню вимоги до площі сховищ. Cry1Fa міститься в продуктах Herculex®, SmartStax™ і WideStrike™. Розглянута пара генів (Cry1Da і Cry1Са) може бути скомбінована, наприклад з продуктом, який містить Cry1Fa, таким як Herculex®, SmartStax™ і WideStrike™. Відповідно, розглянута пара білків може відігравати значну роль у зменшенні тиску відбору на ці й інші білки. Розглянута пара білків може бути використана в комбінаціях із трьох генів для кукурудзи й інших рослин (наприклад, бавовни і сої). 3 UA 112409 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Як уже указувалося вище, згідно із даним винаходом також можуть бути додані додаткові токсини/гени. Відносно використання Cry1E (для контролю FAW), див. заявку на патент США № 61/284278 (подана 16 грудня 2009 року). Відносно використання Cry1Ab (для контролю ECB), див. публікацію заявки на патент США № 2008/0311096. Рослини (і площі угідь, засіяні такими рослинами), що виробляють кожну з розглянутих комбінацій білків, включені в об'єм даного винаходу. Також можуть бути додані додаткові токсини/гени; однак, обговорювані вище конкретні пакети несподівано забезпечують множину місць дії в FAW і ECB. Це може сприяти пом'якшенню або усуненню вимоги до площі сховищ. Отже, засіяне в такий спосіб поле, площа якого перевищує десять акрів, входить в об'єм даного винаходу. Для одержання послідовностей будь-яких генів і білків, розкритих, або згаданих у даному документі, також може бути використаний GENBANK. Див. Додаток А нижче. Релевантні послідовності також доступні з патентів. Наприклад, патент США № 5188960 і патент США № 5827514 описують білки, що містять ядро токсину Cry1Fa, що є придатними для здійснення даного винаходу. Патент США № 6218188 описує оптимізовані для рослин послідовності ДНК, що кодують білки, які містять ядро токсину Cry1Fa, що підходять для використання в даному винаході. Комбінації білків, описаних у даному документі, можуть бути використані для контролю лускокрилих комах-шкідників. Дорослі лускокрилі, наприклад, метелики і мотелі, в основному харчуються квітковим нектаром і є важливими запильниками. Практично усі личинки лускокрилих, тобто гусениці, харчуються рослинами, і багато які з них є важливими комахамишкідниками. Гусениці поїдають внутрішню частину листя, корені або стебла рослини, залишаючи рослину можливості одержувати поживні речовини і часто руйнуючи фізичну опорну структуру рослини. Крім цього, гусениці поїдають плоди, тканини і зерно і борошно, які зберігаються, додаючи цим продуктам нетоварного вигляду або серйозно знижуючи їхню цінність. Як використовується в даному документі, під лускокрилими комахами-шкідниками маються на увазі різні стадії життєвого циклу комахи-шкідника, включаючи стадії личинки. Деякі химерні токсини за даним винаходом містять повну N-кінцеву частину ядра токсину Bt і, у деякій точці від кінця частини, що містить ядро токсину, білок переходить у гетерологічну послідовність протоксину. N-кінцева частина токсину Bt, яка має інсектицидну активність, називається "ядром" токсину. Перехід від сегмента ядра токсину до сегмента гетерологічного протоксину може знаходитися приблизно в місці сполучення токсин/протоксин або, як альтернатива, може бути збережена частина природного протоксину (яка простягається за межі частини ядра токсину) з переходом у гетерологічну частину, протоксин, розташовану далі. Як приклад, один з химерних токсинів за даним винаходом являє собою частину, що стосується ядра токсину Cry1Da (приблизно 600 амінокислот) і/або гетерологічний протоксин (решта амінокислот до С-кінця). В одному з переважних варіантів здійснення, частину химерного токсину, що містить протоксин, одержують з білка-токсину Cry1Ab. У переважному варіанті здійснення частину химерного токсину, що містить протоксин, одержують з білкатоксину Cry1Ab. Фахівець у даній галузі техніки визнає, що Bt токсини, навіть у рамках визначеного класу, такого як Cry1Са, небагато розрізняються по довжині і точному положенні переходу від ядра токсину до частини, що стосується протоксину. Звичайно, токсини Cry1Са мають довжину від приблизно 1150 до приблизно 1200 амінокислот. Перехід від частини, що стосується ядра токсину, до частини, що стосується протоксину, звичайно знаходиться в межах від 50 % до 60 % повної довжини токсину. Химерний токсин розглянутого винаходу повністю включає вказану Nкінцеву частину ядра токсину. Таким чином, химерний токсин містить щонайменше 50 % повної довжини білка-токсину Cry1 Bt, що звичайно складає щонайменше 590 амінокислот. Що стосується частини, яка належить до протоксину, то повна довжина частини, яка належить до протоксину Cry1Ab, простягається від кінця частини, яка належить до ядра токсину, до С-кінця молекули. Гени і токсини. Гени і токсини, які використовуються за даним винаходом, включають не тільки розкриті послідовності повної довжини, але також фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутанти і злиті білки, що зберігають характеристики пестицидної активності токсинів, приклади яких приведені в даному документі. У даному документі, термін "варіанти" або "варіації" генів стосується нуклеотидних послідовностей, що кодують одні і ті ж самі токсини або які кодують токсини-еквіваленти, які мають пестицидну активність. У даному документі, термін "токсини-еквіваленти" стосується токсинів, які мають таку ж або по суті таку ж біологічну активність стосовно цільових комах-шкідників, що і заявлені токсини. 4 UA 112409 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У даному документі використовуються наступні обмежувальні ознаки: приблизно 95 % (для Cry1Da і Cry1Ca), 78 % (для Cry1D і Cry1C) і 45 % (для Cry1) ідентичність послідовностей згідно з "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins, ” N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol.62:807-813. Ці обмеження застосовні тільки відносно ядра токсинів. Для фахівця в даній галузі техніки очевидно, що гени, які кодують активні токсини, можуть бути ідентифіковані й отримані декількома способами. Конкретні гени або частини генів, проілюстровані в даному документі, можуть бути отримані з ізолятів, депонованих у депозитарії культур. Ці гени або їхні частини, або варіанти також можуть бути сконструйовані синтетично, наприклад, з використанням синтезатора генів. Варіації генів можуть бути легко сконструйовані стандартними методами для здійснення точкових мутацій. Фрагменти цих генів також можуть бути отримані з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз відповідно до стандартних процедур. Наприклад, для послідовного відщеплення нуклеотидів від кінців цих генів можуть бути використані такі ферменти, як Bal31, або сайтнаправлений мутагенез. Гени, що кодують активні фрагменти, також можуть бути отримані з використанням різних рестрикційних ферментів. Для безпосереднього одержання активних фрагментів вказаних білків-токсинів можуть бути використані протеази. Фрагменти й еквіваленти, що зберігають пестицидну активність проілюстрованих токсинів, також знаходяться в межах об'єму даного винаходу. У силу надмірності генетичного коду амінокислотні послідовності, розкриті в даному документі, можуть кодуватися множиною різних ДНК-послідовностей. Фахівцю в даній галузі техніки не буде складним створити альтернативні ДНК-послідовності, що кодують такі ж або по суті такі ж токсини. Такі варіанти ДНКпослідовностей знаходяться в межах об'єму даного винаходу. У даному документі "по суті такі ж" послідовності позначають послідовності, що мають заміни, делеції, додавання або вставки, що суттєво не впливають на пестицидну активність. Це визначення також охоплює фрагменти генів, які кодують білки, що зберігають пестицидну активність. Ще один спосіб ідентифікації генів, що кодують токсини, і частин генів, придатних згідно із даним винаходом, полягає у використанні олігонуклеотидних зондів. Такі зонди являють собою детектовані нуклеотидні послідовності. Ці послідовності можуть бути детектованими внаслідок наявності відповідної мітки або можуть бути виконані з можливістю їхньої природної флуоресценції, як описано в міжнародній заявці WO93/16094. Як відомо з рівня техніки, якщо зонд і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються, формуючи сильний зв'язок між двома вказаними молекулами, можна зробити досить обґрунтоване припущення, що зонд і зразок є по суті гомологічними. Переважно, гібридизацію проводять у жорстких умовах методом, добре відомим з рівня техніки, наприклад, описаним у Keller, G. FL, M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Деякі приклади комбінацій концентрації солі і температури є наступними (у порядку зростання твердості): 2X SSPE або SSC при кімнатній температурі; 1X SSPE або SSC при 42 °C; 0,1X SSPE або SSC при 42 °C; 0,1X SSPE або SSC при 65 °C. Детектування зонда забезпечує засіб для визначення відомим способом, чи відбулася гібридизація. Такий зондовий аналіз забезпечує швидкий спосіб ідентифікації генів, що кодують токсин, за даним винаходом. Нуклеотидні сегменти, використовувані як зонди, відповідно до винаходу, можуть синтезуватися в ДНК-синтезаторі і за допомогою стандартних процедур. Дані нуклеотидні послідовності також можуть використовуватися як ПЛР-праймерів для ампліфікації генів за винаходом. Варіанти токсинів. У даному документі, зокрема, приведені приклади деяких токсинів за винаходом. Оскільки ці токсини є усього лише прикладами токсинів за винаходом, очевидно, що даний винахід містить варіанти або еквівалентні токсини (і нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), що мають пестицидну активність, таку ж або аналогічну пестицидній активності токсину, приведеного як приклад. Еквівалентні токсини мають гомологію по амінокислотах із приведеним як приклад токсином. Така гомологія по амінокислотах звичайно перевищує 75 %, переважно, перевищує 90 % і, найбільше переважно, перевищує 95 %. Гомологія по амінокислотах є найбільшою в критичних ділянках, які відповідальні за біологічну активність або беруть участь у визначенні тривимірної конфігурації, що, у кінцевому рахунку, і відповідає за біологічну активність. У цьому відношенні, визначені амінокислотні заміни є прийнятними і припустимими, якщо ці заміни знаходяться в ділянках, які не є критичними для активності або являють собою консервативні амінокислотні заміни, що не впливають на тривимірну конфігурацію молекули. Наприклад, амінокислоти можуть бути віднесені до наступних класів: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислі. Консервативні заміни, у яких амінокислота одного класу заміняється амінокислотою з того ж класу, 5 UA 112409 C2 знаходяться в межах об'єму даного винаходу за умови, що така заміна не змінює суттєво біологічну активність сполуки. Нижче приводиться список прикладів амінокислот, що належать кожному класу. Клас амінокислот неполярні незаряджені полярні кислі основні Приклади амінокислот Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Asp, Glu Lys, Arg, His 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У деяких прикладах також можуть бути використані неконсервативні заміни. При цьому критичним фактором є те, що такі заміни не повинні суттєво погіршувати біологічну активність токсину. Рекомбінантні хазяїни. Гени, які кодують токсини за даним винаходом, можуть бути уведені у множину різних хазяїнів або рослин-хазяїнів. Експресія гена токсину приводить у результаті, прямо або опосередковано, до внутрішньоклітинного продукування і підтримки пестициду. Для створення штаму Bt, який експресує обидва токсини за винаходом, можуть бути використані кон'югаційне перенесення і рекомбінантне перенесення. Один або обидва гени токсинів можуть бути перенесені також в інші організми-хазяїни, що можуть потім використовуватися для одержання синергічного ефекту. При використанні придатних мікроорганізмів-хазяїнів, наприклад Pseudomonas, такі мікроорганізми можна застосовувати в місцях знаходження комахи-шкідника, де вони будуть розмножуватися і потрапляти в кишечник комахи, що приведе в результаті до контролю комахи-шкідника. Як альтернатива, мікроорганізми, що містять ген токсину, можуть бути оброблені в умовах, які продовжують активність токсину і стабілізують клітину. Потім оброблені клітини, що зберігають токсичну активність, вносять у середовище проживання цільової комахи-шкідника. Якщо ген Bt токсину вводять за допомогою придатного вектора в мікроорганізм-хазяїн, а вказаний хазяїн потім вводять у середовище проживання в живому стані, то принциповим моментом є використання певних мікроорганізмів-хазяїнів. Вибираються такі мікроорганізмихазяїни, відносно яких відомо, що вони живуть у "фітосфері" (філоплані, філосфері, ризосфері і/або ризоплані) однієї або більше зернових культур, які представляють інтерес. Такі мікроорганізми вибирають таким чином, щоб вони мали здатність успішно конкурувати в конкретному середовищі проживання (зерновій культурі або інших місцях проживання комах) з дикими типами мікроорганізмів, забезпечували стабільну підтримку й експресію поліпептидупестициду і, бажано, забезпечували поліпшений захист пестициду від розкладання й інактивації під дією навколишнього середовища. Відносно величезної кількості мікроорганізмів відомо, що вони живуть у філоплані (поверхні листя рослин) і/або в ризосфері (ґрунті, що оточує кореневу систему рослини) множини важливих зернових культур. Ці мікроорганізми включають бактерії, водорості і гриби. Особливий інтерес представляють такі мікроорганізми, як бактерії, наприклад, що належать до родів Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc і Alcaligenes; гриби, зокрема, дріжджі, наприклад, що належать до видів Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula і Aureobasidium. Особливий інтерес представляють такі види, що живуть у фітосфері бактерій, як Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus і Azotobacter vinlandii, такі види дріжджів, що живуть у фітосфері, як Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae і Aureobasidium pollulans. Особливий інтерес представляють пігментовані мікроорганізми. Існує широкий спектр способів уведення Bt генів, що кодує токсин, у мікроорганізм-хазяїн в умовах, які забезпечують стабільну підтримку й експресію цього гена. Ці способи добре відомі фахівцям у даній галузі техніки й описані, наприклад, у патенті США № 5135867, що включений у даний документ у вигляді посилання. Обробка клітин. Клітини Bacillus thuringiensis або рекомбінантні клітини, які експресують Bt токсини, можуть бути оброблені з метою продовження активності токсину і стабілізації клітини. Формована мікрокапсула з пестицидом містить Bt токсин або токсини усередині клітинної структури, що була стабілізована і захищає токсин при внесенні мікрокапсули в середовище 6 UA 112409 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проживання цільової комахи-шкідника. Придатні клітини-хазяїни можуть включати клітини або прокаріот, або еукаріот, і звичайно обмежені тільки тими клітинами, що не виробляють речовини, токсичні для вищих організмів, таких як ссавці. Проте, можуть бути використані організми, що виробляють речовини, токсичні для вищих організмів, якщо ці токсичні речовини є нестабільними, або внесена кількість є досить низькою, настільки, що при цьому відсутня яканебудь імовірність інтоксикації ссавця-хазяїна. Як хазяїни особливий інтерес представляють прокаріоти і нижчі еукаріоти, такі як гриби. При обробці клітини звичайно є інтактними і по суті знаходяться в проліферативній формі, а не у формі спор, хоча в деяких випадках можуть бути використані спори. Обробка клітин мікроорганізмів, тобто клітин, що містять ген або гени Bt токсину, може виконуватися з використанням хімічних або фізичних засобів або з використанням комбінації хімічних і/або фізичних засобів за умови, що ці методи не чинять негативного впливу на властивості токсину, а також не погіршують здатність клітини захищати токсин. Прикладами хімічних реагентів є галогенуючі агенти, зокрема, галогени з атомними номерами 17-80. Більш точно, можна використовувати йод у м'яких умовах протягом часу, достатнього для досягнення бажаних результатів. Інші придатні методи включають обробку альдегідами, такими як глутаральдегід; протиінфекційними засобами, такими як зефіран хлорид і цетилпіридинхлорид; спиртами, такими як ізопропіловий спирт і етанол; різними гістологічними фіксаторами, такими як Люголь-йод, фіксатор Буена, різні кислоти і фіксатор Helly (См. Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); або комбінацією фізичних (тепло) і хімічних агентів, що захищають і сприяють пролонгуванню активності токсину, який продукується в клітині при введенні цієї клітини тварині-хазяїну. Прикладами фізичних засобів є короткохвильове випромінювання, таке як гамма-випромінювання і рентгенівське випромінювання, заморожування, УФ-опромінювання, ліофілізація та інші. Способи обробки клітин мікроорганізмів описані в патентах США №№ 4695455 і 4695462, що включені в даний документ у вигляді посилання. Клітини звичайно мають підвищену стабільність структури, що збільшує їхню стійкість до умов навколишнього середовища. Якщо пестицид знаходиться в проформі, спосіб обробки клітини варто вибирати таким чином, щоб патогеном цільової комахи-шкідника не придушувався процесинг від проформи до зрілої форми пестициду. Наприклад, формальдегід буде зшивати білки і може придушувати процесинг проформи поліпептиду-пестициду. Спосіб обробки клітини повинен сприяти збереженню щонайменше суттєвої частки біодоступності або біоактивності токсину. Характеристики, які становлять особливий інтерес, при виборі клітини-хазяїна з метою продукування, включають легкість уведення Bt гена або генів у клітину хазяїна, приступність експресуючої системи, ефективність експресії, стабільність пестициду в клітині-хазяїні і наявність допоміжних генетичних можливостей. Характеристики, які становлять особливий інтерес, у випадку використання у вигляді пестицидної мікрокапсули включають захисні властивості відносно пестициду, такі як товсті клітинні стінки, пігментація і внутрішньоклітинне упакування або формування включень; виживання у водному середовищі; відсутність токсичності для ссавця; привабливість для поглинання комахами-шкідниками; легкість у знищенні і фіксації без ушкодження токсину тощо. Також може розглядатися легкість у створенні і поводженні, економічність, стабільність при збереженні тощо. Вирощування клітин. Клітину-хазяїна, що містить інсектицидний Bt ген або гени можна вирощувати в будь-якому придатному поживному середовищі, в якому ДНК-конструкція забезпечує селективну перевагу, забезпечуючи таке селективне середовище, що всі або по суті всі клітини зберігають Bt ген. Потім ці клітини можуть бути зібрані відомими методами. З іншого боку, клітини можна обробляти до їхнього збирання. Bt клітини, які продукують токсини за винаходом, можуть бути культивовані з використанням стандартних середовищ і методів ферментації, відомих у даній галузі техніки. Після завершення циклу ферментації бактерії можуть бути зібрані спочатку шляхом виділення спор і кристалів Bt з ферментаційного бульйону способами, добре відомими в даній галузі. Відновлені спори і кристали Bt можуть бути представлені у складах у вигляді змочуваного порошку, рідкого концентрату, гранул, або у вигляді інших складів з додаванням поверхнево-активних речовин, диспергуючих речовин, інертних наповнювачів і інших компонентів для полегшення поводження з ними і їхнього застосування стосовно конкретних цільових комах-шкідників. Такі склади і процедури нанесення добре відомі в даній галузі. Склади. Сформовані гранули-принади, які містять атрактант і спори, кристали і токсини Bt ізолятів, або рекомбінантні мікроби, що містять гени, отримані з Bt ізолятів, розкритих у даному документі, можуть бути внесені в ґрунт. Сформований продукт також може наноситися у вигляді 7 UA 112409 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 покриття на насіння або в процесі обробки коренів або обробки всієї рослини на пізніх стадіях циклу розвитку кукурудзи. Обробка рослин і ґрунту Bt клітинами може виконуватися з використанням змочуваних порошків, гранул або пудри шляхом змішування з різними інертними матеріалами, такими як неорганічні мінерали (філосилікати, карбонати, фосфати і т. п.), або рослинними матеріалами (подрібненою серцевиною кукурудзяного качана, рисовою лузгою, горіховою шкарлупою і т. п.). Сполуки можуть включати адгезивні ад'юванти, стабілізуючі агенти, інші пестицидні добавки або поверхнево-активні речовини. Рідкі сполуки можуть бути водними або неводними і можуть застосовуватися у вигляді пін, гелів, суспензій, емульгованих концентратів і т. п. Інгредієнти можуть включати реологічні агенти, поверхнево-активні речовини, емульгатори або полімери. Як добре відомо фахівцю в даній галузі, пестицидна концентрація може варіювати в широких межах залежно від природи конкретної композиції, зокрема, від того, чи буде вона являти собою концентрат або чи буде використовуватися безпосередньо. Пестицид може бути присутнім щонайменше в кількості 1 ваг. % і може складати 100 % ваги композиції. Сухі композиції можуть містити пестицид у кількості приблизно від 1 до 95 ваг. %, у той час як рідкі сполуки, як правило, можуть містити приблизно від 1 до 60 ваг. % твердої речовини в рідкій 2 4 фазі. Композиції, як правило, можуть містити приблизно від 10 до 10 клітин/мг. Ці склади застосовуються в кількості від приблизно 50 мг (у рідкому або сухому вигляді) до 1 кг або більше на гектар. Склади можуть наноситися на середовище проживання лускокрилої комахи-шкідника, наприклад на листя або на ґрунт, шляхом зрошування, обпилювання, оббризкування і т. п. Трансформація рослин. Переважним рекомбінантним хазяїном для продукування білків за винаходом, що мають інсектицидну дію, є трансформована рослина. Гени, що кодують білки Bt токсину, як це розкрито в даному документі, можуть бути введені в клітини рослини множиною різних методів, що добре відомі в даній галузі техніки. Наприклад, для підготовки до введення чужорідних генів у вищі рослини доступна множина клонуючих векторів, що містять реплікаційну систему Escherichia coli і маркер, що забезпечує можливість відбору трансформованих клітин. У число таких векторів входять, крім інших, pBR322, pUC серія, M13mp серія і pACYC184. Відповідно, фрагмент ДНК, що містить послідовність, яка кодує білок Bt токсину, може бути вставлений у вектор у придатному сайті рестрикції. Отримана в результаті плазміда використовується для трансформації в E. coli. Клітини E. coli культивують у придатному поживному середовищі потім збирають і лізують. Плазміди виділяють. Як способи аналізу звичайно використовують секвенування, рестрикційний аналіз, електрофорез і інші біохімічні і молекулярно-біологічні способи. Після кожної операції використана ДНК-послідовність може бути відщеплена і приєднана до наступної ДНК-послідовності. Кожна плазмідна послідовність може бути клонована в тих же або інших плазмідах. Залежно від способу введення в рослину бажаних генів, також можуть бути необхідні інші ДНК-послідовності. Наприклад, якщо для трансформації клітини рослини використовуються плазміди Ti або Ri, то щонайменше правий кінець, а часто як правий, так і лівий кінці Ti або Ri плазмідної Т-ДНК, повинні бути приєднані як фланкуючі області, призначені для вставки генів. Використання Т-ДНК для трансформації клітин рослин докладно досліджене і вичерпно розкрито в EP 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986) і An et al., (1985) і є добре відомим у даній галузі техніки. Після того як уведена ДНК інтегрується в геном рослини, вона стає щодо стабільною. Трансформаційний вектор звичайно містить маркер, який забезпечує можливість відбору, що забезпечує стійкість трансформованої клітини рослини до біоциду або антибіотика, такому як, наприклад, Біалафос, Канаміцин, G418, Блеоміцин або Гігроміцин. Окремо використовуваний маркер повинен, відповідно, забезпечувати відбір трансформованих клітин, а не тих клітин, що не містять ДНК, яка вводиться. Існує множина способів уведення ДНК у рослинну клітину-хазяїна. Ці способи включають трансформацію за допомогою Т-ДНК, використовуючи Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як трансформуючий агент, злиття, ін'єкцію, біолістику (бомбардування мікрочастинками) або електропорацію, а також інші можливі способи. Якщо для трансформації використовуються Agrobacteria, призначена для введення ДНК повинна бути клонована в спеціальні плазміди, а саме, або в проміжний вектор, або в бінарний вектор. Проміжні вектори можуть бути вбудовані в Ti або Ri плазміду методом гомологічної рекомбінації завдяки послідовностям, які гомологічні послідовностям у Т-ДНК. Ti або Ri плазміди також містять virділянку, необхідну для перенесення Т-ДНК. Проміжні вектори не можуть самореплікуватися в Agrobacteria. Проміжний вектор може бути перенесений у Agrobacterium tumefaciens за допомогою плазміди-хелпера (кон'югація). Бінарні вектори можуть самореплікуватися як у E. coli, так і в Agrobacteria. Вони містять ген маркера селекції і лінкер або полілінкер, який 8 UA 112409 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обмежений ділянками правої і лівої меж Т-ДНК. Вони можуть бути трансформовані безпосередньо в Agrobacteria (Holsters et al., 1978). Agrobacteria, використовувані як клітинихазяї, повинні містити плазміду, що несе vir-ділянку. Vir-ділянка необхідна для перенесення ТДНК у клітину рослини. Також можуть міститися додаткові Т-ДНК. Трансформовані в такий спосіб бактерії використовуються для трансформації клітин рослини. Для перенесення ДНК у клітину рослини рослинні експлантанти можна переважно культивувати з Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes. Потім з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, частин листя, сегментів стебла, коренів, а також з протопластів або клітин, культивованих у суспензії) у придатному середовищі, що може містити антибіотики або біоциди для селекції, може бути регенерована ціла рослина. Отримані в такий спосіб рослини потім можуть бути досліджені на наявність упровадженої ДНК. У випадку ін'єкції або електропорації до плазмід не пред'являється ніяких додаткових вимог. Можливе використання звичайних плазмід, таких як, наприклад, похідні від pUC. Трансформовані клітини ростуть у рослинах звичайним чином. Вони можуть формувати зародкові клітини і передавати трансформовану ознаку(и) рослинам-нащадкам. Такі рослини можна вирощувати звичайним способом і схрещувати з рослинами, що мають такі ж трансформовані спадкоємні фактори або інші спадкоємні фактори. Отримані в результаті гібридні особи мають відповідні фенотипічні властивості. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, рослини трансформують генами, у яких використання кодона оптимізоване для рослин. Див., наприклад, патент США № 5380831, включений у даний документ у вигляді посилання. Хоча в даному документі як приклади приведені укорочені токсини, в ділянці використання Bt добре відомо, що 130 кДа (повнорозмірні) токсини мають N-кінцеву половину, що є ядром токсину, і С-кінцеву половину, що являє собою "хвіст" протоксину. Таким чином, з укороченими/ядерними токсинами за даним винаходом можна використовувати придатні "хвости". Див., наприклад, патент США № 6218188 і патент США № 6673990. Крім цього, способи створення синтетичних Bt генів для використання в рослинах відомі в даній галузі техніки (Stewart and Burgin, 2007). Одним з необмежувальних прикладів трансформованої рослини є плодоносна рослина маїсу, що містить експресований рослиною ген, який кодує білок Cry1Da, і додатково містить експресований рослиною ген, який кодує білок Cry1Са. Перенесення (або інтрогресія) ознаки(ознак), що визначається Cry1Da і Cry1Са, в інбредні лінії маїсу може досягатися шляхом виведення рослин на основі рекурентного відбору, наприклад, шляхом зворотного схрещування. У цьому випадку, бажаний рекурентний батько спочатку схрещується з донорною інбредною особиною (нерекурентним батьком), що несе придатний ген(и) для ознак, які визначаються Cry1D і Cry1C. Потім потомство від цього зворотного схрещування спарюють з рекурентним батьком з наступним відбором отриманого потомства на предмет бажаної ознаки(ознак), яка повинна бути перенесена від нерекурентного батька. Після трьох, переважно, чотирьох, більш переважно, п'яти або більше поколінь, отриманих методом зворотного схрещування з рекурентним батьком і в результаті відбору по бажаній ознаці(ознаках), потомство стає гетерозиготним по локусу, що контролює переносиму ознаку(ознаки), але залишається подібною до рекурентного батька по більшості або майже по всіх інших генах (див., наприклад, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376). Стратегії керування стійкістю комах (IRM). Наприклад, Roush et al. описує стратегії з двома токсинами, так зване створення "пірамід" або "пакетів", для керування трансгенними рослинами, що мають інсектицидні властивості. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786). На іншому веб-сайті Агентство США по захисту навколишнього середовища (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) опублікувало наступні вимоги для забезпечення нетрансгенних (тобто, які не містять Bt генів) сховищ (рефугій) (розділ зернові культури/кукурудза, які не містять Bt генів) для використання з трансгенними зерновими культурами, які продукують один Bt білок, активний стосовно цільових комах-шкідників. "Конкретні структуровані вимоги до кукурудзи, захищеної від метелика кукурудзяного білками Bt (Cry1Ab або Cry1F) є наступними: Структуровані сховища: 20 % сховище з кукурудзи, що не має Bt захисту від лускокрилих в областях, де кукурудза є основною культурою; 50 % сховище з рослин, що не мають Bt захисту від лускокрилих, в областях, де бавовна є основною культурою; Блоки Внутрішні (тобто усередині Bt полю) 9 UA 112409 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зовнішні (тобто окремі поля в межах 1/2 милі (1/4 милі, якщо можливо) від Bt полю для забезпечення максимального об'єму випадкового спарювання) Розташовані на полі смуги Смуги повинні мати щонайменше 4 ряди в ширину (переважно 6 рядів) для зменшення ефекту переміщення личинок". Крім цього, Національна Асоціація Виробників Кукурудзи на своєму веб-сайті (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) також представила схожі рекомендації відносно вимог до сховищ. Наприклад: "Вимоги відносно IRM для метелика кукурудзяного: - Засівати щонайменше 20 % від площі посіву кукурудзи під гібриди-сховища - У регіонах, що вирощують бавовну, сховища повинні складати 50 % - Посіви необхідно висаджувати в межах 1/2 милі від гібридів-сховищ - Сховища можна засівати у вигляді смуг усередині Bt полю; смуги-сховища повинні складати щонайменше 4 ряди в ширину - Сховища можуть оброблятися звичайними пестицидами тільки у випадку досягнення економічного порога, що досягається для цільової комахи - Основані на Bt розпилювані інсектициди не можна використовувати відносно кукурудзисховища - Придатні сховища необхідно висаджувати на кожній фермі з Bt кукурудзою.” Як вказано в Roush et al. (наприклад, на стор. 1780 і 1784, правий стовпчик), створення пакетів або пірамід із двох різних білків, кожний з який є активним відносно цільової комахишкідника, і з малою або без перехресної стійкості може забезпечувати можливість використання менших сховищ. Roush указує, що для успішно розробленого пакета розмір сховища менший ніж 10 % може забезпечити ефект по керуванню стійкістю, порівнянний з 50 % сховищем для одиночної (на організованій у вигляді піраміди) ознаки. Для доступних у даний час Bt продуктів кукурудзи Агентство Захисту Навколишнього Середовища США вимагає суттєво меншого об'єму (звичайно 5 %) висаджених структурованих сховищ кукурудзи, що не містить Bt гени, чим у випадку продуктів з єдиною ознакою (звичайно 20 %). Існують різні способи забезпечення IRM ефектів сховищ, включаючи різні геометричні патерни посадок на полях (як уже згадувалося вище) і змішування насіння перед посівом як обговорювалося в Roush et al. (см. вище) і в патенті США № 6551962. Приведені вище процентні співвідношення або близькі до них співвідношення сховищ можуть використовуватися для розглянутих подвійних і потрійних пакетів або пірамід. Для потрійних пакетів із трьома місцями дії у однієї цільової комахи-шкідника цільовим значенням є нульова площа сховища (або сховище із площею, наприклад, менше 5 %). Це особливо вірно для комерційних посівних площ, наприклад, більших ніж 10 акрів. Усі патенти, заявки на патент, попередні заявки і публікації, на які приведені посилання або які цитуються в даному документі, включені у вигляді посилання у всій своїй повноті в тій частині, у якій вони не суперечать даним, які у явному вигляді приводяться в даному описі. За винятком випадків, коли це спеціально обговорено або випливає з контексту, граматичні форми однини варто розуміти як такі, що означають "щонайменше один". Нижче приведені приклади, що ілюструють способи здійснення винаходу. Ці приклади не слід розглядати як обмежувальні. Усі процентні співвідношення вказані по масі, а співвідношення в розчинах вказані по об'єму Усі температури вказані в градусах Цельсія. Приклади 125 Приклад 1- I Мічення Cry білків Йодування Cry токсинів. Очищені укорочені Cry токсини йодували, використовуючи IodoBeads або IODOGEN (Pierce). Коротко, дві Iodo-Beads двічі промивали 500 мкл забуференого фосфатом розсолу, PBS (20 мМ фосфату натрію, 0,15 M NaCl, pН 7,5), і поміщали в 1,5 мл центрифугальну пробірку за свинцевим екраном. Додавали 100 мкл PBS. У тубус, використовуючи відповідні способи роботи з радіоактивними речовинами, у PBS розчин з Iodo125 Beads додавали 0,5 мКі Na I (17,4 Кі/мг, Lot 0114, Amersham). Реакцію між компонентами проводили протягом 5 хвилин при кімнатній температурі, потім у цей розчин додавали 2-25 мкг укороченого Cry білка високої чистоти і проводили реакцію протягом наступних 3-5 хвилин. Реакцію зупиняли шляхом видалення розчину з Iodo-Beads і введення його в 0,5 мл центрифугальну колонку Zeba для знесолювання (InVitrogen), урівноважену PBS. Кожну з IodoBeads двічі промивали по 10 мкл PBS, і промивний розчин також вносили в колонку для знесолення. Радіоактивний розчин елюювали, використовуючи колонку для знесолення, центрифугуванням при 1000x g протягом 2 хв. У випадку Cry1Da, для виконання процедури по введенню радіоактивної мітки використовували спосіб IODOGEN. Використовуючи цю 10 UA 112409 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 процедуру, Сry токсин у 100 мМ фосфатному буфері (pН 8) спочатку очищали від ліпополісахаридів (ЛПС), пропускаючи його декілька разів через невелику 0,5 мл колонку на основі поліміксину. У пробірку IODOGEN (Pierce Chem. Co.) додавали 20 мкг Cry1Da токсину, що 125 не містить ЛПС, а потім 0,5 мКі Na I. Реакційну суміш струшували протягом 15 хв при 25 °C. Розчин із пробірки видаляли, і для зупинки реакції додавали 50 мкл 0,2 М нерадіоактивного NaI. Білок діалізували проти PBS, три рази змінюючи буфер, для видалення будь-якого незв'язаного 125 I. Радіоактивну чистоту йодованих Cry білків визначали методами ДСН-ПААГ електрофорезу, формування зображення на люмінесцентному покритті і підрахунку гамма подій. Коротко, 2 мкл радіоактивні білки виділяли методом ДСН-ПААГ електрофорезу. Після виділення гелі сушили в пристрої для сушіння гелів BioRad відповідно до інструкції виробника. Зображення висушених гелів одержували шляхом обгортання їх плівкою Mylar (товщиною 12 мкм) і експонування протягом 1 години під люмінесцентним екраном Molecular Dynamics (35 см × 43 см) із тривалим післясвітінням. Пластини проявляли на люмінесцентному пристрої візуалізації Molecular Dynamics Storm 820, і зображення аналізували за допомогою програмного забезпечення ImageQuant™. Радіоактивну смугу разом з ділянками, розташованими безпосередньо вище і нижче цієї смуги, вирізували з гелю лезом бритви, і здійснювали підрахунок подій за допомогою гамма-лічильника. Радіоактивність детектували тільки в смузі, що відповідає Cry білку, і в ділянках, розташованих нижче цієї смуги. Відсутність радіоактивності в ділянках, розташованих вище смуги, указувало на те, що всі радіоактивні речовини складалися з компонентів білка, більш дрібних у порівнянні з укороченим Cry білком. Ці компоненти, найбільш імовірно, являли собою продукти розпаду. Приклад 2 - Протокол одержання BBMV Одержання і фракціонування розчиненого BBMV. Личинок Spodoptera frugiperda, Ostrinia nubilalis або Heleothis zea на останній віковій стадії витримували без їжі всю ніч, а потім ранком препарували після охолодження на льоду протягом 15 хвилин. З порожнини тіла видаляли тканину середньої кишки, залишаючи розташовану позаду задню кишку, прикріплену до зовнішнього покриву. Середню кишку вміщували в 9X об'єм охолодженого льодом буфера для гомогенізації (300 мМ маніту, 5 мМ EGTA, 17 мМ основи Тріс, pН 7,5), доповненого коктейлем інгібіторів протеаз (Sigma P-2714), розведеним відповідно до рекомендацій постачальника. (Кінцева концентрація компонентів коктейлю (у мкМ) складає AEBSF (500), ЕДТА (250 мМ), бестатин (32), Е-64 (0,35), лейпептин (0,25) і апротинін (0,075)). Тканину гомогенізували 15 ударами, використовуючи скляний гомогенізатор тканин. BBMV одержували преципітацією MgCl2 по методу Wolfersberger (1993). Коротко, однаковий об'єм 24 мМ розчину MgCl 2 у 300 мМ маніту змішували з гомогенатом середньої кишки, перемішували протягом 5 хвилин і вистоювали на льоду протягом 15 хв. Розчин центрифугували при 2500x g протягом 15 хв при 4 °C. Супернатант зберігали, а осад суспендували у вихідному об'ємі 0,5X розведеного буфера для гомогенізації і знову центрифугували. Два супернатанти об'єднували, центрифугували при 27000x g протягом 30 хв при 4 °C для одержання фракції BBMV. Осад суспендували в 10 мл буфера для гомогенізації, додавали до інгібіторів протеаз і знову центрифугували при 27000x g протягом 30 хв при 4 °C для промивання BBMV. Отриманий осад суспендували в буфері для збереження BBMV (10 мМ HEPES, 130 мМ KCl, 10 % гліцерину, pН 7,4) до одержання концентрації білка приблизно 3 мг/мл. Концентрацію білка визначали методом Бредфорда (Bradford, 1976), використовуючи бичачий сироватковий альбумін (BSA) як стандарт. Перед заморожуванням зразків визначали активність лужної фосфатази методом аналізу Sigma відповідно до інструкції виробника. Питома активність маркерного ферменту у фракції BBMV, як правило, у 7 разів перевищувала активність, визначену у фракції гомогенату середньої кишки. BBMV фасували по 250 мкл, швидко заморожували в рідкому N2, і зберігали при -80 °C. 125 Приклад 3 - Спосіб вимірювання зв'язування I Cry білків з BBMV білками 125 Зв'язування I Cry білків з BBMV. Для визначення оптимальної кількості білка BBMV для 125 використання в аналізі зв'язування будували криву насичення. I-мічений Cry білок (0,5 нМ) інкубували протягом 1 години при 28 °C з різними кількостями білка BBMV у межах від 0 до 500 мкг/мл у буфері для зв'язування (8 мМ NaHPО 4, 2 мМ ΚH2ΡО4, 150 мМ NaCl, 0,1 % бичачого 125 сироваткового альбуміну, pН 7,4). Загальний об'єм складав 0,5 мл. Зв'язаний I-Cry білок відділяли від незв'язаного шляхом перенесення 150 мкл зразка реакційної суміші в трьох екземплярах з 1,5 мл центрифугальної пробірки в 500 мкл центрифугальну пробірку і центрифугування зразків при 14000x g протягом 6 хвилин при кімнатній температурі. Супернатант дбайливо видаляли, а осад дбайливо промивали три рази охолодженим льодом буфером для зв'язування. Дно центрифугальної пробірки з осадом, що знаходиться в ньому, відрізали і поміщали в 13×75-мм скляну культуральну пробірку. У кожному зразку підраховували 11 UA 112409 C2 5 10 15 20 25 30 події гамма-лічильником протягом 5 хвилин. Число подій, визначених у зразку, віднімали з кількості фонових подій (реакція без білка) і наносили на графік залежно від концентрації білка BBMV. Оптимальна для використання кількість білка була визначена як рівна 0,15 мг/мл BBMV білка. Для визначення кінетичних характеристик зв'язування будували криву насичення. Коротко, 125 BBMV (150 мкг/мл) інкубували протягом 1 години при 28 °C з I-Cry токсином, узятим при різних концентраціях, що збільшуються в межах від 0,01 до 10 нМ. Загальне зв'язування визначали, шляхом троєкратного відбору по 150 мкл кожної концентрації, центрифугування і підрахунку подій, як описано вище. Неспецифічне зв'язування визначали таким же способом, при цьому в реакційну суміш додавали 1000 нМ гомологічного трипсинізованого нерадіоактивного Cry токсину до насичення всіх неспецифічних сайтів зв'язування з рецепторами. Специфічне зв'язування обчислювали у вигляді різниці між загальним зв'язуванням і неспецифічним зв'язуванням. Аналіз конкурентного гомологічного і гетерологічного зв'язування виконували, 125 використовуючи 150 мкг/мл BBMV білка і 0,5 нМ Cry білка з радіоактивною I міткою. Конкурентний немічений Cry токсин додавали в реакційну суміш у концентраціях, що змінюються від 0,045 до 1000 нМ, і в той же самий час додавали радіоактивний ліганд для забезпечення справжнього конкурентного зв'язування. Інкубували протягом 1 години при 28 °C, і 125 вимірювали кількість I-Cry білка, зв'язаного з рецептором токсину, як описано вище, з вирахуванням неспецифічного зв'язування. Стопроцентне загальне зв'язування визначали під час відсутності всіх конкурентних лігандів. Результати представлені у вигляді графіка з використанням напівлогарифмічної шкали у вигляді залежності вираженого у відсотках загального специфічного зв'язування від концентрації доданого конкурентного ліганду. Приклад 4 - Короткий огляд результатів На Фіг. 1 показана залежність вираженого у відсотках загального специфічного зв'язування 125 I Cry1Da (0,5 нМ) з BBMV, виділеним з FAW, від ступеня конкуренції з неміченими гомологічним Cry1Da (○) і гетерологічним Cry1Ca ( ). Крива заміщення для гомологічної конкуренції з Cry1Da має вигляд сигмоїдальної кривої, що показує 50 % заміщення радіоактивно 125 міченого ліганду при приблизно 1,5 нМ Cry1Da. Cry1Ca не зміщує специфічне зв'язування I Cry1Da ні при якій з досліджених концентрацій, аж до 1000 нМ, що в 2000 разів більше 125 концентрації I Cry1Da, використаної в аналізі. 12 UA 112409 C2 Джерела інформації: 13 UA 112409 C2 14 UA 112409 C2 15 UA 112409 C2 16 UA 112409 C2 17 UA 112409 C2 18 UA 112409 C2 19 UA 112409 C2 20 UA 112409 C2 21 UA 112409 C2 22 UA 112409 C2 23 UA 112409 C2 24 UA 112409 C2 25 UA 112409 C2 26 UA 112409 C2 27 UA 112409 C2 28