Трансгенна рослина, що містить днк, яка кодує інсектицидний білок cry1cа та cry1аb для боротьби з лускокрилими шкідниками

Реферат: Даний винахід включає способи і рослини для контролю лускокрилих комах, і вказані рослини містять комбінацію інсектицидного білка Сrу 1Са і інсектицидного білка Cry 1Ab для сповільнення або запобігання розвитку стійкості комах. UA 112287 C2 (12) UA 112287 C2 UA 112287 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рівень винаходу Люди вирощують кукурудзу для використання як їжі і джерела енергії. Люди також вирощують бавовну і множину інших зернових культур, що включають в себе сою. Комахи поїдають і ушкоджують рослини і таким чином підривають зусилля людини. Щорічно затрачуються мільярди доларів для контролю комах-шкідників, де збиток, який вони наносять, обчислюється додатковими мільярдами доларів. Для контролю комах-шкідників застосовуються насамперед синтетичні органічні хімічні інсектициди, разом з тим, в деяких сферах важливу роль відіграють біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, отримані з Bacillus thuringiensis (Bt). Здатність виробляти стійкі до комах рослини за допомогою їх трансформації генами інсектицидного білка Bt являє собою революційну зміну в сучасному сільському господарстві і підвищує важливість і значення інсектицидних білків і їх генів. Для створення стійких до комах трансгенних рослин використовувалися декілька Bt-білків, які в цей час успішно зареєстровані і введені в комерційний обіг. Вони включають в себе білки кукурудзи Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fa і Cry3Bb, білки бавовни Cry1Ac і Cry2Ab і картопляний білок Cry3A. Експресуючі вказані білки комерційні продукти експресують єдиний білок, крім тих випадків, коли бажано об'єднати інсектицидний спектр 2 білків (наприклад, Cry1Ab і Cry3Bb в кукурудзі об'єднують для забезпечення стійкості до лускокрилих шкідників і до личинок, що ушкоджують коріння, відповідно), або якщо незалежна дія білків робить їх корисною як інструмент для затримки розвитку стійкості у сприйнятливих популяцій комах (наприклад, об'єднують білки бавовни Cry1Ac і Cry2Ab для забезпечення контролю стійкості до листовійки-брунькоїду тютюну). У зв'язку з цим, деякі з якостей стійких до комах трансгенних рослин, які привели до швидкого і широко поширеного прийняття цієї технології, також викликають стурбованість можливістю розвитку у популяцій шкідників стійкості до інсектицидних білків, які продукуються цими рослинами. Був запропонований ряд стратегій для збереження корисності властивостей стійкості до комах, зумовленої Bt білками, які включають в себе застосування білків у високих дозах, застосування в комбінації зі "сховищами", і спільне застосування з різними токсинами або пошкодження цими токсинами (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management", Nature Biotechnol. 16: 144-146). Білки, вибрані для використання з метою керування стійкістю комах (IRM), в сукупності повинні виявляти свій інсектицидний ефект незалежно таким чином, щоб стійкість, що розвивається до одного білка, не викликала розвиток стійкості до другого білка (тобто, щоб була відсутня перехресна стійкість до цих білків). Якщо, наприклад, популяція шкідника, вибрана по стійкості до "білка А", сприйнятлива до "білка В", можна зробити висновок про відсутність перехресної стійкості, і що комбінація білка А і білка В буде ефективно затримувати розвиток стійкості до білка А єдиного. При відсутності стійких популяцій комах можна провести оцінку на основі інших характеристик, які, ймовірно, пов'язані з механізмом дії і інтенсивністю перехресної стійкості. Було запропоноване застосування рецептор-опосередкованого зв'язування для ідентифікації інсектицидних білків з ймовірною відсутністю перехресної стійкості (van Mellaert et al. 1999). Ключовим фактом для прогнозу відсутності перехресної стійкості, який лежить в основі згаданого підходу, є те, що інсектицидні білки не конкурують за рецептори у сприйнятливих видів комах. У випадку, якщо два токсини B.t. Cry конкурують за один і той же рецептор, і згодом у комахи відбувається певна мутація рецептора, в результаті якої один з токсинів більше не зв'язується з цим рецептором і тому втрачає інсектицидну дію проти цієї комахи, то у цієї комахи може також виникати стійкість до другого токсину (який конкурентно зв'язується з цим рецептором). Разом з тим, якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, це може служити ознакою відсутності одночасної стійкості комахи до двох згаданих токсинів. Для захисту рослин від множини комах-шкідників в цей час застосовується Cry1Ab, що являє собою інсектицидний білок, який використовується в трансгенній кукурудзі. Білок Cry1Ab забезпечує захист від основного шкідника кукурудзи, яким є європейський кукурудзяний метелик. Додаткові токсини Cry можна знайти в переліку на вебсайті комітету по офіційній номенклатурі B.t (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Див. Додаток А до вказаного джерела. У цей час існує близько 60 основних груп токсинів "Cry" (Cry1-Cry59), з додатковими токсинами Cyt, токсинами VIP і подібними токсинами. Багато які з цих численних груп мають підгрупи, які позначаються великими буквами, і в підгрупах з великими буквами 1 UA 112287 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виділяють підпідгрупи, які позначаються малими буквами. (Наприклад, Cry1 має підгрупи A-L, і в підгрупі Cry1A виділяють підпідгрупи а-i). Коротка суть винаходу Даний винахід частково стосується несподіваного відкриття, що Cry1Ca має високу активність проти популяції вогнівки цукрової тростини, що включає в себе популяцію стійкої до Cry1Ab вогнівки цукрової тростини. Фахівцям в даній галузі техніки буде очевидно, в плані переваги даного розкриття, що рослини, які продукують Cry1Ca і Cry1Ab (які включають в себе інсектицидні ділянки вказаних білків), будуть корисними для сповільнення або запобігання розвитку стійкості до будь-якого одного з вказаних інсектицидних білків. Наприклад, ген cry1Fa також може складатися з цих генів/білка з двох основ. Даний винахід також стосується відкриття, що Cry1Ca і Cry1Ab не конкурують один з одним за зв'язування з рецепторами кишечнику кукурудзяної листової совки (Spodoptera frugiperda; FAW). КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР Фіг. 1 показує конкурентне зв'язування корового токсину Cry1Ab, корового токсину Cry1Ca і 125 корового токсину Cry1Ab, міченого I, з мембранними везикулами щіткової облямівки (BBMV) Spodoptera frugiperda. Фіг. 2 показує конкурентне зв'язування корового токсину Cry1Ca, корового токсину Cry1Ab і 125 корового токсину Cry1Ab, міченого I, з BBMV Spodoptera frugiperda. КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ SEQ ID NO:1 показує коровий Cry1Ca/протоксин Cry1Ab химерний білок 1164 aa (DIG-152), SEQ ID NO:2 показує коровий токсин Cry1Ca, SEQ ID NO:3 показує коровий токсин Cry1Ab. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід частково стосується несподіваного відкриття, що Cry1Ca має високу активність проти популяції вогнівки цукрової тростини (SCB; Diatraea saccharalis), яка стійка до Cry1Ab. Відповідно, даний винахід частково стосується несподіваного відкриття, що Cry1Ca можна використовувати в комбінації або в "комплекті" з Cry1Ab для боротьби з розвитком стійкості до будь-якого одного зі згаданих інсектицидних білків. Інакше кажучи, даний винахід частково стосується несподіваного відкриття, що популяція вогнівки цукрової тростини, вибрана по стійкості до Cry1Ab, не має стійкості до Cry1Ca; популяція вогнівки цукрової тростини зі стійкістю до токсину Cry1Ab є сприйнятливою (тобто, не виявляє перехресної стійкості) до Cry1Ca. Таким чином, даний винахід включає в себе використання токсину Cry1Ca для контролю популяцій вогнівки цукрової тростини, які є стійкими до Cry1Ab. Фахівцям в даній галузі техніки буде очевидно, в плані переваги даного розкриття, що рослини, які продукують Cry1Ca і Cry1Ab (які включають в себе інсектицидні ділянки вказаних білків), будуть корисними для сповільнення або запобігання розвитку стійкості до будь-якого одного з вказаних інсектицидних білків. Даний винахід включає в себе використання Cry1Ca для захисту цукрової тростини і інших економічно важливих видів рослин від пошкодження і втрати урожаю, викликаного вогнівкою цукрової тростини або популяціями вогнівки цукрової тростини, які стали стійкими до Cry1Ab. Вогнівка цукрової тростини може також бути шкідником кукурудзи. Це особливо актуальне для деяких країн Центральної і Південної Америки, наприклад, Бразилії і Аргентини. Таким чином, згідно з даним винаходом також можна захищати, наприклад, кукурудзу. Даний винахід, таким чином, описує сукупність заходів щодо керування стійкістю комах (IRM) для запобігання або зменшення розвитку стійкості до Cry1Ab і/або Cry1Ca у вогнівки цукрової тростини. Додатково, дослідження зв'язування рецептора з допомогою радіоміченого Cry1Ca і тканини комахи Spodoptera frugipera; кукурудзяної листової совки (FAW), показали, що Cry1Ab не конкурує за ділянку високоафінного зв'язування, з якою зв'язується Cry1Ca. Ці результати вказують, що комбінацію Cry1Ab і Cry1Ca можна використовувати як ефективний спосіб зниження розвитку стійкості в популяціях комахи (таких як FAW і SCB) до білків Cry1Ab і/або Cry1Ca для рослин (таких як кукурудза і цукрова тростина), які продукують обидва білки. Спільні дослідження токсину показали, що білок Cry1Ca зв'язується з двома білками в BBMV у S.frugiperda, один з яких має молекулярну масу 40 кДа і інший 44 кДа, де білок Cry1Ab зв'язується з єдиним білком 150 кДа (Aranda et al., 1996) і його не ввели в дослідженнях в дію неконкурентного зв'язування. Таким чином, даний винахід також включає в себе комбінацію Cry1Ca і Cry1Ab як сукупність заходів IRM щодо зниження розвитку стійкості кукурудзяної листової совки і/або вогнівки цукрової тростини до якого-небудь білка, або по боротьбі зі стійкістю популяцій вогнівки 2 UA 112287 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цукрової тростини, що виявляється до Cry1Ab. Даний винахід стосується наступного: композицій для контролю лускокрилих шкідників, де вказані композиції містять клітини, які експресують коровий токсиновмісний білок Cry1Ca і коровий токсиновмісний білок Cry1Ab; клітин-хазяїв, трансформованих для експресії обох білків: корового токсиновмісного білка Cry1Ab і корового токсиновмісного білка Cry1C, де вказаний хазяїн являє собою клітину мікроорганізму або рослини (полінуклеотидний суб'єкт (суб'єкти) переважно знаходяться в генетичній конструкції під контролем промотору, що не походить з Bacillus thuringiensis (функціонально зв'язаного з ним/які містять його); полінуклеотиди, що розглядаються, можуть містити кодон, який використовується для посилення експресії в рослині); способу контролю лускокрилих шкідників, що містить контакт вказаних шкідників або навколишнього середовища вказаних шкідників з ефективною кількістю композиції, яка продукує коровий токсиновмісний білок Cry1Ab, і клітини, яка експресує коровий токсиновмісний білок Cry1C; рослини (такоїяк, наприклад, кукурудза або соя, або бавовна, або цукрова тростина), яка містить ДНК, що кодує коровий токсиновмісний білок Cry1Ca, і ДНК, що кодує коровий токсиновмісний білок Cry1Ab; і насіння такої рослини; рослини (такоїяк, наприклад, кукурудза або соя, або бавовна, або цукрова тростина), де у вказану рослину кукурудзи була впроваджена ДНК, що кодує коровий токсиновмісний білок Cry1Ca, і ДНК, що кодує коровий токсиновмісний білок Cry1Ab; і насіння такої рослини. Автори винаходу в біотестах з штучним поживним середовищем продемонстрували, наприклад, що Cry1Ca (білок з рекомбінантного штаму Pseudomonas fluorescens MR1206/DC639; плазміда pMYC2547), має високу ефективність для контролю популяцій вогнівки цукрової тростини (SCB; Diatraea saccharalis), які були вибрані по стійкості до Cry1Ab. Це є показником корисності Cry1Ca для контролю популяцій SCB, які стійкі до Cry1Ab, або для зниження розвитку стійкості до Cry1Ab в популяціях SCB. Частково виходячи з описаних у винаході даних, вважається, що спільна експресія Cry1Ca і Cry1Ab може створити високоефективний комплекс IRM для контролю SCB. Для розширення спектра дії до вказаної комбінації можна додавати інші білки. Наприклад, для кукурудзи, додавання Cry1Fa зможе створити комплекс IRM проти європейського кукурудзяного метелика (ECB), Ostrinia nubilalis (Hubner), при додаванні ще одного МОА створюється комплекс для контролю вогнівки цукрової тростини SCB. Інформацію про білок Cry1C як потенційний біоінсектицид для рослин див. в публікації (Avisar et al. 2009). Avisar D, Eilenberg Н, Keller M, Reznik N, Segal M, Sneh В, Zilberstein А (2009) The Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cry1C as а potential bioinsecticide in plants. Plant Science 176:315-324. Рецептори комах. Як описано в розділі прикладів, дослідження конкурентного рецепторного зв'язування з використанням радіоміченого корового білка-токсину Cry1Ca показали, що коровий білок-токсин Cry1Ab не конкурує за присутню в тканинах комах FAW високоафінний сайт зв'язування, з якими зв'язується Cry1Ca. Ці результати показують, що комбінація білків Cry1Ab і Cry1Ca може бути ефективним засобом для зниження розвитку стійкості в популяціях FAW до Cry1Ab (і аналогічно, для зниження розвитку стійкості до Cry1Ca), і, ймовірно, буде підвищувати рівень стійкості до цього шкідника кукурудзяних рослин, які експресують обидва білки. Виходячи з цих даних, також передбачається, що Cry1Ca буде ефективний для контролю популяцій SCB, які мають стійкість до Cry1Ab. Один варіант здійснення полягає у використанні згаданих білків Cry в регіонах, де Cry1Ab перестав бути ефективним для контролю SCB внаслідок розвитку стійкості. Інший варіант здійснення полягає у використанні Cry1Ca в комбінації з Cry1Ab для зниження розвитку стійкості у SCB до білка Cry1Ab. Комбінації токсинів, описаних у винаході, можна використовувати для контролю лускокрилих шкідників. Дорослі лускокрилі, тобто, метелики і молі, харчуються в основному квітковим нектаром. Майже всі личинки, тобто, гусениці, харчуються рослинами, і багато які з личинок є серйозними шкідниками. Гусениці харчуються на листі або всередині листя, або поїдають коріння або стебла рослини, де вони позбавляють рослину поживних речовин і часто руйнують конструкцію фізичної опори рослини. Додатково, гусениці харчуються фруктами, тканинами і зерном і борошном, які зберігаються, руйнуючи вказані продукти для продажу або значною мірою зменшуючи їх вартість. Лускокрилі шкідники, що згадуються у винаході, належать до різних стадій життя шкідника, включаючи в себе личинкові стадії. Химерні токсини даного винаходу містять повну N-кінцеву токсичну ділянку корового токсину B.t. і, в деякій точці після кінця ділянки токсину білок несе транзицію в гетерологічній 3 UA 112287 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності протоксину. N-кінцева токсична ділянка токсину B.t. називається згідно з винаходом "коровим" токсином. Транзиція в гетерологічному сегменті протоксину може відбуватися приблизно біля сполуки токсину/протоксину або, як альтернатива, може зберігатися ділянка нативного протоксину (розташована після ділянки токсину) з транзицією в гетерологічному протоксині, розташованою в 5'-3' напрямку. Як приклад, один химерний токсин даного винаходу має повну корову токсичну ділянку Cry1Ab (амінокислоти від 1 до 601) і гетерологічний протоксин (амінокислоти від 602 до С-кінця). У одному переважному варіанті здійснення ділянка химерного токсину, яка містить протоксин, походить з білка-токсину Cry1Ab. Як другий приклад, другий химерний токсин даного винаходу, показаний в SEQ ID NO:1 (DIG-152), має повну корову токсичну ділянку Cry1Ca (амінокислоти від 1 до 619) і гетерологічний протоксин (амінокислоти від 620 до С-кінця). У переважному варіанті здійснення ділянка химерного токсину, яка містить протоксин, походить з білка-токсину Cry1Ab. Фахівцям в даній галузі техніки буде очевидно, що токсини B.t., які навіть належать до конкретного класу, наприклад, до Cry1Ca, до деякої міри можуть варіювати по довжині і точній локалізації транзиції від ділянки токсину до ділянки протоксину. Звичайно довжина токсинів Сry1Ca складає від близько 1150 до близько 1200 амінокислот. Транзиція від ділянки токсину до ділянки протоксину буде звичайно займати ділянку в діапазоні від близько 50 % до близько 60 % від загальної довжини токсину. Химерний токсин даного винаходу буде повністю включати в себе всю протяжність цієї корової N-кінцевої ділянки токсину. Таким чином, химерний токсин буде містити щонайменше близько 50 % повнорозмірних B.t. токсинів Сry1Ca або Cry1Ab. Звичайно вони будуть складати щонайменше близько 590 амінокислот. Відносно ділянки протоксину, повнорозмірна ділянка Cry1(b) протоксину розташована від кінця ділянки токсину до С-кінця молекули. Кінець цієї ділянки довжиною приблизно від 100 до 150 амінокислот є найбільш важливим для включення в нього химерного токсину даного винаходу. Гени і токсини. Гени і токсини, корисні згідно з даним винаходом, включають в себе не тільки повнорозмірні розкриті послідовності, але також і фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутанти і злиті білки, які зберігають властивості пестицидної активності токсинів, конкретно описаних у винаході як приклади. Використовувані у винаході терміни "варіанти" або "зміни" генів стосуються нуклеотидних послідовностей, які кодують однакові токсини, або які кодують еквівалентні токсини, що мають пестицидну дію. Використовуваний у винаході термін "еквівалентні токсини" стосується токсинів, що мають однакову або по суті однакову біологічну дію проти цільових шкідників, як і токсини, вказані в формулі винаходу. Використовувані в даному винаході межі ідентичності послідовностей складають близько 95 % (білки Cry1Ab і 1Са), 78 % (Cry1А і Cry1C) і 45 % (Cry1), див. публікації "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Ці межі також можна застосовувати тільки для корових токсинів (для токсинів Cry1Ab і Cry1C). Перелік номерів GENBANK, приведений нижче в Додатку А, також можна використовувати для отримання послідовності для будь-якого з генів і білків, розкритих або згаданих в даному винаході. Фахівцям в даній галузі техніки буде очевидно, що існує ряд способів ідентифікації і отримання генів, що кодують активні токсини. Конкретні гени або ділянки генів, згадані у винаході як приклад, можна виділяти з колекцій депозитарію культур, як описано вище. Ці гени, або їх ділянки або варіанти, також можна конструювати штучно, наприклад, за допомогою синтезатора генів. Варіації генів можна легко конструювати за допомогою стандартних технологій створення точкових мутацій. Також можна створювати фрагменти цих генів згідно зі стандартними методиками з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз. Наприклад, можна використовувати ферменти, такі як Bal31, або сайтнаправлений мутагенез для систематичного відсікання нуклеотидів відкінців цих генів. Також можна отримувати гени, що кодують активні фрагменти, за допомогою ряду ферментів рестрикції. Можна використовувати протеази для прямого створення активних фрагментів згаданих токсинів. Фрагменти і еквіваленти, які зберігають пестицидну дію токсинів, що розглядаються, входять в об'єм даного винаходу. Крім того, завдяки надмірності генного коду множина різних послідовностей ДНК може кодувати розкриті у винаході амінокислотні послідовності. Фахівцям в даній галузі техніки будуть очевидні способи створення таких альтернативних послідовностей ДНК, що кодують однакові, або по суті аналогічні токсини. Ці різні послідовності ДНК входять в об'єм даного винаходу. Використовуване у винаході поняття "по суті аналогічна" послідовність стосується послідовностей, що мають амінокислотні заміни, делеції, додавання або інсерції, які 4 UA 112287 C2 5 10 15 20 25 30 35 фактично не впливають на пестицидну дію. У це визначення також включені фрагменти, що зберігають пестицидну дію. Додатковим способом ідентифікації генів і генних ділянок, що кодують токсини і корисних згідно з даним винаходом, є використання олігонуклеотидних зондів. Ці зонди являють собою виявлювані нуклеотидні послідовності. Детекцію таких послідовностей можна провести за допомогою відповідної мітки, або можна задіяти флуоресцентні властивості, як описано в міжнародній патентній заявці № WO 93/16094. Як відомо в даній галузі техніки, якщо при гібридизації молекули зонда і зразка нуклеїнової кислоти утворюється міцний зв'язок між цими двома молекулами, то обґрунтовано передбачається, що зонд і зразок мають значний ступінь гомології. Переважно, гібридизацію проводять при суворих умовах способами, відомими в даній галузі техніки, які описані, наприклад, авторами Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Деякі приклади концентрацій солей і температурних комбінацій являють собою (в порядку збільшення ступеня суворості): 2 X SSPE або SSC (розчин хлориду і цитрату натрію) при кімнатній температурі; 1 X SSPE або SSC при 42ºC; 0,1 X SSPE або SSC при 42ºC; 0,1 X SSPE або SSC при 65ºC. Детекція зонда являє собою загальноприйнятий спосіб для визначення факту проведення гібридизації. Такий аналіз зондів забезпечує швидкий спосіб ідентифікації кодуючих токсини генів даного винаходу. Нуклеотидні сегменти, які використовуються як зонди згідно з винаходом, можна синтезувати за допомогою синтезатора ДНК і стандартних методик. Вказані нуклеотидні послідовності можна також використовувати як ПЛР-праймери для ампліфікації генів даного винаходу. Конкретні токсини даного винаходу приведені у винаході як конкретні приклади. Оскільки згадані токсини є просто прикладами токсинів даного винаходу, буде очевидно, що даний винахід містить варіанти або еквіваленти токсинів (і нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), що мають пестицидну дію, яка однакова або схожа з дією токсину, що розглядається. Еквівалентні токсини і токсин, що розглядається, мають амінокислотну гомологію. Ця амінокислотна гомологія звичайно перевищує 75 %, переважно складає більше 90 %, і найбільш переважно більше 95 %. Найбільш виражену амінокислотну гомологію виявляють в найважливіших областях токсину, які зумовлюють біологічну дію або залучені до зумовлення тривимірної конфігурації, яка зрештою відповідає за біологічну дію. У цьому відношенні підходять конкретні заміни амінокислоти, і можна передбачати, що ці заміни знаходяться в областях, які не мають вирішального значення для дії, або вони являють собою консервативні амінокислотні заміни, які не торкаються тривимірної конфігурації молекули. Наприклад, амінокислоти можуть належати до наступних класів: неполярні, незаряджені полярні, лужні і кислі. Консервативні заміни, за допомогою яких амінокислота одного класу замінюється на іншу амінокислоту того ж типу, входять в об'єм даного винаходу, якщо ця заміна значною мірою не змінює біологічну дію сполуки. У таблиці 1 приведений перелік прикладів амінокислот, що належать до кожного класу. 40 45 50 У деяких випадках також можна робити неконсервативні заміни. Вирішальним чинником є те, що ці заміни не повинні значною мірою знижувати біологічну дію токсину. Рекомбінантні хазяї. Гени, які кодують токсини даного винаходу, можна вставляти в широкий спектр клітин-хазяїв мікроорганізмів або рослин. Експресія генів токсину прямо або опосередковано приводить до внутрішньоклітинної продукції і збереження пестициду. Можна використовувати кон'югаційне перенесення і рекомбінантне перенесення для створення штаму B.t., який експресує обидва токсини даного винаходу. Інші організми-хазяї також можна трансформувати одним або двома генами токсину, що використовуються в цьому випадку для досягнення синергетичного ефекту. Можна застосовувати мікроорганізми з прийнятними мікробними хазяями, наприклад, Pseudomonas, у шкідника в місці їх розмноження і поглинання. 5 UA 112287 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Результатом є контроль над шкідником. Альтернативно, мікроорганізм, що є хазяєм гена токсину, можна обробляти при умовах, які пролонгують дію токсину і стабілізують клітину. Потім оброблену клітину, яка зберігає токсичну активність, можна застосовувати в навколишньому середовищі цільового шкідника. Якщо ген токсину B.t. впроваджують в мікроорганізм-хазяїн за допомогою відповідного вектора, і вказаний хазяїн використовується в навколишньому середовищі в живому стані, має значення використання конкретних мікроорганізмів-хазяїв. Хазяїв вибирають з мікроорганізмів, які мають відому здатність в одній або більше сільськогосподарських культур, які розглядаються, заселяти "фітосферу" (філоплан, філосферу, ризосферу і/або ризоплан). Вибирають такі мікроорганізми, які здатні успішно конкурувати в конкретному середовищі (сільськогосподарські культури і інші середовища мешкання комах) з мікроорганізмами дикого типу, забезпечувати стійке збереження і експресію гена, який експресує поліпептидний пестицид, і забезпечувати поліпшений захист пестициду від розкладання і інактивації в навколишньому середовищі. Відомо, що велика кількість мікроорганізмів населяє філоплан (поверхня листя рослини) і/або ризосферу (ґрунт, який оточує коріння рослини) у широкого спектра важливих сільськогосподарських культур. Ці мікроорганізми включають в себе бактерії, морські водорості і гриби. Особливий інтерес викликають такі мікроорганізми, як, наприклад, бактерії роду Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc і Alcaligenes; гриби, особливо дріжджі, наприклад, роду Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula і Aureobasidium. Особливий інтерес викликають такі фітосферні види бактерій як Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus і Azotobacter vinlandii; і фітосферні види дріжджів, такі як Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, С. diffluens, С. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae і Aureobasidium pollulans. Особливий інтерес викликають пігментовані мікроорганізми. Широка різноманітність шляхів доступна для впровадження в мікроорганізм-хазяїн гена B.t., що кодує токсин при умовах, які дозволяють стійко зберігати і експресувати ген. Ці способи відомі фахівцям в даній галузі техніки і описані, наприклад, в патенті США № 5135867, який включений у винахід шляхом посилання. Обробка клітин. Bacillus thuringiensis або рекомбінантні клітини, які експресують токсини B.t., можна обробляти для пролонгування дії токсину і стабілізації клітини. Утворювана мікрокапсула пестициду містить токсин B.t. або токсини в клітинній структурі, яка була стабілізована, і буде захищати токсин в ході застосування мікрокапсули в середовищі шкідника-мішені. Прийнятні клітини-хазяї можуть включати в себе або прокаріоти або еукаріоти, і звичайно обмежені клітинами, які не продукують речовин, що є токсичними для вищих організмів, наприклад, ссавців. Разом з тим, можна використовувати організми, які продукують токсичні речовини для вищих організмів, якщо ці токсичні речовини нестабільні або рівень застосування є досить низьким, щоб уникнути будь-якої імовірності токсичного впливу на хазяя-ссавця. Як хазяї особливий інтерес представляють прокаріоти і нижчі еукаріоти, такі як гриби. Звичайно для обробки задіюють інтактні клітини, в основному в проліферативній формі, а не у вигляді спори, хоч в деяких випадках можна використовувати спори. Обробку мікробної клітини, наприклад, мікроорганізму, що містить ген або гени токсину B.t., можна здійснювати хімічними або фізичними способами, або комбінацією хімічних і/або фізичних способів при умові, що відсутній і шкідливий вплив технології на властивості токсину, і зменшення здатності клітин до захисту токсину. Прикладами хімічних реагентів є галогенові агенти, зокрема, галогени з атомними номерами 17-80. Більш конкретно, можна використовувати йод при помірних умовах і протягом достатнього часу для досягнення бажаних результатів. Інші прийнятні способи включають в себе обробку альдегідами, такими як глутаральдегід; протиінфекційними агентами, наприклад, зефіран хлоридом і цетилпіридинію хлоридом; спиртами, такими як ізопропіл і етанол; різними гістологічними фіксаторами, такими як йодний розчин Люголю, фіксатор Боуена, різні кислоти і фіксатор Хеллі (див.: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); або комбінацію фізичних впливів (нагрівання) і хімічних агентів, які зберігають і пролонгують дію токсину, який продукується в клітині при введенні клітини в середовище хазяя. Прикладами фізичних способів є короткохвильове випромінювання, наприклад, гамма-випромінювання і рентгенівське випромінювання, заморожування, ультрафіолетове опромінення, ліофілізація і т. п. Способи 6 UA 112287 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обробки мікробних клітин розкриті в патентах США № 4 695455 і 4695462, включених у винахід шляхом посилання. Звичайно клітини мають підвищену структурну стійкість, яка збільшує їх стабільність в умовах навколишнього середовища. Якщо пестицид знаходиться в попередній формі, необхідно вибирати спосіб обробки клітин, який не інгібує перетворення пре-форми в зрілу форму пестициду за допомогою патогена цільового шкідника. Наприклад, формальдегід зшиває білки і здатний інгібувати перетворення пре-форми поліпептиду пестициду. Спосіб обробки повинен зберігати щонайменше значну частину властивостей біодоступності або біоактивності токсину. Особливо важливі властивості для відбору клітин-хазяїв з метою продукції включають в себе простоту впровадження гена або генів B.t. в клітину-хазяя, доступність систем експресії, ефективність експресії, стабільність пестициду в хазяї і присутність додаткових генетичних здатностей. Властивості для застосування як пестицидної мікрокапсули, що розглядаються, включають в себе захисні характеристики для пестициду, такі як товсті клітинні стінки, пігментація і внутрішньоклітинна упаковка або утворення тілець включення; виживання у водному середовищі; відсутність токсичності для ссавців; привабливість для поглинання шкідниками; здатність легко викликати загибель і фіксуватися без пошкодження токсину; і т. п. Інші важливі умови включають в себе простоту виготовлення і використання, економічність, стабільність при зберіганні і тому подібне. Ріст клітин. Клітину-хазяя, що містить інсектицидні ген або гени B.t., можна вирощувати в будь-якому зручному поживному середовищі, в якому конструкція ДНК дає селективну перевагу, і у всьому середовищі або по суті у всіх клітинах в селективному середовищі забезпечується збереження гена B.t. Потім ці клітини можна збирати загальноприйнятими способами. Альтернативно, клітини можна обробляти перед їх збиранням. Клітини B.t., які продукують токсини за винаходом, можна культивувати з використанням стандартних в даній галузі техніки середовищ і способів ферментації. Після завершення циклу ферментації бактерії можна збирати з ферментаційного бульйону першою сепарацією спор B.t. і кристалів за допомогою способів, відомих в даній галузі. Відновлені спори B.t. і кристали можна об'єднувати в змочуваний порошок, рідкий концентрат, гранули або інші рецептури за допомогою додавання сурфактантів, диспергуючих агентів, інертних носіїв і інших компонентів, щоб полегшити обробку і застосування для конкретних цільових шкідників. Ці рецептури і методики застосування широко відомі в даній галузі техніки. Рецептури. Рецептури гранульованих приманок, які містять атрактант і спори, кристали і виділені B.t. токсини, або рекомбінантні мікроорганізми, які містять гени, що отримуються з ізолятів B.t., розкриті в даному винаході, можна застосовувати на ґрунті. Рецептуру продукту також можна застосовувати як покриття насіння, або для обробки коріння, або для повної обробки рослини на більш пізніх етапах циклу злакової рослини. Для обробки рослин і ґрунту можна використовувати B.t.-клітини у вигляді змочуваних порошків, гранул або порошкових препаратів шляхом змішування з різними інертними матеріалами, такими як неорганічні мінерали (філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати і т. п.) або рослинними матеріалами (порошок з кукурудзяних качанів, рисове лушпиння, шкаралупа волоського горіха і т. п.). Рецептури можуть включати в себе адгезивні ад'юванти, стабілізуючі агенти, інші пестицидні добавки або сурфактанти. Рідкі рецептури можуть мати водну або неводну основу і використовуватися у вигляді піни, гелів, суспензій, емульгованих концентратів або подібних форм. Компоненти можуть включати в себе реологічні агенти, сурфактанти, емульгатори, диспергуючі агенти або полімери. Фахівцям в даній галузі техніки буде очевидно, що концентрація пестициду може широко варіювати залежно від природи конкретної рецептури, зокрема, чи є вона концентратом або виготовлена для безпосереднього застосування. Пестицид може бути присутнім в кількості щонайменше 1 % ваги і може становити 100 % ваги. У сухих рецептурах пестицид може складати приблизно від 1 до 95 % ваги, тоді як рідкі рецептури звичайно можуть мати приблизно від 1 до 60 % ваги твердих частинок в рідкій фазі. У рецептурах звичайно може 2 4 знаходитися від близько 10 близько до 10 клітин/мг. Вказані рецептури можна застосовувати в кількості приблизно від 50 мг (в рідкому або сухому вигляді) до 1 кг або більше на гектар. Рецептури можна застосовувати в середовищі мешкання лускокрилих шкідників, наприклад, на листі або на ґрунті, шляхом розпилення, обпудрювання, обприскування або подібними способами. Трансформація рослин. Переважним рекомбінантним хазяєм, який продукує інсектицидні білки даного винаходу, є трансформована рослина. Гени, що кодують Bt білки-токсини, розкриті у винаході, можна вставляти в клітини рослини, використовуючи множину способів, відомих в даній галузі техніки. Наприклад, для підготовки до вставки чужих генів у вищі рослини доступна 7 UA 112287 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 велика кількість векторів клонування, що містять систему реплікації в Escherichia coli і маркер, що дозволяє провести селекцію трансформованих клітин. Вектори містять, наприклад, серед іншого, pBR322, серії pUC, серії M13mp, pACYC184. Відповідно, фрагмент ДНК, який несе послідовність, що кодує Bt білок-токсин, можна вставляти у вектор на відповідній ділянці рестрикції. Отриману плазміду використовують для трансформації в Е. coli. Клітини Е. coli вирощують у відповідному поживному середовищі, потім збирають і лізують. Відновлюють плазміду. Як способи аналізу звичайно проводять аналіз послідовностей, аналіз рестрикції, електрофорез і інші біохімічні і молекулярно-біологічні тести. Після кожної маніпуляції використовувану послідовність ДНК можна розщеплювати і з'єднувати з наступною послідовністю ДНК. Кожну послідовність плазміди можна клонувати в тій же плазміді або в інших плазмідах. Залежно від способу вставки бажаних генів в рослину можуть бути потрібні інші послідовності ДНК. Наприклад, якщо для трансформації рослинної клітини використана плазміда Ti або Ri, то щонайменше права межа, але часто і права і ліва межа Ti або Ri плазміди Т-ДНК повинні з'єднуватися як фланкуюча область генів, призначених для вставки. Проведені інтенсивні дослідження використання Т-ДНК для трансформації рослинних клітин, що в достатньому об'ємі описані в патенті EP 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986) і An et al., (1985), і добре відомі в даній галузі техніки. Після включення в геном рослини вставлена ДНК є відносно стабільною. Вектор трансформації звичайно містить вибираний маркер, який додає трансформованим рослинним клітинам резистентності до біоциду або антибіотику, такому як біалафос, канаміцин, G418, блеоміцин або гігроміцин, серед іншого. Конкретний використовуваний маркер повинен відповідно дозволяти відбір трансформованих клітин, а не клітин, що не містять ДНК-вставку. Для вставки ДНК в рослинну клітину-хазяя доступна велика кількість способів. Ці способи включають в себе трансформацію з Т-ДНК, з використанням як агента трансформації Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes, злиття, ін'єкцію, біолістику (бомбардування мікрочастинками) або електропорацію, а також інші можливі способи. Якщо для трансформації використовують Agrobacteria, ДНК, що вставляється, необхідно клонувати в спеціальні плазміди, а саме, або в проміжний вектор або в бінарний вектор. Проміжні вектори можна інтегрувати в плазміди Ti або Ri шляхом гомологічної рекомбінації зумовленої послідовностями, які є гомологічними послідовностям в Т-ДНК. Плазміди Ti або Ri також містять vir-область, необхідну для перенесення Т-ДНК. Проміжні вектори не можуть самостійно реплікуватися в Agrobacteria. Проміжний вектор можна перенести в Agrobacterium tumefaciens за допомогою хелперной плазміди (кон'югация). Бінарні вектори можуть реплікуватися і в Е. coli і в Agrobacteria. Вони містять ген маркера селекції і лінкер або полилинкер, які обмежені правими і лівими прикордонними областями Т-ДНК. Вони можуть бути трансформовані безпосередньо в Agrobacteria (Holsters et al., 1978). Та, що Використовується як клітина-хазяїн Agrobacterium повинен містити плазміду, несучу vir-область. Ця vir-область необхідна для перенесення Т-ДНК в клітину рослини. Може бути присутнім додаткова Т-ДНК. Трансформована вказаним шляхом бактерія використовується для трансформації клітин рослини. Рослинні експланти переважно можна культивувати з Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes для перенесення ДНК в клітину рослини. Потім можна відновлювати цілі рослини з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, з частин листя, сегментів стебел, коріння, але також з протопластів або суспензії культивованих клітин) у відповідному середовищі, яке може містити антибіотики або біоциди для селекції. Отримані вказаним шляхом рослини потім можна тестувати на присутність вставки ДНК. Спеціальних вимог до плазмід у разі ін'єкції і електропорації не існує. Можна використовувати звичайні плазміди, наприклад, такі як похідні pUC. Трансформовані клітини ростуть всередині рослин звичайним шляхом. Вони можуть формувати зародкові клітини і передавати трансформовану ознаку (ознаки) рослинамнащадкам. Такі рослини можна вирощувати звичайним шляхом і схрещувати з рослинами, які мають ті ж самі трансформовані спадкові чинники або інші спадкові чинники. Отримувані гібридні суб'єкти мають відповідні фенотипічні властивості. У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини трансформують генами, в яких використовуваний кодон був оптимізований для рослин. Див., наприклад, патент США № 5380831, включений у винахід шляхом посилання. Деякі зрізані токсини розглянуті у винаході як приклад, разом з тим в галузі техніки Bt-білків відомо, що токсини 130 кДа-типу (повнорозмірні) мають N-кінцеву групу, яка являє собою коровий токсин, і С-кінцевий залишок, який є "хвостом" протоксину. Таким чином, відповідні "хвости" можна використовувати зі зрізаними/коровими токсинами даного винаходу. Див. наприклад, патент США № 6218188 і патент США № 6673990. Додатково, в даній галузі техніки відомі способи створення синтетичних Bt-генів для 8 UA 112287 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використання в рослинах (Stewart and Burgin, 2007). Одним з необмежувальних прикладів переважної трансформованої рослини є фертильна рослина кукурудзи, що містить рослинний експресований ген, що кодує білок Cry1Fa, і що додатково містить другий рослинний експресований ген, що кодує білок Cry1Ca. Перенесення (або вставка) ознаки (ознак) Cry1Ab і Cry1C в інбредні лінії кукурудзи може здійснюватися розмноженням з рекурентною селекцією, наприклад, шляхом зворотного схрещування. У цьому випадку, бажаного рекурентного батька спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентним батьком), який несе відповідний ген (гени) для ознак Cry1Ab і Cry1C. Потомство від цього схрещування потім зворотно парують з рекурентним батьком, з подальшою селекцією отримуваного потомства на бажану ознаку (ознаки), яка переноситься від нерекурентного батька. Через три, переважно чотири, більш переважно, через п'ять або більше поколінь зворотних схрещувань з рекурентним батьком з селекцією на бажану ознаку (ознаки), потомство буде гетерозиготним по локусах, які відповідають за переносиму ознаку (ознаки), але буде схожим на рекурентного батька по більшості або майже по всіх інших генах (див., наприклад, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376). Стратегії керування стійкістю комах (IRM). Автори Roush et al., наприклад, виділяють стратегію двох токсинів, який також назвається "пірамідинг" або "комплект", для керування інсектицидними трансгенними сільськогосподарськими культурами. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. В. (1998) 353, 1777-1786). На вебсайті Керування з охорони навколишнього середовища США (the United States Environmental Protection Agency: epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) опубліковані наступні вимоги для забезпечення посівів нетрансгенних (тобто, не-B.t) "сховищ" (блок не-Bt сільськогосподарських культур/кукурудзи), що висівається разом з трансгенними зерновими культурами, які продукують єдиний Bt білок, активний проти цільових шкідників. Існують наступні конкретні структуровані вимоги для кукурудзяної продукції, Bt-захищеної від кукурудзяного метелика (Cry1Ab або Cry1F): Структуровані "сховища": 20 % площі в кукурудзяній зоні відводять під "сховище" для Bt-незахищеної від лускокрилих шкідників кукурудзи 50 % площі в бавовняній зоні відводять для "сховище" культур, Bt-незахищених від лускокрилих шкідників Блоки 1. Внутрішні (тобто, у межах Bt-поля) 2. Зовнішні (тобто, окремі поля в межах ½ милі (¼ милі, по можливості) від Bt-поля, для максимального збільшення частоти випадкового спарювання) Смуги усередині поля Ширина смуг повинна складати щонайменше 4 ряди (переважно 6 рядів), для зменшення ефекту переміщення личинок. На вебсайті Національної асоціації виробників кукурудзи (ncga.com/insect-resistancemanagement-fact-sheet-bt-com), також опубліковане подібний посібник відносно вимог. Наприклад: Вимоги IRM по кукурудзяному метелику: - Щонайменше 20 % площ відводять під вирощування "сховищ" гібридної кукурудзи - У зонах вирощування бавовни "сховища" повинні складати 50 % - Вирощування повинне бути на відстані в межах 1/2 милі від гібридів "сховища" - "Сховище" можна вирощувати у вигляді смуг усередині Bt-полю; смуги "сховища" повинні мати ширину щонайменше 4 ряди - "Сховище" можна обробляти звичайними пестицидами, тільки у випадку досягнення економічного порога для цільової комахи - У "сховище" кукурудзи не можна застосовувати розпилювані інсектициди на основі Bt - Відповідне "сховище" повинне вирощуватися на кожній фермі з Bt-кукурудзою. Автори Roush et al. стверджують (наприклад, правий стовпчик, сторінки 1780 і 1784) що комплект або "пірамідинг" із двох різних білків, кожний з яких ефективний проти цільових шкідників і не має якої-небудь перехресної стійкості або слабку перехресну стійкість, може дати можливість застосовувати сховище меншого розміру. Roush припускає, що при успішному комплекті розмір сховище менше 10 % сховища може дати порівнянний контроль стійкості до рівня 50 % сховища для єдиної (не-пірамідної) ознаки. Для доступних у даний час пірамідних Btкукурудзяних продуктів відповідно до вимог Управління по охороні навколишнього середовища США необхідне структуроване сховище не-Bt кукурудзи значно меншої площі (звичайно 5 %), 9 UA 112287 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ніж для продуктів з єдиною ознакою (звичайно 20 %). Кожне з вищезгаданих процентних співвідношень (таких, як наприклад, для 1F/Ab), або подібних співвідношень сховищ можна застосовувати для розглянутих подвійних або потрійних комплектів або пірамід. Даний винахід містить у собі комерційну площу землі в акрах, наприклад, більше 10 акрів, з вирощуванням зі згаданим сховищем (або без нього), і з рослинами згідно із даним винаходом. Існують різні способи вирощування сховищ, що включають у себе вирощування в полях з різним геометричним плануванням (як згадано вище), і упаковки з насінною сумішшю, як додатково розглянуто Roush і, наприклад, у патенті США № 6551962. Усі патенти, патентні заявки, попередні заявки і публікації, згадані або цитовані у винаході, включені у винахід шляхом посилання у всій повноті за умови, що вони не суперечать ідеї даної заявки. Якщо конкретно не позначено або мається на увазі, використовувані у винаході терміни в однині позначають "щонайменше один". Далі у винаході приведені наступні ілюстративні приклади. Приклади не повинні розглядатися як обмеження обсягу винаходу. ПРИКЛАД 1 Дизайн химерних токсинів, що містять корові токсини Cry1 і гетерологічні протоксини, і інсектицидна дія білка DIG-152, який продукується в Pseudomonas fluorescens Химерні токсини. Химерні білки, що несуть домен корового токсину з одного токсину Cry, які злиті із сегментом протоксину з іншого токсину Cry, описані раніше, наприклад, у патенті США № 5593881 і патенті США № 5932209. Химерні варіанти білка Cry1Ca даного винаходу містять у собі химерні токсини, що містять N-кінцевий сегмент корового токсину, який походить з інсектицидного токсину Cry1Ca3, що злитий із сегментом гетерологічного дельта-ендотоксинового протоксину в деякій точці після кінця сегмента корового токсину. Транзиція від корового токсину до сегмента гетерологічного протоксину може відбуватися приблизно біля зчленування нативного корового токсину/протоксину, може зберігатися ora-ділянка нативного протоксину (розташована після сегмента корового токсину), із транзицією гетерологічного протоксину, що виникає в 5'-3' напрямку. Різними механізмами сегменти корового токсину і протоксину можуть містити точну амінокислотну послідовність нативних токсинів, з якої вони походять, або можуть містити в собі амінокислотні додавання, делеції або заміни, що не зменшують біологічну функцію сегментів при злитті їхній один з одним і здатні підсилити вказану функцію. Наприклад, химерний токсин даного винаходу містить сегмент корового токсину, який походить з Cry1Ca3 і гетерологічного протоксину. У переважному варіанті здійснення винаходу сегмент корового токсину, який походить з Cry1Ca3 (619 амінокислот), є злитим з гетерологічним сегментом, що містить сегмент протоксину, що походить з дельта-ендотоксину Cry1Ab (545 амінокислот). Амінокислотна послідовність, яка складається з 1164 амінокислот, химерного білка, який називається у винаході DIG-152, розкрита в SEQ ID NO:1. Мається на увазі, що інші химерні злиття, що містять варіанти корового токсину Cry1Ca3 і протоксини, які походять з Cry1Ab, входять в обсяг даного винаходу. Інсектицидна дія білка DIG-152 проти лускокрилих була продемонстрована на личинках новонародженої вогнівки цукрової тростини (SCB; Diatraea saccharalis) і Cry1Ab-резистентної SCB (rSCB) в експериментах залежності реакції від дози, за допомогою методик уведення раціону. Тільця включення DIG-152 солюбілізували при акуратному погойдуванні при 4º протягом 4 годин у 7,5 мл 100 мм CAPS, pН 11, 1 мм ЕДТА, до якого додавали 200 мкл інгібітору бактеріальної протеази (Sigma P4865; виготовленої відповідно до інструкції постачальника). Після центрифугування до одержання осаду нерозчинного матеріалу стокову концентрацію білка доводили до 4,0 мг/мл у 100 мм CAPS, pН 11. Для біотесту з комахами готували корм із концентрацією білка DIG-152 у діапазоні від 0,030 мкг до 102 мкг/г, шляхом змішування придатних об'ємів з раціоном меридик (meridic) (Bio-Serv, Frenchtown, NJ) безпосередньо перед розподілом близько 0,7 мл раціону в окремі осередки в кюветах з 128 осередками (Bio-Ba-128, C-D International). Трипсин- активований білок Cry1Ab (використовуваний як позитивний контроль інсектицидної активності) тестували в діапазоні концентрації від 0,03125 мкг до 32 мкг/г раціону (приготовленого шляхом змішування ліофілізованого порошку з відповідною кількістю дистильованої води перед готуванням раціону). Як контрольні уведення використовували раціони, приготовлені з дистильованою водою (чистий контроль для тестів Cry1Ab) або з буфером єдиним (100 мМ CAPS pН 11 для DIG-152 тесту). З кожного осередку з поверхні раціону забирали одну новонароджену личинку D. saccharalis (< через 24 години після вилуплення). Після інокуляції личинки осередку накривали 10 UA 112287 C2 5 10 15 20 25 30 35 кришками з отворами (C-D International), і кювети з біопробами поміщали в камеру зі штучним кліматом, де підтримували умови 28ºC, відносну вологість RH 50 % і цикл світло/темрява 16 годин:8 годин. На сьомий день після інокуляції реєстрували смертність личинок, вагу личинок і число личинок, що вижили, що не показували збільшення ваги (