Трансгенна рослина, яка містить днк, що кодує інсектицидний білок сry1ca, і днк, що кодує інсектицидний білок сry1fa, для вироблення резистентності до комах
Номер патенту: 112156
Опубліковано: 10.08.2016
Автори: Нарва Кеннет, Вуслі Аарон Т., Мід Томас, Сторер Ніколас П., Бертон Стефані Л., Шитс Джоел Дж.
Формула / Реферат
1. Трансгенна рослина, яка містить ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Cа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Fа.
2. Трансгенне насіння рослини за п. 1, яке містить ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Cа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Fа.
3. Трансгенна рослина за п. 1, де ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Cа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Fа, були введені у вказану рослину шляхом інтрогресії.
4. Трансгенне насіння рослини за п. 3, яке містить ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Cа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Fа.
5. Сукупність рослин в полі, що містить не-Bacillus thuringientis (не-Bt) рослини-сховища, які не експресують трансгенні інсектицидні білки, і сукупність трансгенних рослин за п. 1, де вказані трансгенні рослини містять ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Cа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Fа, де вказані не-Bt рослини-сховища складають менше ніж 40 % від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.
6. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 30 % від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.
7. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 20 % від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.
8. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 10 % від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.
9. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 5 % від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.
10. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища розташовані у вигляді блоків або смуг.
11. Суміш насіння, що містить насіння не-Bt рослин-сховищ і сукупність трансгенного насіння за п. 4, яке містить ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Cа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Fа, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 40 % від всього насіння у вказаній суміші.
12. Суміш насіння за п. 11, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 30 % від всього насіння у вказаній суміші.
13. Суміш насіння за п. 11, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 20 % від всього насіння у вказаній суміші.
14. Суміш насіння за п. 11, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 10 % від всього насіння у вказаній суміші.
15. Суміш насіння за п. 11, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 5 % від всього насіння у вказаній суміші.
16. Спосіб запобігання виробленню у комахи совки трав′яної (FAW; Spodoptera frugiperda) резистентності до токсину Cry, де вказаний спосіб включає висівання насіння для отримання сукупності трансгенних рослин, які містять ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Cа, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Fа, і контактування вказаної комахи з указаною сукупністю трансгенних рослин.
17. Трансгенна рослина за п. 1, де вказана рослина також включає ДНК, що кодує білок, який містить коровий токсин Cry1Ab.
18. Сукупність рослин в полі, що містить не-Bt рослини-сховища і сукупність трансгенних рослин за п. 17, де вказані рослини-сховища складають приблизно менше ніж 20 % від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.
19. Сукупність рослин в полі, що містить не-Bt рослини-сховища і сукупність рослин за п. 17, де вказана сукупність рослин-сховищ складає приблизно менше ніж 10 % від всіх сільськогосподарських культур на вказаному полі.
20. Спосіб запобігання виробленню у комахи совки трав′яної резистентності до токсину Cry, де вказаний спосіб включає висівання насіння для отримання сукупності рослин за п. 19 і контактування вказаної комахи з указаною сукупністю трансгенних рослин.
21. Композиція для боротьби з лускокрилими шкідниками, що містить клітини, які експресують інсектицидно активну кількість білка, що містить коровий токсин Cry1Fа, і білка, що містить коровий токсин Cry1Cа.
22. Композиція за п. 21, що містить хазяїна, трансформованого так, щоб він експресував білок, що містить коровий токсин Cry1Fа, і білок, що містить коровий токсин Cry1Cа, де вказаним хазяїном є мікроорганізм або клітина рослини.
23. Спосіб боротьби з лускокрилими шкідниками, що включає обробку вказаних шкідників або середовища проживання цих шкідників інсектицидно активною кількістю композиції за п. 21.
24. Трансгенна рослина, що продукує білок Cry1Fa плюс білок Cry1Ca, плюс третій білок, вибраний з групи, що складається з білків Vip3A, Cry1D, Cry1Be і Cry1E.
25. Спосіб запобігання виробленню у комахи совки трав′яної резистентності до токсину Cry, де вказаний спосіб включає висівання насіння для отримання сукупності рослин за п. 24, і контактування вказаної комахи з указаною сукупністю трансгенних рослин.
26. Сукупність рослин в полі, що містить не-Bt рослини-сховища і сукупність трансгенних рослин за п. 24, де вказані не-Bt рослини-сховища складають менше ніж приблизно 10 % від всіх сільськогосподарських культур в указаній сукупності рослин.
27. Сукупність рослин за п. 26, де вказана сукупність рослин містить менше ніж 5 % рослин-сховищ.
28. Спосіб запобігання виробленню у комахи совки трав′яної резистентності до токсину Cry, де вказаний спосіб включає висівання насіння для отримання сукупності рослин за п. 26 або 27 і контактування вказаної комахи з указаною сукупністю трансгенних рослин.
29. Суміш насіння, що містить насіння не-Bt рослин-сховищ і сукупність трансгенного насіння рослин за п. 24, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 10 % від всього насіння у вказаній суміші.
30. Сукупність рослин за будь-яким з пп. 5, 18 і 26, де вказані рослини займають площу понад 10 акрів.
31. Трансгенна рослина за будь-яким з пп. 1, 17 і 24, де вказана рослина вибрана з групи, що складається з кукурудзи, сої і бавовнику.
32. Трансгенна рослина за будь-яким з пп. 1, 17 і 24, де вказаною рослиною є рослина кукурудзи.
33. Клітина рослини за будь-яким з пп. 1, 17, 31 і 32, де вказана клітина рослини містить вказану ДНК, що кодує вказаний інсектицидний білок Cry1Cа, і вказану ДНК, що кодує вказаний інсектицидний білок Cry1Fа, і де вказаний інсектицидний білок Cry1Fа щонайменше на 99 % ідентичний послідовності SEQ ID NO:4, а вказаний інсектицидний білок Cry1Cа щонайменше на 99 % ідентичний послідовності SEQ ID NO:5.
34. Трансгенна рослина за будь-яким з пп. 1, 17, 24, 31 і 32, де вказаний інсектицидний білок Cry1Fа містить SEQ ID NO:4, а вказаний інсектицидний білок Cry1Cа містить SEQ ID NO:5.
Текст
Реферат: Даний винахід описує рослини, стійкі до лускокрилих шкідників, та способи боротьби з цими шкідниками, де вказані рослини містять інсектицидний білок Cry1Fa і інсектицидний білок Сrу1Са. Запропонований винахід дозволяє сповільнювати або попереджувати вироблення резистентності у комахи совки трав′яної до токсину Cry. UA 112156 C2 (12) UA 112156 C2 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Попередній рівень техніки Людина вирощує кукурудзу для вживання в їжу і для енергетичних цілей. Людина також вирощує множину інших культур, включаючи сою і бавовну. Комахи поїдають і пошкоджують рослини, і тим самим наносять збиток діяльності людини. Для боротьби з комахами-шкідниками щорічно витрачаються мільярди доларів, і ще мільярди йдуть на відшкодування збитку, що наноситься цими шкідниками. Інсектициди, синтезовані методами органічної хімії, є головним інструментом, що використовується для боротьби з комахами-шкідниками, але в деяких регіонах, в боротьбі з комахами-шкідниками важливу роль грають біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, що походять від Bacillus thuringiensis (Bt). Можливість культивувати резистентні до комах рослини за допомогою трансформації цих рослин генами інсектицидних білків Bt була революцією в сучасному сільському господарстві і довела важливість і цінність інсектицидних білків і їх генів. Деякі білки Bt були використані для створення резистентних до комах трансгенних рослин, які успішно пройшли випробування, і в цей час їх виготовляють в промисловому масштабі. Такими білками є Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F і Cry3Bb, що вводяться в кукурудзу, Cry1Ac і Cry2Ab, що вводяться в бавовну, і Cry3A, що вводиться в картоплю. Комерційно доступні продукти, експресуючі ці білки, експресують тільки один з цих білків, за винятком випадків, коли бажано отримати комбінований інсектицидний спектр з 2 білків (наприклад, в кукурудзі, Cry1Ab і Cry3Bb об'єднані для вироблення резистентності до лускокрилих шкідників і кореневих личинок, відповідно), або випадків, коли незалежна дія цих білків робить їх цінним інструментом для сповільнення розвитку резистентності до інсектицидів у сприйнятливих популяцій комах (наприклад, Cry1Ac і Cry2Ab в бавовнику об'єднують з метою вироблення у рослин резистентності до тютюнової листовійки). Тобто, деякі сорти резистентних до комах трансгенних рослин, які швидко і повсюдно пристосовуються до цієї технології, також мають той недолік, що популяції шкідників виробляють резистентність до інсектицидних білків, що продукується цими рослинами. Було запропоновано декілька стратегій для збереження цінних ознак резистентності до Bt-комах, де вказані стратегії включають використання у високих доз білків в комбінації із збереженням площ "сховищ" нетрансгенних рослин, і чергування або спільного використання різних токсинів (McGaughey et al.(1998), "Bt-Resistance Management" Nature Biotechnol. 16: 144-146). Необхідно, щоб білки, відібрані для використання в IRM-кластерах, мали незалежну інсектицидну дію, при якій резистентність, що виробляється до одного білка, не розповсюджувалася на інший білок (тобто, не спостерігалася перехресна резистентність до білок). Так, наприклад, якщо популяція комах, вибраних на резистентність до "білка А", є сприйнятливою до "білка В", то можна зробити висновок, що в цьому випадку перехресна резистентність відсутня, і комбінація "білок А і білок В" буде ефективною для сповільнення вироблення резистентності до одного білка А. У випадку відсутності популяції резистентних комах, оцінка може бути зроблена виходячи з інших характеристик, які, як передбачається, стосуються механізму дії і можливої перехресної резистентності. Було висловлене припущення, що застосування опосередкованого рецептором зв'язування при ідентифікації інсектицидних білків, очевидно, не буде приводити до вироблення перехресної резистентності. (van Mellaert et al. 1999). Ключовим прогностичним фактором відсутності перехресної резистентності, що з'являється при такому підході, є те, що інсектицидні білки не конкурують за зв'язування з рецепторами у сприйнятливих видів комах. У випадку, коли два токсини Bt конкурують за зв'язування з одним і тим же рецептором, і якщо цей рецептор мутує у комахи так, що один з токсинів більше не зв'язується з цим рецептором, а тому не має інсектицидної дії проти комахи, то така комаха може набувати резистентності до другого токсину (який конкурентно зв'язується з тим же рецептором). Тобто, можна сказати, що така комаха буде мати перехресну резистентність до обох токсинів Bt. Однак якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами,то це означає, що така комаха не має одночасної резистентності до цих двох токсинів. Cry1Fa може бути використаний для боротьби з лускокрилими шкідниками багатьох видів, включаючи європейського кукурудзяного трача (ECB; Ostrinia nubilalis (Hubner)) і совку трав'яну (FAW; Spodoptera frugiperda), і має активність проти бурякового трача (SCB; Diatraea saccharalis). Білок Cry1Fa, що продукується в рослинах кукурудзи, що містять модифікацію TC1507, відповідальний за вироблення ознаки резистентності до комах, і цей білок застосовується у провідних галузях промисловості для боротьби з совкою трав'яною (FAW). Cry1Fa також використовується в продуктах Herculex®, SmartStax™ і WideStrike™. 1 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Можливість провести дослідження на зв'язування з рецептором (конкурентне або гомологічне) з використанням білка Cry1Fa має певні обмеження, оскільки при застосуванні більшості методів мічення білків для детектування в аналізах на зв'язування з рецептором відбувається інактивація інсектицидної активності білка Cry1Fa. Додаткові токсини Cry перераховані На web-сайті офісу Комітету по номенклатурі B.t. (Crickmore et al; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). ДИВ. Додаток А в даній заявці. У цей час відоме приблизно 60 основних груп токсинів "Cry" (Cry1-Cry59), і крім того, існують інші токсини, такі як токсини Cyt і токсини VIP і т. п. Багато токсинів з кожної пронумерованої групи мають підгрупи, позначені великими буквами, а підгрупи, позначені великими буквами, в свою чергу, поділяються на підгрупи (суб-підгрупи), позначені малими буквами (наприклад, Cry1 має підгрупу A-L, а Cry1A має підгрупу a-i). Короткий опис суті винаходу Даний винахід частково оснований на несподіваному виявленні того факту, що популяція трав'яної совки (Spodoptera frugiperda; FAW), відібрана на резистентність до інсектицидної активності білка Cry1Fa, не є резистентною до інсектицидної активності білка Cry1Ca. Для фахівця в даній галузі очевидно, що перевага такого відкриття полягає в тому, що рослини, експресуючі ці два інсектицидні білки або їх інсектицидні частини, можуть бути використані для сповільнення або попередження розвитку резистентності до будь-якого з цих окремо взятих інсектицидних білків. Даний винахід також підтверджується виявленням того факту, що Cry1Fa і Cry1Ca не конкурують один з одним за зв'язування з кишковими рецепторами совки трав'яної (FAW) (або Diatraea saccharalis (бурякового трача; SCB)). Даний винахід також стосується, зокрема, трикомпонентних кластерів або "пірамід" з трьох (або більше) токсинів, де токсини Cry1Fa і Cry1C являє собою базову пару. Одна з переважних пірамід включає щонайменше два білки, що не мають перехресної резистентності до двох шкідників до совки трав'яної і до ECB (Європейського кукурудзяного трача; Ostrinia nubilalis); Cry1Fa плюс Cry1Ca плюс один або декілька анти-ЕСВ токсинів, таких як Cry1Ab. У деяких переважних варіантах піраміди, вибрані токсини мають три різні механізми дії проти FAW. Переважними пірамідними комбінаціями є Cry1Fa плюс Cry1Ca плюс інший токсин/ген, вибраний з групи, що складається з Vip3Ab, Cry1D, Cry1Be і Cry1E. Рослини (і посівні площі, засіяні такими рослинами), які продукують ці три токсини, входять в об'єм даного винаходу. Можуть бути також додані додаткові токсини/гени, але ці конкретні трикомпонентні кластери, відповідно до даного винаходу, будуть, як несподівано було виявлено, переважно діяти проти FAW по трьох механізмах. Це допоможе знизити або взагалі уникнути потреби в площах"сховищах" нетрансгенних культур. У загальних рисах, даний винахід також стосується застосування трьох інсектицидних білків (в деяких переважних варіантах, білків Cry), які не конкурують один з одним проти одного шкідника-мішені. Короткий опис графічного матеріалу Фігура 1: Оцінка ступеня пошкодження кукурудзи, заражені in vitro щойно личинками совки трав'яної, що вилупилися (FAW), і совки трав'яної, резистентної до Cry1F (rFAW). Трансгенні рослини T0, відібрані після трансформації плазмідою pDAS5162, були розділені на дві групи за допомогою імуноблот-скринінгу з використанням антитіла DIG152RPC1: на рослини, які не продукують DIG-109 (на фігурі, з лівого боку), і на рослини, які не мають детектовані рівні DIG109 (в центрі фігури). DIG-109-позитивні рослини ранжували по рівню експресії (зліва направо; від найменшого до найбільшого). НР-аналіз на DSM2 здійснювали на 36 pDAS5162трансформованих лініях. У 95 % зразків була детектована проста подія інтеграції, визначена як 1-2 копії цього гена. Результати біологічного аналізу рослин, що використовуються як позитивний і негативний контроль, представлені на правій стороні фігури. Фігура 2: Конкурування за зв'язування BBMV Spodoptera frugiperda з коровим токсином 125 Cry1Fa, з коровим токсином Cry1Ca і з I-міченим коровим токсином Cry1Ca. Короткий опис послідовностей SEQ ID NO:1 - Химерний білок "коровий Cry1Ca/протоксин Cry1Ab", що складається з 1164 амінокислот (DIG-152) (варіант pMYC2547) SEQ ID NO:2 - Другий химерний білок "коровий Cry1Ca/протоксин Cry1Ab", що складається з 1164 амінокислот (DIG-109) (сорт кукурудзи) SEQ ID NO:3 - Оптимізована для кукурудзи послідовність CDS, що кодує 3492 п. н. DIG-109 SEQ ID NO:4 - коровий токсин Cry1Fa. SEQ ID NO:5 - коровий токсин Cry1Ca. Докладний опис винаходу 2 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як повідомляється в даний заявці, токсин Cry1Ca, що продукується в трансгенній кукурудзі і в інших рослинах (наприклад, в бавовнику і сої), виявляє високу ефективність в боротьбі проти совки трав'яної (FAW; Spodoptera frugiperda), у якої виробляється резистентність до активності Cry1Fa. Таким чином, даний винахід частково оснований на несподіваному виявленні того факту, що совка трав'яна, резистентна до дії Cry1Fa, є сприйнятливою (тобто, не має перехресної резистентності) до дії Cry1Ca. Даний винахід також частково оснований на несподіваному виявленні того факту, що токсин Cry1Ca є ефективним для захисту рослин (таких як рослини кукурудзи) від ураження Cry1Faрезистентної совки трав'яної. Обговорення цього шкідника приводиться, наприклад, в публікації Tabashnik, PNAS (2008), vol. 105 no. 49, 19029-19030. Даний винахід включає застосування токсину Cry1Ca для захисту кукурудзи і інших економічно цінних видів рослин від ураження шкідниками і зниження врожайності, що викликається поїданням цих рослин совкою трав'яною або популяціями совки трав'яної, у яких виробляється резистентність до Cry1Fa. Даний винахід також стосується кластера IRM, що використовується для попередження або сповільнення розвитку резистентності совки трав'яної до Cry1Fa і/або Cry1Ca. Даний винахід також стосується композицій, що використовуються для боротьби з лускокрилими шкідниками, в клітинах яких продукується білок, що містить коровий токсин Cry1Fa, і білок, що містить коровий токсин Cry1Ca. Даний винахід також стосується хазяїна, трансформованого так, щоб він продукував білок, що містить коровий токсин Cry1Fa, і білок, що містить коровий токсин Cry1Ca, де вказаним хазяїном є клітина мікроорганізму або рослини. Полінуклеотид(и), що розглядається(ються) переважно присутній(і) в генетичній конструкції під контролем промотору, що не є промотором Bacillus thuringiensis (функціонально приєднаний(і) до цього промотору/містить(ять) цей промотор). Полінуклеотиди, що розглядаються, можуть містити звичайно кодони, що зустрічаються в цій рослині, сприяючі підвищенню рівня експресії в рослині. Даний винахід також стосується способу боротьби з лускокрилими шкідниками, що включає контактування вказаних шкідників або середовища їх проживання з ефективною кількістю композиції, що містить білок, який включає коровий токсин Cry1Fa, а також білок, який включає коровий токсин Cry1Ca. У одному зі своїх варіантів, даний винахід стосується рослини кукурудзи (і інших рослин, наприклад, бавовнику і сої), що включає експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Cry1Ca, і експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Cry1Fa, і насіння такої рослини. У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується рослини кукурудзи (і інших рослин, наприклад, бавовнику і сої), де експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Cry1Ca, і експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Cry1Fa, були введені у вказані рослини кукурудзи і в насіння таких рослин шляхом інтрогресії. (Опис Cry1C, що використовується в рослинах як потенційний біоісектицид, приводиться в публікації Avisar et al. 2009). Avisar D, Eilenberg Н, Keller M, Reznik N, Segal M, Sneh В, Zilberstein А (2009) The Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cry1C as а potential bioinsecticide in plants. Plant Science 176:315-324). Рецептори комах. Як описано в прикладах, дослідження на конкурентне зв'язування з рецептором, що проводиться з використанням радіоактивно міченого білка корового токсину Cry1Ca, показало, що цей білок корового токсину Cry1Fa не конкурує за високоафінне зв'язування з сайтом, присутнім в тканинах комахи FAW, з яким зв'язується Cry1Ca. Ці результати показали, що комбінація білків Cry1Fa і Cry1Ca являє собою ефективний засіб для послаблення вироблення резистентності у популяції FAW до Cry1Fa (і аналогічно, для послаблення вироблення резистентності до Cry1Ca), а також для підвищення рівня резистентності рослин кукурудзи, експресуючих обидва ці білки, до вказаного шкідника. Таким чином, частково на основі даних, описаних вище, і даних, представлених в літературі, можна зробити висновок, що спільне продукування (у вигляді кластера)білків Cry1Ca і Cry1Fa може бути застосоване для отримання високої дози IRM-кластера, що використовується для боротьби з FAW. У цю комбінацію можуть бути додані і інші білки для розширення спектра комах-шкідників, що знищуються. Так, наприклад, для кукурудзи, додавання Cry1Ab дозволить створити IRM-піраміду, що використовується для боротьби з європейським кукурудзяним трачем. У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується застосування одного або двох білків Cry1Fa і Cry1Ca в комбінації з білком Cry1Ab для послаблення вироблення резистентності у 3 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 комах. Таким чином, в іншому своєму варіанті, даний винахід стосується застосування одного або двох білків Cry1Fa і Cry1Ca в сільськогосподарських регіонах, в яких застосування білка Cry1Ab стає неефективним для боротьби зі буряковим трачем, що зумовлено розвитком резистентності у таких популяцій шкідників. Відповідно до цього, переважного "трикомпонентного кластера" або "пірамідної" комбінації, що застосовується відповідно до даного винаходу, є Cry1F плюс Cry1C плюс Cry1Ab. Даний винахід також стосується, зокрема, трикомпонентних кластерів або "пірамід" з трьох (або більше) токсинів, де токсини Cry1Fa і Cry1C являє собою базову пару. Одна з переважних пірамід включає щонайменше два білки, що не мають перехресної резистентності до двох шкідників - до FAW і до ECB (Європейського кукурудзяного трача; Ostrinia nubilalis); Cry1Fa плюс Cry1Ca плюс один або декілька анти-ЕСВ токсинів, таких як Cry1Ab (див. заявку США 20080311096), оскільки Cry1F має активність проти обох комах. Іншими токсинами проти ECB є Cry1Be (див. заявку США реєстр. № 61/284290, подану 16 грудня, 2009), Cry II (див. заявку США реєстр. № 61/284278, подану 16 грудня, 2009), Cry2Aa (див. заявку США реєстр. № 61/284278, подану 16 грудня 2009) і DIG-3 (див. заявку США 201000269223). У деяких переважних варіантах "піраміди", вибрані токсини мають три різні механізми дії проти FAW, і такими переважними пірамідними комбінаціями є Cry1Fa плюс Cry1Ca плюс інший токсин/ген, вибраний з групи, що складається з Vip3Ab, Cry1D (див. заявку США реєстр. № 61/284252, подану 16 грудня, 2009), Cry1Be і Cry1E (див. заявку США реєстр. № 61/284278, подану 16 грудня 2009). Рослини (і посівні площі, засіяні такими рослинами), які продукують ці три токсини, входять в об'єм даного винаходу. Можуть бути також додані додаткові токсини/гени, і ці конкретні трикомпонентні кластери, відповідно до даного винаходу, будуть, як несподівано було виявлено, переважно діяти проти FAW по трьох механізмах. Це дозволяє знизити або уникнути потреби в площах-"сховищах" нетрансгенних культур. Таким чином, в даному винаході розглядається висівна площа понад 10 акрів. Інші токсини, наприклад, Vip3, перераховані в Додатку А. Ці номери GENBANK можуть бути також використані для ідентифікації послідовностей будь-яких описаних і згаданих тут генів і білків. У патенті США No. 5188960 і в патенті США No. 5827514 описані білки, які містять коровий токсин Cry1Fa, і які можуть бути використані для здійснення даного винаходу. У патенті США № 6218188 описані оптимізовані для рослини послідовності ДНК, що кодують білки, які містять коровий токсин Cry1Fa, і які можуть бути використані в даному винаході. Комбінації токсинів, описаних в даному винаході, можуть бути використані для боротьби з лускокрилими шкідниками. Дорослі лускокрилі, наприклад, метелики і молі, харчуються, головним чином, нектаром і відіграють значну роль в запиленні. Майже всі личинки лускокрилих, тобто, гусениці, поїдають рослини, і багато з них є небезпечними шкідниками. Гусениці живуть на листі або поїдають внутрішню частину листя, або вони пошкоджують коріння або стебла рослини, що приводить до виснаження поживних речовин у рослини, і в більшості випадків, до руйнування основної фізичної структури рослини. Крім того, гусениці пошкоджують плоди, тканини і зерно, що зберігається, і борошно, в результаті чого продукти або взагалі стають непридатними для продажу, або їх комерційна цінність значно знижується. Використовуваний тут термін "лускокрилі шкідники" також стосується різних стадій життєвого циклу шкідника, включаючи стадії розвитку личинок. Деякі химерні токсини згідно з винаходом містять повнорозмірну частину N-кінцевого корового токсину Bt, і в певному положенні, розташованому за межами частини корового токсину, цей білок переходить в гетерологічну послідовність протоксину. N-кінцева, інсектицидно активна частина токсину Bt називається "коровим токсином". Перехід від корового сегмента токсину в гетерологічний сегмент протоксину може відбуватися приблизно в області стику токсин/протоксин, або альтернативно, частина нативного протоксину (що простягається за межі коровою частини токсину) може зберігатися, причому, перехід в гетерологічну частину протоксину може відбуватися нижче. Одним з прикладів може служити один химерний токсин згідно з винаходом, який являє собою повнорозмірну частину корового токсину Cry1Fa (амінокислоти 1-601) і гетерологічний протоксин (амінокислоти від положення 602 до С-кінця). У одному переважному варіанті винаходу, частина химерного токсину, що містить протоксин, походить від токсину білка Cry1Ab. Другим прикладом може служити другий химерний токсин згідно з винаходом, який описаний в SEQ ID NO:l і являє собою частину повнорозмірного корового токсину Cry1Ca (амінокислоти 1619) і гетерологічний протоксин (амінокислоти від положення 620 до С-кінця). У переважному варіанті винаходу, частина химерного токсину, що містить протоксин, походить від токсину білка Cry1Ab. 4 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для фахівців в даній галузі очевидно, що токсини Bt, навіть токсини, які належать до певного класу, такого як Cry1F, можуть до деякої міри варіюватися по своїй довжині і точній локалізації переходу від частини корового токсину в частину протоксину. Звичайно, токсини Cry1Ca і Cry1Fa мають довжину приблизно від 1150 до 1200 амінокислот. Перехід від частини корового токсину в частину протоксину звичайно відбувається на ділянці між частинами, що складають приблизно від 50 % і приблизно до 60 % від всієї довжини токсину. Химерний токсин згідно з винаходом включає повнорозмірну область цієї N-кінцевої частини корового токсину. Таким чином, химерний токсин містить щонайменше приблизно 50 % повнорозмірного білка Cry1Fa токсину Bt або щонайменше приблизно 50 % повнорозмірного білка токсину Cry1Ca. Цей білок має довжину, що звичайно складає щонайменше приблизно 590 амінокислот. Що стосується частини протоксину, то повнорозмірна область частини протоксину Cry1Ab простягається від кінця частини корового токсину до С-кінця молекули. Гени і токсини. Гени і токсини, що використовуються в даному винаході, включають не тільки описані тут повнорозмірні послідовності, але також і фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутанти і гібридні білки, які зберігають характерну пестицидну активність токсинів, конкретно описаних в даний заявці. Використовувані тут термін "варіанти" або "модифікації" генів означають нуклеотидні послідовності, які кодують ті ж самі токсини або токсини, еквівалентні токсинам, що мають пестицидну активність. Використовуваний тут термін "еквівалентні токсини" означає токсини, що мають таку же або, по суті, таку ж біологічну активність проти шкідниківмішеней, як і заявлені токсини. Межі ідентичності, що використовуються тут, становлять приблизно 95 % (Cry1Fa і Cry1Ca), 78 % (Cry1F і Cry1C) і 45 % (Cry1) відповідно до "змін номенклатури для пестицидних кристалічних білків Bacillus thuringiensis" ("Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813). Такі межі можуть бути також застосовані тільки для корових токсинів (для токсинів Cry1F і Cry1C). Для фахівців в даній галузі очевидно, що гени, які кодують активні токсини, можуть бути ідентифіковані і отримані декількома способами. Специфічні гени або частини генів, описані в даний заявці, можуть бути отримані з ізолятів, депонованих в депозитаріях культур. Ці гени або їх частини або варіанти можуть бути також сконструйовані шляхом синтезу, наприклад, на синтезаторі генів. Варіанти генів можуть бути легко сконструйовані стандартними методами отримання точкових мутацій. Крім того, фрагменти цих генів можуть бути отримані з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз відповідно до стандартних процедур. Так, наприклад, для систематичного відщеплення нуклеотидів від кінців цих генів можуть бути використані ферменти, такі як Bal31, або може бути застосований сайтнаправлений мутагенез. Гени, що кодують активні фрагменти, можуть бути також отримані з використанням різних рестриктуючих ферментів. Для безпосереднього отримання активних фрагментів цих білків-токсинів можуть бути використані протеази. Фрагменти і еквіваленти, які зберігають пестицидну активність описаних тут токсинів, входять в об'єм даного винаходу. Крім того, внаслідок надлишковості генетичного коду, ряд різних послідовностей ДНК може кодувати описані тут амінокислотні послідовності. Фахівець в даній галузі може легко отримати такі альтернативні послідовності ДНК, що кодують ті ж самі або, по суті, ті ж самі токсини. Такі варіанти послідовностей ДНК входять в об'єм даного винаходу. Використовуваний тут термін "по суті, ті ж самі" послідовності означає послідовності, які мають амінокислотні заміни, делеції, додавання або інсерції, які фактично не чинять впливу на пестицидну активність. У це визначення також входять фрагменти генів, що кодують білки, які зберігають пестицидну активність. Іншим методом ідентифікації генів, що кодують токсини і частини генів, що використовуються в даному винаході, є застосування олігонуклеотидних зондів. Такими зондами є нуклеотидні послідовності, що детектуються. Такі послідовності можуть бути детектовані за допомогою відповідної мітки, або вони можуть бути спочатку зроблені флуоресцентними, як описано в Міжнародній заявці No. WO93/16094. Як добре відомо фахівцям, якщо молекула-зонд і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються за допомогою утворення міцного зв'язку між двома молекулами, то розумно передбачити, що такий зонд і зразок будуть мати значну гомологію. Гібридизацію, переважно, проводять в жорстких умовах із застосуванням методів, добре відомих фахівцям, наприклад, описаних Keller, G. Н., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Нижче приводяться деякі приклади комбінацій концентрацій солі і температур (в порядку зростання жорсткості): 2 × SSPE або SSC при кімнатній температурі; 1 × SSPE або SSC при 42 °C; 0,1 × SSPE або SSC при 5 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 42 °C; 0,1 × SSPE або SSC при 65 °C. Детектування зонда являє собою відомий метод, що застосовується для того, щоб визначити, відбувається гібридизація чи ні. Такий аналіз з використанням зонда являє собою швидкий метод ідентифікації токсин-кодуючих генів згідно з винаходом. Нуклеотидні сегменти, що використовуються як зонди згідно з винаходом, можуть бути синтезовані на синтезаторі ДНК відповідно до стандартних процедур. Ці нуклеотидні послідовності можуть бути також використані як ПЛР-праймери для ампліфікації генів згідно з винаходом. Варіанти токсинів. Деякі токсини згідно з винаходом конкретно описані в даний заявці. Оскільки ці токсини приводяться тут просто як приклади токсинів згідно з винаходом, то потрібно зазначити, що даний винахід включає варіанти токсинів або еквівалентні токсини (і нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), що мають таку ж пестицидну активність, як і представлений тут токсин, або аналогічну активність. Еквівалентні токсини мають амінокислотну послідовність, гомологічну амінокислотну послідовності представленого тут токсину. Така гомологія амінокислотних послідовностей звичайно складає більше ніж 75 %, переважно, більше ніж 90 %, а найбільш переважно, більше ніж 95 %. Гомологія амінокислотних послідовностей є найвищою в критичних областях токсину, що відповідають за біологічну активність або визначають тривимірну конфігурацію, яка, зрештою, відповідальна за біологічну активність. Відповідно до цього, деякі амінокислотні заміни є допустимими і можуть бути присутнім в тих областях, які не грають важливої ролі в повідомленні активності, або є консервативними амінокислотними замінами, які не впливають на тривимірну конфігурацію молекули. Так, наприклад, амінокислоти можуть бути поділені на наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислотні. Таким чином, при консервативних замінах, амінокислоту одного класу замінюють іншою амінокислотою того ж типу, і така заміна входить в об'єм даного винаходу, при умові, що вона, фактично, не буде впливати на біологічну активність сполуки. У таблиці 1 представлений список прикладів амінокислот, що належать до кожного класу. Таблиця 1 Клас амінокислот Неполярні Незаряджені полярні Кислотні Основні 30 35 40 45 Приклади амінокислот Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trр Gly, Ser, Thr, Сys, Tyr, Asn, Gln Asр, Glu Lys, Arg, His У деяких випадках можуть бути також зроблені неконсервативні заміни. Важливим фактором є те, що такі заміни не повинні значно знижувати біологічну активність токсину. Рекомбінантні хазяї. Гени, що кодують токсини згідно з винаходом, можуть бути введені мікробним або рослинним хазяїнам широкого ряду. Експресія гена токсину приводить, прямо або опосередковано, до продукування пестициду всередині клітин і його збереження в цих клітинах. Для отримання штаму Bt, що експресує обидва токсини згідно з винаходом, може бути застосоване кон'югативне і рекомбінантне перенесення. Інші організми-хазяїни можуть бути також трансформовані одним або обома генами токсинів, що використовуються для досягнення синергічного ефекту. З використанням прийнятних мікробів-хазяїнів, наприклад, Pseudomonas, ці мікроби можуть бути внесені в місця проживання шкідників, де вони можуть розмножуватися і поїдати ці мікроби. Це буде приводити до знищення шкідників. Альтернативно, мікроб, що містить ген токсину, може бути оброблений в умовах, сприяючих пролонгуванню активності токсину і стабілізації клітини. Оброблена клітина, яка зберігає токсичну активність, може бути потім внесена в середовище проживання шкідників-мішеней. Якщо ген токсину Bt вводять мікробу-хазяїну за допомогою прийнятного вектора, і якщо вказаного хазяїна вносять в середовище проживання в живому вигляді, то важливо, щоб були використані певні мікроби-хазяїни. При цьому, вибирають такі мікроорганізми-хазяїни, які, як відомо, займають певну "фітосферу" (філоплан, філосферу, ризосферу і/або ризоплан) однієї або декількох представляючих інтерес культур. Ці мікроорганізми вибирають так, щоб вони мали здатність успішно конкурувати в конкретних умовах (в культурі і в іншому середовищі проживання комах) з мікроорганізмами дикого типу, забезпечували стабільне збереження і 6 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 експресію генів, що кодують поліпептид-пестицид, і бажано, забезпечували кращий захист пестициду від руйнування і інактивації в умовах навколишнього середовища. Відомо, що велике число мікроорганізмів проживає на філоплані (на поверхні листя рослин) і/або на ризосфері (в ґрунті, що оточує коріння рослин) цінних сільськогосподарських культур широкого ряду. Такими мікроорганізмами є бактерії, водорості і гриби. Особливий інтерес представляють такі мікроорганізми, як бактерії, наприклад, бактерії роду Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc і Alcaligenes; гриби, а зокрема, дріжджі, наприклад, дріжджі роду Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula і Aureobasidium. Особливий інтерес представляють такі види бактерій фітосфер, як Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus і Azotobacter vinlandii; і дріжджів-фітосфер, таких як Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, С. diffluens, С. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae і Aureobasidium pollulans. Особливий інтерес представляють пігментовані мікроорганізми. Для введення гена Bt, що кодує токсин, мікроорганізму-хазяїну в умовах, що забезпечують стабільне збереження гена і стабільну експресію гена, можуть бути застосовані методи широкого ряду. Такі методи добре відомі фахівцям в даній галузі і описані, наприклад, в патенті США No. 5135867, який вводиться в даний опис за допомогою посилання. Обробка клітин. Bacillus thuringiensis або рекомбінантні клітини, експресуючі токсини Bt, можуть бути оброблені з метою пролонгування активності токсину і стабілізації клітин. Пестицидна мікрокапсула, що утворюється, містить токсин або токсини Bt в клітинній структурі, яка стабілізує і захищає токсин у випадку, коли цю мікрокапсулу вносять в середовище проживання шкідника-мішені. Відповідними клітинами-хазяїнами можуть бути прокаріоти або еукаріоти, і такими клітинами звичайно є, але не обмежуються ними, клітини, які не продукують речовини, що є токсичними для вищих організмів, таких як ссавці. Однак можуть бути також використані і мікроорганізми, які продукують речовини, токсичні для вищих організмів, але, при цьому, ці токсичні речовини є нестабільними, або рівень їх введення є досить низьким, що виключає можливість якого-небудь токсичного впливу на ссавця-хазяїна. Як хазяїни, особливий інтерес представляють прокаріоти і нижчі еукаріоти, такі як гриби. Клітини, що обробляються, звичайно є інтактними і, по суті, знаходяться в проліферативній формі, а не в формі спор, хоча, в деяких випадках можуть використовуватися і спори. Обробка мікробних клітин, наприклад, мікробів, що містять ген або гени токсину Bt, може бути здійснена хімічними і/або фізичними методами, або комбінацією хімічних і фізичних методів, при умові, що такий метод не буде чинити негативного впливу на властивості токсину і не буде приводити до зниження здатності клітин захищати токсин. Прикладами хімічних реагентів є галогенуючі агенти, а зокрема, галогени з атомними номерами 17-80. Більш конкретно, може бути використаний йод в м'яких реакційних умовах протягом певного періоду часу, достатнього для досягнення бажаних результатів. Іншими відповідними методами є обробка альдегідами, такими як глутаральдегід; протиінфекційними агентами, такими як хлорид зефірану і хлорид цетилпіридинію; спиртами, такими як ізопропіловий спирт і етанол; різними гістологічними фіксаторами, такими як йод Люголя, фіксатор Боуїна; різні кислоти і фіксатор Хеллі (див: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); або комбінацією фізичного методу (нагрівання) і хімічних агентів, які зберігають і пролонгують активність токсину, що продукується в клітинах, введених в середовище проживання хазяїна. Прикладами фізичних методів є короткохвильове випромінювання, таке як гаммавипромінювання і рентгенівське випромінювання, заморожування, УФ-опромінення, ліофілізація і т. п. Методи обробки мікробних клітин описані в патентах США №№ 4695455 і 4695462, які вводяться в даний опис за допомогою посилання. Ці клітини звичайно мають підвищену структурну стабільність, що приводить до збільшення резистентності до умов навколишнього середовища. Якщо пестицид присутній в формі попередника, то спосіб обробки клітин повинен бути вибраний так, щоб він не приводив до інгібування процесингу попередника з утворенням зрілої форми пестициду під дією патогена шкідника-мішені. Так, наприклад, формальдегід буде забезпечувати перехресне зшиття з білками, і тим самим інгібувати процесинг попередника поліпептидного пестициду. Спосіб обробки повинен зберігати щонайменше значну міру біологічної доступності або біологічної активності токсину. 7 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Властивостями, що представляють особливий інтерес для продукування при виборі клітинихазяїна, є простота введення гена або генів Bt хазяїну, доступність експресійних систем, ефективність експресії, стабільність пестициду в хазяїни і наявність додаткових генетичних ознак. Технологічними властивостями пестицидних мікрокапсул, які представляють інтерес, є їх захисна здатність відносно пестициду, наприклад, товщина клітинних стінок, пігментація і внутрішньоклітинна упаковка або здатність утворювати тільця включення; виживаність у водному середовищі; відсутність токсичності для ссавців; привабливість з точки зору поїдання шкідниками; простота утилізації; фіксація без пошкодження токсину і т. п. Іншими властивостями, що розглядаються, є простота приготування препарату і його транспортування, матеріальні витрати, стабільність при зберіганні і т.п. Культивування клітин. Клітини-хазяїни, що містять інсектицидний ген або гени B.t., можуть бути вирощені в будь-якому прийнятному поживному середовищі, в якому ДНК-конструкція буде забезпечувати селективну перевагу, тобто, забезпечувати селективне середовище, в якому всі або майже всі клітини будуть зберігати ген B.t. Потім ці клітини можуть бути зібрані звичайними способами. Альтернативно, ці клітини можуть бути оброблені до їх збирання. Клітини B.t., що продукують токсини згідно з винаходом, можуть бути культивовані з використанням стандартних середовищ і методом ферментації. Після завершення циклу ферментації, бактерії можуть бути зібрані спочатку шляхом відділення спор і кристалів B.t. від зброджуваного бульйону стандартними методами. Виділені спори і кристали B.t. можуть бути приготовані у вигляді змочуваного порошку, рідкого концентрату, гранул або інших препаратів, отриманих шляхом додавання поверхнево-активних речовин, диспергуючих речовин, інертних носіїв і інших компонентів, що полегшують транспортування, і обробку ними конкретних шкідників-мішеней. Такі процедури приготування і застосування добре відомі фахівцям. Препарати. Приготовані гранули-приманки, що містять атрактант і спори, кристали і токсини ізолятів B.t., або рекомбінантні мікроби, що містять гени, отримані з описаних тут ізолятів B.t., можуть бути внесені в ґрунт. Приготований продукт може бути застосований у вигляді покриття, що наноситься на насіння, або препарату для обробки коріння або всієї рослини на останніх стадіях циклу вирощування сільськогосподарської культури. Для обробки рослин і ґрунту, клітини B.t. можуть бути приготовані у вигляді змочуваних порошків, гранул або дустів, шляхом змішування з різними інертними матеріалами, такими як неорганічні мінеральні речовини (філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати і т. п.) або рослинні матеріали (подрібнені в порошок качани кукурудзи, рисове лушпиння, шкаралупа волоського горіха і т. п.). Такі препарати можуть включати ад'юванти типу "розпилювачів-зв'язувальних речовин", стабілізуючі агенти, інші пестицидні добавки або поверхнево-активні речовини. Рідкі препарати можуть бути водними або безводними, і можуть бути використані у вигляді пін, гелів, суспензій, емульгованих концентратів або т. п. Інгредієнтами можуть бути реологічні агенти, поверхневоактивні речовини, емульгатори, диспергуючі речовини або полімери. Як відомо фахівцям в даній галузі, концентрація пестициду може значно варіюватися залежно від природи конкретного препарату, а зокрема, залежно від того, чи використовується він у вигляді концентрату або в чистому вигляді. Пестицид складає щонайменше 1 % по масі, а може становити 100 % по масі. Сухі препарати можуть становити приблизно 1-95 % по масі пестициду, а рідкі препарати звичайно становлять приблизно 1-60 % по масі твердих речовин в 2 4 рідкій фазі. Ці препарати звичайно містять приблизно від 10 до 10 клітин/мг. Ці препарати можуть бути введені в кількості приблизно від 50 мг (в рідкому або в сухому вигляді) до 1 кг або більше на гектар. Препарати можуть бути внесені в середовище проживання лускокрилих шкідників, наприклад, нанесені на листя або ґрунт шляхом розпилення, опилення, зрошування або т. п. Трансформація рослин. Переважними рекомбінантними хазяїнами, які можуть бути використані для продукування інсектицидних білків згідно з винаходом, є трансформовані рослини. Гени, що кодують описані тут білки токсинів Bt, можуть бути введені в рослинні клітини із застосуванням різних методів, добре відомих фахівцям. Так, наприклад, існує велике число клонуючих векторів, що містять систему реплікації в Escherichia coli, і маркер, що дозволяє провести відбір трансформованих клітин, і ці вектори можуть бути використані з метою отримання препарату для інсерції чужорідних генів у вищі рослини. Вектори містять, наприклад, inter alia pBR322, серії pUC, серії M13mp, pACYC184. Відповідно до цього, ДНК-фрагмент, що має послідовність, яка кодує білок токсину Bt, може бути вбудований у вектор у прийнятний рестрикційний сайт. Отриману плазміду використовують для трансформації Е. coli. Клітини E. coli культивують у прийнятному поживному середовищі, а потім збирають і піддають лізису. Потім цю плазміду виділяють. Методами аналізу звичайно є аналіз послідовності, рестрикційний аналіз, електрофорез і інші методи, що застосовуються в біохімії і молекулярній біології. Після 8 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кожної маніпуляції, послідовність ДНК, що використовується, може бути розщеплена і приєднана до наступної послідовності ДНК. Кожна послідовність плазміди може бути клонована в одній і тій же або в інших плазмідах. Залежно від методу вбудовування потрібних генів в рослину, можуть виявитися необхідними і інші послідовності ДНК. Так, наприклад, якщо плазміду Ti або Ri використовують для трансформації клітин рослини, то щонайменше правий кордон, а в більшості випадків, правий і лівий кордони Т-ДНК-плазміди Ti або Ri приєднують як фланкуючі області генів, що вбудовуються. Використання Т-ДНК для трансформації клітин рослин було ретельно досліджене і детально описане в EP 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986), і An et al., (1985), і добре відомо фахівцям. Після інтеграції вбудованої ДНК у геном рослини, така ДНК стає відносно стабільною. Трансформуючий вектор звичайно містить селективний маркер, що повідомляє трансформованим клітинам рослини резистентність до біоциду або антибіотика, такими як біалафос, канаміцин, G418, блеоміцин або гігроміцин, inter alia. З використанням окремо узятого маркера можна, відповідно, здійснювати відбір трансформованих клітин, а не клітин, що не містять вбудовану ДНК. Існує багато методів, що підходять для вбудовування ДНК у клітини рослин-хазяїнів. Такими методами є трансформація молекулою T-ДНК із використанням Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як трансформуючих агентів, злиття, інжекція, біобалістичні методи (бомбардування мікрочастинками) або електропорація, а також інші можливі методи. Якщо для трансформації використовуються агробактерії, то вбудовувану ДНК клонують у конкретні плазміди, а саме, у проміжний або вектор у бінарний вектор. Проміжні вектори можуть бути інтегровані в плазміду Ti або Ri за допомогою гомологічної рекомбінації з використанням послідовностей, гомологічних послідовностям, що є присутніми у T-ДНК. Плазміда Ti або Ri також містить область vir, необхідну для переносу T-ДНК. Проміжні вектори не можуть самі реплікуватися в агробактеріях. Проміжний вектор може бути перенесений у Agrobacterium tumefaciens за допомогою хелперної плазміди (кон'югування). Бінарні вектори можуть самі реплікуватися як у E. coli, так і в агробактеріях. Вони містять селективний маркерний ген і лінкер або полілінкер, що замикають праву і ліву приграничні області T-ДНК. Вони можуть бути трансформовані безпосередньо в агробактерії (Holsters et al., 1978). Агробактерія, використовувана як клітина-хазяїна, містить плазміду, що несе область vir. Область vir необхідна для перенесення T-ДНК у клітину рослини. Може також бути присутньою і додаткова T-ДНК. Трансформовану в такий спосіб бактерію використовують для трансформації клітин рослин. Рослинні експлантати можуть бути переважно культивовані з Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes для перенесення ДНК у клітину рослини. Потім цілі рослини можуть бути вирощені з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, зі шматочків листя, сегментів стебел, коренів, а також протопластів або клітин, культивованих суспензійним методом) у придатному середовищі, що може містити антибіотики або біоциди для відбору. Потім вирощені в такий спосіб рослини можуть бути протестовані на присутність вбудованої ДНК. У випадку інжекції і електропорації, яких-небудь спеціальних вимог до одержання плазмід не пред'являється. При цьому, можуть бути використані стандартні плазміди, такі як, наприклад, похідні pUC. Трансформовані клітини розвиваються в рослині як звичайно. Вони можуть утворювати зародкові клітини і передавати трансформовану(і) ознаку(и) потомству. Такі рослини можуть бути вирощені звичайним способом і схрещені з рослинами, що мають трансформовані наслідувані фактори або інші наслідувані фактори. Отримані гібридні рослини мають відповідні фенотипічні властивості. У переважному варіанті винаходу, рослини трансформують генами, у яких зустрічальність кодонів оптимізована для рослин. Див, наприклад, патент США No. 5380831, що вводиться в даний опис за допомогою посилання. Хоча в даній заявці описані деякі зрізані токсини, однак, фахівцям з Bt добре відомо, що токсини, які належать до типу токсинів довжиною 130 кДа (повнорозмірні), мають N-кінцеву половину, що являє собою коровий токсин, і С-кінцеву половину, що являє собою протоксиновий "хвіст". Таким чином, відповідні "хвости" можуть бути використані разом із зрізаними/коровими токсинами відповідно до винаходу. Див., наприклад, патент США № 6218188 і патент США № 6673990. Крім того, методи створення синтетичних генів Bt для їхнього використання в рослинах відомі фахівцям (Stewart and Burgin, 2007). Одним з необмежуючих прикладів переважної трансформованої рослини є фертильна рослина кукурудзи, що містить експресований у рослині ген, що кодує білок Cry1Fa, а також другий експресований у рослині ген, що кодує білок Cry1Ca. Перенесення (або інтрогресія) Cry1Fa- і Cry1Ca-детермінованої(их) ознаки(к) в інбредні лінії кукурудзи може бути досягнуть шляхом рекурентного селективного схрещування, наприклад, 9 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зворотного схрещування. У цьому випадку, потрібну рекурентну рослину спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентним батьком), що несе відповідний(і) ген(и), що повідомляє(ють) Cry1F- і Cry1C-детерміновані ознаки. Потім потомство цього кроса піддають зворотному схрещуванню з рекурентним рослиною з наступним відбором отриманого потомства на потрібну(і) ознаку(и), перенесену(і) від нерекурентного батька. Через три, переважно, чотири, а ще більш переважно, через п'ять або більше поколінь "бекросів" з рекурентним батьком з відбором на потрібну(і) ознаку(и), потомство буде гетерозиготним по локусах, що контролює перенесену(і) ознаку(и), але воно буде аналогічно рекурентному батьку по більшості або майже по всіх інших генах (див., наприклад, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376). Стратегії вирощування культур, резистентних до комах (IRM). Наприклад, Roush і співробітниками були описані стратегії з використанням двох токсинів, що також називаються створенням "пірамід" або "кластерів" для вирощування трансгенних культур, що мають інсектицидні властивості. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786). На web-сайті Агентства США по захисту навколишнього середовища (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006. htm) опубліковані наступні вимоги по забезпеченню площ-сховищ з нетрансгенними культурами (тобто, не-B.t.) культурами (земельної ділянки або блоку із сільськогосподарськими не-вt-культурами/кукурудзою) для їхнього використання під трансгенні культури, що продукують один білок Bt, що має активність проти шкідників-мішеней. "Конкретними структурними вимогами до продуктів з Bt-кукурудзи (Cry1Ab або Cry1F), захищеної від кукурудзяного трача, є: Структурні площі-"сховища": 20 % площі-сховища під Bt-кукурудзу, не захищену від Лускокрилих у Кукурудзяному поясі; 50 % площі-сховища під Bt-бавовник, не захищений від Лускокрилих у Бавовняному поясі; Блоки: Внутрішні (тобто, у полях з Bt) Зовнішні (тобто, окремі поля в межах ½ милі (по можливості ¼ милі) від Bt-поля для максимізації вільного схрещування) Смужки регулярно оброблюваних сільськогосподарських земель: Ці смужки повинні мати ширину щонайменше в 4 ряди (переважно, 6 рядів) для зниження числа випадків міграції личинок". Крім того, Національна асоціація виробників кукурудзи, на своєму web-сайті (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) також опублікувала аналогічний посібник з вимог для площ-сховищ. Так, наприклад: "Вимоги до IRM у випадку кукурудзяного трача: - Засівати щонайменше 20 % акрів кукурудзою для збереження нетрансгенних гібридів - У регіонах вирощування бавовнику, повинно залишатися 50 % площі-сховища - Повинно бути засіяно 1/2 милі нетрансгенними гібридами - Площі-сховища можуть бути засіяні смугами на Bt-поля; площі-сховища повинні бути засіяні у вигляді смуг, що повинні мати ширину щонайменше в 4 ряди - Площі-сховища можуть бути оброблені стандартними пестицидами тільки, якщо досягаються економічні пороги для комах-мішеней - розпилювані інсектициди на основі Bt не можуть бути використані на площах-сховищах під кукурудзу - відповідне сховище повинне бути засіяне Bt-кукурудзою на кожній фермі" Як указували Roush і співробітники (наприклад, на сторінках 1780 і 1784 у правому стовпчику), або кластери піраміди з двох різних білків, кожний з який є ефективним проти шкідників-мішеней з мінімальною перехресною резистентністю або з відсутністю такої резистентності, можуть бути використані на дрібніших "сховищах" нетрансгенних рослин. Roush висловив припущення, що для успішного використання кластерів, площа-притулок, розмір якого складає менше ніж 10 %, може бути оброблений культурою з резистентністю, порівнянною з резистентністю культур, оброблюваною приблизно на 50 % площі-сховища для одного (непірамідного) токсину. Що стосується доступних у даний час продуктів з кукурудзи, що містять "пірамідні" Bt, то Агентство США по захисту навколишнього середовища вимагає, щоб значно менша (звичайно 5 %) площа структурного сховища була засіяна не-Bt кукурудзою, а не культурою з одним токсином (звичайно 20 %). Існують різні шляхи забезпечення IRM-ефектів використання площ-сховищ, включаючи різні геометричні схеми засівання на поля (як згадувалося вище) і суміші насіння в одному пакеті, що також обговорюється Roush і ін. (див. вище), і в патенті США № 6551962. 10 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вищевказані відсотки або аналогічні співвідношення площ-сховищ можуть бути використані для розглянутих двокомпонентних або трикомпонентних кластерів або пірамід. Для трикомпонентних кластерів із трьома механізмами дії проти однієї шкідника-мішені, сховища взагалі бути не повинно (або наприклад, площа-притулок повинний бути меншим 5 %). Це особливо справедливо для площ під комерційні культури – наприклад, понад 10 акрів. Усі патенти, патентні заявки, попередні заявки і публікації або цитовані в них роботи у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання в тій мірі, у якій вони відповідають детальному опису даної заявки. Нижче приводяться приклади, що ілюструють способи практичного здійснення даного винаходу. Ці приклади не повинні розглядатися як обмеження обсягу винаходу. Усі відсотки дані по масі, а всі співвідношення сумішей розчинників дані по обсязі, якщо це не обговорено особливо. Усі температури дані в градусах Цельсія. Якщо це не зазначено або не мається на увазі конкретно, то використовувані тут артиклі "a", "an" і "the" означають "щонайменше один". Приклад 1 Конструювання химерних білків, що містять корові токсини Cry1Ca і протоксини Cry1Ab Химерні токсини. Химерні білки, що містять домен корового токсину одного Cry, приєднаного до протоксинового сегмента іншого токсину Cry, були вже описані, наприклад, у патенті США № 5593881 і в патенті США № 5932209. Послідовність білка ендотоксину Cry1Ca3-дельта депонована у GenBank під реєстраційним номером AAA22343 під застарілим позначенням Cry1C(b). Варіантами химерних білків Cry1Ca відповідно до винаходу є химерні токсини, що містять Nкінцевий сегмент корового токсину, що походить від інсектицидного токсину Cry1Ca3, приєднаного до гетерологічного протоксинового сегмента ендотоксину дельта у визначеному положенні, розташованому за межами сегмента корового токсину. Перехід від корового токсину в гетерологічний сегмент протоксину може відбуватися приблизно в природній області стику токсин/протоксин, або альтернативно, частина нативного протоксину (що простягається за межі сегмента корового токсину) може зберігатися, причому, перехід у гетерологічний протоксин може відбуватися нижче. В одному з варіантів, сегменти корового токсину і протоксину можуть включати точно таку ж амінокислотну послідовність нативних токсинів, від яких вони походять, або вони можуть включати амінокислотні додавання, делеції або заміни, що не погіршують, а можуть навіть поліпшувати біологічну функцію сегментів, зв'язаних один з одним. Так, наприклад, химерний токсин відповідно до винаходу містить сегмент корового токсину, що походить від Cry1Ca3, і гетерологічний протоксин. У переважному варіанті винаходу, сегмент корового токсину, що походить від Cry1Ca3 (619 амінокислот), приєднаний до гетерологічного сегмента, який містить сегмент протоксину, що походить від дельтаендотоксину Cry1Ab (545 амінокислот). Послідовність химерного білка з 1164 амінокислот, позначеного тут DIG-152, представлена як SEQ ID NO:1. Другий переважний варіант винаходу включає химерний білок, у якому сегмент корового токсину Cry1Ca (619 амінокислот) приєднаний до другого сегмента протоксину з 545 амінокислот, що походить від Cry1Ab. Послідовність другого химерного білка з 1164 амінокислот, позначеного тут DIG-109, представлена як SEQ ID NO:2 (варіант, оптимізований для кукурудзи). Слід зазначити, що в об'єм даного винаходу входять і інші химерні гібриди, що містять варіанти корового токсину Cry1Ca і протоксини, що походять від Cry1Ab. Слід зазначити, що химерні білки DIG-152 і DIG-109, по суті, функціонально еквівалентні один одному, і відрізняються тільки в одному положенні послідовності (у положенні амінокислоти 620, що є положенням приєднання сегмента корового токсину Cry1Ca до сегмента протоксину Cry1Ab). Приклад 2 Конструювання експресійних плазмід, що кодують химерні білки "коровий токсин Cry1Ca/протоксин Cry1Ab", і їх експресія в Pseudomonas Для створення експресійної конструкції pMYC2547 Pseudomonas fluorescens (Pf), отриманої з метою продукування повнорозмірного химерного білка DIG-152 (представленого в SEQ ID NO:1) біли застосовані стандартні методи клонування (описані, наприклад, у посібнику Sambrook et al, (1989) і Ausubel et al, (1995), і в більш пізніх виданнях). Продукування білка здійснювали в штамі MB214 Pseudomonas fluorescens (похідному штаму MB101; P. fluorescens, біовар 1), що має інсерцію модифікованого оперону lac, як описано в патенті США № 5169760. Основна стратегія клонування включає субклонування фрагмента ДНК, що кодує DIG-152, у плазмідні вектори, у результаті чого цей фрагмент буде поміщений під експресійний контроль 11 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 промотору Ptac і термінатора rrnBTl2, що походить від плазміди pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, WI). Одна з таких плазмід позначається pMYC2547, а ізолят MB214, що містить цю плазміду, позначається Dpfl08. Аналіз на ріст і експресію в шейкерних колбах Продукування білка DIG-152 для характеризації і біологічного аналізу на його дію проти комах здійснювали з використанням штаму Dpf108 P. fluorescens, вирощеного в шейкерних колбах. Продукування білка DIG-152, що знаходиться під контролем промотору Ptac, здійснювали, як описано раніше в патенті США No. 5527883. Докладний опис мікробіологічних маніпуляцій приводиться в публікації Squires et al., (2004), у заявці на патент США 20060008877, у заявці на патент США 20080193974 і в заявці на патент США 20080058262, що вводяться в даний опис за допомогою посилання. Експресія була індукована шляхом додавання ізопропіл-βD-1-тіогалактопіранозиду (IPTG) після першого інкубування протягом 24 годин при 30 °C зі струшуванням. Зразки культур брали під час індукування й у різні періоди часу після індукування. Клітинну густину вимірювали по оптичній густині на 600 нм (OD 600). Фракціонування клітин і аналіз зразків у шейкерних колбах, проведений за допомогою електрофорезу в ПААГ із ДСН. При кожному взятті зразка, клітинну густину зразків доводили до OD600=20, і 1 мл-аліквоти центрифугували при 14000 x g протягом п'яти хвилин. Клітинний осад заморожували при -80 °C. Розчинні і нерозчинні фракції, узяті з заморожених зразків клітинного осаду в шейкерних колбах, одержували з використанням розчину для екстракції бактеріального білка EasyLyse™ (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, WI). Кожен клітинний осад ресуспендували в 1 мл розчину EasyLyse™, а потім розводили 1:4 у буфері для лізису і інкубували зі струшуванням при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Лізат центрифугували при 14000 об/хв протягом 20 хвилин при 40C, і супернатант виділяли у виді розчинної фракції. Потім осад (нерозчинну фракцію) ресуспендували в рівному обсязі забуференого фосфатом фізіологічного розчину (PBS; 11,9 мM Na 2HPО4, 137 мM NaCl, 2,7 мM KCl, pН 7,4). Зразки змішували у відношенні 1:1 з 2 × буфером для зразків Лемлі, що містить βмеркаптоетанол (Sambrook et al, див. вище), і кип'ятили протягом 5 хвилин, а потім завантажували на 12 % біс-тріс-гель Criterion XT (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Електрофорез здійснювали в XT-буфері MOPS, рекомендованому виробником. Гелі офарблюваликумасі синім Bio-Safe відповідно до протоколу, рекомендованим виробником (Bio-Rad), і візуалізували з використанням візуалізуючої системи Alpha Innotech (San Leandro, CA). Одержання тілець включення. Одержання тілець включення білка DIG-152 (IB) здійснювали в клітинах, отриманих шляхом реакції ферментації P. fluorescens, що продукували нерозчинний інсектицидний Bt-білок, як показав аналіз, проведений за допомогою електрофорезу в ПААГ із ДСН і MALDI-MS (матрична лазерна десорбція/іонізуюча мас-спектрометрія). Гранули, отримані шляхом ферментації P. fluorescens, відтавали на водяній бані при 37 °C. Клітини ресуспендували до 25 % мас/об у буфері для лізису [50 мм трісу, pН 7,5, 200 мм NaCl, 20 мм EDTA-динатрієвої солі (етилендіамінтетраоцтової кислоти), 1 % тритону X-100 і 5 мм дитіотреїтолу (DTT); 5 мл/л "коктейлю" інгібіторів бактеріальної протеази (Catalog # P8465; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), що додавали безпосередньо перед застосуванням]. Клітини суспендували на гомогенізаторі з ручним керуванням з установкою шкали найменшого значення (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Лізоцим (25 мг Sigma L7651, виділеного з білка курячих яєць) додавали до клітинної суспензії шляхом змішування металевим шпателем, і суспензію інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години. Суспензію прохолоджували на льоду протягом 15 хвилин, а потім обробляли ультразвуком на ультразвуковому генераторі Branson Sonifier 250 (два раунди по 1 хвилині, 50 % черговий цикл, 30 % вихід). Лізис клітин підтверджували за допомогою мікроскопії. При необхідності додавали 25 мг лізоциму, а потім інкубування й обробку ультразвуком повторювали. Після підтвердження лізису клітин під мікроскопом, лізат центрифугували при 11500 x g протягом 25 хвилин (4 °C) з одержанням осаду тілець включення (IB), і супернатант відкидали. Осад IB ресуспендували з 100 мл буфера для лізису, гомогенізували в міксері з ручним керуванням і центрифугували як описані вище. Осад IB повторно промивали шляхом ресуспендування (у 50 мл буфери для лізису), гомогенізації, обробки ультразвуком і центрифугування доти, доки супернатант не ставав безбарвним, а осад IB твердим і не зовсім білим. Для кінцевого промивання, осад IB ресуспендували в стерильно відфільтрованій (на фільтрі 0,22 мкм) дистильованій воді, що містить 2 мM EDTA, і центрифугували. Кінцевий осад ресуспендували в стерильно відфільтрованій дистильованій воді, що містить 2 мM EDTA, і зберігали у вигляді 1 мл-аліквот при -80 °C. 12 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Аналіз, проведений за допомогою електрофорезу в ПААГ із ДСН, і кількісну оцінку білка в препаратах IB здійснювали шляхом відтавання 1 мл-аліквоти осаду IB і розведення 1:20 стерильно відфільтрованою дистильованою водою. Потім розведений зразок кип'ятили з 4 × відновним буфером для зразків [250 мм тріс, pН 6,8, 40 % гліцерину (об/об), 0,4 % бромфенолового синього (мас/об), 8 % ДСН (мас/об) і 8 % β-меркаптоетанолу (об/об)] і завантажували на 4-20 % тріс-гліцин Novex® у гелі в ямках 12+2 (Invitrogen), обробленому 1 × трісом/гліцином/ДСН-буфером (BioRad). Гель піддавали електрофорезу протягом 60 хвилин при 200 вольт, а потім забарвлювали кумасі синім (50 % G-250/50 % R-250 у 45 % металолі, 10 % оцтовій кислоті), і знебарвлювали 7 % оцтовою кислотою, 5 % метанолом у дистильованій воді. Кількісну оцінку смуг-мішеней здійснювали шляхом порівняння денситометиричних величин для смуг зі стандартними зразками альбуміну бичачої сироватки (BSA), проаналізованих на тому же гелі для побудови стандартної кривої. Солюбілізація тілець включення. 6 мл суспензії тілець включення DIG-152 від клону Pf, DPfl08, центрифугували на мікроцентрифузі Еппендорфа моделі 5415C, установленої на найвище значення (приблизно 14000 x g), у результаті чого одержували осад тілець включення. Супернатант буфера для збереження видаляли і замінювали 25 мл 100 мМ натрійкарбонатного буфера, pН 11, у конічній 50 мл-пробірці. Тельця включення ресуспендували піпеткою і піддавали вихровому перемішуванню до одержання однорідної суміші. Пробірку поміщали на платформу, що повільно обертається, і залишали на ніч при 4 °C для екстракції білка-мішені. Екстракт центрифугували при 30000 x g протягом 30 хвилин при 4 °C, і отриманий супернатант 5-кратно концентрували на центрифугальному фільтруючому пристрої з регенерованою целюлозою Amicon Ultra-15 (з відсіканням молекулярної маси 30000; Millipore). Буфер для зразків замінювали 10 мМ CAPS [3-(циклогексаміно)-1-пропансульфоновою кислотою], pН 10, з використанням одноразових стовпчиків PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Солюбілізація білка тілець включення і їх активація трипсином. У деяких випадках, суспензію DIG-152 тілець включення від клону Pf, DPfl08, центрифугували на мікроцентрифузі Еппендорфа моделі 5415C, установленій на найвище значення (приблизно 14000 x g), у результаті чого одержували осад тілець включення. Супернатант буфера для збереження видаляли і замінювали 100 мМ CAPS, pН 11, з одержанням білка, концентрація якого складала приблизно 50 мг/мл. Пробірку обертали при кімнатній температурі протягом трьох годин до повної солюбілізації білка. Потім додавали трипсин у рівних кількостях до 5 %-10 % (мас. %, по вихідній масі порошку IB) і здійснювали гідроліз шляхом інкубування при обертанні протягом ночі при 4 °C або обертанні протягом 90-120 хвилин при кімнатній температурі. Нерозчинний матеріал видаляли шляхом центрифугування при 10000 x g протягом 15 хвилин, і супернатант наносили на аніонообмінну колонку MonoQ (10 мм × 10 див). Активований білок DIG-152 елюювали (як було визначено за допомогою електрофорезу в ПААГ із ДСН) 25 колонковими об'ємами 0 % - 100 % 1М градієнта NaCl. Фракції, що містять активований білок, поєднували, і при необхідності, концентрували до менше ніж 10 мл на центрифугальному фільтруючому пристрої з регенерованою целюлозою Amicon Ultra-15 як описано вище. Потім матеріал пропускали через стовпчик з Superdex 200 (16 мм × 60 см) у буфері, що містить 100 мМ NaCl, 10 % гліцерину, 0,5 % твіну-20 і 1 мМ EDTA. Аналіз, проведений за допомогою електрофорезу в ПААГ із ДСН, показав, що активований (ферментативно зрізаний) білок елююється при 65-70 мл. Фракції, що містять активований білок, збирали і концентрували на центрифугальному концентраторі як описано вище. Гель-електрофорез. Препарати концентрованого білка одержували для проведення електрофорезу шляхом розведення 1:50 у буфері для зразків LDS NuPAGE® (Invitrogen), що містить 5 мМ DTT як відновник, і нагрівали при 95 °C протягом 4 хвилин. Зразок завантажували на доріжки-дублікати з 4-12 % гелем NuPAGE® разом з п'ятьма BSA-стандартами в кількості від 0,2 мкг до 2 мкг/доріжку (для побудови стандартної кривої). Потім подавали напругу в 200 В з використанням буфера MOPS для електрофорезу з ДНС (Invitrogen) доти, доки барвник-"свідок" не досягав основи гелю. Гель забарвлювали 0,2 % кумасі синім G-250 у 45 % метанолі, 10 % оцтовою кислотою, і знебарвлювали спочатку шляхом швидкої обробки 45 % металолом, 10 % оцтовою кислотою, а потім шляхом тривалої обробки 7 % оцтовою кислотою, 5 % метанолом до появи прозорого тла. Після знебарвлення, гель сканували на мультивізуалізаторі BioRad FluorS. Для одержання об'ємів пофарбованих смуг білка з вирахуванням тла і для побудови стандартної кривої BSA, що була використана для обчислення концентрації химерного білка DIG-152 у маточному розчині, використовували комп'ютерну програму Quantity One Software v.4.5.2. Приклад 3 Інсектицидна активність білка DIG-152, що продукується в Pseudomonas fluorescens 13 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Інсектицидна активність білка DIG-152 була продемонстрована на личинках совки трав'яної (FAW, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)) і на личинках Cry1F-резистентною FAW (rFAW). Приготування і біоаналізи зразків. Препарати тілець включення (нативного повнорозмірного білка або білка, активованого трипсином) переносили в 10 мМ CAPS-буфер, pH10, методами заміни буфера, такими як діаліз, або на колонках PD-10. Потім зразки відповідним чином розводили в 10 мМ CAPS, pH 10, і всі біоаналітичні препарати містили контроль, що складається з цього буфера, який служив як фон для підтвердження загибелі комах або інгібування їх розвитку. Концентрації білків в буфері для біоаналізу оцінювали за допомогою гель-електрофорезу з використанням BSA з метою побудови стандартної денситометричної кривої для гелю, і цей аналіз проводили з використанням системи візуалізації BioRad, як описано вище. Білки в гелевій матриці забарвлювали барвником на основі кумасі синього, і перед прочитанням знебарвлювали. Очищені білки тестували на інсектицидну активність за допомогою біоаналізів, що проводяться з використанням щойно личинок, що вилупилися лускокрилих, яким давали штучний корм для комах. Личинки FAW вилуплювалися з яєць, отриманих з колоній, що зберігаються в комерційно доступному інсектарії (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). Личинки rFAW вилуплювалися з яєць, отриманих з непромислових колоній (Dow AgroSciences, Indianapolis, IN). Біоаналізи проводили в 128-ямкових пластикових планшетах, спеціально виготовлених для біоаналізів комах (C-D International, Pitman, NJ). Кожна ямка містила 1,0 мл корму для лускокрилих багатьох видів (Southland Products, Lake Village, AR). 40 аліквот зразка білка 2 2 наносили піпеткою на поверхню в 1,5 см кожної ямка з кормом (тобто, 26 мкл/см ). Концентрацію корму обчислювали як кількість (нг) білка DIG-152 на квадратний сантиметр площі поверхні в ямку. Оброблена ямка витримувала у витяжному шафі доти, поки рідина на поверхні корму не випаровувалася або не вбиралася в цьому кормі. Протягом декількох часів розмноження, окремі личинки збирали зволоженою щіткою з верблюжої вовни і вміщували на оброблений корм, одну личинку на ямку. Потім заражену ямку герметично закривали клейкими прозорими пластиковими пластинами, і забезпечувала отвором для газообміну (C-D International). Планшети для біоаналізу витримували в регульованих умовах навколишнього середовища [28°, відносна вологість приблизно 40 % (ВВ), 16 год.:8 год. (день:ніч)] протягом 5 днів, після чого реєстрували загальне число комах, оброблених кожним зразком білка, число загиблих комах і масу комах, що вижили. Процент загиблих комах і процент інгібування їх росту обчислювали для кожної обробки. На кожній стадії обробки обчислювали процент загиблих комах і процент інгібування їх росту. Процент інгібування росту (GI) обчислювали таким чином: %GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)] × 100, де TWIT означає загальну масу комах для даної обробки (Total Weight of Insects in the Treatment), TNIT означає загальне число комах для даної обробки (Total Number of Insects in the Treatment), TWIBC означає загальну масу комах в фоновому контролі (Total Weight of Insects in the Background Check) (буфер-контроль), і TNIBC означає загальне число комах в фоновому контролі (Total Number of Insects in the Background Check) (буфер-контроль). GI50 визначали як концентрацію химерного білка DIG-152 в кормі, де величина %GI дорівнює 50. LC50 (50 % летальну концентрацію) реєстрували як концентрацію білка DIG-152 в кормі, при якій гинуло 50 % тестованих комах. Статистичний аналіз (односторонній ANOVA) проводили з використанням комп'ютерної програми JMP (SAS, Cary, NC). У таблиці 2 представлені результати біоаналізів білка DIG-152 на його поїдання личинками комахи совки трав'яної. 14 UA 112156 C2 Таблиця 2 2 Величини GI50 і LC50 (в нг/см ), обчислені для корму комах, на верхню частину якого був нанесений білок DIG-152 FAW GI50 38,1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 LC50 2828,7 rFAW GI50 78,9 LC50 2210,9 Відмітною ознакою білка DIG-152 згідно з винаходом є те, що ріст личинок совки трав'яної, які щойно вилупилися (Spodoptera frugiperda), інгібується після поїдання білка або DIG-152. Крім того, личинки совки трав'яної, які є резистентними до інтоксикації білком Cry1Fa, залишаються сприйнятливими до активності DIG-152, як і личинки совки трав'яної дикого типу. Значущість сприйнятливості цих Cry1Fa-резистентних комах до Cry1Ca детальніше обговорювалася вище. Приклад 4 Конструювання послідовності, що оптимізована по кодонах кукурудзи і кодує білок DIG-109 Фахівцеві в галузі молекулярної біології рослин відомо, що множина послідовностей ДНК може бути сконструйована так, щоб вони кодували одну амінокислотну послідовність. Загальновідомий спосіб підвищення рівня експресії області, що кодує що представляє інтерес білок, полягає в створенні такої кодуючої області, в якій склад кодонів аналогічний загальному складу кодонів хазяїна, в якому повинна бути досягнута експресія генів. Посібник по конструюванню і продукуванню синтетичних генів можна знайти, наприклад, в заявці WO 1997/13402 і в патенті США № 5380831. Послідовність ДНК, що має зміщення кодонів кукурудзи, конструювали і синтезували так, щоб вона продукувала химерний інсектицидний білок DIG-109 в трансгенних однодольних рослинах. Таблицю зустрічання кодонів в кукурудзі (Zea mays L.) складали виходячи з 706 білоккодуючих послідовностей, виведених з послідовностей, депонованих в GenBank (world wide web: ncbi.nlm.nih.gov). Середньоваговий набір кукурудзяних кодонів обчислювали шляхом виключення будь-якого надлишкового кодону, кількість якого складає приблизно менше ніж 10 % від загального зустрічання кодонів для даної амінокислоти. Середньовагове уявлення для кожного кодону обчислювали за формулою: Середньоваговий % C1=1/(%C1+%C2+%C3+т.п.) × %C1 × 100, де C1 являє собою кодон, що розглядається, а %C2, %C3 і т. п. означає середній % зустрічання інших синонімічних кодонів. Для отримання послідовності ДНК, яка оптимізована по кодонах кукурудзи і кодує білок DIG109 SEQ ID NO:2, що складається з 1164 амінокислот, були зроблені заміни кодонів в нативній послідовності ДНК crylCа, що кодує сегмент корового токсину Cry1Ca, в результаті чого була отримана послідовність ДНК, що має загальний склад оптимізованих для кукурудзи кодонів, представлена в таблиці зміщення кодонів. Аналогічним чином, заміни кодонів в нативній послідовності ДНК crylAb, що кодує сегмент протоксину Cry1Ab були зроблені так, щоб отримана послідовність ДНК мала загальний склад оптимізованих для кукурудзи кодонів, представлені в таблиці зміщення кодонів. Додаткові уточнення послідовностей були зроблені для усунення небажаних сайтів розпізнавання рестриктуючих ферментів, потенційних сайтів сплайсингу інтронів рослин, довгих ділянок залишків А/Т або С/G, і інших мотивів, які можуть негативно впливати на стабільність РНК, транскрипцію або трансляцію кодуючої області в клітинах рослин. Для введення потрібних сайтів розпізнавання рестриктуючих ферментів і для видалення довгих внутрішніх відкритих рамок зчитування (крім рамок +1) були зроблені потрібні заміни. Всі ці заміни були зроблені на ділянках, в межах яких приблизно залишалося зміщення кодонів в порівнянні зі складом кодонів кукурудзи. Повна оптимізована по кодонам кукурудзу послідовність (що кодує білок DIG-109) представлена в SEQ ID NO:3. Синтез фрагмента ДНК здійснювали відповідно до інструкцій постачальника (DNA2.0, Menlo Park, CA). Приклад 5 Конструювання рослинних трансформуючих векторів, що містять експресовані в рослині гени, що кодують білки DIG-109 Для трансформації однодольних рослин-хазяїнів звичайно використовується супербінарна система Agrobacterium (Japan Tobacco, Tokyo, JP). У такій супербінарній системі використовується човниковий плазмідний вектор pSBl1, що містить послідовності повторів правого кордону Т-ДНК (RB) і повторів лівого кордону Т-ДНК (LB), розділений сайтами множинного клонування. Похідне pSBl1 (що позначається pDAB7691) отримували стандартними 15 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 методами клонування ДНК. Плазміда pDAB7691 містить оптимізовану для кукурудзи DIG-109кодуючу послідовність (CDS; тобто, SEQ ID NO:3), що знаходиться під транскрипційним контролем промотору убіхітину 1 кукурудзи з приєднаним інтроном 1 (патент США № 5510474) і з приєднаною 3'-нетрансльованою областю Per5 кукурудзи (3' UTR) (патент США № 7179902). Крім того, pDAB7691 містить рослинний селективний маркерний ген, що включає послідовність CDS DSM2 Dow AgroSciences (WO 2008/070845 A2), що знаходиться під транскрипційним контролем промотору актину 1 рису з приєднаним інтроном 1 (патент США № 5641876), і з 3'UTR ліпази кукурудзи (патент США № 7179902). Фізичне розташування компонентів Т-області pDAB7691 можна представити як: RB> промотор Ubil кукурудзи:CDS DIG-109:3'UTR Per5 кукурудзи > промотор Act1 рису:CDS DSM2:3'UTR ліпази кукурудзи >LB. Друге похідне pSB11 (що позначається pDAB100276) отримували стандартними методами клонування ДНК. Плазміда pDAB100276 містить оптимізовану по кодонах кукурудзи DIG-109кодуючу послідовність (CDS; тобто, SEQ ID NO:3), що знаходиться під транскрипційним контролем промотору убіхітину 1 кукурудзи з приєднаними інтроном 1 і 3'UTR Per5 кукурудзи. Крім того, плазміда pDAB100276 містить рослинний селективний маркерний ген, що включає послідовність CDS AAD1 Dow AgroSciences (заявка на патент США № 20090093366), що знаходиться під транскрипційним контролем промотору убіхітину 1 кукурудзи з приєднаними інтроном 1 і 3'UTR ліпази кукурудзи. Фізичне розташування компонентів Т-області pDAB100276 можна представити як: RB>промотор Ubil кукурудзи:CDS DIG-109:3'UTR Per5 кукурудзи>промотор Ubil кукурудзи:CDS AAD-1:3'UTR ліпази кукурудзи >LB. Для трансформації Agrobacterium, клітини клонуючого штаму DH5α Escherichia coli, що містить плазміду pDAB7691 або плазміду pDAB100276, культивували при 37 °C протягом ночі на середовищі з агаром LB (г/л: триптон Bacto, 10; дріжджовий екстракт Bacto, 5; NaCl, 10; агар, 15), містили спектиноміцин (100 мкг/мл). Клітини штаму DH5a, що містять кон'югативну мобілізуючу плазміду pRK2013, культивували на агарі LB, що містить канаміцин (50 мкг/мл). Після інкубування, планшети вміщували при 4 °C для забезпечення доступності штаму LBA4404 Agrobacterium tumefaciens, що містить плазміду pSBl. Приклад 6 Трансформація Agrobacterium для отримання супербінарних векторів Супербінарна система Agrobacterium, в якій використовується штам LBA4404 Agrobacterium tumefaciens, що містить плазміду pSB1, звичайно застосовується для трансформації однодольних рослин-хазяїнів. Методика конструювання і підтвердження створення супербінарних векторів добре описана в Технічному посібнику для pSB1 (Japan Tobacco). Для генерування і підтвердження створення супербінарної плазміди pDAS5162, яка являє собою доінтегровану плазміду, що містить плазміди pSBl і pDAB7691, і супербінарної плазміди pDAS5848, яка являє собою до-інтегровану плазміду, що містить плазміди pSBl і pDAB100276, застосовували стандартні методи мікробіології молекулярної біології. Приклад 7 Продукування білка DIG-109 в рослинах кукурудзу Agrobacterium-опосередкована трансформація кукурудзи. Насіння від кросів F1 Hi-II (Armstrong et al., 1991) висівало в 5-галлонні горщики, що містять суміш 95 % культурального середовища Metro-Mix 360 без ґрунту (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) і 5 % ґрунту з глиною/вапном. Рослини вирощували в теплиці з використанням комбінації натрієвих і галогенових ламп високого тиску в режимі освітлення 16 годин день: 8 годин ніч. Для отримання незрілих ембріонів F2, що використовуються для трансформації, здійснювали контрольоване запилення сибсів. Качани кукурудзи збирали приблизно через 8-10 днів після запилення, коли незрілі ембріони мали розмір від 1,0 мм до 2,0 мм. Інфікування і спільне культивування. З качанів кукурудза знімала листя, і поверхню стерилізували шляхом очищення рідким милом, просоченим в 20 % комерційно доступному відбілювачі (що містить 5 % гіпохлорит натрію), залишали приблизно на 20 хвилин, а потім три рази промивали стерильною водою. Суспензію клітин Agrobacterium tumefaciens, що містять pDAS5162, супербінарний вектор, що включає ген, який кодує білок DIG-109, і рослинний селективний маркерний ген DSM2, отримували шляхом перенесення 1 або 2 петель бактерій [культивовані протягом 2-3 днів при 28 °C на твердому середовищі YEP (г/л: дріжджовий екстракт Bacto, 10; пептон Bacto, 10; NaCl, 5; агар, 15), що містить 100 мг/л спектиноміцину, 10 мг/л тетрацикліну і 250 мг/л стрептоміцину] в 5 мл рідкого інфекційного середовища [базального середовища LS (Linsmaier and Skoog, 1965), вітаміни N6 (Chu et al., 1975), 1,5 мг/л 2,4 16 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-D), 68,5 г/л сахарози, 36,0 г/л глюкози, 6 мМ L-проліну, pH 5.2], що містить 100 мкК ацетосирінгону. Альтернативно, суспензію клітин Agrobacterium tumefaciens, що містять pDAS5848, супербінарний вектор, що включає ген, кодуючий білок DIG-109 і рослинний селективний маркерний ген AAD-1, отримували шляхом перенесення 1 або 2 петель бактерії, культивовані як описано вище, в 5 мл рідких інфекційного середовища, що містить 100-200 мкМ ацетосирингону. У обох випадках, розчин струшували до отримання однорідної суспензії, і її концентрацію доводили до кінцевої густини 200 одиниць Клетта за допомогою колориметра КлеттаСаммерсона з використанням пурпурного фільтра (для трансформації pDAS5162), або до оптичної густини 1,2 на 550 нм (для трансформації pDAS5848). Незрілі ембріони виділяли безпосередньо в мікроцентрифугальну пробірку, що містить 2 мл інфекційного середовища. Потім середовище видаляли і замінювали 1 мл розчину Agrobacterium, після чого розчин Agrobacterium/ембріон інкубували протягом 5-10 хвилин при кімнатній температурі. Потім ембріони переносили в середовище для спільного культивування [базальне середовище LS, вітаміни N6, 1,5 мг/л 2,4-D, 30,0 г/л сахарози, 6 мМ L-проліну, 0,85 мг/л AgNО3, 2,8 г/л геланової камеді (PhytoTechnology Laboratories, Lenexa, KS), pH 5,8], що містить 100 мкМ ацетосирингону (для трансформантів pDAS5162) або 100-200 мкК ацетосирингону (для трансформантів pDAS5848), і спільно культивували протягом 3-4 днів при 20 °C в темряві. Після спільного культивування, ембріони переносили в регенеруюче середовище, що містить солі MS і вітаміни, 6 мМ L-проліну, 100 мг/г міо-інозиту, 500 мг/г MES, 30 г/л сахарози, 1,5 мг/г 2,4-D, 0,85 мг/г AgNO3, 250 мг/г цефотаксиму, 2,8 г/л геланової камеді, pH 5,8. Приблизно через 7 днів, ембріони переносили в те ж саме середовище, в яке було додано 3 мг/г біалофосу (для трансформантів pDAS5162) або 100 нM галоксифопу (для трансформантів pDAS5848) (селективне середовище). Трансформовані ізоляти ідентифікували приблизно через 8 тижнів і об'єднували в загальну масу шляхом перенесення на свіже селективне середовище з 2-тижневими інтервалами для регенерації і аналізу. Регенерація і продукування насіння. Для регенерації, культури переносили в індукційну середовище "28" (солі MS і вітаміни, 30 г/л сахарози, 5 мг/г бензиламінопурину, 1,5 мг/г 2,4-D, 250 мг/г цефотаксиму, 2,8 г/л геланової камеді, pH 5,7), в яку було додано 3 мг/г біалофосу (для трансформанів pDAS5162) або 100 нM галоксифопу (для трансформанів pDAS5848). -2 -1 Інкубування проводили протягом 1 тижня в умовах слабкого освітлення (14 мкЕм с ), а потім -2 -1 протягом 1 тижня в умовах сильного освітлення (приблизно 89 мкЕм с ). Потім тканини переносили в середовище для регенерації "36" (середовище, аналогічне індукційному середовищу, за винятком того, що воно не містило регуляторів росту рослини). Коли паростки досягали 3-5 см в довжину, рослини переносили в скляні пробірки для культивування, що містять середовище SHGA [(Schenk and Hildebrandt (1972), salts and vitamins; PhytoTechnologies Labr.), що містить 1,0 г/л міо-інозиту, 10 г/л сахарози і 2,0 г/л геланової камеді, pH 5,8] для подальшого культивування і розвитку пагонів і коріння. Рослини пересаджували в ту ж саму суміш ґрунту, описану раніше, і культивували в теплиці до початку цвітіння. Для отримання насіння проводили штучне запилення. Для фахівця в галузі трансформації кукурудзи очевидно, що для трансформації кукурудзи і для відбирання трансформованих рослин можуть бути застосовані і інші методи у випадку використання інших експресованих в рослині селективних маркерних генів (наприклад, генів толерантності до гербіцидів). Приклад 8 Біохімічний аналіз і біоаналізи рослин кукурудзи, продукуючих білок DIG-109, на токсичність для комах Продукування білка DIG-109 в трансгенних рослинах кукурудзи оцінювали по білках, екстрагованих з листя молодих рослин (генерація T0). Два диски листя кукурудзи діаметром 6 мм вміщували в пробірку для зразків, взяту з глибокого 96-ямкового планшета з набором пробірок (Costar Cat# 3957), і заморожували до -80° і зберігали до початку аналізу. У день аналізу, два 4,5-мілілітрових покритих цинком BB Daisy™ додавали в кожну (заморожену) пробірку разом з 200 мкл буфера для екстракції, що складається з PBS (забуференого фосфатом розчину; Fisher Cat# BP665-1) і 0,05 % твіну 20. Кожну пробірку закривали кришкою, і планшет вміщували в кульовий млин (Kleco™ 4-96 Pulverizer; Garcia Manufacturing, Visalia, CA) максимум на три хвилини. Подрібнені в порошок зразки центрифугували протягом 5 хвилин при 2500 × g, і супернатант, що містить розчинні білки, використовували в імуноаналізах. Імуноблот-аналіз білків, екстрагованих з листя кукурудзи, показав, що поліклональне антитіло проти DIG152RPC1 (отримане у кроликів, імунізованих активованим трипсином білком, 17 UA 112156 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що містить коровий токсин Cry1Ca) не вступає в перехресну реакцію з білками, екстрагованими з листя нетрансгенних рослин. У екстрактах рослин, трансформованих pDAS5162, білки деяких видів були детектовані з використанням антитіла проти DIG152PRC1. Очевидно, що незважаючи на те, що трансген, введений в кукурудзу шляхом трансформації pDAS5162, буде кодувати повнорозмірний білок DIG-109, однак, протеолітична активність клітин кукурудзи буде приводити до зростання ланцюга білка з утворенням надмірної кількості стабільних молекул з меншою молекулярною масою. Листя, зібране від незалежно отриманих трансгенних рослин кукурудзи, трансформованих конструкцією pDAS5162, тестували in vitro на токсичність для комах з використанням щойно личинок совки трав'яної, що вилупилися (FAW, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)), і Cry1Fрезистентною FAW (rFAW). Яйця FAW були отримані з комерційно доступного інсектарію (Benzob), а яйця rFAW були отримані від непромислових популяцій (Dow AgroSciences). Зразки сегментів листя були взяті для біоаналізів вирощених в теплиці рослин Т0 на токсичність для комах, і приблизно через два тижні, рослини переносили з лабораторії в теплицю. Для шматочка листя від кожної рослини (приблизно 1 кв. дюйм кожні) вміщували в окрему ямку 32ямкового планшета (CD International), поверхня якого була покрита 3 мл отвердженого 2 % агару. З яєць вилуплювалися личинки, яким давали корм, прийнятний для лускокрилих багатьох видів (Southland Products), і менше ніж через 24 години личинки відбирали. Приблизно 10 личинок на сегмент листя обережно вміщували в кожну ямку щіткою з верблюжої вовни. Інфіковані планшети герметично закривали перфорованими кришками, що поставляються разом з планшетами, а потім зберігали при 28 °C, при відносній вологості (ВВ) 40 %, в режимі освітлення 16 год.: 8 год. (день:ніч)] протягом трьох днів. Процент ураження (% DAM) кожного шматочка листа реєстрували по закінченні тесту. Ступінь ураження усереднювали і використовували для того, щоб визначити, які рослини мали найменше ураження комахами кожного тестованого типу. Тести повторювали декілька разів для всіх комах. Дані аналізували з використанням статистичної комп'ютерної програми JMP (SAS, Cary, NC) шляхом усереднення величин % DAM для кожної рослини і для кожного типу комахи. Для одностороннього аналізу ANOVA використовували модель "Fit Y × X". Якщо це необхідно, то для оцінки значущої відмінності середніх величин %DAM для кожної обробки застосовували метод розділення середніх Тьюкі-Крамера. Порівняння проводили для величин %DAM, отриманих від контрольних рослини одного і того ж віку. Рослини позитивного контролю вирощували з насіння комерційно доступного гібрида Herculex I™, продукуючого токсин Cry1Fa B.t. Негативний контроль (тобто, нетрансформовані рослини) був представлений лініями Hi II і B104, і ізолінією Herculex I™ (батько-гібрид Herculex I™, що не містить Cry). На фігурі 1 систематизовані результати, отримані в таких тестах за допомогою біоаналізу комах. Була несподівано виявлена позитивна кореляція між продукуванням DIG-109 в листі 2 трансгенних рослин і %DAM. Для FAW, F=35,3; d.f. (ступінь свободи) =1,33; Р
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюCombined use of сry1ca and сry1fa proteins for insect resistance managemetn
Автори англійськоюMeade, Thomas, Narva, Kenneth, Storer, Nicholas, P., Sheets, Joel, J., Woosley, Aaron, T., Burton, Stephanie, L.
Автори російськоюМид Томас, Нарва Кеннет, Сторер Николас П., Шитс Джоел Дж., Вусли Аарон Т., Бертон Стэфани Л.
МПК / Мітки
МПК: A01H 5/00, C07K 14/325, A01N 63/02, C12N 15/82, A01P 7/04, A01H 5/10
Мітки: інсектицидний, яка, сry1fa, рослина, кодує, днк, вироблення, білок, комах, містить, трансгенна, резистентності, сry1ca
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/52-112156-transgenna-roslina-yaka-mistit-dnk-shho-kodueh-insekticidnijj-bilok-sry1ca-i-dnk-shho-kodueh-insekticidnijj-bilok-sry1fa-dlya-viroblennya-rezistentnosti-do-komakh.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Трансгенна рослина, яка містить днк, що кодує інсектицидний білок сry1ca, і днк, що кодує інсектицидний білок сry1fa, для вироблення резистентності до комах</a>
Трансгенна рослина, яка містить днк, що кодує інсектицидний білок vip3ab, і днк, що кодує інсектицидний білок cry1ca, для керування резистентністю комах
Номер патенту: 111936
Опубліковано: 11.07.2016
Автори: Мід Томас, Вуслі Аарон Т., Бертон Стефані Л., Сторер Ніколас П., Нарва Кеннет, Шитс Джоел Дж.
МПК: C12N 15/82, A01H 5/10, A01P 7/04, A01N 63/02, C07K 14/325, A01H 5/00
Мітки: комах, білок, рослина, інсектицидний, містить, кодує, cry1ca, яка, днк, резистентністю, керування, трансгенна, vip3ab
Формула / Реферат:
1. Трансгенна рослина, яка містить ДНК, що кодує білок Vip3Ab, який має інсектицидну дію, і ДНК, що кодує білок Cry1Сa, який має інсектицидну дію.2. Трансгенна рослина за п. 1, де вказана рослина додатково містить ДНК, що кодує третій білок, який має інсектицидну дію, при цьому вказаний третій білок вибирають з групи, що складається з Cry1Fa, Cry1Da, Cry1Be і Cry1E.3. Трансгенна рослина за п. 2, де вказаний третій білок...
Трансгенна рослина, яка містить днк, що кодує інсектицидний білок cry1ab, і днк, що кодує інсектицидний білок cry1be, для керування резистентністю комах
Номер патенту: 111935
Опубліковано: 11.07.2016
Автори: Нарва Кеннет, Шитс Джоел Дж., Сторер Ніколас П., Бертон Стефані Л., Мід Томас, Вуслі Аарон Т.
МПК: A01P 7/04, A01N 63/02, C12N 15/82, A01H 5/10, C07K 14/325, A01H 5/00
Мітки: яка, резистентністю, кодує, рослина, комах, днк, білок, cry1be, містить, трансгенна, керування, cry1ab, інсектицидний
Формула / Реферат:
1. Трансгенна рослина, яка містить ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Ab, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Be.2. Трансгенна рослина за п. 1, де вказана рослина додатково містить ДНК, що кодує третій інсектицидний білок, де вказаний третій білок вибраний з групи, що складається з Cry2A, Cry1I і DIG-3.3. Трансгенна рослина за п. 2, де вказана рослина додатково містить ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Fa, і ДНК, що...
Трансгенна рослина, що містить днк, яка кодує інсектицидний білок vip3ab, і днк, яка кодує інсектицидний білок cry1fa, стійка до лускокрилих шкідників
Номер патенту: 111934
Опубліковано: 11.07.2016
Автори: Нарва Кеннет, Шитс Джоел Дж., Вуслі Аарон Т., Бертон Стефані Л., Сторер Ніколас П., Мід Томас
МПК: A01H 5/00, A01H 5/10, A01N 63/02, A01P 7/04, C12N 15/82, C07K 14/325
Мітки: шкідників, лускокрилих, рослина, містить, днк, білок, трансгенна, стійка, cry1fa, яка, vip3ab, інсектицидний, кодує
Формула / Реферат:
1. Трансгенна рослина, що містить ДНК, яка кодує інсектицидний білок Vip3Ab, і ДНК, яка кодує інсектицидний білок Cry1Fa, де вказаний інсектицидний білок Cry1Fa є щонайменше на 95 % ідентичним SEQ ID NO:1, і вказаний інсектицидний білок Vip3Ab є щонайменше на 95 % ідентичним SEQ ID NO:2.2. Насінина рослини за п. 1, що містить ДНК, яка кодує інсектицидний білок Vip3Ab, і ДНК, яка кодує інсектицидний білок Cry1Fa.3....
Трансгенна рослина цукрової тростини, яка містить днк, що кодує інсектицидний білок cry1fa, і днк, що кодує інсектицидний білок cry1ab, для боротьби з вогнівкою цукрової тростини
Номер патенту: 112056
Опубліковано: 25.07.2016
Автори: Сторер Ніколас П., Бертон Стефані Л., Мід Томас, Шитс Джоел Дж., Нарва Кеннет
МПК: A01H 5/00, C12N 15/82, C07K 14/325, A01P 7/04, A01N 63/02, A01H 5/10
Мітки: білок, яка, кодує, боротьби, тростини, містить, рослина, cry1fa, цукрової, інсектицидний, трансгенна, днк, вогнівкою, cry1ab
Формула / Реферат:
1. Трансгенна рослина цукрової тростини, яка містить ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Fa, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry1Ab.2. Трансгенна рослина цукрової тростини за п. 1, в якій ДНК, що кодує коровий токсиновмісний білок Cry1Fa, і ДНК, що кодує коровий токсиновмісний білок Cry1Ab, інтрогресовані у вказану рослину цукрової тростини.3. Частина трансгенної рослини за п. 1, яка містить ДНК, що кодує інсектицидний...
Трансгенна рослина, яка містить cry1ab та cry2aa, для регулювання європейського кукурудзяного метелика і способи боротьби зі стійкістю комах
Номер патенту: 111814
Опубліковано: 24.06.2016
Автори: Мід Томас, Шитс Джоел Дж., Вуслі Аарон Т., Бертон Стефані Л., Нарва Кеннет, Сторер Ніколас П.
МПК: C07K 14/325, C12N 15/82, A01H 5/10, A01N 63/02, A01H 5/00
Мітки: європейського, яка, регулювання, трансгенна, містить, cry2aa, боротьби, кукурудзяного, стійкістю, комах, cry1ab, способи, метелика, рослина
Формула / Реферат:
1. Трансгенна рослина, що містить ДНК, яка кодує інсектицидний білок Cry1Ab, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry2Aa.2. Трансгенна рослина за п. 1, яка додатково містить ДНК, що кодує третій інсектицидний білок, вказаний третій білок вибраний з групи, яка складається з Cry1Fa, Cry1Be, Cry1I і DIG-3.3. Трансгенна рослина за п. 2, де вказаний третій білок вибраний з групи, яка складається з Cry1Fa і Cry1Be, вказана рослина...
Попередній патент: Розкладаний видалюваний імплантат для безперервного вивільнення активної сполуки
Наступний патент: Моноклональне антитіло до c-mеt
Випадковий патент: Спосіб лікування гострого деструктивного панкреатиту