Виділений і очищений кристалічний білок bacillus thuringiensis, композиція кристалічного білка, очищений сегмент нуклеїнової кислоти, що кодує кристалічний білок, спосіб застосування сегмента нуклеїнової кислот

1. Виділений і очищений кристалічний білок Bacillus thuringiensis, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID № 3 або SEQ ID №4. 2. Білок за п.1, який відрізняється тим, що вказаний кристалічний білок виділяють із Bacillus thuringiensis EG10327 (NRRL B-21365), EG11402 (NRRL B-21366) або EG11403 (NRRL B-21367). 3. Білок за п.2, який відрізняється тим, що вказаний кристалічний білок має розмір приблизно 29 kДа або приблизно 14kДа, як було визначено методом електрофорезу в ПААГ із ДСН. 4. Білок за п.1, який відрізняється тим, що включений у композицію, яка містить від приблизно 1 % до приблизно 50% мас. вказаного кристалічного білка. 5. Білок за п.1, який відрізняється тим, що включений у композицію, отриманий способом, що включає наступні стадії: (a) культивування клітини штаму Bacillus thuringiensis, що містить сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує кристалічний білок, що відповідає амінокислотним послідовностям SEQ ID №3 або SEQ ID №4, або обом в умовах, ефективних для продукування вказаного кристалічного білка; і (b) одержання із вказаної клітини вказаного кристалічного білка. 6. Білок за п.5, який відрізняється тим, що стадія (b) включає, крім того, одержання вказаного крис UA (21) 99042264 (22) 24.09.1997 (24) 17.04.2006 (86) PCT/US97/17600, 24.09.1997 (31) 08/718,905 (32) 24.09.1996 (33) US (46) 17.04.2006, Бюл. № 4, 2006 р. (72) Донован Вілльям П., US, Донован Джудіт С., US, Слейні Аннетт С., US (73) МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖІ, ЛЛС, США., US (56) Donovan W. et al. Isolation and characterization of EG2158, a new strain of Bacillus thuringiensis toxic to coleopteran larvae, and nucleotide sequence of the toxin gene. molecular and General genetics., 1988, Vol.214, P.365-372. Jhonson T. et al. Insecticidal activity of EG4961, a novel strain of Bacillus thuringiensis toxic to larvae and adults of southern corn rootworm (Coleoptera: chrysomelidae) and Colorado potato beetle (Coleoptera: chrysomelidae). J.of Economic Entomology. 1993, Vol.86, N.2, P.330-333. Ely S. The engineering of plants to express Bacillus thuringensis delta-endotoxins. Entwistle P. et al. (Eds.): Bacillus thuringensis, An environmental boipesticide: Theory and practice. 1993, GB. Chichester, Wiley&Sons, P.105-124. 2 (19) 1 3 75317 4 талічного білка у кількості від приблизно 1 % до линною клітиною. 22. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.21, який відприблизно 50% мас. 7. Композиція кристалічного білка за п.1, який відрізняється тим, що вказаною рослинною клітиною різняється тим, що містить білки з амінокислотє клітина кукурудзи, пшениці, рослини, що утворює ними послідовністями SEQ ID №3 та SEQ ID №4 і дерн, овочевої рослини, плодового дерева або має інсектицидну активність проти довгоносика декоративної рослини. 23. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.15, який відбавовняного, японського жука (Popillia japonica) різняється тим, що вказана клітина-хазяїн ексабо хруща каштанового (Tribolium castaneum). 8. Очищений сегмент нуклеїнової кислоти, який пресує сегмент нуклеїнової кислоти для продукукодує кристалічний білок SEQ ID №3 або SEQ ID вання вказаного кристалічного білка. 24. Сегмент нуклеїнової кислоти по п.8, який від№4. 9. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.8, який відрірізняється тим, що вбудований у трансгенну росзняється тим, що додатково визначений як такий, лину. 25. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.24, який відщо включає послідовність нуклеїнової кислоти різняється тим, що вказаний сегмент нуклеїнової SEQ ID № 1 або комплементарну їй послідовність, або послідовність, що гібридизується в жорстких кислоти включений у потомство трансгенної росумовах в присутності від близько 0,02М до близько лини. 26. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.24, який від0,15М NaCl і температурі від близько 50°С до блирізняється тим, що вказаний сегмент нуклеїнової зько 70°С з послідовністю SEQ ID №1, або послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID №2 або комкислоти включений у насіння трансгенної рослини. плементарну їй послідовність, або послідовність, 27. Спосіб застосування сегмента нуклеїнової кисщо гібридизується в жорстких умовах в присутнослоти, що кодує кристалічний білок, як визначено в ті від близько 0,02М до близько 0,15М NaCl і темпослідовності SEQ ID №3 або SEQ ID №4 для експературі від близько 50°С до близько 70°С з поспресії білка, який включає наступні стадії: лідовністю SEQ ID №2. (a) одержання рекомбінантного вектора, що вклю10. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.8, який відчає сегмент нуклеїнової кислоти згідно з п.8, який різняється тим, що визначений як РНК-сегмент. знаходиться під контролем промотору; 11. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.8, який від(b) введення вказаного рекомбінантного вектора в різняється тим, що кодує кристалічний білок, який клітину-хазяїн; має довжину приблизно 267 амінокислот, або ко(c) культивування вказаної клітини-хазяїна для дує кристалічний білок, який має довжину приблиекспресії вказаного білка і зно 126 амінокислот. (d) відокремлення вказаного експресованого білка. 12. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.8, який від28. Спосіб за п.27, який відрізняється тим, що різняється тим, що включений в рекомбінантний вказаним рекомбінантним вектором є pEG246, що вектор. знаходиться в клітині-хазяїні NRRL В-21364, або є 13. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.12, який відpEG1246, що знаходиться в клітині-хазяїні NRRL різняється тим, що вказаний рекомбінантний векB-21367. тор являє собою pEG246 і знаходиться в клітині29. Виділений сегмент нуклеїнової кислоти, охарахазяїні NRRL В-21364 або являє собою pEG1246 і ктеризований як сегмент нуклеїнової кислоти, який знаходиться в клітині-хазяїні NRRL B-21367. включає область послідовності, що складається 14. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.12, який відпринаймні із 18 суміжних нуклеотидів послідовносрізняється тим, що вказаний сегмент нуклеїнової ті SEQ ID № 1 або SEQ ID №2, або комплементаркислоти функціонально зв'язаний із промотором. ної їм. 15. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.12, який від30. Виділений сегмент нуклеїнової кислоти за п.29, різняється тим, що вбудований в рекомбінантну який відрізняється тим, що включений в набір клітину-хазяїн. для визначення наявності нуклеїнової кислоти, що 16. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.15, який відвключає у відповідному контейнері виділену нуклерізняється тим, що вказана клітина-хазяїн є проїнову кислоту і реагент для детекції. каріотичною клітиною. 31. Виділений сегмент нуклеїнової кислоти за п.30, 17. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.16, який відякий відрізняється тим, що містить послідовності різняється тим, що вказана клітина-хазяїн є бакSEQ ID № 1, SEQ ID №2 або комплементарні їм. теріальною клітиною. 32. Спосіб виявлення послідовності нуклеїнових 18. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.17, який відкислот, що кодує кристалічний білок, де вказаний різняється тим, що вказаною бактеріальною клібілок містить послідовності SEQ ID №3 або SEQ ID тиною є клітина виду E.coli, B.thuringiensis, № 4, який включає наступні стадії: B.subtilis, B.megaterium, або Pseudomonas. (а) одержання зразка нуклеїнових кислот, що, 19. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.18, який відймовірно, кодують кристалічний білок послідовнорізняється тим, що вказаною бактеріальною клісті SEQ ID №3 або SEQ ID №4; тиною є E.coli NRRL B-21364, B.thuringiensis NRRL (b) контактування вказаного зразка нуклеїнових B-21365, B.thuringiensis NRRL B-21366, або кислот із виділеним сегментом нуклеїнової кислоB.thuringiensis NRRL B-21367. ти, що кодує вказаний кристалічний білок в жорст20. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.15, який відких умовах в присутності від близько 0,02М до різняється тим, що вказана клітина-хазяїн є еукаблизько 0,15М NaCl і температурі від близько 50°С ріотичною клітиною. до близько 70°С, ефективних для гібридизації в 21. Сегмент нуклеїнової кислоти за п.20, який відосновному комплементарних нуклеїнових кислот; і різняється тим, що вказана клітина-хазяїн є рос(c) виявлення отриманих у такий спосіб гібридизо 5 75317 6 ваних комплементарних нуклеїнових кислот. ті SEQ ID №3 або SEQ ID №4, або обидві. 33. Спосіб за п.32, який відрізняється тим, що 38. Штам клітин Bacillus thuringiensis згідно з п.37, який відрізняється тим, що клітини мають NRRL виділений сегмент нуклеїнової кислоти включає мітку, що детектується, і де вказані гібридизовані номер доступу В-21365, В-21366 або В-21367. комплементарні нуклеїнові кислоти виявляються 39. Спосіб одержання кристалічного білка, який за допомогою цієї мітки. містить амінокислотні послідовності SEQ ID №3 34. Очищене антитіло, яке генероване шляхом або SEQ ID №4, що включає: використання білка за п.1 як імуногена. (a) культивування клітини Bacillus thuringiensis за 35. Антитіло за п.34, яке включене в набір для імуп.37 в умовах, ефективних для продукування вканодетекції, що містить у відповідному контейнері заного кристалічного білка; і антитіло і реагент для імунодетекції. (b) одержання із вказаної клітини вказаного крис36. Спосіб виявлення кристалічного білка, що місталічного білка. тить послідовності SEQ ID №3 або SEQ ID №4 у 40.Білок за п.4, одержаний способом за п.39. біологічному зразку, який включає стадії: 41. Інсектицидна композиція, яка містить кристалі(a) одержання біологічного зразка, що, ймовірно, чний білок з амінокислотними послідовностями містить вказаний кристалічний білок; SEQ ID №3 або SEQ ID №4, що має інсектицидну (b) контактування зазначеного зразка з антитілом активність проти довгоносика бавовняного, японзгідно з п.34, в умовах, ефективних для утворення ського жука (Popillia japonica) або хруща каштаноімунокомплексів; і вого (Tribolium castaneum). 42. Інсектицидна композиція за п.41, яка відрізня(c) виявлення утворених у такий спосіб імунокомпється тим, що містить від близько 1% до близько лексів. 37. Штам клітин Bacillus thuringiensis, що містить 50% мас. кристалічного білка SEQ ID №3 або SEQ сегмент нуклеїнової кислоти, що кодує кристалічID №4. ний білок, який містить амінокислотні послідовнос Ця заявка є частковим продовженням [заявки США №08/718905 від 24 вересня 1996], що цілком включена в даний опис у виді посилання. Даний винахід стосується області молекулярної біології. Більш конкретно, у деяких варіантах свого здійснення, даний винахід стосується способів і композицій, що включають ДНК-сегменти і білки, які походять від бактерій. Ще більш конкретно, даний винахід стосується нових генів сrуЕТ33 і сrуЕТ34, які походять від Bacillus thuringiensis, і кодують кристалічні білки, що є токсичними для твердокрилих комах. Описані різні способи одержання і використання зазначених ДНК-сегментів; ДНК-сегментів, що кодують синтетично модифіковані білки Cry; і нативних і синтетичних кристалічних білків, наприклад, використання ДНК-сегментів у якості діагностичних зондів і матриць для продукування білків; і використання білків, гібридних білків-носіїв і пептидів у різних імунологічних і діагностичних цілях. У даний заявці також описані способи одержання і використання нуклеїнокислотних сегментів для продукування трансгенних рослинних клітин, що містять ДНК-сегменти, описані в даний заявці. Кристалічні білки Bacillus thuringiensis Одним з унікальних відмітних ознак бактерії В.thuringiensis є продукування нею кристалічних білків у процесі споруляції, які мають специфічну токсичність для деяких загонів і видів комах. Було показано, що багато різних штамів В.thuringiensis продукують інсектицидні кристалічні білки. Композиції, що включають штами В.thuringiensis, які продукують білки, що мають інсектицидну активність проти лускокрилих і двокрилих комах, виготовляються промисловістю, і використовуються у якості екологічно прийнятних інсектицидів, оскільки, вони є абсолютно токсичними тільки для конкретних видів комах, на які спрямована їхня дія, але не роблять несприятливого впливу на рослини й інші організми, на які дія цих інсектицидів не спрямована. Механізм інсектицидної активності кристалічних білків B.thuringiensis був особливо широко досліджуваний за останнє десятиліття. Було показано, що кристалічні білки є токсичними для комах тільки після того, як цей білок ковтається комахою. Завдяки лужному рН і присутності протеолітичних ферментів у середній кишці комахи, ці білки солюбілізуються, у результаті чого визволяються компоненти, токсичні для даної комахи. Ці токсичні компоненти руйнують клітини середньої кишки комахи, приводять до припинення її харчування, а в деяких випадках, і до загибелі комахи. Виходячи з цього, було показано, що B.thuringiensis є ефективним і екологічно безпечним інсектицидом, що може бути використаний для боротьби з різними комахо-шкідниками. Як указувалося Hofte et al., (1989), більшість інсектицидних штамів B.thuringiensis мають активність проти комах загону Лускокрилих, тобто, комах-гусениць. Інші штами B.thuringiensis мають інсектицидну активність проти загону Двокрилих, тобто, мух і комарів, або проти лускокрилих і двокрилих комах. За останні роки, було встановлено, що декілька штамів B.thuringiensis, які продукують кристалічні білки, є токсичними для комах загону Твердокрилих, тобто, жуків [Krieg et al., 1982; Sick et al., 1990; Lambert et al., 1992]. Генетика кристалічних білків Ряд генів, що кодують кристалічні білки, були клоновані з декількох штамів B.thuringiensis. В огляді Hofte et al., (1989) обговорюються гени і білки, що були ідентифіковані в штамах B.thuringiensis до 1990 року, і подана номенклатура і схема класифікації, що традиційно застосовується до генів і білків B.thuringiensis. Гени сгуі кодують білки Сrу l, які є токсичними для лускокрилих комах. Гени cry II кодують білки Cry II, 7 75317 8 Cry17А cbm71 X99478 що є токсичними як для лускокрилих, так і для Cry18А CryBPI X99049 двокрилих комах. Гени cry III кодують білки Cry III, Cry19А Jeg65 Y08920 які є токсичними для твердокрилих комах, а гени Cyt1Aa CytA X03182 cry lV кодують білки Cry lV, що є токсичними для Cyt1Ab CytM X98793 двокрилих комах. Cyt1B U37196 Недавно була запропонована нова номенклаCyt2A CytB Z14147 тура, яка являє собою систематичну класифікацію Cyt2B CytB U52043 генів cry, засновану не на специфічності до комах, a а на гомологи їхніх ДНК-послідовностей. Ця схема Адаптовано з: http://epunix.biol.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index, html класифікації подана в таблиці 1. Таблиця 1 A Переглянута номенклатура δ-ендотоксину B.thuringiensis Нова Cry1Аа Cry1Аb Cry1Ас Cry1Ad Cry1Ае Cry1Ва Cry1Вb Cry1Ве Cry1Bd Cry1Ca Cry1Сb Cry1Dа CryDb Cry1Еа Cry1Еb Cry1Fa Cry1iFb Cry1Gа CryGb Cry1Ha Cry1Hb Cry1la Cry1lb Cry1Ja Cry1Jb Cry1K Cry2Aa Cry2Ab Cry2Ac Cry3А Cry3Ва Cry3Вb Cry3С Cry4A Cry4В Cry5Аа Cry5Ab Cry5В Cry6А Cry6В Cry7Аа Cry7Аb Cry8А Cry8В Cry8С Cry9А Cry9В Cry9С Cry10А Cry11А Cry11В Cry12А Cry13А Cry14А Cry15А Cry16А Стара CrylA(a) CrylA(b) CrylA(c) CrylA(d) CrylA(e) CrylB ET5 PEG5 CryEI CrylC CrylC(b) CrylD Prt Cryl CrylE(b) CrylF PrtD PrtA CryH2 PrtC CryV CryV ET4 ET1 CryΙΙΑ CryllB CryllC CrylllA CrylllB CrylllB2 CrylllD CrylVA CrylVB CryVA(a) CryVA(b) Cry VIA CryVIB CrylllC CrylllCb CrylllE CrylllG CrylllF CrylG CrylX CrylH CrylVC CrylVD Jeg80 CryVB CryVC CryVD 34kDa cbm71 # Доступу банку генів M11250 M13898 M11068 M73250 M65252 X06711 L32020 Z46442 U70726 X07518 M97880 X54160 Z22511 X53985 M73253 M63897 Z22512 Z22510 U70725 Z22513 U35780 X62821 U07642 L32019 U31527 U28801 M31738 M23724 X57252 M22472 X17123 M89794 X59797 Y00423 X07423 L07025 L07026 U19725 L07022 L07024 M64478 U04367 U04364 U04365 U04366 X58120 X75019 Z37527 Ml2662 M31737 X86902 L07027 L07023 U13955 M76442 X94146 Ідентифікація кристалічних білків, що є токсичними для твердокрилих комах Бактеріальні кристалічні білки стали широко використовуватися у якості інсектицидів відтоді, коли було повідомлено про перше виділення токсичного для твердокрилих комах штаму B.thuringiensis (Krieg et al., 1983; 1984). Повідомлялося, що цей штам [описаний у патенті США. №4766203], що уводиться в даний час у опис за допомогою посилання, іменований B.thuringiensis типовий вид tenebrionis, є токсичним для личинок твердокрилих комах Agelastica aini (листоїда вільхового) і Leptinotarsa decemlineata (колорадського жука). [У патенті США №4766203] (який уводиться в даний опис за допомогою посилання) описаний інсектицидний кристалічний білок розміром 65-70 кілодальтонів (кДа), ідентифікований як B.thuringiensis tenebrionis (див. також, Berhnard, 1986). Sekar і ін. (1987) повідомляють про клонування і характеризацію гена, який кодує кристалічний білок, що походить від B.thuringiensis tenebrionis, і токсичний для твердокрилих комах. Передбачений розмір цього поліпептиду (установленого виходячи з генної послідовності) складає 73кДа, однак, виділений білок складається, в основному, із 65кДа-компоненту. Hofte й ін. (1987) також описують ДНК-послідовність клонованого гена з B.thuringiensis tenebrionis, причому, цй послідовність ідентична послідовності, описаній Sekar і ін. (1987). McPherson і ін. (1988) описують ДНКпослідовність для клонованого гена інсектицидного білка з B.thuringiensis tenebrionis; причому, послідовність цього гена ідентична послідовності, описаній Sekar і ін. (1987). Було виявлено, що клітини Е.соlі і клітини Pseudomonas fiuorescens містять клонований ген, що є токсичним для личинок колорадського жука. [У Міжнародній патентній заявці №WO 91/07481, опублікованій 30 травня 1991], описані мутанти B.thuringiensis, що продукують високі рівні тих же самих інсектицидних білків, які продукуються вихідними батьківськими штамами, але на більш низьких рівнях. Були описані мутанти штаму B.thuringiensis tenebrionis, токсичного для твердокрилих комах. Herrnstadt і ін. (1986) описують токсичний для твердокрилих комах штам, позначений B.thuringiensis типовий вид san diego, що продукує кристалічний 64кДа-білок, який є токсичним для деяких твердокрилих комах, включаючи Pyrrhalta luteola (листоїд в'язовий); Anthono-mus gradis (довгоносик бавовняний); Leptinotarsa decemlineata 9 75317 10 (колорадський жук); Osiorhynchus siilcatus (скосарь відному ЕР 0346114)] описаний ізолят борознистий); Tenebrio molitor (борошняний хруB.thuringiensis, позначений PS122D3, що був сірощак великий), Haltica zom-bacina; і Diabrotica типований як сіротип 8a8b, morrisoni, і який має undecimpunctata (блошка західна одинадцятикрапінсектицидну активність проти личинок колорадськова). кого жука. [У патенті США №4966765 (відповідноДНК-послідовність гена токсину, токсичного му ЕР 0346114)] описаний штам B.thuringiensis, для твердокрилих, що походить від B.thuringiensis PS86B1 (ідентифікований за допомогою сіротипуsan diego, була встановлена Herrnstadt і ін. (1987) і вання як сіротип tolworthi), що має інсектицидну описана [в патенті США №4771131]. Послідовність активність проти колорадського жука. гена токсину B.thuringiensis san diego ідентична Нуклеотидні послідовності гена сrуІІІВ і білок, послідовності, описаній Sekar і ін. (1987) для клощо кодується ним, який є токсичним для твердокнованого гена токсину, токсичного для твердокририлих комах, були описані Sick і ін. (1990), однак, лих B.thuringiensis tenebrionis. За допомогою різних штам-джерело B.thuringiensis був ідентифікований діагностичних тестів, Krieg і ін. (1987) продемонстлише шляхом сіротипування як сіротип tolworthi. [У рували, що штам B.thuringiensis san diego ідентичпатенті США №4966156, виданому 26 лютого ний штаму B.thuringiensis tenebrionis. 1991p. Sick і ін. (відповідному ЕР 0337604)], опиІнший штам B.thuringiensis, EG2158, був виявсаний ген токсину B.thuringiensis, отриманий із лений Donovan і ін. (1988) і описаний [у патенті штаму 43F B.thuringiensis, що має активність проти США №5024807]. Штам EG2158 продукує кристатвердокрилих комах, і його генна послідовність лічний 73кДа-білок СrуС, що має інсектицидну аквиявилась ідентичною гену сrуІІІВ. Повідомлялося, тивність проти твердокрилих комах. Його ДНКщо штам 43F B.thuringiensis має активність проти послідовність ідентична послідовності, описаній колорадського жука і Leptino-tarsa texana. Sekar і ін. (1987) для клонованого гена токсину [В опублікованій Європейській патентній заявці B.thuringiensis tenebrionis. Цей ген токсину для №0382990] описані два штаму B.thuringiensis, твердокрилих був позначений Hofte і ін. (1989) btPGS1208 і btPGS1245, що продукують кристалігеном сrуІІІА. Для цього штаму також були виявлечні білки розміром 74 і 129кДа, відповідно, що мані два більш дрібних білки розміром 30- і 29-кДа, ють інсектицидну активність проти личинок колоале вони не були охарактеризовані (Donovan et al., радського жука. Виявилось, що ДНК-послідовність, 1988). установлена для гена токсину, який продукує [У патенті США №5024837] також описаний гі74кДа-білок, є родинною гену сrуlllВ, описаному брид штамів B.thuringiensis типовий вид kurstaki, Sick і ін. (1990). що виявляв активність як проти лускокрилих, так і [В опублікованій Міжнародній патентній заявці проти твердокрилих комах. [У патенті США РСТ WO 90/13651] описані штами B.thuringiensis, №4797279 (відповідному ЕР 0221024)] описаний що містять ген токсину, який кодує 81кДа-білок, гібрид B.thuringiensis, трансформований плазміщо, як указується, є токсичним як для лускокрилих, дою, що походить від B.thuringiensis типового виду так і для твердокрилих комах. [У патенті США kurstaki, і містить ген, який кодує кристалічний бі№5055293] описане використання B.laterosporous лок, токсичний для лускокрилих; і плазмідою, що для боротьби з блошкою довговусою (Diabrotica). походить від B.thuringiensis tenebrionis, і містить Даний винахід різко відрізняється від попередген, що кодує кристалічний білок, токсичний для ніх робіт тим, що він стосується нових кристалічтвердокрилих. Гібридний штам B.thuringiensis проних білків СrуЕТ33 і СrуЕТ34, і нових ДНКдукує кристалічні білки, що мають як властивості послідовностей, які кодують ці білки, що представбілків, які походять від B.thuringiensis kurstaki, так і ляють нoвий клас кристалічних білків властивості білків, які походять від B.thuringiensis B.thuringiensis, і не мають загальної гомології посtenebrionis. [У патенті США №4910016 (відповідлідовностей із жодним зі штамів, описаних у вищеному ЕР 0303379)] описаний ізолят B.thuringiensis, вказаній літературі. Ізолят B.thuringiensis, описаідентифікований як B.thuringiensis MT 104, який ний і заявлений у даному винаході, являє собою має інсектицидну активність проти твердокрилих і перший із виявлених штамів B.thuringiensis лускокрилих комах. kurstaki, що, як було показано, має токсичність для [В опублікованій Європейській патентній заявці твердокрилих комах. Штами B.thuringiensis даного №0318143] описаний інтактний частково модифівинаходу містять нові гени cry, що експресують кований ген від B.thuringiensis tenebrionis, і рекомбілкові токсини, які мають інсектицидну активність бінантні вектори, що містять цей ген, і здатні до проти твердокрилих комах, таких як, комахи роду спрямованої експресії білка, який має токсичність РоріІІіса і Tribolium. для твердокрилих комах; а [в опублікованій ЄвроВ одному зі своїх аспектів даний винахід стопейській патентній заявці №0324254] описаний сується нових нуклеїнокислотних сегментів, які штам B.thuringiensis A30, що має інсектицидну містять два гени токсичного для твердокрилих активність проти твердокрилих комах, включаючи комах 5-ендотоксину, що мають нуклеотидні посличинки колорадського жука, личинки блішки довлідовності і виведені амінокислотні послідовності, говусої, і довгоносика бавовняного. проілюстровані на Фіг.1а, Фіг.1в і Фіг.1с. Далі, ці [У патенті США №4999192 (відповідному ЕР гени будуть позначатися сrуЕТ33 (SEQ ID №1) і 0328383)] описаний штам B.thuringiensis PS40D1, сrуЕТ34 (SEQ ID №2). Ген сrуЕТ33 має кодуючу що має інсектицидну активність проти личинок область, що простирається від нуклеотидної осноколорадського жука. Цей штам був також ідентифіви 136 до основи 939, як показано на Фіг.А, Фіг.1В і кований за допомогою сіротипування як сіротип Фіг.1С; а ген сrуЕТ34 має кодуючу область, що 8a8b, morrisoni. [У патенті США №5006336 (відпопростирається від нуклеотидної основи 969 до 11 75317 12 основи 1349, як показано на Фіг.1А, Фіг.1В і Фіг.1С. хівцям. В іншому своєму аспекті, даний винахід стосуГен сrуЕТ33 маф нуклеотидну послідовність, ється інсектицидних білків, що кодуються новими показану на Фіг.1А, Фіг.1В і Фіг.1С. Ген сrуЕТ33 генами сrуЕТ33 і сrуЕТ34. Виведена амінокислот(SEQ ID №1) кодує 29кДа-білок сrуЕТ33, що має на послідовність білка СrуЕТ33 (SEQ ID №3), коамінокислотну послідовність, показану на Фіг.1А, дована геном сrуЕТ33, що простирається від нукФіг.1В і Фіг.1С (SEQ ID №3). Ген сrуЕТ34 (SEQ ID леотидної основи 136 до основи 936, показана на №2) кодує 14кДа-білок СrуЕТ34, що мaє амінокисФіг.1А, Фіг.1В і Фіг.1С. Виведена амінокислотна лотну послідовність, показану на Фіг.1А, Фіг.1В і послідовність білка CryET34 (SEQ ID №4), кодоваФіг.1С (SEQ ID №4). на геном сrуЕТ34, що простирається від нуклеотиВикористовуваний у даному описі термін "ДНКдної основи 969 до основи 1346, також показана сегмент" стосується виділеної ДНК-молекули, що на Фіг.1А, Фіг.1В і Фіг.1С. Ці білки мають інсектине містіть повної геномної ДНК даного виду. Тому, цидну активність проти комах загону твердокри"ДНК-сегмент, що кодує кристалічний білок або лих, а зокрема, проти довгоносика бавовняного, пептид" означає ДНК-сегмент, що містить кодуючі хрущака каштанового і хрущака японського (японпослідовності кристалічного білка, вже виділені ського жука). або очищені з повної геномної ДНК бактеріального В іншому своєму аспекті даний винахід стосувиду, від якого був отриманий цей ДНК-сегмент, і ється біологічно чистої культури природного штаякий, у даному випадку, є грам-позитивною бактему ЕG10327 бактерії B.thuringiensis дикого типу, рією роду ВасіІІus, а зокрема, виду Bacillus, відодепонованого 14 грудня 1994р. Науково-дослідною мого як B.thuringiensis. Термін "ДНК-сегмент" колекцією сільськогосподарських культур. Північвключає ДНК-сегменти і більш дрібні фрагменти ною регіональною дослідницькою лабораторією цих сегментів, а також рекомбінантні вектори, (Northern Regional Research Laboratory, NRRL) під включаючи, наприклад, плазміди, косміди, фагміномером доступу № NRRL В-21365. Штам ди, фаги, віруси і т.і. EG10327 B.thuringiensis являє собою природний Аналогічно, ДНК-сегмент, що містить виділештам B.thuringiensis, що містить гени, які є родинний або очищений ген, який кодує кристалічний ними або ідентичними генам сrуЕТЗЗ і сrуЕТ34 білок, означає ДНК-сегмент, що може, крім того, даного винаходу. Штам EG10327 продукує інсеквключати послідовності, що кодують пептид, деякі тицидні 29кДа- і 14кДа-білки, які є родинними або інші елементи, такі як, регуляторні послідовності, ідентичними білкам СrуЕТ33 і СrуЕТ34, описаним відділені, в основному, від інших природних генів; у даний заявці. або послідовності, що кодують білок. У цьому зв'яВ іншому своєму аспекті, даний винахід стосузку, термін "ген" використовують просто для позється рекомбінантного вектора, що містить один начення одиниці, що кодує функціональний білок, або обидва нових гени сrуЕТЗЗ і сrуЕТ34; рекомбіполіпептид або пептид. При цьому, слід також віднантної клітини-хазяїна, трансформованої таким значити, що цей функціональний термін включає рекомбінантним вектором; і біологічно чистої кульобидві геномні послідовності, послідовності опетури рекомбінантної бактерії, трансфордованої рону і більш дрібні сконструйовані генні сегменти, зазначеним вектором. У кращих варіантах здійсякі експресують білки, поліпептиди або пептиди, нення винаходу, кращою бактерією є або можуть бути адаптовані для їхньої експресії. B.thuringiensis, така як, рекомбінантний штам Термін "виділений, в основному, з інших посEG11402 (депонований 14 грудня 1994p. NRRL під лідовностей, що кодують", - означає, що потрібний номером доступу В-21366), описаний у прикладі 8, ген, а в даному випадку, ген, який кодує бактеріаі рекомбінантний штам EG11403 (депонований 14 льний кристалічний білок, складає значну частину грудня 1994p. NRRL під номером доступу Вкодуючої області ДНК-сегмента, і що цей ДНК21367), описаний у прикладі 7. В іншому кращому сегмент не містить великих ділянок природної коваріанті здійснення даного винаходу кращою є дуючої ДНК, таких як великі хромосомні фрагменбактерія Е.соlі, така як, рекомбінантні штами ти або інші функціональні гени або кодуючі області EG11460 (депоновані 14 грудня (1994p. NRRL під оперону. Саме собою зрозуміло, що цей термін номером доступу В-21364). Усі штами, депоновані включає спочатку виділений ДНК-сегмент, і не виNRRL, були депоновані Колекцією патентних кульключає гени, рекомбінантні гени, синтетичні лінкетур відповідно до Будапештського договору, і було ри, aбо області, що кодують, які були пізніше штуотримано депозитне свідчення про життєздатність чно додані до сегмента. штамів відповідно до встановленої Міжнародної У конкретних варіантах свого здійснення даформи про депонування ВР/4. ний винахід стосується виділених ДНК-сегментів і ДНК-сегменти генів сrуЕТ33 і сrуЕТ34 рекомбінантних векторів, що включають ДНКДаний винахід також стосується ДНКпослідовності, що кодують пептид виду Cry, аміносегментів, що можуть бути виділені практично з кислотна послідовність якого включає амінокислобудь-якого джерела; які не містять повної геномної тну послідовність, в основному, подану в SEQ ID ДНК; і які кодують нові пептиди, описані в даний №3 або SEQ ID №4. заявці. Було показано, що ДНК-сегменти, що коТермін "амінокислотна послідовність, в основдують пептиди цього виду, можуть кодувати білки, ному, подана в SEQ ID №3 або SEQ ID №4" ознаполіпептиди, субодиниці, функціональні домени і чає, що ця послідовність відповідає, в основному, т.і. родинних кристалічним білкам Продуктів або частини послідовності або SEQ ID №3, або SEQ ID інших неродинних генних продуктів. Крім того, ці №4, і має відносно невелике число амінокислот, ДНК-сегменти можуть бути цілком синтезовані in що не є ідентичними або біологічно функціонально vitro із використанням методів, добре відомих фаеквівалентними амінокислотам будь-якій із зазна 13 75317 14 чених послідовностей. Термін "біологічно функціозначень, а також включаючи послідовності прибнально еквівалентний" добре зрозумілий будьлизно в 5200 нуклеотидів і т.і. якому фахівцю, і, крім того, він точно визначений у Слід також відзначити, що даний винахід не даному описі (див., наприклад, "Ілюстративні варіобмежується конкретними нуклеїнокислотними анти здійснення винаходу"). Відповідно до цього, послідовностями, що кодують пептиди даного виамінокислотні послідовності, що мають ідентичнаходу або які кодують амінокислотні послідовносність або функціональну еквівалентність з аміноті SEQ ID №3 або SEQ ID №4, включаючи ті ДНКкислотами SEQ ІD №3 або SEQ ID №4 від біля послідовності, що, зокрема, описані в SEQ ID №1 70% до біля 80%, або переважно, від біля 81% до або SEQ ID №2. Тому, рекомбінантні вектори і вибіля 90%, а більш переважно, від біля 91% до біля ділені ДНК-сегменти можуть, так чи інакше, вклю99%, будуть вважатися послідовностями, що, в чати самі пептид-кодуючі області; кодуючі ділянки, основному, подані в SEQ ID №3 або SEQ ID №4. несучі обрані зміни або модифікації в основній Слід також відзначити, що амінокислотні і нукобласті, що кодує; або вони можуть кодувати леїнокислотні послідовності можуть включати добільш великі поліпептиди, що, при цьому, включадаткові залишки, такі як додаткові N- або С-кінцеві ють ці пептид-кодуючі області; або вони можуть амінокислотні послідовності або 5'- або 3'кодувати біологічно функціонально еквівалентні послідовності, але, при цьому, вони будуть вважабілки або пептиди, що мають варіантні амінокистися, в основному, такими, як послідовності, подалотні послідовності. ні в одній із вищеописаних послідовностей, за ДНК-сегменти даного винаходу включають біумови, що ці послідовності задовольняють критеологічно функціональні еквівалентні пептиди. Такі ріям, викладеним вище, включаючи збереження послідовності можуть продукуватися в результаті біологічної активності білка, у тому випадку, якщо виродженості кодонів і функціональної еквівалентце стосується експресії білка. Зокрема, дo нуклеіності пептидів, які кодуються, що, як відомо, власнокислотних послідовностей можуть бути додані тиво природним нуклеїнокислотним послідовноскінцеві послідовності, і вони можуть, наприклад, тям і білкам, що кодовані ними. Альтернативно, включати різні некодуючі послідовності, що фланфункціонально еквівалентні білки або пептиди кують або 5'-, або 3'-частини кодуючої області або можуть бути сконструйовані з використанням техвони можуть включати різні внутрішні послідовносніки рекомбінантних ДНК, де модифікації можуть ті, тобто, інтрони, що як відомо, присутні усередині бути внесені в структуру білка виходячи з властигенів. востей амінокислотних послідовностей, що повинНуклеїнокислотні сегменти даного винаходу, ні бути змінені. Потрібні модифікації можуть бути незалежно від довжини самої кодуючої послідовштучно введені з використанням техніки сайтності можуть бути об'єднані з іншими ДНКнаправленого мутагенезу, наприклад, для внесенпослідовностями, такими як промотори, сигнали ня змін в антигенність білка або для тестування поліаденілування, додаткові сайти ферментів, що мутантів із метою оцінки їхньої активності на морестриктують, сайти множинного цлонування, інші лекулярному рівні. сегменти, що кодують, і т.і. так, що їхня повна доЯкщо необхідно, то можуть бути також отривжина може значно варіюватися. А тому, якщо мані гібридні білки і пептиди, у яких, наприклад, взяти до уваги той факт, що може бути використапервинна структура областей, які кодують пептид, ний нуклеінокислотний фрагмент майже будь-якої у тій же самій одиниці, що експресує, порівнюєтеся довжини, то повна довжина, переважно, обмежуз іншими білками або пептидами, які мають потріється просто шляхом розробки або використання бні функції, наприклад, із метою обчищення або відповідного протоколу техніки рекомбінантних імунодетекції (наприклад, білки, що можуть бути ДНК. Так, наприклад, можуть бути отримані нуклеочищені за допомогою афінної хроматографії; і їнокислотні фрагменти, що включають коротку області, що кодують ферментну мітку, відповідно). безупинну ділянку, що кодує або пептидні послідоУ ще одному своєму аспекті, даний винахід вності, описані в SEQ ID №3 або SEQ ID №4, або стосується рекомбінантних векторів. Особливо фрагменти, що ідентичні або комплементарні ДНКкращими є вектори, у яких кодуюча частина ДНКпослідовностям, що кодують будь-який пептид у сегмента, незалежно від того, кодує вона повноропослідовності SEQ ID №3 або SEQ ID №4, а зокзмірний білок чи більш дрібний пептид, знаходитьрема, ДНК-сегменти, описані в SEQ ID №1 або ся під контролем промотору. Цей промотор може SEQ ID №2. Так, наприклад, можуть бути також бути промотором, що у природних умовах асоціювикористані ДНК-послідовності, такі як, послідовється з геном, який кодує пептиди даного винахоності у біля 18 нуклеотидів, і послідовності, що ду, і може бути отриманий шляхом виділення 5'складають аж до біля 10000, біля 5000, біля 3000, некодуючих послідовностей, розташованих вище біля 2000, біля 1000, біля 500, біля 200, біля 100, сегмента, що кодує, або екзону, наприклад, із вибіля 50, і біля 14 пар основ у довжину (включаючи користанням техніки рекомбінантного клонування усі фрагменти з проміжними довжинами). і/або РСК™-технології, описаній в даній заявці у Для кожного фахівця зовсім очевидно, що, у зв'язку з одержанням композицій. даному контексті, термін "проміжні довжини" ознаСrуЕТ33- і сrуЕТ34-ДНК-сегменти, використочає будь-яку довжину, що складає проміжне знавувані у якості гібридизаційних зондів і праймерів чення між вищевказаними інтервалами, таку як, Крім використання для регулювання експресії 18, 19, 20, 21, 22, 23 і т.д.; 30, 31, 32 і т.д.; 50, 51, кристалічних білків або пептидів даного винаходу, 52, 53, і т.д.; 100, 101, 102, 103, і т.д.; 150, 151, 152, розглянуті вище нуклеїнокислотні послідовності 153 і т.д.; включаючи всі цілі числа 200-500; 500також використовуються у ряді інших цілей. (На1000; 1000-2000; 2000-3000; 3000-5000; і аж до цих приклад, вони можуть бути також використані у 15 75317 16 якості зондів або праймерів в експериментах по даного винаходу можуть бути використані за їхню гібридизації нуклеїнової кислоти. Власне кажучи, здатністю до селективного утворення дуплексних передбачається, що особливе застосування момолекул із комплементарними ділянками ДНКжуть знайти нуклеїнокислотні сегменти, що містять фрагментів. У залежності від розглянутого застообласть послідовності, яка складається, принаймсування, може статися бажаним використовувати ні, із послідовності довжиною в 14 безперервно різні умови гібридизації для досягнення різних слідуючих один за одним нуклеотидів, що мають Ступенів селективності зонда стосовно послідовту ж послідовність, або послідовність, комплеменності-мішені. Для застосувань, що вимагають витарну послідовності ДНК-сегмента довжиною в 14 сокої селективності, звичайно/ із метою одержання безперервно слідуючих один за одним нуклеотидів гібридів, може статися бажаним використовувати у SEQ ID №1 або SEQ ID №2. У деяких варіантах відносно жорсткі умови, наприклад, можуть бути здійснення даного винаходу, можуть бути викорисобрані умови з відносно низькою концентрацією тані більш довгі ідентичні або комплементарні посолі і/або високою температурою, наприклад, такі слідовності із суміжних безперервно слідуючих як, присутність від біля 0,02М до біля 0,15Μ Nad один за одним нуклеотидів, наприклад, послідовпри температурі від біля 50°С до біля 70°С. Такі ності, що складаються із біля 20, 30, 40, 50, 100, селективні умови майже не допускають, або вза200, 500, 1000, 2000, 5000п.о., і т.д. (включаючи всі галі не допускають, невідповідності між зондом і проміжні довжини і вище, і включаючи повнорозміматрицею або ланцюгом-мішенню, і повинні бути рну послідовність із 5200 пар основ). особливо відповідними для виділення ДНКЗдатність таких нуклеїнокислотних зондів спесегментів, що кодують кристалічний білок. Детекцифічно гібридизуватися з послідовностями, що ція ДНК-сегментів за допомогою гібридизації добкодують кристалічний білок, дозволяє використоре відома фахівцям, і приклади методів гібридизавувати ці зонди для виявлення присутності комційного аналізу наводяться [в патентах США плементарних послідовностей у даному зразку. №№4965188 і 5176995] (кожний із яких вводиться Однак, вони можуть бути використані й в інших в даний опис за допомогою посилання). Особливо цілях, включаючи використання даних про посліпідхожий опис цієї техніки можна також знайти [в довність для одержання праймерів мутантних вироботах Maloy et al., 1993; Segal 1776; Prokop, дів, або праймерів, використовуваних для одер1991; і Kuby, 1991]. жання інших генетичних конструкцій. Саме собою зрозуміло, що для деяких застоПередбачається, що нуклеїнокислотні молекусувань, наприклад, там, де для одержання мутанли, які мають області послідовності, що складатів бажано використовувати ланцюг мутантного ються із ділянок із 10-14, 15-20, 30, 50, або навіть праймера, гібридизований з нижчерозташованою 100-200 безперервно слідуючих один за одним матрицею, або там, де необхідно знайти і виділити нуклеотидів або т.і., ідентичних або комплементапослідовності, що кодують кристалічний білок, і рних ДНК-послідовностям SEQ ID №1 або SEQ ID походять від родинних штамів, функціональних №2, є особливо придатними для використання у еквівалентів, або т.і., звичайно вимагаються менякості гібридизаційних зондів, наприклад, у Сауше жорсткі умови гібридизації для того, щоб міг зерн- і Нозерн-блотінгу. Більш дрібні фрагменти, в утворитися гетеродуплекс. У цих випадках, може основному, можуть бути використані при здійсненстатися кращим використовувати такі умови, як ні гібридизації, де довжина безперервної комплеприсутність від біля 0,15Μ до біля 0,9Μ солі, при ментарної області може варіюватися, наприклад, температурі від біли 20°С до біля 55°С. Перехресвід біля 10-14 і до біля 100 або 200 нуклеотидів, но види, що гібридизуються, можуть бути, тим саале для детекції, якщо це необхідно, можуть бути мим, легко ідентифіковані, як сигнали позитивної також використані і більш великі безперервні комгібридизації у порівнянні з контрольними гібридиплементарні ділянки, відповідно до довжини комзаціями. У будь-якому випадку, можна загалом плементарних послідовностей. відзначити, що умови можуть бути зроблені більш Очевидно, що фрагменти можуть бути також жорсткими шляхом додавання зростаючих кількосотримані іншими методами, такими як, наприклад, тей формаміду, який служить для дестабілізації метод механічної фрагментації або гідроліз фергібридного дуплекса так само, як і підвищена темментами, що рестриктують. Невеликі нуклеїнокиспература. Таким чином, умови гібридизації можуть лотні сегменти або фрагменти можуть бути легко бути легко змінені, і обраний метод залежить від отримані, наприклад, методом прямого синтезу бажаних результатів. фрагмента хімічними способами, як це звичайно У деяких варіантах здійснення даного винахоробиться, із використанням автоматичного олігоду, для оцінки гібридизації може статися переважнуклеотидного синтезатора. Крім того, фрагменти ним використовувати нуклеїнокислотні послідовможуть бути отримані шляхом застосування техності даного винаходу в комбінації з відповідними нології репродукування нуклеїнової кислоти, такої засобами, такими як, мітка. Фахівцям відомий шияк технологія PCR™, описана [в заявках на Патент рокий ряд індикаторних засобів, включаючи флуоСША №4683195 і 4683202] (кожна з яких вводитьресцентні, радіоактивні, ферментативні і інші лігася в даний винахід за допомогою посилання), нди, такі як, авідин/біотин, які здатні давати шляхом вбудовування обраних послідовностей у сигнал, що детектується. У кращих варіантах здійрекомбінантні вектори для рекомбінантного продуснення винаходу, замість радіоактивних або інших кування, або шляхом застосування інших технолонебажаних з екологічної точки зору реагентів, пегій рекомбінантних ДНК, в основному, відомих фареважно, використовувати флуоресцентну мітку хівцям в області молекулярної біології. або ферментну мітку, таку як, уреаза, лужна фосВідповідно до цього, нуклеотидні послідовності фатаза або пероксидаза. Стосовно ферментних 17 75317 18 міток, відомо, що в цьому випадку, для забезпечити, що даний винахід також передбачає викоричення їхньої візуалізації як людським оком, так і стання більш коротких ДНК-сегментів для спрямоспектрофотометричним прибором, можуть бути ваної експресії кристалічних пептидів, або епітопвикористані колометричні індикаторні субстрати, них корових областей, таких, які можуть бути які дозволяють ідентифікувати специфічну гібривикористані для генерування антитіл проти крисдизацію з використанням зразків, що містять комталічного білка. Особливо відповідними вважаплементарні нуклеїнові кислоти. ються ДНК-сегменти, що кодукіть пептидні антигеВзагалі, вважається, що гібридизаційні зонди, ни довжиною від біля 8 до біля 50 амінокислот, описані у даний заявці, можуть бути використані у або більш переважно від біля 8 до біля 30 аміноякості реагентів для гібридизації у розчині, а у декислот, або навіть більш переважно, від біля 8 до яких варіантах, може бути також використана твебіля 20 амінокислот. Такими пептидними епітопарда фаза. У тих варіантах даного винаходу, де ми можуть бути амінокислотні послідовності, що використовується тверда фаза, ДНК, що тестуєтьвключають безперервні амінокислотні послідовнося, (або РНК) адсорбують або як-небудь інакше сті з SEQ ID №3 або SEQ ID №4. приєднують до обраної матриці або до поверхні. Трансгени кристалічних білків і трансгенні роПотім, цю фіксовану одноланцюжну нуклеїнову слини кислоту піддають специфічній гібридизації з обраУ ще одному своєму аспекті даний винахід ними зондами у відповідних умовах. Вибір умов стосується способів продукування трансгенної залежить від конкретних обставин, і визначається рослини, що експресує нуклеїнокислотний сегвиходячи з конкретно необхідних критеріїв (напримент, який кодує новий кристалічний білок даного клад, у залежності від вмісту G+C, типу нуклеїновинаходу. Спосіб продукування трансгенних росвої кислоти-мішені, джерела нуклеїнової кислоти, лин добре відомий фахівцям. Загалом, цей спосіб розміру гібридизаційного зонда і т.і.). Після промипередбачає трансформацію відповідної клітинивання гібридизованої поверхні так, щоб були відхазяїна ДНК-сегментом, що містить промотор, далені неспецифічно зв'язані молекули-зонди, правильно приєднаний до кодуючої області, яка специфічну гібридизацію детектують, або навіть кодує кристалічний білок СrуЕТ33 або СrуЕТ34 оцінюють кількісно за допомогою мітки. B.thuringiensis. Така кодуюча область, звичайно Рекомбінантні вектори й експресія кристалічправильно з'єднана з областю термінації транскних білків рипції, завдяки чому зазначений промотор здатний В інших варіантах здійснення даного винаходу, регулювати транскрипцію кодуючої області у кліпередбачається, що деякі переваги можуть бути тині, забезпечуючи, тим самим, здатність клітини досягнуті шляхом приміщення ДНК-сегмента, що продукувати рекомбінантний білок in vivo. Альтеркодує, під контроль рекомбінантного або гетеролонативно, у тих випадках, коли бажано здійснювати гічного промотору. Використовуваний у даному контроль, регуляцію або зниження кількості рекоописі термін "рекомбінантний або гетерологічний мбінантного кристалічного білка, що конкретно промотор" означає промотор, який у природних експресується в конкретній трансгенній клітині, умовах звичайно не асоціюється з ДНК-сегментом, даний винахід також передбачає експресію антисщо кодує кристалічний білок або пептид. Такими мислової мРНК кристалічного білка. Використання промоторами можуть бути промотори, які звичайантисмислової мРНК як засобу для регулювання но асоціюються з іншими генами, і/або промотори, або зниження кількості даного потрібного білка в виділені з будь-яких бактеріальних, вірусних, еукаклітині добре відомо фахівцям. ріотичних або рослинних клітин. В основному, дуВ іншому своєму аспекті даний винахід стосуже важливо використовувати промотор, який ефеється трансгенних рослин, що експресують ген або ктивно направляє експресію ДНК-сегмента в тип генний сегмент, який кодує одну або декілька ноклітини, організм, або навіть тварину, обрані для вих поліпептидних композицій, описаних у даний експресії. Використання промоторів і комбінацій заявці. Використовуваний у даному описі термін типів клітин для експресії білка, в основному, ві"трансгенна рослина" означає рослину, що містить домо кожному фахівцю в області молекулярної убудовані ДНК-послідовності, включаючи, але не біологи, [див., наприклад, Sambrook et al., 1989]. обмежуючись ними, гени, які, цілком ймовірно, не Відповідними промоторами можуть бути конституіснують у природі; ДНК-послідовності, що як пративні або індуцибельні промотори, що можуть бути вило, не транскрибуються в РНК, або не транслювикористані у відповідних умовах для досягнення ються ("експресуються") з творенням білка; або високих рівнів експресії убудованого ДНКбудь-які інші гени або ДНК-послідовності, які басегмента, так, щоб їх можна було застосовувати жано ввести в нетрансформовану рослину, такі як, для великомасштабного продукування рекомбінагени, що, в основному, можуть бути присутніми у нтних білків і пептидів. Відповідними промоторнинетрансформованій рослині, але які бажано або ми системами, що можуть бути використані для сконструювати методами генної інженерії, або моекспресії високих рівнів білка, є, але не обмежудифікувати так, щоб вони мали змінену експресію. ються ними, векторна система експресії Pichia У деяких випадках, необхідно, щоб геном тра(Pharmacia LKB Biotechnology). нсгенної рослини даного винаходу був збільшений Що стосується варіантів здійснення експресії за допомогою стабільного введення одного або для одержання рекомбінантних білків і пептидів, то декількох трансгенів сrуЕТ33 або сrуЕТ34, які мовважається, що в більшості випадків можуть бути жуть бути нативними, синтетично модифікованивикористані більш довгі ДНК-сегменти; при цьому, ми, або мутантними. У деяких випадках, у геном найбільш кращими є ДНК-сегменти, що кодують трансформованої рослинної клітини-хазяїна може повну пептидну послідовність. Однак, слід зазнабути введене більш одного трансгена. Таким ви 19 75317 20 падком є, наприклад, випадок, коли в геном росСайт-специфічний мутагенез лини вводять ДНК-сегмент, що кодує більш, ніж Сайт-специфічний мутагенез являє собою теодин кристалічний білок. У деяких ситуаціях, може хніку, використовувану для одержання окремих статися бажаним мати один, два, три, чотири або пептидів, або біологічно функціональних еквіваленавіть більш кристалічні білки B.thuringiensis (або нтних білків або пептидів за допомогою специфічнативних, або рекомбінантно сконструйованих), ного мутагенезу на основі ДНК. Крім того, ця технівключених і таких, що стабільно експресуються у ка дозволяє легко одержати і проаналізувати трансформованій трансгенній рослині. варіанти послідовностей, наприклад, приймаючи Кращим геном, що може бути убудований, є, до уваги одне або декілька з вищевказаних посинаприклад, ДНК-послідовність, яка кодує кристалілань, шляхом введення однієї або декількох мочний білок, і походить від бактерії, а зокрема, один дифікацій нуклеотидної послідовності в ДНК. Сайтабо декілька генів, що описані в даний заявці, і які специфічний мутагенез дозволяє продукувати мубули отримані від видів Bacillus. У високому ступетанти за допомогою використання специфічних ні кращими нуклеїнокислотними послідовностями олігонуклеотидних послідовностей, що містять є послідовності, отримані від B.thuringiensis, або ДНК-послідовність із потрібною мутацією, а також будь-яка з цих послідовностей, яка була генетично достатнє число суміжних нуклеотидів, і одержувасконструйована для зниження або збільшення ти праймерну послідовність потрібного розміру і з інсектицидної активності кристалічного білка в тапотрібною варіабельністю послідовностей для кій трансформованій клітині-хазяїні. утворення стабільного дуплекса, що простираєтьЗасоби, використовувані для трансформації ся по обидві сторони від делеційного стику. Звирослинної клітини і для одержання трансгенної чайно, кращим є праймер довжиною від біля 13, клітинної лінії, добре відомі фахівцям, і обговорюабо біля 14, або біля 16, або біля 17 включно, і ються у даному описі. Вектори, плазміди, косміди, включаючи, до біля 18, або біля 19, або біля 20, YAC (штучні дріжджові хромосоми) і ДНКабо біля 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, або навіть до сегменти, використовувані для трансформації табіля 30, 40, або біля 50 або т.і. нуклеотидів, де ких клітин, містять, зрозуміло, в основному, оперобіля 5-10 залишків на обох сторонах від стику посни, гени, або послідовності даного винаходу, що лідовності є зміненими. походять від генів, або нативні або синтетично В основному, техніка сайт-специфічного мутасконструйовані послідовності, а зокрема, послідогенезу добре відома фахівцям, і описана в різних вності, які кодують кристалічні білка, що описуютьпублікаціях. Слід зазначити, що звичайно, у цій ся. Ці ДНК-конструкції можуть, крім того, включати техніці використовують фаговий вектор, що є приструктури, такі як, промотори, енхансери, полілінсутнім як в одноланцюжній, так і в дволанцюжній кери, або навіть генні послідовності, що мають формі. Типовими векторами, використовуваними в позитивно або негативно-регуляторну активність сайт-специфічному мутагенезі, є такі вектори, як стосовно конкретних генів, які представляють інфаг М13. Цей фаг є комерційно доступним і його терес. ДНК-сегмент або ген може кодувати або використання, в основному, добре відомо фахівнативний, або модифікований кристалічний білок, цям. Дволанцюжні плазміди також традиційно вищо може бути експресований в отриманих рекомкористовуються в сайт-специфічному мутагенезі, бінантних клітинах, і/або який може забезпечувати що дозволяє виключити стадію переносу потрібнополіпшений фенотип генерованій клітині. го гена з плазміди у фаг. Такими трансгенними рослинами можуть бути, В основному, відповідно до даного винаходу, переважно, однодольні або дводольні рослини, що сайт-специфічний мутагенез здійснюють спочатку мають підвищену резистентність до інсектициду, шляхом одержання одноланцюжного вектора або завдяки введенню в ці рослини трансгенного ДНКдисоціації шляхом плавлення дволанцюжного вексегмента, який кодуює один або декілька кристалітора, що у своїй послідовності містить ДНКчних білків СrуЕТ33 і/або СrуЕТ34, що є токсичнипослідовність, яка кодує потрібний пептид. Олігоми для твердокрилих комах. Особливо кращими нуклеотидний праймер, що несе потрібну мутоварослинами є трави, які утворюють дерн, пшениця, ну послідовність, одержують, в основному, синтеовочеві рослини, декоративні рослини, плодові тично. Потім цей праймер гібридизують з дерева, і т.і. одноланцюжним вектором, і піддають обробці феУ своєму родинному аспекті даний винахід тарментами, що полімеризують ДНК, такими як фракож стосується насіння, продукованого трансфоргмент Кленова полімерази І Е.соlі, для завершення мованою рослиною; потомства, отриманого від повного синтезу ланцюга, що несе мутацію. У тацього насіння; і насіння, продукованого потомсткий спосіб утворюється гетеродуплекс, де один вом вихідної трансгенної рослини, отриманої відланцюг кодує вихідну немутовану послідовність, а повідно до вищевказаного способу. Таке потомстдругий ланцюг несе потрібну мутацію. Потім, цей во і насіння будуть містити трансген, що кодує гетеродуплексний вектор використовують для тракристалічний білок, і стабільно убудований у їхнім нсформації відповідних клітин, таких як, клітини геном, і ці потомствені рослини будуть успадковуЕ.соlі, і відбирають клони, що містять рекомбінантвати ознаки, повідомлені їм шляхом уведення стані вектори, які несуть відповідним чином розташобільного трансгена методами менделеївської гевану мутовану послідовність. нетики. Усі зазначені трансгенні рослини, що Одержання варіантів послідовності обраних мають убудовані в їхній геном трансгенні ДНКДНК-сегментів, що кодують пептид, із використансегменти, які кодують один або декілька кристаліням сайт-направленого мутагенезу, є одним із чних білків або поліпептидів СrуЕТ33 і/або способів продукування потенційно корисних видів, СrуЕТ34, являють собою аспекти даного винаходу. але цей спосіб не повинний розглядатися як деяке 21 75317 22 обмеження, оскільки можуть бути використані й ревинний). Продукування поліклональних антитіл інші способи, що передбачають одержання варіанможе бути простежене шляхом узяття проб крові тів послідовностей пептидів і ДНК-послідовностей, від імунізованої тварини в різних ділянках організщо кодують ці пептиди. Так, наприклад, для одерму тварини після його імунізації. Може бути також жання варіантних послідовностей, рекомбінантні уведена друга (бустер)-ін'єкція. Процес введення вектори, що кодують потрібну пептидну послідовбустер-ін'єкцій і титрування повторюють доти, поки ність, можуть бути оброблені мутагенними агентане буде отриманий відповідний титр. При досягми, такими як, гідроксиламін. ненні потрібного рівня імуногенності, кров імунізоКомпозиції, що включають антитіло проти ваної тварини може бути зібрана, а сироватка моСrуЕТ33 і СrуЕТ34, і способи їх одержання же бути виділена і збережена, і/або ця тварина У конкретних варіантах здійснення винаходу, може бути використана для продукування монокавтори даного винаходу використовували антитілональних антитіл (mAb). ла, або моноклональні, або поліклональні, що Моноклональні антитіла (mAb) можуть бути зв'язуються з кристалічними білками, описаними в легко отримані з використанням добре відомої даний заявці. Способи одержання і характеризації техніки, [наприклад, описаної в патенті США антитіл добре відомі фахівцям [див., наприклад. №419626], що вводиться в даний опис за допомоAntibody: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor гою посилання. Звичайно ця техніка передбачає Laboratory, New York, 1988]; цей опис вводиться в імунізацію відповідної тварини обраною Імуногендану заявку за допомогою посилання). У способах ною композицією, наприклад, очищеним або частгенерування моноклональних антитіл (mAb) звиково очищеним кристалічним білком, поліпептидом чайно використовуються ті ж самі лінії, що викориабо пептидом. Композицію, яка імунізує, уводять стовуються для одержання поліклональних антиспособом, ефективним для стимуляції клітин, що тіл. Інакше кажучи, поліклональне антитіло продукують антитіло. Кращими тваринами є гризупродукують шляхом імунізації тварини імуногенни, такі як, миші і пацюки, однак, можуть бути таною композицією даного винаходу, і від імунізовакож використані клітини кроликів, овець або жаб. ної тварини беруть антисироватку. Для продукуВикористання пацюків може мати деякі переваги вання антисироватки можуть бути використані (Coding, 1986, pp.60-61), але краще використовутварини широкого ряду. Звичайно, тваринами, вати мишей, особливо кращими є миші BALB/c, використовуваними для продукування антисирооскільки вони використовуються найбільш часто, і ватки, є кролики, миші, пацюки, хом'ячки, морські дають, в основному, найбільш високий відсоток свинки, або кози. Для продукування поліклональстабільних гібридів. них антитіл, кращими є кролики, оскільки вони маПісля імунізації; для генерування mAb відповіють відносно великий об'єм крові. дно до звичайної схеми, відбирають соматичні Фахівцям добре відомо, що дана композиція клітини, здатні продукувати антитіла, зокрема, може варіюватися за своєю імуногенністю. Тому, лімфоцити В (В-клітини). Ці клітини можуть бути часто виявляється необхідним додатково стимуотримані шляхом біопсії із селезінки, мигдалин або лювати імунну систему хазяїна, що може бути долімфатичних вузлів, або зі зразків периферійної сягнуте шляхом зв'язування пептидного або полікрові. Клітини селезінки і клітини периферійної пептидного імуногена з носієм. Прикладами крові є кращими, перші, тому, що вони являють кращих носіїв є гемоціанін лімфи равлика (KLN) і собою багате джерело клітин, які продукують анальбумін бичачої сироватки (BSA). У якості носіїв титіло, що знаходяться в стадії лімфобластів, які можуть бути також використані й інші альбуміни, діляться, а другі - тому що, периферійна кров є такі як овальбумін, альбумін мишиної сироватки, легко доступним джерелом. Часто імунізують ряд або альбумін кролячої сироватки. Кон'югування різних тварин, після чого селезінку з найбільш виполіпептиду з білком-носієм може бути здійснено соким титром видаляють, і лімфоцити селезінки способами, добре відомими фахівцям, наприклад, одержують шляхом гомогенізації селезінки шприіз використанням глутаральдегіду, мцом. Звичайно селезінка імунізованої миші містить малеімідобенкоїл-N-гідроксисукцинімідоефіру, приблизно 5 107-2 108 лімфоцитів. карбодиміду, і біс-біазотованого бензидину. Потім В-лімфоцити, що продукують антитіло, Фахівцям також добре відомо, що імуногенотримані від імунізованої тварини, піддають злитність конкретної імуногенної композиції може бути тю з імррталізованими мієломними клітинами, звипосилена шляхом використання неспецифічних чайно, клітинами тварини того ж виду, який було стимуляторів імунної відповіді, відомих як ад'юваімунізовано. Кращими мієломними лініями, що нти. Типовими і кращими ад'ювантами є повний підходять для використання в процедурах злиття з ад'ювант Фрейнда (неспецифічний стимулятор метою продукування гібридом, є клітини, що не імунної відповіді, що містить "убиту" бактерію продукують антитіл, мають високу ефективність Mycobacterium tuberculosis), неповний ад'ювант злиття, і не містять ферментів, що повідомляють Фрейнда, і ад'ювант на основі гідроксиду Алюцим клітинам нездатність зростати у визначених мінію. селективних середовищах, які підтримують ріст Кількість імуногенної композиції, використовутільки потрібних злитих клітин (гібридом). ваної для продукування поліклональних антитіл, Може бути використаний будь-який вид з ряду варіюється в залежності від природи імуногена, а існуючих мієломних клітин, відомих фахівцям також від тварини, використовуваної для імунізації. [Coding, рр.65-66, 1986; Campbell, рр.75-83, 1984]. Для введення імуногена можуть бути використані Так, наприклад, якщо імунізованою твариною є різні способи (підшкірний, внутрішньом'язовий, миша, то можуть бути використані Р3-Х63/Аg8, чрезшкірний, внутрішньовенний і внутрішньоочеХ63-Аg8.653, NS1/1-Ag41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, 23 75317 24 MPC-11, MPC11-X45-GTG 1,7 і S194/5XXO Bul; добір гібридом здійснюють шляхом культивування якщо імунізованими тваринами є пацюки, то моклітин методом одноклонового розведення в жуть бути використані R210.RCY3, Y3-Ag1.2.3, планшетах для мікротитрування з наступним анаIR983F і 4В210; а якщо для злиття використовулізом окремих клональних супернатантів (приблиються клітини людини, то можуть бути використані зно через 2-3 тижні) для одержання потрібної реаусі U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 і ктивності. Цей аналіз повинний бути чутливим, UC729-6. простим і швидким, таким як, радіоімуноаналізи, Однією з кращих мієломних клітин миші є мієімуноферментні аналізи, аналізи на цитотоксичломна клітинна лінія NS-1 (що позначається також ність, аналізи методом бляшок, дот-блотP3-NS-1-Ag4-1), яка легко може бути отримана зі імуноаналізи на зв'язування, і т.і. сховища генетичних мутантних клітин людини Потім відібрані гібридоми піддають серійному (Human Genetic Mutant Cell Repository, NIGMS) розведенню і клонують в окремі клітинні лінії, що шляхом запиту в цьому сховищі клітинної лінії продукують антитіло, клони яких можуть бути поGM3573. Іншою мієломною мишиною клітинною тім розмножені до нескінченності з продукуванням лінією, що може бути використана, є резистентна mAb. Ці клітинні лінії можуть бути використані для до 8-азагуаніну непродукуюча клітинна лінія, мипродукування mAb двома основними способами. шиної мієломи SP2/0. Зразок гібридоми може бути ін'єкційований (часто Методи генерації гібридів клітин що продукув черевну порожнину) гістосумісній тварині того ють антитіло селезінки, або лімфовузлів і мієломтипу, що був використаний для продукування соних клітин звичайно передбачають змішування матичних і мієломних клітин для початкового злитсоматичних клітин із мієломними клітинами у відтя. У ін'єкційованої тварини розвивається пухлина, ношенні 2:1, хоча це відношення може варіюватищо секретує специфічні моноклональні антитіла, ся в межах від біля 20:1 до біля 1:1, відповідно, у продукує гібридними злитими клітинами. Потім, присутності агента або агентів (хімічних або елекфізіологічні рідини тварини, такі як, сироватка або тричних), що стимулюють злиття клітинних мемасцитна рідина, можуть бути віддалені з одержанбран. Були описані методи злиття з використанням ням mAb високої концентрації. Окремі клітинні лінії вірусу Сендай (Kоhler & Milstein, 1975; 1976), і з можуть бути також культивовані in vitro, де mAb використанням поліетиленгліколю (ПЕГ), такого як звичайно секретуються в культуральне середови37% (об/dp) ПЕГ (Geffer et al., 1977). Відповідними ще, із якого вони можуть бути легко отримані у для використання є також методи електрично інвисоких концентраціях. Якщо необхідно, продукодукованого злиття (Goding, 1986, pp.71-74). вані mAb можуть бути потім очищені методом фіПроцедури злиття звичайно продукують житльтрації, центрифугування, і різними хроматогра-6 фічними методами, такими як, ВЕЖХ або афінна тєздатні гібриди при низькій частоті, біля 1 10 хроматографія. 1 10-8. Однак, у цьому зв'язку не виникає ніяких ELISA і імунопреципітація проблем, оскільки життєздатні злиті гібриди моЗ метою даного винаходу можуть бути викорижуть бути диференційовані від батьківських незлистані аналізи ELISA. В аналізі ELISA, білки або тих клітин (зокрема, від незлитих мієломних клітин, пептиди, що включають послідовності антигенних що звичайно, повинні безперервно ділитися) шлякристалічних білків, імобілізують на обраній поверхом культивування в селективному середовищі. хні, переважно, на поверхні, що має спорідненість Таким селективним середовищем звичайно є седо даного білка, такій як, лунки полістиролового редовище, що містить агент, який блокує de novo планшета для мікротитрування. Після відмивання синтез нуклеотидів у середовищі для культивудля видалення неповністю адсорбованого матерівання тканин. Типовими і кращими агентами є аміалу лунки аналітичного планшета, переважно, ноптерин, метотрексат і азасерин. Аміноптерин і зв'язують із неспецифічним білком, або сенсибіліметотрексат блокують de novo синтез як пуринів, зують неспецифічним білком, який, як відомо, є так і піримідинів, тоді як азасерин блокує тільки антигенно нейтральним стосовно антисироватці, синтез пуринів. Якщо використовується аміноптещо тестується, таким як, альбумін бичачої сироварин або метотрексат, то в середовище добавлятки (BSA), казеїн або розчини сухого молока. Ця ють гіпоксантин і тимідин як джерело нуклеотидів процедура дозволяє блокувати ділянки неспеци(середовище HAT). Якщо використовується азасефічної адсорбції на поверхні, що імобілізує, і, тим рин, то в середовище добавляють гіпоксантин. самим, сприяє зниженню фону, обумовленого неКращим селективним середовищем є HAT. У специфічним зв'язуванням антисироватки на посередовищі HAT можуть виживати тільки клітини, верхні лунок. здатні діяти шляхом "реутилізації" нуклеотидів. Після зв'язування антигенного матеріалу з луМієломні клітини є дефіцитними по Ключових фенкою, сенсибілізації нереакційноздатним матеріарментах "реутилізаційного" шляху, наприклад, по лом для зниження фону, і промивання для видагіпоксантин-фосфоріoозилтрансферазі (HPRT), і лення незв'язаного матеріалу, поверхню, що вони не можуть виживати в цьому середовищі. Вімобілізує, піддають контакту з антисироваткою клітини можуть діяти цим шляхом, але вони мають або з досліджуваним клінічним або біологічним обмежений життєвий цикл у культурі, і звичайно екстрактом способом, що сприяє утворенню імунгинуть приблизно через два тижні. Тому, тільки ного комплексу (антиген/антитіло). Ці умови пеклітини, що можуть виживати в селективних серередбачають, переважно, розведення антисироватдовищах, є гібридами, утвореними від мієломи і Вки розріджувачами, такими як, BSA, бичачий гамаклітин. глобулін (BGG), і забуферений фосфатом фізіолоЦе культивування дає популяцію гібридом, із гічний розчин (РВЗ)/Твін®. Ці додані агенти також якої відбирають специфічні гібридоми. Звичайно, 25 75317 26 сприяють зниженню неспецифічного зв'язування. використані у якості високоафінних первинних реПотім нанесений шар антисироватки залишають агентів для ідентифікації білків, імобілізованих на для інкубування протягом від біля 2 до біля 4 готвердій матриці-носії, такій як нітроцелюлоза, нейдини, при температурі, переважно, порядку від лон, або їхні комбінації. У сполученні з імунопребіля 25°С до біля 27°С. Після інкубування, поверхципітацією із наступним гель-електрофорезом, ню, яка контактує з антисироваткою, промивають вони можуть бути використані у якості реагенту для видалення матеріалу, який не утворив імунодля одностадійної детекції антигенів, проти яких комплекс. Краща процедура промивання передбавторинні реагенти, використовувані для детекції чає промивання таким розчином, як PBS/Твін®, антигену, дають небажаний фон. їхнє використанабо боратним буфером. ня є особливо кращим у тому випадку, коли досліПісля утворення специфічних імунних компледжуваними антигенами є імуноглобуліни (що доксів між зразком, що тестується, і зв'язаним антизволяє уникнути використання імуноглобулінів, які геном, і після наступного промивання, поява цього зв'язуються з компонентами клітинної стінки бакімунокомплекса і навіть його кількості можуть бути терій), і в цьому випадку досліджувані антигени визначені за допомогою взаємодії, якій піддають перехресно реагують з агентом, що детектує, або цей імунокомплекс із "другим" антитілом, що має вони мігрують при тій же самій відносній молекуспецифічність до першого антитіла. Для здійсненлярній масі, що і сигнал, який реагує перехресно. ня цього Способу виявлення, "друге" антитіло пеВважається, що особливо цінними в цьому віреважно, кон'югують із ферментом, що генерує дношенні є методи імунологічної детекції, що проколірне фарбування після його інкубування з відводяться в сполученні з Вестерн-блотінгом, і пеповідним хромогенним субстратом. Так, наприредбачають використання мічених ферментами, клад, необхідно, щоб зв'язана з антисироваткою радіоактивно мічених, або флуоресцентно-мічених поверхня контактувала або була інкубована з ан"інших" антитіл проти молекули токсину. титілом, що кон'юговане з уреазою або пероксидаНабори для скринінгу і детекції кристалічних зою проти імуноглобулінів людини IgG протягом білків такого періоду часу й у таких умовах, які сприяють У даному винаході описані методи і набори прояву фарбування, зв'язаному з утворенням імудля скринінгу зразків, що приблизно містять полінокомплекса (наприклад, інкубування протягом 2 пептиди кристалічного білка або поліпептиди, що годин при кімнатній температурі в розчині, що міспоходять від кристалічного білка, або клітини, що тить PBS, такому як, PBS-Твін®). продукують такі поліпептиди. Набір може містити Після інкубування з "другим" антитілом, мічеодне або декілька антитіл даного винаходу, і може ним ферментом, і наступним відмиванням для також містити реагент(и) для детекції взаємодії видалення незв'язаного матеріалу, кількість мітки між зразком і антитілом Даного винаходу. Отримаможе бути оцінена шляхом інкубування з хромоний реагент(и) може бути радіоактивно-, фруоресгенним субстратом, таким як, сечовина і бромкрецентно-, або ферментативно-міченим. Цей набір золовий пурпурний або 2,2'-азино-ди-(3-етилможе містити відомий радіоактивно мічений агент, бензтіазолін)-6-сульфонова кислота (ABTS) і Н2О2, здатний зв'язувати або взаємодіяти з нуклеїновою у випадку, якщо у якості ферментної мітки викорикислотою або антитілом даного винаходу. стовується пероксидаза. Потім, кількісна оцінка Реагент(и) цього набору може бути виготовлеможе бути проведена шляхом виміру ступеня проний у виді рідкого розчину, у виді матеріалу, зв'ядукування фарбування, наприклад, із використанзаного з твердим носієм, або у виді сухого порошням спектрофотометру у візуальній області спектку. Переважно, .щоб реагент(и) був виготовлений рів. у виді рідкого розчину, який є водяним розчином. Антитіла проти кристалічних білків даного виЯкщо реагенти зв'язують із твердим носієм, то находу можуть бути, зокрема, використані для кращим твердим носієм може бути хроматографівиділення інших кристалічних білкових антигенів чне середовище, тест-планшет, що має безліч шляхом імунопреципітації. Імунопреципітація пелунок, або предметне скло для мікроскопа. Якщо редбачає виділення цільового антигенного компореагенти виготовляють у виді сухого порошку, то нента із суміші комплексу, і використовується для цей порошок може бути розведений з одержанням розпізнавання або виділення невеликих кількостей розчину шляхом додавання відповідного розчинбілка. Для виділення мембрани, білкові клітини ника, який може бути підготовлений заздалегідь. повинні бути солюбілізовані в міцели детергента. В інших варіантах свого здійснення, даний виКращими є неіоногенні солі, оскільки інші агенти, нахід стосується способів імунодетекції і асоційотакі як солі жовчних кислот, осаджуються при кисваних з ними наборів. Було припущено, що крислотному рН або у присутності двовалентних каталічні білки або пептиди даного винаходу можуть тіонів. бути використані для детекції антитіл, які зв'язуВ альтернативному експерименті, антитіла ються з ними; або, альтернативно, антитіла, отриданого винаходу можуть бути використані для замані відповідно до даного винаходу, можуть бути микання місцеположення двох антигенів. Цей мевикористані для детекції кристалічних білків або тод є особливо ефективним для підвищення локапептидів, що містять епітоп родинного кристалічлізованої концентрації антигенів, наприклад, пар ного білка. Загалом, у цих способах, спочатку оде"фермент-субстрат". ржують зразок, що, приблизно, містить зазначений Вестерн-блотінг білок, пептид або антитіло, а потім, цей зразок Композиції даного винаходу можуть бути шипіддають контакту з антитілом або пептидом данороко використані в імуноблот-аналізі або Вестернго винаходу в умовах, ефективних для утворення блот-аналізі. Антитіла проти пептидів можуть бути імунокомплексу, і якщо це утворення мало місце, 27 75317 28 то здійснюють детектування присутності цього нахід стосується епітопних корових послідовносімунокомплексу. тей, що походять від білків або пептидів Cry. В основному, процедура детекції утворення Використовуваний у даному описі термін " що імунокомплексу добре відома фахівцям і може містить епітоп, який імунологічно перехресно реабути здійснена різними способами. Так, напригує з одним або декількома антитілами проти крисклад, для цієї мети, даний винахід передбачає талічного білка" стосується пептиду або білкового проведення аналізів ELISA, РІА, імуноблотінгу (наантигену, який має первинну, вторинну або треприклад, дот-блот-аналізу), непрямого імунофлуотинну структуру, аналогічну епітопу, локалізованоресцентного аналізу т.і. В основному, утворення му усередині кристалічного білка або поліпептиду. імунокомплексу може бути виявлене; за допомоПри цьому, ступінь подібності є, в основному, тагою мітки, такої як, радіоактивна мітка або фермекою, що моноклональні або поліклональні антитінтна мітка (така як, лужна фосфатаза, пероксидала, спрямовані проти кристалічного білка або поліза хріну, або т.і.). Зрозуміло, може статися кращим пептиду, будуть також зв'язуватися, реагувати, або використовувати вторинний ліганд для зв'язуваняк-небудь інакше розпізнавати перехресноня, таких як, "друге" антитіло або система біореактивний пептидний або білковий антиген. У тин/авідинового ліганду для зв'язування, добре сполученні з такими антитілами можуть бути виковідома фахівцям. ристані різні методи імуноаналізу, наприклад, такі Було припущено, що для аналізу може бути як, Вестерн-блотінг, ELISA, РІА, і т.і., усі з яких використаний практично будь-який досліджуваний добре відомі фахівцям. зразок, що, приблизно, містить або кристалічний Ідентифікація імунодомінантних епітопів Cry, білок або пептид, або пептид, родинний кристалічі/або їх функціональних еквівалентів, що підходять ному білку, або антитіло проти цього білка, як роздля використання у вакцинах, є відносно прямим глядається в даному випадку. При цьому, передметодом. Так, наприклад, можуть бути використані бачається, що ці варіанти здійснення винаходу методи Норр, [описані в патенті США №4554101], можуть знайти застосування при титруванні зразщо вводиться в даний опис за допомогою посиків антигену або антитіла, при доборі гібридом, і лання, і в якому описана ідентифікація й одержант.і. У родинних варіантах свого здійснення, даний ня епітопів з амінокислотної послідовності на освинахід стосується виготовлення наборів, що монові її гідрофільності. Ці методи описані в деяких жуть бути використані для виявлення присутності інших роботах, і для ідентифікації епітопних корокристалічних білків або родинних білків, і/або анвих послідовностей можуть бути також використані титіл у зразку. У якості прикладів можуть служити комп'ютерні програми, розроблені на основі цих клітини, супернатанти клітин, клітинні екстракти, методів [див., наприклад, Jameson & Wolf, 1988; ферментні фракції, білкові екстракти, або інші безWolf et al., 1988; патент США №4554101]. Амінокиклітинні композиції, що, приблизно, містять крисслотна послідовність цих "епітопних корових посталічні білки або пептиди. Узагалі говорячи, наболідовностей" може бути потім легко введена в пери даного винаходу можуть включати відповідний птиди з використанням методу пептидного синтезу кристалічний білок, пептид, або антитіло, спрямоабо з використанням техніки рекомбінантних ДНК. ване проти такого білка або пептиду, разом із реаКращими пептидами для використання в дагентом для імунодетекції, і тарою для утримування ному винаході є пептиди, що мають довжину поантитіла або антигену і реагенту. Реагент, що імурядку від біля 8 до біля 20 амінокислот, а більш нодетектує, звичайно включає мітку, асоційовану з переважно від біля 8 до біля 15 амінокислот. Було антитілом або антигеном, або мітку, асоційовану з припущено, що більш короткі пептиди, що поховторинним зв'язуючим лігандом. Прикладами тадять від антигенного кристалічного білка, мають, у ких лігандів є "друге" антитіло, спрямоване проти деяких випадках, більше переваг, наприклад, при "першого" антитіла або антигену, або біотиновий проведенні імунологічного аналізу. Прикладами або авідиновий (або стрептавідиновий) ліганд, що таких переваг є легке одержання й обчищення, має асоційовану мітку. Як вказувалося вище, мавідносно низька вартість і краща відтвореність буть, що для цілей даного винаходу може бути продуктів, і кращий біологічний розподіл. використаний цілий ряд традиційних міток, добре Було припущено, що конкретні переваги дановідомих фахівцям. го винаходу можуть бути реалізовані шляхом одеУ якості тари звичайно використовується поржання синтетичних пептидів, що включають мосуд, у який можуть бути поміщені антитіло, антиген дифіковані і/або подовжені епітопні/імуногенні або реагент, що детектує, а переважно, їхні аліккорові послідовності, що дозволяють одержати воти. Набори даного винаходу звичайно також "універсальний" епітопний пептид, спрямований на включають засоби для утримування тари з антитікристалічні білки, а зокрема, на Cry-послідовності лами, антигенами, і реагентами в герметично заабо Cry-родинні послідовності. У конкретному аскритому виді для комерційної реалізації. Такою пекті даного винаходу, ці епітопні послідовності тарою можуть бути видувні пластикові контейнери, ідентифікують як гідрофільні області конкретного у яких зберігаються потрібний посуд. поліпептидного антигену. Було припущено, що ці Епітопні корові послідовності області являють собою ділянки, що, цілком ймовіДаний винахід також стосується білкових або рно, індукують Т-клітинну або В-клітинну стимуляпептидних композицій, що не містять інтактних цію, а, отже, дозволяють виявити продукування клітин і інших пептидів, і містять очищений білок специфічного антитіла. або пептид, який має епітоп, що імунологічно пеВикористовувані в даному винаході епітопні рехресно реагує з одним або декількома антитілакорові послідовності являють собою відносно коми проти кристалічного білка. Зокрема, даний виротку ділянку, що складається з амінокислот, що є 29 75317 30 "комплементарними" антигензв'язуючим сайтам являючи, при цьому, помітного розкладання, або або зв'язуються з цими сайтами на антитілах, не утрачаючи своєї антигенної активності. Однак, спрямованих проти кристалічного білка, і описаних якщо передбачається більш тривале збереження у у даній заявці. Крім того, або альтернативно, епіводяному розчині, то в цьому випадку, звичайно, топна корова послідовність являє собою послідовкращими є агенти, що включають буфери, такі як, ність, що виявляє антитіла, які перехресно реагуТріс або фосфатні буфери, у яких рН підтримуєтьють з антитілами, спрямованими проти пептидних ся від біля 7,0 до біля 7,5. Крім того, може статися композицій даного винаходу. При цьому, слід закращим використовувати агенти, що інгібують ріст значити, що в контексті даного опису, термін "коммікробів, такі як, азид натрію або Мертіолат. Для плементарний" стосується амінокислот або пептитривалого збереження у водяному стані, розчини дів, що мають здатність зв'язуватися один з бажано берегти при біля 4°С, а більш переважно, одним. Таким чином, деякі епітопні корові послідоу замороженому стані. Зрозуміло, якщо пептиди вності даного винаходу можуть бути чітко визназберігаються в ліофілізованому або порошкоподічені за їхню здатністю конкурувати за зв'язування бному стані, то вони можуть зберігатися, практичабо, мабуть, витискати зв'язування потрібного білно, нескінченно, наприклад, у заздалегідь визнакового антигену з антисироваткою, спрямованою чених аліквотах, що, перед їхнім застосуванням, на відповідний білок. можуть бути повторно гідратовані з використанням При цьому, очевидно, що розмір поліпептидпопередньо визначеної кількості води (переважно, ного антигену, в основному, не грає вирішальної дистильованої) або буфера. ролі, за умови, що він має довжину, принаймні, Біологічно функціональні еквіваленти достатню для здійснення ідентифікації корової У структуру пептидів даного винаходу і ДНКпослідовності або послідовностей. Очевидно, сегментів, що кодують ці пептиди, можуть бути найменшою коровою послідовністю, що може бути внесені модифікації і зміни, у результаті чого може використана в даному винаході, є послідовність, бути отримана функціональна молекула, яка кодує що має довжину приблизно біля 8 амінокислот, а білок або пептид із потрібними властивостями. більш переважно, приблизно від 10 до 20 амінокиНижче наводиться обговорення, що стосується слот. Таким чином, цей розмір звичайно відповідає замін амінокислот білка з метою створення еквівасамим дрібним пептидним антигенам, отриманим лента, або навіть поліпшення молекули другої гевідповідно до даного винаходу. Однак, якщо необнерації. У конкретних варіантах здійснення даного хідно, цей антиген може мати більш великий розвинаходу, передбачається, що мутовані кристалічмір за умови, що він містить основну епітопну коні білки можуть бути використані для підвищення рову послідовність. інсектицидної активності білка, і отже, для підвиІдентифікація епітопних корових послідовносщення інсектицидної активності і/або експресії тей відома фахівцям, і описана, [наприклад, у парекомбінантного трансгена в рослинній клітині. тенті США №4554101], що вводиться в даний опис Заміни амінокислот можуть бути здійснені шляхом за допомогою посилання, і в якому описана ідензаміни кодонів ДНК-послідовності на відповідні тифікація й одержання епітопів з амінокислотної кодони, подані в таблиці 2. послідовності виходячи з гідрофільності. Крім того, Таблиця 2 можуть бути використані численні комп'ютерні програми, призначені для визначення антигенних діАмінокислоти Кодони лянок білків [див., наприклад, Jameson & Wolf, Аланін Ala A GCA GCC GCG GCU 1988; Wolf et al., 1988]. Програми для комп'ютериЦистеїн Cys С UGC UGU зованого аналізу пептидних послідовностей (наАспаргінова Asp D GAC GAU приклад, DNAStar® software, DNAStar, Inc., кислота Madison, Wl) можуть бути також використані для Глутамінова Glu Ε GAA GAG конструювання синтетичних пептидів відповідно кислота до даного опису. Фенілаланін Phe F UUC UUU Синтез епітопних послідовностей або пептиГліцин Gly G GGA GGC GGG GGU дів, що містять у своїй послідовності антигенний Гістидин His Η CAC CAU епітоп, може бути легко здійснений із використанІзолейцин lie 1 AUA AUC AUU Лізин Lys К AAA AAG ням стандартної техніки синтезу, такої як, метод Лейцин Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU твердофазного синтезу (наприклад, із використанМетіонін Met Μ AUG ням комерційно доступного синтезатора, такого як Аспаргін Asn Ν AAC AAU Applied Biosystems Model 430A Peptide Пролін Pro Ρ CCA CCC CCG CCU Synthesizer). Потім синтезовані в такий спосіб пепГлутамін Gin Q CAA CAG тидні послідовності розділяють на аліквоти з заАргінін Arg R AGA AGG CGA CGC CGC CGU здалегідь визначеною кількістю, і зберігають відСерин Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU повідним чином, наприклад, у виді водяних Треонін Thr Τ АСА ACG ACU розчинів, або навіть, більш переважно, у виді поВалін Val V GUA GUC GUG GUU рошку або в ліофілізованому стані, аж до їхнього Триптофан Trp W UGG використання. Тирозин Tyr Υ UAC UAU Узагалі говорячи, завдяки відносній стабільності пептидів, вони можуть легко зберігатися, якщо Наприклад, деякі амінокислоти в структурі білце необхідно, у водяних розчинах протягом досить ка можуть бути замінені іншими амінокислотами тривалого часу, наприклад, до 6 місяців або більш, без значної втрати здатності зв'язування з такими практично в будь-якому водяному розчині, не виструктурами, як, наприклад області антитіл, що 31 75317 32 зв'язують антиген, або сайтів зв'язування на молебути замінені іншими амінокислотами, що мають кулах субстрату. Оскільки саме здатність зв'язувааналогічне значення ліпофільності, і ця заміна, ти і природа білка визначає біологічну функціонапроте, приводить до одержання білка з аналогічльну активність цього білка, то в послідовності ною біологічною активністю, тобто до одержання білка можуть зроблені деякі амінокислотні заміни, білка з біологічно еквівалентною функцією. При і, саме собою зрозуміло, ці заміни можуть бути проведенні таких замін, переважно здійснювати зроблені в його ДНК-послідовності, що кодує, але, заміну амінокислот, значення ліпофільності яких при цьому, може бути отриманий білок із подібнискладає порядку ±2, більш переважно, порядку ±1, ми властивостями. Тому, автори даного винаходу а ще більш переважно, порядку ±0,5. вважають, що в пептидних послідовностях описаЯк указувалося вище, амінокислотні заміни них композицій або у відповідних ДНКпроводять, в основному, виходячи з відносної попослідовностях, що кодують зазначені пептиди, дібності замісників бокових ланцюгів амінокислот, можуть бути зроблені різні заміни без утрати їхньої наприклад, їхньої гідрофобності, гідрофільності, біологічної цінності або активності. заряду, розміру, і т.і. Характерні заміни, що здійсПроведення таких замін може бути здійснено з нюють з обліком різних вищевказаних характерисурахуванням гідропатичного індексу. Важливість тик, добре відомі фахівцям, і такими замінами є: цього гідропатичного індексу амінокислот у повіаргінін і лізин; глутамат і аспаратат; серин і треодомленні даному білку інтерактивної біологічної нін; глутамін і аспаргін; і валін, лейцин і ізолейцин. функції, в основному, відома фахівцям (Kyte & Композиції кристалічних білків у якості інсекDoolittle, 1982, ця робота вводиться в даний опис тицидів і способи їхнього використання за допомогою посилання). Вважається, що відносАвтори даного винаходу вважають, що компоний гідропатичний характер амінокислоти повідозиції кристалічних білків, описані в даний заявці, є мляється вторинній структурі отриманого білка, особливо цінними при їхньому використанні у якощо, у свою чергу, визначає взаємодію білка з інсті інсектицидів для місцевої і/або системної оброшими молекулами, наприклад, із ферментами, бки польових культур, трав, фруктів і овочів, і десубстратами, рецепторами, ДНК, антитілами, анкоративних рослин. У кращому варіанті здійснення тигенами, і т.і. винаходу, біоінсектицидна композиція містить маКожній амінокислоті приписують гідропатичний сляну текучу суспензію бактеріальних клітин, що індекс виходячи з її гідрофобності і зарядної хараекспресують новий кристалічний білок, описаний у ктеристики (Kyte & Doolittle, 1982), так, наприклад, даний заявці. Кращими клітинами є клітини ізолейцин (+4,5); валін (+4,2); лейцин (+3,8); феніEG10327 B.thuringiensis однак, у даному винаході лаланін (+2,8); цистеїн/цистин (+2,5); метіонін може бути використана будь-яка бактеріальна (+1,9); аланін (+1,8); гліцин (-0,4); треонін (-0,7); клітина, що експресує нові нуклеїнокислотні сегсерин (-0,8); триптофан (-0,9); тірозин (-1,3); пролін менти, описані в даний заявці, які продукують кри(-1,6); гістидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамін (сталічний білок, наприклад, така клітина, як 3,5); аспартат (-3,5); аспаргін (-3,5); лізин (-3,9); і B.thuringiensis, B.megaterium, B.subtilis, E.coli, або аргінін (-4,5). Pseudomonas spp. Відомо, що деякі амінокислоти можуть бути В іншому важливому варіанті даного винаходу, замінені іншими амінокислотами, що мають аналобіоінсектицидна композиція включає гранули, що гічний гідропатичний індекс або оцінку, і ця заміна, вододиспергуються. Ці гранули містять бактеріапроте, приводить до одержання білка з аналогічльні клітини, які експресують новий кристалічний ною біологічною активністю, тобто, до одержання білок, описаний у даний заявці. Кращими бактерібілка з біологічно еквівалентною функцією. При альними клітинами є клітини EG10327 проведенні таких замін, переважно здійснювати B.thuringiensis, однак, у даному винаході можуть заміну амінокислот, гідропатичний індекс яких бути також використані бактеріальні клітини, такі складає в межах ±2, більш переважно, у межах ±1, як, B.thuringiensis, B.megaterium, B.subtilis, E.coli, а ще більш переважно, у межах ±0,5. або Pseudomonas spp., трансформовані ДНКФахівцям також відомо, що заміна еквівалентсегментом, описаним у даний заявці, і такі, що них амінокислот може бути ефективно здійснена експресують кристалічний білок. виходячи з гідрофільності. [У патенті США У третьому, важливому варіанті даного вина№4554101], що вводиться в даний опис за допоходу, біоінсектицидна композиція містить дуст, могою посилання, указується, що найбільше знапорошок, що змочується, гранули, або колоїдальчення локальної середньої гідрофільності білка, ний концентрат. Вищезгаданий порошок містить що визначається гідрофільністю його суміжних бактеріальні клітини, що експресують новий крисамінокислот, корелює з біологічною властивістю талічний білок, описаний у даний заявці. Кращими цього білка. бактеріальними клітинами є клітини EF10327 Як докладно описано [в патенті США B.thuringiensis, однак, у даному винаході можуть №4554101], амінокислотним залишкам були прибути також використані бактеріальні клітини, такі писані наступні значення гідрофільності: аргінін як, B.thuringiensis, B.megaterium, B.subtilis, E.coli, (+3,0); лізин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат або Pseudomonas spp., трансформовані ДНК(+3,0±1); серин (+0,3); аспаргін (+0,2); глутамін сегментом, описаним у даний заявці, і такі, що (+0,2); гліцин (0); треонін (-0,4); пролін (-0,5±1); експресують кристалічний білок. Такі сухі форми аланін (-0,5); гістидин (-0,5); цистеїн (-1,0); метіонін інсектицидних композицій можуть бути виготовлені (-1,3); валін (-1,5); лейцин (-1,8); ізолейцин (-1,8); так, щоб вони відразу розчинялися після їхній змотірозин (-2,3); фенілаланін (-2,5); триптофан (-3,4). чування; або альтернативно, вони можуть бути Слід зазначити, що деякі амінокислоти можуть виготовлені у виді композицій із регульованим ви 33 75317 34 вільненням, із пролонгованим вивільненням, або з нього середовища, а також спосіб, норма, і кільяким-небудь іншим залежним від часу вивількість інсектицидно активної композиції, що наноненням. ситься. У четвертому важливому варіанті здійснення Описані інсектицидні композиції можуть бути даного винаходу, біоінсектицидна композиція місвиготовлені з використанням бактеріальних клітин, тить водяну суспензію бактеріальних клітин, описуспензій кристалів і/або спор, або виділених білсаних вище, що експресують кристалічний білок. кових компонентів у сполученні з агрономічно приТакі водяні суспензії можуть бути виготовлені у йнятним носієм. Перед застосуванням, ці комповиді маткового концентрованого розчину, що роззиції можуть бути виготовлені у відповідному виді, водять безпосередньо перед застосуванням, або наприклад, у ліофілізованому, осушеному шляхом альтернативно, вони можуть бути виготовлені у виморожування, осушеному в десікаторі, або у виді готового розведеного розчину. водяному носії, у середовищі або у відповідному У цих способах, що передбачають викорисрозріджувачі, такому як, фізіологічний розчин або тання бактеріальних клітин, клітини-хазяїни, що інший буфер. Отримані композиції можуть бути містять ген(и) кристалічного білка, можуть бути виготовлені у виді дусту або гранульованого матекультивовані в будь-якому стандартному живильріалу, або суспензії в маслі (рослинному або міненому середовищі, у якому ДНК-конструкція має ральному), або у виді водяних емульсій або емуселективну перевагу для даного селективного сельсій типу "вода/масло", або у виді порошку, що редовища, так, щоб, в основному, усі, або абсолюзмочується, або в комбінації з будь-яким іншим тно всі клітини містили ген B.thuringiensis. Ці клітиматеріалом-носієм, що підходить для застосуванни можуть бути потім зібрані стандартним ня в агрономічних цілях. Відповідні агрономічні способом. Альтернативно, ці клітини можуть бути носії можуть бути твердими або рідкими, і добре оброблені до їхнього збору. відомі фахівцям. Термін "агрономічно прийнятний Якщо інсектицидні композиції містять інтактні носій" включає всі ад'юванти, наприклад, інертні клітини B.thuringiensis, що експресують потрібний компоненти, що диспергують агенти, поверхневобілок, то такі бактерії можуть бути отримані декільактивні речовини, адгезивні агенти, зв'язувальні кома шляхами. Вони можуть бути отримані у виді речовини, і т.і., що звичайно використовуються в порошків, що змочуються, гранул або дуетів шлятехнології виготовлення інсектицидних препаратів, хом їхнього змішування з різними інертними матеі який добре відомі фахівцям в області виготовріалами, такими як, неорганічні мінерали (філосилення інсектицидних препаратів. Ці композиції лікати, карбонати, сульфати, фосфати, і т.і.) або з можуть бути змішані з одним або декількома тверрослинними матеріалами (здрібненими кукурудзядими або рідкими ад'ювантами, і отримані різними ними початками, рисовою лушпайкою, горіховою способами, наприклад, шляхом гомогенного змішкаралупою, і т.і.). Ці композиції можуть включати шування, змішування і/або здрібнювання інсектиадгезивні добавки, що стабілізують агенти, інші цидної композиції з відповідними ад'ювантами, із пестициди добавки, або поверхнево-активні речовикористанням стандартної техніки виготовлення вини. Рідкі композиції можуть бути виготовлені на інсектицидних препаратів. водяній основі, або вони можуть бути безводними і Інсектицидні композиції даного винаходу нановикористані у виді піни, суспензій, концентратів, сять на ділянки, що уражаються цільовими тверщо емульгуються, або т.і. Інгредієнтами цих комдокрилими комахами, звичайно на листи потребупозицій можуть бути реологічні агенти, поверхнеючих захисту рослин або культур, стандартними во-активні речовини, емульгатори, що диспергуспособами, переважно, шляхом оприскування. ють агенти, або полімери. Інтенсивність і тривалість обробки залежить від Альтернативно, нові білки СrуЕТ33 і/або умов, характерних для конкретного виду шкідника СrуЕТ34 можуть бути отримані за допомогою на(шкідників), оброблюваної культури (культур) і контивних або рекомбінантних систем, що експресукретних умов навколишнього середовища. Співють, in vitro і виділені для наступного застосування відношення між кількостями активного інгредієнта і на полях. Такий білок може бути присутнім у неносія звичайно залежить від хімічної природи, розочищених клітинних лізатах, суспензіях, колоїдах, і чинності і стабільності інсектицидної композиції, а т.і., або альтернативно, перед введенням в активтакож від конкретно використовуваної композиції. ний біоцидний препарат, він може бути виділений, Може також статися доцільним, а в деяких виочищений, забуферений, і/або підданий якійсь падках і необхідним, наприклад, у випадку комах, додатковій обробці. Аналогічним способом, у дещо уражають корені або стебла, або для обробки яких випадках, може статися бажаним виділити овочів-делікатесів або декоративних рослин, викокристали і/або спори з бактеріальних культур, що ристовувати іншу техніку нанесення композиції, експресують кристалічний білок, і використовувати наприклад, запилення, розбризкування, пропитку, розчини, суспензії, колоїдні препарати, що містять зрошення ґрунту, нанесення на насіння (протравці кристали і/або спори, у якості активної біоінсекка) , нанесення на сход, оприскування, розбризкутицидної композиції. вання з літака (аерація), аерозольне дощування, Незалежно від способу застосування, кількість дрібнодисперсне оприскування, і т.і. Ці способи активного компонента (компонентів) є інсектициднанесення інсектицидів також добре відомі фано-ефективною кількістю, що може варіюватися в хівцям. залежності від таких чинників, як наприклад, конкІнсектицидна композиція даного винаходу моретний вид твердокрилої комахи, проти якого же бути використана в способі даного винаходу як спрямований інсектицид; конкретний вид обробокремо, так і в сполученні з іншими сполуками, люваної рослини або культури; умови навколишвключаючи (але не обмежуючись ними) інші пес 35 75317 36 тициди. Спосіб даного винаходу може бути також ні ті ж самі скорочення, що і на Фіг.2. використаний у сполученні з обробкою іншими Опис ілюстративних варіантів здійснення визасобами, такими як, поверхнево-активні речовинаходу ни, детергенти, полімери, або препарати з пролонДеякі переваги даного винаходу гованим вивільненням. Інсектицидні композиції Штам EG 10327 B.thuringiensis є природним даного винаходу можуть бути виготовлені для сисштамом, що має інсектицидну активність проти темного або для місцевого застосування. твердокрилих комах, включаючи довгоносика баКонцентрація інсектицидної композиції, що вивовняного, личинки хрущака каштанового користовується для нанесення на ділянки, які ото(Tribolium castaneum), і личинки японського жука чують дану рослину, для системного внесення, (Popillia japonica). Штам EG2158 B.thuringiensis або для нанесення на листи рослини, може широмістить гени кристалічного білка, токсичного для ко варіюватися в залежності від природи конкреттвердокрилих комах, що аналогічні або ідентичні ної композиції, способу обробки, умов навколишгенам кристалічного білка штаму EG10327. Два нього середовища, і ступеню біологічної активності гени нових кристалічних токсинів, позначені композиції. Звичайно, біоінсектицидна композиція сrуЕТ33 і сrуЕТ34, були клоновані з EG2158. Ген присутня у препараті, що наноситься, в концентСrуЕТ33 кодує кристалічний білок СrуЕТ33 розмірації, яка становить, принаймні, біля 1% мас, і мором 29кДа, а ген сrуЕТ34 кодує кристалічний білок же доходити аж до біля 99% мас, включно. Сухі СrуЕТ34 розміром 14кДа. Кристалічні білки препарати можуть містити від біля 1% до біля СrуЕТ33 і СrуЕТ34 є токсичними для личинки хру99%, або більш по масі композиції, а рідкі препащака каштанового, личинки довгоносика бавовнярати можуть містити від біля 1% до біля 99% мас. ного, і личинки японського жука. або більш активного інгредієнта. Препарати, що Визначення включають інтактні бактеріальні клітини, звичайно Нижче визначені значення наступних термінів і містять від біля 104 до біля 107клітин/мг. понять: Інсектицидна композиція може бути нанесена Експресія: комбінація внутрішньоклітинних на конкретну рослину або на потрібну ділянку процесів, включаючи транскрипцію і трансляцію, шляхом одного або декількох обробок, якщо це яким піддається кодуюча ДНК-молекула, така як, необхідно; при цьому, при звичайній польовій обструктурний ген, для продукування поліпептиду. робці, норма внесення на один гектар складає Промотор: сайт розпізнавання на ДНКпорядку від біля 50г до біля 500г активного інгредіпослідовності або групи ДНК-послідовностей, що єнта, або від біля 500г до біля 1000г, або від біля забезпечує регуляцію експресії структурного гена, 1000г до біля 5000г або більш активного інгреі з яким специфічно зв'язується РНК-полімераза, дієнта. ініціюючи синтез РНК (транскрипцію) цього гена. Малюнки складають частину опису даного виРегенерація: процес вирощування рослини з находу і додатково ілюструють деякі аспекти данорослинної клітини (наприклад, із протопласту або го винаходу. Для кращого розуміння даного винаексплантату рослини). ходу нижче наводиться більш докладний опис Структурний ген: ген, що експресується з проконкретних варіантів його здійснення з посиландукуванням поліпептиду. нями на один або декілька з цих малюнків. Трансформація: процес введення екзогенної На Фіг.1А, Фіг.1В і Фіг.1С показані нуклеотидні ДНК-послідовності (наприклад, вектори, рекомбіпослідовності гена сrуЕТ33 (SEQ ID №1) і гена нантної ДНК-молекули) у клітину або протопласт, у сrуЕТ34 (SEQ ID №2), і виведені амінокислотні якій (або в якому) ця екзогенна ДНК вбудовується послідовності білка СrуЕТ33 (SEQ ID №3) і білка в хромосому цієї клітини і має здатність репліСrуЕТ34 (SEQ ID №4). куватися. На Фіг.2 показана рестрикційна карта плазміди Трансформована клітина: клітина, ДНК якої pEG246. Розташування й орієнтація гена сrуЕТ33 модифікована шляхом введення в цю клітину мо(SEQ ID №1) і гена сгуЕТ34 (SEQ ID №2) показані лекули екзогенної ДНК. стрілками. Плазміда pEG246 є функціональною в Трансгенна клітина: будь-яка клітина, що поЕ.соlі, оскільки вона походить від pBR322, і резисходить, або регенерована, з трансформованої тентна до ампіциліну (AmpR). Для сайтів розщепклітини, або походить з трансгенної клітини. Приклення ендонуклеазами, що рестрикують, були виладами трансгенних клітин є калюси рослин, що користані наступні скорочення: R=EcoRI, B=BamHI. походять від трансформованої рослинної клітини, На Фіг.2 також показаний маркер розміру в одну а зокрема, від такої клітини, як клітина листа, котисячу пар основ (1kb). реню, стебла, наприклад, соматичні клітини або На Фіг.3, де також приведені первинні структурепродуктивні клітини, отримані від трансгенної ри й у тому ж масштабі, що на Фіг.2, показана ресрослини. трикційна карта плазміди pEG1246. Розташування Трансгенна рослина: рослина або її потомстй орієнтація гена сrуЕТЗЗ (SEQ ID №1) і гена во, що походить від трансформованої рослинної сrуЕТ34 (SEQ ID №2) зазначені стрілками. Плазміклітини або протопласта, де ДНК цієї рослини місда pEG1246 походить від плазміди pEG246 (Фіг.2) і тить уведену екзогенну ДНК-молекулу, що не примістить плазміду pNN101 Bacillus spp (який екссутня у нативній нетрансгенній рослині того ж сапресує ген резистентності до хлорамфеніколу мого виду. Терміни "трансгенна рослина" і [Cam8] і ген резістентності до тетрацикліну [TetR], "трансформована рослина" іноді використовуютьвставлену в BamHI-сайт плазміди pEG246. Плазся фахівцями як синоніми для визначення рослиміда pEG1246 є функціональною як у Е.соlі, так і в ни, ДНК який містить екзогенну ДНК-молекулу. B.thuringiensis. На цьому малюнку були використаОднак, зовсім очевидно, що більш правильним із 37 75317 38 наукового погляду визначенням терміна "трансвводяться в даний опис за допомогою посилання, генна рослина" є "регенерована рослина або каабо шляхом вирізання обраних ДНК-фрагментів із люс, отримані з трансформованої рослинної клітирекомбінантних плазмід, що містять відповідні ни або протопласта", і нижче, при використанні вставки і відповідні рестрикційні сайти. цього терміна буде матися на увазі саме цей зміст. Вектори, що експресують Вектор: ДНК-молекула, здатна реплікуватися у У даному винаході розглядається вектор, що клітині -хазяїні, і/або ДНК-молекула, до якої може експресує, який містить полінуклеотид даного вибути правильно приєднаний інший ДНК-сегмент находу. Таким чином, в одному з варіантів даного так, щоб це приєднання забезпечувало реплікацію винаходу, вектором що експресує, є виділена й приєднаного сегмент. Типовим вектором є плазочищена ДНК-молекула, яка містить промотор, міда. правильно приєднаний до кодуючої області, що Зонди і праймери кодує поліпептид даного винаходу, і яка правильно В іншому аспекті даного винаходу, інформація з'єднана з областю термінації транскрипції, у репро ДНК-послідовність, отримана завдяки даному зультаті чого зазначений промотор регулює трансвинаходові, дозволяє одержувати відносно короткі крипцію області, що кодує. ДНК (або РНК)-послідовності, що володіють здатВикористовуваний у даний заявці термін "праністю специфічно гібридизуватися з генними посвильно приєднаний" означає, що промотор з'єдналідовностями обраних поліолігонуклеотидів, опиний з областю, що кодує , таким чином, що транссаних у даний заявці. У цих аспектах, крипція цієї кодуючої області контролюється і нуклеїнокислотні зонди відповідної довжини одеррегулюється цим промотором. Способи правильжують виходячи з генної послідовності обраного ного приєднання промотору до області, що кодує, кристалічного білка, наприклад, такої послідовносдобре відомі фахівцям. ті, як показана в SEQ ID №1 або SEQ ID №2. ЗдаУ кращому варіанті здійснення винаходу, ретність таких ДНК і нуклеїнокислотних зондів спекомбінантна експресія ДНК, що кодують кристалічцифічно гібридизуватися з послідовністю гена, ні білки даного винаходу, відбувається, переважякий кодує кристалічний білок, робить їх особливо но, у клітинах-хазяїнах Bacillus. Кращими цінними для використання в різних цілях. Найклітинами-хазяїнами є B.thuringiensis, більш важливо, що ці зонди можуть бути викорисB.megaterium, B.subtilis і інші бацили, а найбільш тані в ряді аналізів для виявлення присутності кращими клітинами-хазяїнами є клітини комплементарних послідовностей у даному зразку. B.thuringiensis. Промотори, що функціонують у У деяких варіантах даного винаходу, переважбактеріях, добре відомі фахівцям. Типовим і крано використовувати олігонуклеотидні праймери. щим промотором для кристалічних білків Bacillus є Послідовність таких праймерів конструюють із вибудь-який із відомих промоторів генів кристалічних користанням полінуклеотиду даного винаходу для білків, включаючи промотори генів сrуЕТ33 і детекції, ампліфікації або мутації визначеного сегсrуЕТ34. Альтернативно, промотори мутованого мента гена кристалічного білка B.thuringiensis із або рекомбінантного гена, що кодує кристалічний використанням Рск™-технології. З використанням білок, можуть бути штучно сконструйовані фахівтаких праймерів за допомогою PCR™ можуть бути цем і використані для стимуляції експресії нових також ампліфіковані сегменти генів родинних кригенних сегментів, описаних у даний заявці. сталічних білків, що походять від інших видів. В альтернативному варіанті здійснення винаДля досягнення визначених переваг даного ходу, рекомбінантну експресію ДНК, що кодують винаходу, кращими нуклеїнокислотними послідовкристалічний білок даного винаходу, здійснюють із ностями для досліджень або аналізів, проведених використанням трансформованої грам-негативної методом гібридизації, є послідовності, які комплебактерії, такої як, клітина-хазяїн бактерії Е.соlі або ментарні, принаймні, ділянці, що складається з 14Pseudomonas spp. Промотори, що функціонують із 30 нуклеотидів, або більш довгій ділянці послідоввисоким рівнем експреси цільових поліпептидів у ності, що кодує кристалічний білок, такий як, посЕ.соlі і в інших грам-негативних клітинах-хазяїнах, лідовність, показана в SEQ ID №1 або SEQ ID №2. також добре відомі фахівцям. Розмір фрагмента, принаймні, у 14 нуклеотидів, У випадку, коли вектор даного винаходу, що дає гарантію того, що цей фрагмент буде мати експресує, використовується для трансформації довжину, достатню для утворення як стабільної, рослини, вибирають такий промотор, який здатний так і селективної дуплексної молекули. Молекули, регулювати експресію в рослинах. Промотори, що що мають комплементарні послідовності більшої функціонують у рослинах також добре відомі фахідовжини, чим у 14 основ, звичайно є більш кравцям. Промоторами, що підходять для експресії щими, хоча б для підвищення стабільності і селекполіпептиду в рослинах, є індуцибельні, вірусні, тивності гібриду, і тим самим для підвищення якосинтетичні, і конститутивні промотори, описані в сті і ступеню специфічності отриманих гібридних літературі [Poszkowski et al., 1989; Odell et al., молекул. В основному, переважно сконструювати 1985], і промотори з тимчасовою регуляцією, проснуклеїнокислотні молекули, що мають комплементоровою регуляцією, і з просторово-тимчасовою тарні ділянки генів довжиною 14-20 нуклеотидів, регуляцією [Спаї et al., 1989]. або навіть більш довгі ділянки. Такі фрагменти Промотор вибирають також за його здатністю можуть бути легко отримані, наприклад, шляхом направляти транскрипційну активність трансфорпрямого синтезу фрагмента хімічними методами, мованих рослинних клітин або трансгенних рослин шляхом застосування техніки репродукування нукв область, що кодує. Структурні гени можуть зналеїнових кислот, такої як, PCR™-технологія, [опиходитися під контролем ряду промоторів у тканисана в патентах США №4683195 і 4683202], які нах рослин. Промотори можуть бути майже 39 75317 40 конститутивними промоторами, такі як, як промоДНК. Однак, вектором, що підходить для використор 35S CaMV, або ткане-специфічними або стадітання в даному винаході, є вектор, здатний регуєспецифічними промоторами, що функціонують у лювати експресію області поліпептиду, що кодує, дводольних або однодольних рослинах. до якої він правильно приєднаний. Якщо промотором є майже-конститутивний Типові вектори, використовувані для експресії промотор, такий як, промотор 35S CaMV, то посигенів у вищих рослинах, добре відомі фахівцям, і лення експресії поліпептиду спостерігається в ряді такими векторами є вектори, що походять від платканин трансформованої рослини (наприклад, у зміди Agrobacterium timefaciens (Ті), що індукує кал юсі, листах, насіннях і в корені). Дія, що альтепухлини [описаній Roger et al., 1987]. Однак, відомі рнативно трансформує, може бути спрямована на і деякі інтегруючі векторні системи рослин, що фуспецифічні тканини рослин шляхом використання нкціонують у рослинах, включаючи плазмідний вектора рослини, що інтегрує, який містить тканевектор регуляції переносу pCaMVCN, описаний у специфічний промотор. літературі (Fromm et al., 1985). Плазміда Прикладами тканеспецифічного промотору є pCaMVCN (що постачається фірмою Pharmacia, промотор лектину, що є специфічним для тканини Piscataway, NJ) включає промотор 353 вірусу монасінь. Білок лектин у бобах сої кодується єдиним заїки кольорової капусти CaMV. геном (Lei), що експресується тільки під час дозріУ кращому варіанті здійснення винаходу, веквання, і становить від біля 2 до біля 5% від загатор, використовуваний для експресії поліпептиду, льної мРНК насінь. Ген лектину і сім'яспецифічний включає селективний маркер, що є ефективним у промотор цілком охарактеризовані і використовурослинній клітині, переважно, селективний маркер ються для напрямку специфічної експресії в трансрезистентності до лікарського засобу. Кращим генні рослини тютюну [Vodkin et al., 1983; Lindstrom маркером селективності до лікарського засобу є et al., 1990]. ген, експресія якого приводить до резистентності Вектор, що експресує, який містить область, до канаміцину, тобто, хімерний ген, що містить що кодує потрібний поліпептид, конструюють так, промотор нопалін-синтази, неоміцинщоб ця область, яка кодує, знаходилася під контфосфотрансферази II Tn5 (nptll), і 3'-область норолем промотору лектину, і цей вектор вводять у палін-синтази, що нетранслюеться, [описану рослини з використанням, наприклад, методу траRogers et al., 1988]. нсформації протопластів [Dhir et al., 1991]. ЕкспреРНК-полімераза транскрибує ДНКсія поліпептиду специфічно направляється в напослідовність, яка кодує, за допомогою сайта полісіння трансгенної рослини. аденілування. Звичайно, ДНК-послідовності, розТрансгенна рослина даного винаходу, що проташовані на декілька сотень пар основ нижче сайдукується із рослинної клітини, трансформованої та поліаденілування, служать для термінації тканеспецифічним промотором, може бути схретранскрипції. Ці ДНК-послідовності називаються щена з іншою трансгенною рослиною, вирощеною областями термінації транскрипції. Ці області неіз рослинної клітини, трансформованої іншим ткаобхідні для ефективного поліаденілування транскнеспецифічним промотором, з одержанням гібририбованої матричної РНК (мРНК). дної трансгенної рослини, що виявляє ефекти Способи одержання векторів, що експресують, трансформації в більш, ніж одній специфічній ткадобре відомі фахівцям. Вектори, що експресують нині. (що трансформують), використовувані для трансПрикладами тканеспецифічних промоторів є формації рослин, і методи одержання цих векторів промотор сахарозо-синтетази 1 кукурудзи [Yang et [описані в патентах США №№4971908, 4940835, al., 1990], промотор алкоголь-дегідрогенази 1 куку4769061 і 4757011], які вводяться в даний опис за рудзи [Vogel et al., 1989], промотор світлозбираюдопомогою посилання. Ці вектори можуть бути чого комплексу кукурудзи [Simpson, 1986], промомодифіковані так, щоб вони включали кодуючу тор білка теплового шоку кукурудзи [Odell et al., послідовність даного винаходу. 1985], промотор невеликої суб'одиниці карбоксиБули розроблені різні методи для правильного лази RuPB гороху [Poulsen et al., 1986; Cashmore з'єднання ДНК із векторами за допомогою комet al., 1983], промотор манопінсинтази плазміди Ті плементарних липких кінців або тупих кінців. Так, [Langridge et al., 1989], промотор нопалінсинтази наприклад, комплементарні гомополімерні ділянки плазміди Ті [Langridge et al., 1989], промотор халможуть бути додані до ДНК-сегмента, що вставлякон-ізомерази петунії [Van Tunen et al], промотор ється, і до векторного ДНК. Потім вектор і ДНКбагатого гліцином білка 1 бобів [Keller et al., 1989], сегмент з'єднують за допомогою водневого зв'язку промотор транскрипту 35S CaMV [Odell et al., 1985] між гомополімерними "хвостами" з утворенням і промотор пататіну картоплі [Wenzler et al., 1989]. рекомбінантних ДНК-молекул. Кращими промоторами є промотор вірусу мозаїки Кодуючою областю, що кодує поліпептид, яка кольорової капусти (CaMV 35S) і промотор невемає здатність забезпечувати інсектицидну активликої субодиниці S-E9 карбоксилази RuPB. ність клітині, є переважно, ген, що кодує кристаліВибір вектора, що експресує, і, у кінцевому рачний білок СrуЕТ33 і СrуЕТ34 B.thuringiensis. У хунку, промотору кодуючої області поліпептиду, кращих варіантах здійснення винаходу, такий поправильно приєднаного до цієї області, залежить ліпептид має амінокислотну послідовність SEQ ID безпосередньо від потрібних функціональних вла№3 або SEQ ID №4, або функціональний еквівастивостей, наприклад, від розташування і часу лент цих послідовностей. Відповідно до таких ваекспресії білка, і від клітини-хазяїна, що трансфоріантів, кращою є також кодуюча область, що місрмується. Ці обмеження добре відомі фахівцям в тить ДНК-послідовність SEQ ID №1 або ДНКобласті конструювання рекомбінантних молекул послідовність SEQ ID №2. 41 75317 42 Характеризація нових кристалічних білків Білок СrуЕТ33 включає послідовність із 267 аміноДаний винахід стосується нових поліпептидів, кислот, і має обчислену молекулярну масу що складають весь або частину кристалічного біл29,216Да. Білок СrуЕТ33 має обчислену ізоелектка СrуЕТ33 або СrуЕТ34 B.thuringiensis. ричну константу (р1), рівну 4/78. Амінокислотний У кращому варіанті даного винаходу описаний склад білка СrуЕТ33 наводиться в таблиці 3. і заявлений виділений і очищений білок СrуЕТ33. Таблиця 3 Амінокислотний склад білка СrуЕТ33 Амінокислота Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His lle Кислотна Основна Ароматична Гідрофобна # Залишку 14 5 22 12 2 7 15 18 3 17 % усіх залишків Амінокислота (5,2) Leu (1.9) Lys (8,2) Met (4,5) Phe (0,7) Pro (2,6) Ser (5,6) Thr (6,7) Trp (1,1) Tyr (6,3) Val (Asp+Glu) (Arg+Lys) (Phe+Trp+Tyr) (Ароматична-lle+Leu+Met+Val) В іншому кращому варіанті даного винаходу описаний і заявлений виділений і очищений білок СrуЕТ34. Білок СrуЕТ34 включає послідовність із 126 амінокислот, і має обчислену молекулярну # Залишку 12 14 3 11 12 22 39 2 14 23 27 19 27 82 % усіх залишків (4,5) (5,2) (1.1) (4,1) (4,5) (8,2) (14/5) (0,7) (5,2) (8,6) (10,0) (7,1) (10,0) (30,5) масу 14,182 Так. Білок СrуЕТ34 має обчислену ізоелектричну константу (р1), рівну 4,26. Амінокислотний склад білка СrуЕТ34 наводиться в таблиці 4. Таблиця 4 Амінокислотний склад білка СrуЕТ34 Амінокислота Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His lle Кислотна Основна Ароматична Гідрофобна # Залишку 5 2 6 11 2 4 ξ 11 1 8 % усіх залишків Амінокислота (3,9) Leu (1.6) Lys (4,7) Met (8,7) Phe (1.6) Pro (3,1) Ser (5,5) Thr (8,7) Trp (0,8) Туrг (6,3) Val (Asp+Glu) (Arg+Lys) (Phe+Trp+Tyr) (Ароматична+lle+Leu+Met+Val) Номенклатура нових білків Автори даного винаходу довільно позначили нові білки СrуЕТ33 і СrуЕТ34. Аналогічним способом, нові нуклеїнокислотні послідовності, що кодують ці поліпептиди, були довільно позначені сrуЕТ33 і сrуЕТ34, відповідно. Формальне надання позначення гену і білку засновано на переглянутій номенклатурі ендотоксинів кристалічних білків (таблиця 1) відповідно до рішення Комітету по номенклатурі B.thuringiensis, створеного для систематичної класифікації кристалічних білків B.thuringiensis. Автори даного винаходу вважають, що ці довільно привласнені позначення будуть замінені офіційною номенклатурою, установленою для цих послідовностей. Трансформовані клітини-хазяїни і трансгенні рослини # Залишку 4 8 2 4 8 9 13 3 11 7 18 10 18 39 % ycix залишків (3,1) (6,3) (1.6) (3,1) (6,3) (7,1) (10,2) (2,4) (8,7) (5,5) (14,2) (7/9) (14,2) (30,7) До інших аспектів даного опису відносяться способи і композиції для трансформації бактерії, дріжджової клітини, рослинної клітини, або цілої рослини одним або декількома векторами, що експресують, які містять генний сегмент, що кодує кристалічний білок. Ще одним варіантом даного винаходу є трансгенна бактерія, дріжджова клітина, рослинна клітина або рослина, отримана в результаті такого процесу трансформації, або потомство і насіння, що походять від такої трансгенної рослини. Методи трансформації бактеріальних і дріжджових клітин добре відомі фахівцям. Звичайно, використовувані способи трансформації аналогічні добре відомим способам, застосовуваним для трансформації інших бактерій або дріжджів, таких, як Е.соlі або Saccharomyces cerevisiae. Методи 43 75317 44 трансформації ДНК рослинної клітини включають шляхом механічного ушкодження. Для здійснення Agrobacterium-опосередковану трансформацію, трансформації шляхом електропорації можна витрансформацію протопластів, перенос гена в пикористовувати або більш тендітні тканини, такі як, лок, ін'єкцію в репродуктивні органи, ін'єкцію в несуспензіонна культура клітин, або ембріогенний зрілі ембріони і бомбардування частками. Кожний калюс; або альтернативно, можна безпосередньо метод має свої особливі переваги і недоліки. Так, трансформувати незрілі ембріони, або інші органінаприклад, один конкретний метод уведення генів зовані тканини. Для цього, стінку потрібної клітини у конкретний вид рослини необов'язково повинний піддають часткової деградації шляхом її обробки бути найефективнішим для введення гена в інший ферментами, що розкладають пектин, (пектолазавид рослини; однак, фахівцям добре відомо, які із ми), або механічному ушкодженню регульованим цих методів можуть бути використані для даного способом. Після цього такі ушкоджені клітини стаконкретного виду рослини. ють реципієнтами для переносу ДНК шляхом елеІснує багато методів уведення ДНК-сегментів, ктропорації, що може бути здійснена на цій стадії, що трансформують, у клітини, але не усі вони є а потім трансформовані клітини ідентифікують відповідними для доставки ДНК у рослинні клітини. шляхом відповідного добору або відповідно до Відповідним методом є, мабуть, практично будьпротоколу скринінгу в залежності від природи ноякий метод, за допомогою якого ДНК може бути вовведеної ДНК. введена в клітину, наприклад, такий як, інфікуванБомбардування мікрочастинками ня агробактерією Agrobacterium, пряма доставка Більш кращим методом упровадження ДНКДНК, наприклад, така як, ПЕГ-опосередкована сегментів, що трансформують, у рослинні клітини трансформація протопластів [Omirulleh et al., є бомбардування цих клітин мікрочастинками. У 1993], упровадження ДНК шляхом висушуванцьому методі, частки можуть бути покриті нуклеїня/інгібування, електропорація, шляхом розмішуновими кислотами і введені в клітини за допомовання з волокнами з карбіду кремнію, шляхом пригою сили, що прискорює. Прикладами таких часток скорення ДНК-покритих часток, і т.і. У деяких є частки, що складаються із вольфраму, золота, варіантах здійснення винаходу, кращими методаплатини, і т.і. ми є, наприклад, бомбардування мікрочастинками, Перевага методу бомбардування мікрочастині т.і. Техніка введення ДНК у клітини добре відома ками, крім того, що він є ефективним способом фахівцям. Були описані чотири загальних методи здійснення стабільної щодо відтворення трансфодоставки гена в клітини: (1) хімічні методи [Graham рмації однодольних рослин, полягає ще й у тому, & van der Eb, 1973; Zatloukal et al./ 1992]; (2) фізичщо для нього не потрібно ні виділення протопласні методи, такі як, мікроінжекція (Сарессі, 1980), тів [Cristou et al., 1988], ні повідомлення клітинам електропорація [Wong & Neumann, 1982; Fromm et сприйнятливості до Agrobacterium-інфекції. Ілюстal., 1985; патент США №5 384253] і "метод постріративним прикладом методу доставки ДНК у клілу з дробовика" [Johnston & Tang, 1994; Fynan et тини кукурудзи шляхом прискорення часток є біоal., 1993]: (3) методи з використанням вірусних балістична система доставки часток (Biolistics векторів [СІарр, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis & Particle Delivery System), яка може бути використаAnderson, 1988a; 1988b]; і (4) методи на основі на для проштовхування часток, покритих ДНК, або опосередкованих рецепторами механізмів [Curiel клітин через екран, що загороджує, такий як, як et al., 1991; 1992; Wagner et al., 1992]. екран із нержавіючої сталі або екран Nytex, на поЕлектропорація верхню фільтра, покритого клітинами кукурудзи, Додавання коротких електричних імпульсів викультивованими в суспензії. Цей екран диспергує сокої напруги до ряду клітин тварин і рослин причастки так, що вони не можуть бути доставлені в водить до утворення пір нанометрового розміру в клітини-реципієнти у виді великих агрегатів. Очеплазматичній мембрані. ДНК уводиться прямо в видно, що це загородження, яке знаходиться між цитоплазму клітини або через ці пори, або в реапаратом для "пострілу", і клітинами, що бомбарзультаті перерозподілу мембранних компонентів, дуються, сприяє зниженню розміру агрегатів часщо супроводжує закриття пір. Електропорація моток, що бомбардують, і може забезпечувати більш же бути винятково ефективною, і може бути виковисоку частоту трансформації шляхом зменшення ристана як для короткочасної експресії генів клоушкодження, яке наноситься клітинам-реципієнтам нів, так і для одержання клітинних ліній, що несуть занадто великими частками, що бомбардують. інтегровані копії потрібного гена. На відміну від Для здійснення бомбардування, переважно, трансфекції, проведеної з використанням фосфату щоб клітини в суспензії були сконцентровані на кальцію, і за допомогою злиття протопластів, елефільтрах або на твердому культуральному серекропорація часто дозволяє одержувати клітинні довищі. Альтернативно, незрілі ембріони або інші лінії, що несуть одну, або, у більшості випадків, клітини-мішені можуть бути поміщені на тверде декілька інтегрованих копій чужорідної ДНК. культуральне середовище. Клітини, що бомбарМетод уведення ДНК у клітину шляхом, електдуються, поміщують на відповідній відстані нижче ропорації добре відомий фахівцям. У цьому метопластини, що загороджує, яка перешкоджає проді, деякі ферменти, що руйнують клітинну стінку, ходженню "макровибухівки". Якщо необхідно, то такі як, ферменти, що розкладають пектин, викоміж пристроєм, який прискорює, і клітинами, що ристовують для того, щоб зробити реципієнтні бомбардуються, може бути поміщений один або клітини-мішені більш сприйнятливими для трансдекілька екранів, які загороджують. За допомогою формації шляхом електропорації, чим неопрацьовикористання техніки, описаної вище, можна одевані клітини. Альтернативно, клітини-реципієнти ржати до 1000 або більш фокусів клітин, що коротроблять більш сприйнятливими до трансформації кочасно експресують маркерний ген. Число клітин 45 75317 46 у фокусі, що експресує продукт екзогенного гена опосередкованого переносу генів, дозволили удочерез 48 годин після бомбардування, часто станосконалити методи вбудовування генів і рестриквить від 1 до 10, а в середньому, 1-3. ційних сайтів у вектори, що полегшило конструюПри трансформації шляхом бомбардування, вання векторів, здатних експресувати гени, що для одержання максимального числа стабільних кодують різні поліпептиди. Ці описані вектори трансформантів можна оптимізувати умови куль[Rogers et al., 1987] мають стандартні мультилінтивування перед бомбардуванням. У цій технології керні області, фланковані промотором і сайтом є дуже важливими як фізичні, так і біологічні параполіаденілування для прямої експресії інсертоваметри бомбардування. Фізичними чинниками є них генів, що кодують поліпептид, і можуть бути параметри, що відносяться до маніпуляції використані з метою даного винаходу. Крім того, ДНК/осадженню мікрочастинок, або параметри, що для трансформації може бути використана бактевпливають на траєкторію польоту і швидкість або рія Agrobacterium, що містить гени активованої або макро-, або мікрочастинок. Біологічними чинникаінактивованої Ті. Завдяки тому, що цей метод зами є всі стадії здійснення маніпуляцій із клітинами безпечує легкий і точний перенос генів, він може перед і безпосередньо після бомбардування, осбути обраний для трансформації тих рослинних мотичне коректування клітин-мішеней для ослабштамів, де Agrobacterium-опосередкована транслення ушкодження клітин, зв'язаних із бомбардуформація є ефективною. ванням, а також природа що трансформує ДНК, Agrobacterium-опосередкована трансформація така як, лінеаризована ДНК або інтактна суперспідисків листів і інших тканин, таких як, сім'ядоля і ральна плазміда. Очевидно, що маніпуляції, прогіпокотиль (підсім'ядольне коліно), мабуть, обмеведені перед бомбардуванням, мають особливо жена рослинами, що звичайно уражаються агроважливе значення для успішної трансформації бактерією. Agrobacterium-опосередкована транснезрілих ембріонів. формація є найбільш ефективною для дводольних У зв'язку з цим, вважається, що для повної опрослин. Деякі однодольні рослини є, мабуть, притимізації умов може статися бажаним провести родними хазяїнами для Agrobacterium, хоча були коректування різних параметрів бомбардування в продуковані трансгенні рослини спаржі з викорисмаломасштабних дослідженнях. Може статися танням векторів на основі Agrobacterium, як [опиособливо кращим провести коректування таких сано Bytebier et al. (1987)]. Тому, комерційно важфізичних параметрів, як розмір зазору, траєкторія ливі зернові культури, такі як, рис, кукурудза, і польоту, товщина тканини, тиск гелію. Можна тапшениця, в основному, повинні бути трансформокож мінімізувати чинники, що редукують пошковані з використанням альтернативних методів. дження, (TRF), шляхом модифікації умов, які Однак, як було згадано вище, із використанням впливають на фізіологічний стан клітинAgro-bacterium може бути також здійснена трансреципієнтів, і які можуть, тому, впливати на ефекформація спаржі [див., наприклад, Bytebieretal., тивність трансформації й інтеграції. Так, напри1987]. клад, осмотичний стан, гідратація тканини, і стан Трансгенна рослина, продукована методами з субкультури або клітинного циклу клітинивикористанням Agrobacterium, звичайно містить реципієнта можуть бути скоректовані для здійсодин ген на одній хромосомі. Можна сказати, що нення оптимальної трансформації. Здійснення такі трансгенні рослини є гетерозіготними за додаінших рутинних маніпуляцій будуть легко зрозумілі ним геном. Однак, оскільки використання слова кожному фахівцю виходячи з опису даного ви"гетерозіготний" звичайно припускає присутність находу. комплементарного гена в тому ж самому локусі Agrobacterium-опосередкований перенос другої хромосоми хромосомної пари, а в рослині, Agrobacterium-опосередкований перенос явщо містить один вищевказаний додатковий ген, ляє собою широко використовувану систему для такого гена немає, то, мабуть, що більш точним впровадження генів у рослинні клітини, оскільки в визначенням для такої рослини буде "незалежний цьому випадку, ДНК може бути введена в тканині сегрегант", оскільки доданий екзогенний ген незацілої рослини, що дозволяє уникнути необхідності лежно сегрегує під час мітозу і мейозу. регенерувати інтактну рослину з протопласту. ВиБільш кращою трансгенною рослиною є роскористання векторів для Agrobacteriumлина, гомозіготна за доданим структурним геном, опосередкованого інтегрування з метою введення тобто, трансгенна рослина, що містить два додаДНК у рослинні клітини добре відомо фахівцям. них гени: за одним геном в тому самому локусі на Див., наприклад, методи, [описані Fraley et al., кожній хромосомі хромосомної пари. Гомозіготна 1985; Roger et al., 1987]. Крім того, інтеграція Тітрансгенна рослина може бути отримана шляхом ДНК є відносно точним способом, що приводить статевого розмноження (самозапилення) трансдо декількох реаранжировок. Область прийнятної генної рослини незалежного сегреганту, що місДНК визначається прикордонними послідовностятить один доданий ген, а потім пророщування деми, а інтрон звичайно вбудовується в геном росяких з продукованих насінь, і аналізу продукованих лини, [як описано Spielmann et al., 1986; Jorgensen рослин на підвищену карбоксилазну активність у et al., (1987)]. порівнянні з контрольною (нативною, нетрансгенІснуючі в даний час вектори для трансформаною) або трансгенною рослиною незалежного сегції агробактерією (Agrobacterium) здатні до репліреганту. кації в Е.соlі також добре, як і в Agrobacterium, що При цьому, слід зазначити, що дві різних трандозволяє проводити стандартні маніпуляції, [описгенних рослини можуть бути також схрещені для сані Klee et al., (1985)]. Крім того, недавні успіхи в продукування потомства, що містить два сегрегуодержанні векторів для Agrobacteriumючих незалежно доданих екзогенних гени. Шляхом 47 75317 48 самозапилення відповідного потомства можна у пилок [Znou et al., 1983; Hess, 1987; Luo et al., продукувати рослини, що є гомозіготними за обо1988] шляхом ін'єкції ДНК у репродуктивні органи ма доданими екзогенними генами, що кодують рослини [Реп'яха et al., 1987], або шляхом прямої потрібний поліпептид. Передбачається також поін'єкції ДНК у клітини незрілих ембріонів із наступворотне схрещування (бекросінг) із батьківською ною повторною гідратацією осушених ембріонів рослиною й ауткросінг із нетрансгенною рослиною. [Neuhaus et al., 1987; Benbrook et al., 1986]. Інші методи трансформації Регенерація, вирощування і культивування роТрансформація протопластів рослин може буслин із трансформантів-протопластів однієї рости здійснена з використанням методів, заснованих лини або з різних трансформованих експлантатів на осадженні фосфатом кальцію, обробці поліетидобре відомі фахівцям (Weissbach & Weissbach, ленгліколем, електропорації, і комбінації цих об1988). Цей процес регенерації і вирощування звиробок [див., наприклад, Potrykus et al., 1985; Lorz чайно включає стадії добору трансформованих et al., 1985; Frornm et al., 1986; Uchimiya et al., клітин, культивування цих окремо обраних клітин із 1986; Callis et al., 1987; Marcotte et al., 1988]. здійсненням проміжних стадій вирощування ембЗастосування цих систем до різних видів росріонів і висаджування паростків що пустили корені. лин залежить від здатності даного виду рослини Трансгенні ембріони і насіння регенерують аналодо регенерації з протопластів. Ілюстративні метогічним способом. Отримані трансгенні укорінені ди регенерації злакових культур із протопластів пагони потім висаджують у відповідне середовище описані в літературі [Fujimura et al., 1985; Toriyama для вирощування рослин, таке як, фунт. et al., 1986; Yamada et al., 1986; Ab-dullah et al., Вирощування або регенерація рослин, що міс1986]. тять чужорідний екзогенний ген, що кодує потрібДля трансформації тих видів рослин, що не ний поліпептид, уведений за допомогою можуть бути успішно регенеровані з протопластів, Agrobacterium, із експлантатів листів можуть бути можуть бути використані інші методи впровадженздійснені методами, добре відомими фахівцям і ня ДНК у інтактні клітини або тканини. Так, напри[описаними в літературі Horsch et al., 1985]. У цих клад, регенерація злаків із незрілих ембріонів або методах, трансформанти культивують у присутноексплантатів може бути здійснена [як описано сті обраного агента й у середовищі, що індукує Vasil (1988)]. Крім цього, може бути використана регенерацію пагонів у трансформовану лінію ростехніка "вистрілювання часток" або високошвидкілини, [як описано Fraley et al., 1983]. сна технологія з застосуванням мікрочастинок Цей метод звичайно дозволяє продукувати па[Vasil, 1992]. гони через 2-4 місяця, після чого ці пагони переноЗ використанням останньої технології, ДНК сять у відповідне середовище, що стимулює утвоупроваджують через клітинну стінку в цитоплазму рення коренів і містить селективний агент й шляхом її нанесення на поверхню дрібних метаантибіотик для попередження росту бактерій. Полевих часток [як описане Klein et al., (1987); Klein тім, пагони, що утворюють корені в присутності et al., (1988); McCabe et al., (1988)]. Ці металеві селективного агента з утворенням паростків, печастки проникають через шари клітин, а тому даресаджують у грунт або інше середовище, що ють можливість здійснювати трансформацію клістимулює утворення коренів. Ці процедури варіютин усередині експлантатів тканин. ються в залежності від конкретно використовуваСпособи продукування резистентних до комах ної лінії рослини, і такі варіанти добре відомі фахітрансгенних рослин вцям. Шляхом трансформації відповідної клітиниЯк обговорювалося вище, для одержання гохазяїна, такої як, рослинна клітина, рекомбінантмозіготних трансгенних рослин, переважно, щоб ним сегментом, що містить ген сrуЕТ33 і/або регенеровані рослини були самопильними. У будьсrуЕТ34, експресія кристалічного білка, що кодуякому випадку, пилок, отриманий від регенеровається, (тобто, бактеріального кристалічного білка них рослин піддають перехресному схрещуванню або поліпептиду, що має інсектицидну активність з вирощеними з насінь рослинами, що представпроти твердокрилих комах) може приводити до ляють агрономічну цінність, переважно інбредної продукування резистентних до комах рослин. лінії. І навпаки, пилок, отриманий від рослин цих Так, наприклад, для трансформації суспензії цінних ліній, використовують для запилення регеембріонних рослинних клітин, таких як, пшениця нерованих рослин. Трансгенну рослину даного або кукурудза, методом бомбардування часток винаходу, що містить потрібний поліпептид, куль[Maddock et al., 1991; Vasil et al., 1992] для доставтивують із використанням методики, добре відомої ки нанесеної на мікрочастинки ДНК у клітинифахівцям. реципієнти, може бути використаний експресуюТаким чином, трансгенна рослина даного вичий вектор, що містить кодуючу область кристалінаходу має підвищену кількість кодуючої області, чного білка B.thuringiensis, і відповідний селектив(наприклад, гена cry), яка кодує потрібний поліпепний маркер. Потім трансгенні рослини тид Cry. Кращою трансгенною рослиною є незалерегенерують із трансформованих ембріонних кажний сегрегант, і ця рослина може передавати люсів, що експресують інсектицидні білки. зазначений ген і його активність потомству. Більш Продукування трансгенних рослин може бути кращою є трансгенна рослина, гомозіготна за цим також здійснене з використанням інших методів геном, і така, що передає цей ген усьому своєму трансформації клітини, відомих фахівцям, таких потомству після статевого розмноження. Семена, як, Agrobacterium-опосередкований перенос ДНК отримані від трансгенної рослини, можуть бути [Fraley et al., 1983]. Альтернативно, ДНК може бути вирощені в полі або в теплиці, і отримані зрілі травведена в рослини шляхом прямого переносу ДНК нсгенні рослини піддають самозапиленню, у ре 49 75317 50 зультаті чого продукуються рослини чистої генеавід 105 порошкоподібних зразків культур, узятих із логічної лінії. Потомство цих рослин стає рослирізних ділянок, були також скриновані з викориснами чистої генеалогічної лінії, що оцінюють, натанням радіоактивно-мічених зондів сrу111В2 і cry приклад, на підвищену інсектицидну активність ІllА, але ідентифікація яких-небудь інших штамів, проти твердокрилих комах, переважно, у польових що містять нові гени типу сrу111 виявилась безусумовах, у визначеному інтервалі умов навколишпішною. нього середовища. Автори даного винаходу вваБуло виявлено, що штам EG10327 жають, що особливо перспективним є створення B.thuringiensis мав інсектицидну дію проти личинок трансгенних рослин, які представляють комерційтвердокрилих комах, особливо, хрущака каштанону цінність, включаючи різні трави, що утворюють вого, довгоносика бавовняного і японського жука. дерн, пшеницю, кукурудзу, рис, ячмінь, овес, ряд Штам EG10327 не мав інсектицидної дії проти декоративних рослин і овочевих рослин, а також Блошки длинновусої або колорадського жука яку ряд горіхових і плодових дерев і рослин. можна виявити в умовах проведеного аналізу. Ген, ПРИКЛАДИ названий "сrу111А-усіченим" геном, виділяли зі Нижченаведені приклади ілюструють кращі штаму EG10327, і визначали його нуклеотидну варіанти здійснення винаходу. При цьому, слід послідовність. Було виявлено, що cry111Азазначити, що методи, описані в цих прикладах, усічений ген був ідентичний першим 2/3 гена ілюструють методику, розроблену автором даного сrуІllА (описаного Donovan і ін. (1988) як ген cryС), винаходу для практичного здійснення винаходу, а але не містив кінцеву 1/3 гена cry111А. Усічений тому можна вважати, що вони являють собою ген cry111А штаму EG10327 продукував дуже некращі способи його здійснення. Однак, у зв'язку з велику кількість (якщо взагалі продукував ) інсекописом даного винаходу, варто врахувати, що в тицидного білка і, крім того, не був охарактеризоконкретних варіантах його здійснення може бути ваний. зроблена безліч змін з одержанням такого ж або ПРИКЛАД 2 схожого результату, але, при цьому, зазначені Оцінка флагелярного серотипу штаму зміни не повинні виходити за рамки суті й об'єму EG10327 даного винаходу. Для характеризації штаму EG10327 були проПРИКЛАД 1 ведені деякі дослідження. Одне дослідження було Виділення EG10327 B.thuringiensis проведено для характеризації його флагелярного Порошкоподібні зразки культури були отримасеротипу. Отримані дані подані нижче: ні з різних джерел у регіонах США і за їхніми мефлагелярний серотип штаму EG10327 визнажами, звичайно з зерносховищ. Зразки культури чали в лабораторії Dr.M-M.Lecadet в Інституті Пасобробляли і розподіляли по чашках з агаром для тера, Париж, Франція. Серотип EG10327 визначавиділення окремих колоній типу Bacillus, [як опили методами, описаними H.de Barjac (1981), і було сано в патенті США №5264364]. виявлено, що цим серотипом є Bacillus Клонований ген сrу111А, відомий, головним thuringiensis kurstaki (Н3а, 3b, 3с). Було виявлено, чином, як ген сrуС штаму EG2158 B.thuringiensis, що попередньо описані штами B.thuringiensis, що описаний Dono-van і ін. (1988), і клонований ген містять cryІІІ-родинні гени, являють собою серотип сrу111В2, відомий, головним чином, як ген сrу111С morrisoni (штам EG2158, що містить cry111А); сештаму EG4961 B.thuringiensis, описаний Donovan і ротип tol-worthi (штам EG2838, що містить ін. (1992), використовували у якості зондів у проcry111В:); і штам kumamotoensis (штам EG4961, цедурах по гібридизації колоній. Зонд гена сrу111А що містить cry111В2) (Rupar et al., 1991). EG10327 складався із радіоактивно міченого 2,0 т.і.о.являє собою перший із виявлених штамів Ніnd111-ХbаІ-рестрикційного фрагмента ДНК, опиB.thuringiensis kurstaki, що є токсичним для тверсаного Dono-van і ін. (1988). Зонд гена сrу111В2 докрилих. складався із радіоактивно міченого 2,4 T.n.o-SsplПРИКЛАД 3 рестрикційного фрагмента ДНК, описаного Оцінка кристалічних білків штаму EG10327 Donovan і ін. (1992). Процедури по гібридизації Штам EG10327, крім того, оцінювали шляхом колоній здійснювали як [описані в Патенті США. характеризації кристалічних білків, що він проду№5264364]. кує. Ці дослідження здійснювали шляхом культиПриблизно 43000 колоній типу Bacillus від 54 вування штаму EG10327 у середовищі для спорупорошкоподібних зразків культури, узятих із різних ляції DSG [0,8% (мас/об.) живильний бульйон ділянок, зондували радіоактивно міченими зондаDifco, 0,5% (мас/об.) глюкоза, 10мМ K2НРO4, 10мМ ми сrу111А і сrу111В2. Один порошкоподібний KН2РО4, 1мМ Ca(NO3)2, 0,5мМ MgSO4, 10мкМ зразок культури від Greece містив приблизно 100 МnСІ2, 10мкМ FeSO4]. Після цього, споруловану природних колоній типу Bacillus, що гібридизувакультуру, що містить спори і кристалічні білки, лись із зондами сrу111В2 і сrу111А. Аналіз деяких збирали шляхом центрифугування, і суспендували із цих природних колоній дикого типу вказував на в деіонізованій воді. Кристалічні білки солюбілізуте, що вони були ідентичні колоніям вали із суспензії спор і кристалів EG10327 шляхом B.thuringiensis, і одну колонію, позначену EG інкубування суспензії в буфері для солюбілізації 10327, відбирали для подальшого дослідження. [0,14МТріс, рН8,0, 2% (мас./об.) додецилсульфату Штам EG10327 B.thuringiensis був депонований 14 натрію (ДСН), 5% (об./об.) 2-меркаптоетанолу, грудня 1994 року під номером доступу №NRRL В10% (об./об.) гліцерину, і 0,1% (мас./об.) бромфе21365 відповідно до Будапештським договору про нолового синього] при 100°С протягом 5 хвилин. депонування культур. Солюбілізовані кристалічні білки були фракціПотім приблизно 84000 колоній типу Bacillus оновані за розміром за допомогою електрофорезу 51 75317 52 на акріламідному гелі (ДСН-ПААГ-аналіз). Після публікацій подані в таблиці 5. фракціонування за розміром, білки візуалізували Таблиця 5 шляхом фарбування барвником кумаси. ДСНПААГ-аналіз показав, що зі спорулованої культури Кристалічні білка EG10327 були солюбілізовані мажорний кристаліB.thuringiensis, описані в літературі чний білок розміром приблизно 29кДа, називаний далі білком CryЕТ33, і мажорний кристалічний біКристалічний Джерело або посилання лок розміром приблизно 14кДа, називаний далі білок білком CryЕТ34. CryІА(а) J. Biol. Chem., 260:6264-6272 Потім, 29кДа-білок CryЕТ33 і 14кДа-білок CryІА(b) DNA, 5:305-314 CryЕТ34 штаму EG10327 були охарактеризовані CryІА(с) Gene, 36:289-300 шляхом визначення їх NН2-кінцевих амінокислотCryІВ Nucl. Acids Res., 16:4168-4169 CryІС Nucl. Acids Res., 16:6240 них послідовностей, як описано нижче. СпорулоCryІСb Appl. Environ. Micro., 59:1131-1137 вану культуру EG10327 інкубували з буфером для CryІС(b) Nucl. Acids Res., 18:7443 солюбілізації і солюбілізовані кристалічні білки CrylD Nucl. Acids Res., 18:5545 фракціонували за розміром на акриламідному гелі CryІЕ ЕРО 358 557 A2 шляхом аналізу, проведеного за допомогою ДСНCrylF J. Bacteriol., 173:3966-3976 ПААГ-електрофорезу. Білки переносили з гелю на CrylG FEBS, 293:25-28 нітроцелюлозний фільтр за допомогою стандартCryV WO 90/13651 ної техніки електроблотінгу. Білок CryЕТ33 і білок Cry2A J.Biol. Chem., 263:561-567 CryЕТ34, що переносили на фільтр методом елекCry2B J. Bacteriol., 171:965-974 троблотінгу, візуалізували шляхом фарбування Cry2С FEMS Microbiol. Lett. ,81:31-36 фільтра барвником кумаси. Частини фільтра, що Cry3А Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7036-7040 містять білок CryЕТ33 і білок CryЕТ34, вирізували Cry3В Nucl. Acids Res., 18:1305 лезом бритви. У цьому способі, білки CryЕТ33 і Cry3В2 Appl. Environ. Microbiol., 58:3921-3927 CryЕТ34 були отримані в чистому виді як білки, Cry3В3 U. S. 5,378,625 перенесені методом блотінгу на окремі частини Cry3С Appl. Environ. Microbiol., 58:2536-2542 Cry3D Gene, 110:131-132 нітроцелюлозного фільтра. Cry4А Nucl. Acids Res., 15:7195 З метою визначення NН2-кінцевої амінокислоCry4В EP0308,199 тної послідовності кожного білка, очищені білки Cry4С J. Bacteriol., 166:801-811 CryЕТ33 і CryЕТ34, що містяться на частинах нітCry4D J. Bacteriol., 170:4732, 1988 роцелюлозного фільтра, піддавали стандартній Cry5 Molec. Micro., 6:1211-1217 автоматизованій процедурі деградації за ЕдмаCry33AkD WO 94/13785 ном. Cry33BkD WO 94/13785 Було встановлено, що NН2-кінцевою послідовCry34kD J. Bacteriol., 174:549-557 ністю білка CryЕТ33 штаму EG10327 є послідовCry40kD J. Bacteriol., 174:549-557 ність: Cry201T635 WO 95/02693 Було встановлено, що NН2-кінцевою послідовністю білка CryЕТ34 штаму EG10327 є послідовність: Амінокислотні залишки, зазначені в дужках нижче послідовності білка CryЕТ34, являють собою можливі альтернативні амінокислоти, що можуть бути присутні у білку CryЕТ34 у даному положенні. Присутність альтернативних амінокислот можливо через неточність, що має місце при використанні автоматичної процедури деградації за Едманом при визначенні амінокислотних послідовностей білка. Комп'ютерні алгоритми (Korn & Queen, 1984) використовували для порівняння N-кінцевих послідовностей білків CryЕТ33 і CryЕТ34 з амінокислотними послідовностями всіх кристалічних білків B.thuringiensis, що відомі авторам винаходу, включаючи послідовності всіх кристалічних білків B.thuringiensis, що були опубліковані в науковій літературі, міжнародних патентних заявках, або виданих патентах. Перелік кристалічних білків, послідовності яких опубліковані, а також джерела Cry517 Cryа7А021 CryAB780RFI CryAB780RF2 CryAB78100kD Crybtpgs1208 Crybtpgs1245 Crybts02618A CryBuibui CryET4 CryET5 CryGei87 CryHD511 CryHD867 CrylPL CryMITS CryPS17A CryPS17B CryP16 CryP18 C17P66 CryPS33F2 CryPS40D1 CryPS43F CryPS50Ca CryPS50Cb Cryps52A1 CryPS63B CryPS69D1 Cryps71M3 CryPS8OJJ1 J. Gen. Micro., 138:55-62 ЕРО 256,553Вl WO 94/21795 WO 94/21795 WO 94/21795 ЕРО 382 990 ЕРО 382 990 WO 94/05771 WO 93/03154 U. S. 5,322,687 U. S. 5,322,687 ЕРО 238,441 U. S. 5,286,486 U. S. 6,286,486 U.S. 5,231,008 JP 6000084 WO 92/19739 U. S. 5,350,576 and U. S. 5,424,410 WO 95/00639 WO 95/00639 WO 95/00639 WO 92/19739 and U. S. 5,424,410 U. S. 5,273,746 WO 93/04587 WO 93/04587 and ЕРО 498,537 A2 WO 93/15206 U.S. 4,849,217 WO 92/1973 9 U. S. 5,424,410 WO 95/02694 WO 94/16079 53 CryPS811A CryPS811A2 Cryps81A2 CryPS81IB CryPS811B2 Cryps81f Cryps81gg Cryps81rrl Cryps86A1 CryX CryXenA24 CrycytA U. S. 5,273,746 ЕРО 405 810 ЕРО 401 979 WO 93/14641 U. S. 5,273,746 U. S. 5,045,469 U. S. 5,273,746 ЕРО 401 979 U. S. 5,468,636 FEBSLett., 336:79-82 WO 95/00647 Nucl. Acids Res., 13:8207-8217 Було виявлено, що N-кінцева послідовність білка CryЕТ34 штаму EG10327 не має гомології з якими відомими кристалічними білками B.thuringiensis, ідентифікованими в таблиці 5. ПРИКЛАД 4 Характеризація кристалічного білка cryЕТ33 штаму EG2159 Було попередньо визначено, що 68кДа-cryІІІАбілок EG2159 (називаний білком CryС у роботі Donovan і ін., 1988) є токсичним для колорадського жука, але цей білок не був ідентифікований у штамі, що має інсектицидну активність для лускокрилих або двокрилих комах. Штам EG2159 був отриманий із штаму EG2158 B.thuringiensis шляхом відпалення 150МДаплазміди зі штаму EG2158 [як описане в роботі Donovan і ін., 1988]. Штам EG2159 був ідентичний штаму EG2158, за винятком того, що штам EG2159 не містив 150МДа-плазміду, яка присутня у штамі EG2158. Був виділений один із двох кристалічних білків, продукованих штамом EG2159, а саме, 68кДа-CryllІА-білок, i був клонований і секвенований ген, що кодує цей білок. Ці результати були раніше описані авторами (Donovan і ін., 1988). Крім того, вид мінорного білка, 29кДа-білка EG2159, не був охарактеризований. У цьому прикладі описана характеризація зазначеного кристалічного 29кДа-білка CryЕТ33 від EG2159 B.thuringiensis. Виділення кристалічних білків із EG2159 Кристалічні білки EG2159 були солюбілізовані шляхом суспендування спорулованої культури штаму EG2159, що містить спори і кристалічні білки, у буфері для солюбілізації білка при 80°С протягом 3 хвилин. Солюбілізовані кристалічні білки фракціонували за розміром шляхом електрофорезу в ПААГ із ДСН, і білки в ДСН-ПААГ-гелі візуалізували шляхом фарбування барвником кумаси. Гелеві зрізи, що містять 29кДа-білок, вирізували з ДСН-ПААГ-гелю лезом бритви, а білки виділяли з гелевих зрізів за допомогою стандартних процедур електроелюції. У результаті цих досліджень був отриманий очищений препарат білка CryЕТ33 із штаму EG2159 B.thuringiensis. NН2-кінцеве секвенування 29кДа-білка NН2-кінцеву амінокислотну послідовність очищеного білка CryЕТ33 визначали автоматичним методом деградації за Едманом. Як було визначено, Амінокислотною послідовністю NН2-кінцевої частини 29кДа-білка є послідовність: 75317 54 Пунктирна лінія (----) у положенні 12 указує на те, що амінокислотний залишок не може бути визначений для білка CryЕТ33 штаму EG2159. Результати Порівняння послідовності білка CryЕТ33 штаму EG10327 (SEQ ID №5) із NH2-кінцевою послідовністю раніше неохарактеризованого 29кДа-білка (Donovan і ін., 1988), що спостерігається в EG2159 (SEQ ID №7, SEQ ID №8), дало підставу припустити, що NH2-кінець 29кДа-білка EG2159 ідентичний білку CryЕТ33 штаму EG10327, за винятком початкового метіонінового (Met) залишку, що присутній у білку CryЕТ33 штаму EG2159. ПРИКЛАД 5 Виділення ДНК-фрагмента, що включає гени cryЕТ33 і cryЕТ34, із штаму EG2158 Як описано вище, штам EG2159 походив від штаму EG2158. Отже, EG2158 містить ген, ідентичний гену білка CryЕТ33, називаний далі геном cryЕТ33, як і штам EG2159. Для клонування гена cryЕТ33 була використана "зворотна генетика". Був синтезований 33-мірний олігонуклеотидний зонд (позначений WD68), що кодує амінокислоти 1-11 МН2-кінця білка CryЕТ33. Нижче подана послідовність WD68: Послідовність WD68 використовували у якості зонда для Саузерн-гібридизації, як описано нижче, із метою ідентифікації ДНК-фрагмента від штаму EG2158, що містив ген cryЕТ33 для 29кДа-білка cryЕТ33. Повну ДНК екстрагували з EG2158 стандартним методом із використанням лізоциму/фенолу. Екстраговану ДНК гідролізували ферментами, що рестриктують ДНК, Hindlll і EcoRI, і гідролізовану ДНК фракціонували за розміром шляхом електрофорезу в агарозному гелі. ДНКфрагменти переносили методом блотінгу з гелю на нітроцелюлозний фільтр із використанням описаних раніше методів (Southern, 1975), і цей фільтр інкубували з олігонуклеотидом WD68, що був радіоактивно позначений кіназою Т4 і [γ-32Ρ]ΑΤΡ. Якогось унікального рестрикційного ДНКфрагмента від EG2158, що специфічно гібридизувався б із зондом WD68, виявлено не було. Потім використовували різні методи ідентифікації ДНК-рестрикційного фрагмента, що містив ген cryЕТ33. Був синтезований 56-мірний олігонуклеотидний зонд (позначений WD73), що кодує амінокислоти 1-19 NН2-кiнця білка CryЕТ33. Послідовність WD73 являє собою: де ділянка в три "Ν" відповідають амінокислоті 12 послідовності WD73, що представляє три інозинових нуклеотиди. Інозинові залишки були використані в цьому положенні для кодування відповідної невідомої амінокислоти в положенні 12 у ΝΗ2кінцевої послідовності білка CryЕТ33. Вважається, що інозин є нейтральним нуклеотидом, і не один із промоторів не перешкоджає його зв'язуванню з 55 75317 56 ДНК-ланцюгами. WD73 радіоактивно мітили кінарекомбінантну плазміду, позначену pEG246, що зою Т4 і [γ-32Ρ]-ΑΤΡ, і використовували для зондускладалася з pBR322 і введеного рестрикційного вання нітроцелюлозного фільтра, що містить фраEcoRi-фрагмента ДНК від штаму EG2158 розміром кціоновані за розміром рестрикційні Hindlll і EcoRIприблизно 5,2т.і.о. Рестрикційна карта pEG246 фрагменти повної ДНК штаму EG2158. WD73 спепоказана на Фіг.2. Штам EG11460 Е.соді, що місцифічно гібридизувався з HindIII-фрагментом притить pEG246, був депонований у Науковоблизно в 7,9т.і.о., і з EcoRI-фрагментом приблизно дослідній колекції сільськогосподарських культур, в 5,2т.і.о., ДНК штаму EG2158. Північної регіональної науково-дослідної лабораПРИКЛАД 6 торії (NRRL) відповідно до Будапештському догоКлонування генів cryЕТ33 і cryЕТ34 із штаму вору про депонування мікроорганізмів під номером EG2158 доступу NRRL B-21364. Для виділення 5,2T.i.o.-EcoRI-фрагмента, опиНуклеотидну послідовність, що становить присаного в попередньому прикладі. Плазмідну бібліблизно одну третину від клонованого 5,2T.i.o.отеку штаму EG2158 конструювали шляхом легуEcoRi-фрагмента pEG246, визначали з викорисвання відібраних за розміром рестрикційних EcoRiтанням стандартного дідезокси-методу Сенгера. ДНК-фрагментів від штаму EG2158 у вектор Секвенування виявило, що 5,2т.і.о.-фрагмент місpBR322 E.coli. Ця процедура включала спочатку тив дві суміжні відкриті рамки зчитування, що коодержання повної ДНК із штаму EG2158 шляхом дують білки, а, зокрема, два нових гени кристалічлізису клітин, із наступною екстракцією ДНК феноного токсину. Вище розташована відкрита рамка лом, а потім проводили гідроліз повної ДНК ферзчитування, позначена cryЕТ33, кодувала білок, ментом, що рестрикує, EcoRI, електрофорез гідNH2-кінцева послідовність якого відповідала NН2ролізованої ДНК у агарозному гелі, вирізання кiнцевм послідовності 29кДа-білка CryЕТ33 штамів гелевого зрізу, що містить EcoRi-ДНК-фрагменти EG2159 і EG10327. Нижчерозташований ген, позрозміром у межах приблизно від 4,0 до 6,0т.і.о, і начений cryЕТ34, кодував білок, амінокислотна нарешті, електроелюцію відібраних за розміром послідовність якого відповідала NН2-кінцевій амірестрикційних EcoRi-фрагментів із зрізу агарознонокислотній послідовності, визначеній для 14кДаго гелю. Ці фрагменти змішували з плазмідним білка CryЕТ34 штаму EG10327. ДНК-послідовності вектором pRB322 E.coli, що також був гідролізовацих нових генів значно відрізнялися від послідовний ферментом EcoRI. Вектор p6R322 несе ген ностей відомих генів кристалічних токсинів резистентності до ампіциліну (AmpR) і цей вектор B.thuringiensis, перерахованих у таблиці 5. реплікувався в E.coli. Для легування вектора ДНК-послідовність гена cryЕТ33 (SEQ ID №1) і pBR322 із рестрикційними фрагментами штаму виведена амінокислотна послідовність білка EG2158, до суміші відібраних за розміром рестриCryЕТ33 (SEQ ID №3) , кодованого геном cryЕТ33, кційних фрагментів ДНК від штаму EG2158 і гідропоказані на Фіг.1А, Фіг.1В і Фіг.1С. Частину гена, лізованого вектора pBR322 добавляли ДНК-лігазу що кодує білок, cryЕТ33 (SEQ ID №1) визначали Т4 і АТР. по нуклеотидам, починаючи з положення 136 і кінПотім, плазмідну бібліотеку трансформували в чаючи положенням 936. Розмір білка CryЕТ33 клітини мікроорганізму-хазяїна E.coli, що не міс(SEQ ID №3) як білка, виведеного з гена cryЕТ33 тить потрібні гени cryЕТ33 і cryЕТ34, як описано (SEQ ID №1), становив 29216 Так (267 амінокиснижче. Після легування, ДНК-суміш інкубували з лот) . Як показано на Фіг.1А, Фіг.1В і Фіг.1С, цими мікроорганізмом-хазяїном Amps-E.coli, HB101, що послідовностями є ДНК-послідовність гена був зроблений компетентним із використанням cryET34 (SEQ ID №2) і виведена амінокислотна стандартних СаСІ2-процедур. Штам НВ101 E.coli послідовність білка CryЕТ34 (SEQ ID №4), кодовабув використаний у якості штаму-хазяїна, оскільки на геном cryЕТ34. Частину гена, що кодує білок, ці клітини легко трансформуються рекомбінантниcryЕТ34 (SEQ ID №2) визначали по нуклеотидам, ми плазмідами, і оскільки, природний штам НВ101 починаючи з положення 969 і кінчаючи положенне містить генів кристалічних білків B.thuringiensis. ням 1346. Розмір білка CryЕТ34 (SEQ ID №4) як Оскільки, pBR322 експресує AmpR то всі клітинибілка, виведеного з гена cryЕТ34 (SEQ ID №2), хазяїни, що одержали рекомбінантну плазміду, є становив 14182кДа (126 амінокислот). резистентними до ампіциліну (AmpR). Після транДля порівняння ДНК-послідовностей генів сформації клітин-хазяїв рекомбінантними плазміcryЕТ33 і cryЕТ34 і виведених амінокислотних подами, клітини розсіювали на агарове середовище, слідовностей білків CryЕТ33 і CryЕТ34 із послідовщо містило Amp. Після інкубування протягом ночі ностями всіх генів B.thuringiensis cry і кристалічних при температурі 37°С, на агарі, що містив Amp, білків, відомих авторам винаходу (описаних у розбуло вирощено декілька тисяч колоній Е.соlі, після ділі 5.3 приклада 3, і перерахованих у таблиці 5), і чого, ці колони блотували на нітроцелюлозні фільз послідовностями всіх генів і білків, наявних у базі три для наступного зондування. даних геномних послідовностей (National Center for Потім, радіоактивно мічений олігонуклеотид Genome Resources, Santa Fe, NM) використовуваWD73 використовували у якості ДНК-зонду в умоликомп'ютерні алгоритми [Korn & Queen, 1984; вах, що дозволяли зондувати специфічне зв'язуAltschul et al., 1990]. Якоїсь подібності відомих гевання трансформованих колоній-хазяїнів, що міснів або білків із послідовністю гена cryЕТ34 (SEQ тять 5,2т.i.o.-EcoRi-фрагмент ДНК штаму EG2158. ID №2) і виведеною послідовністю білка CryЕТ34 Декілька колоній Е.соїі специфічно гібридизува(SEQ ID №4), відповідно, виявлено не було. Було лись із зондом WD73. Крім того, було проведене встановлено, що послідовність гена cryЕТ33 (SEQ дослідження однієї колонії, що гібридизує WD73, ID №1) ідентична тільки послідовності одного віпозначеної EG11460 Е.соlі. EG11460 Е.соlі містив домого гена, і ідентичність цієї послідовності дуже 57 75317 58 низка. Послідовність гена cryЕТ33 (801 нуклеотид) дів [Macaluso & Mettus, 1991]. Нетрансформовані була на 38% ідентична послідовності гена клітини штаму-хазяїна EG10368 є негативними по B.thuringiensis підвиду thompsoni (1020 нуклеотикристалічному білку (Cry) і сприйнятливими до дів), [описаного Brown & Whiteley (1992)]. Було хлорамфеніколу (Cams). Після електропорації, виявлено, що виведена послідовність білка суміш для трансформації розподіляли на агарове cryЕТ33 (SEQ ID №3) має послідовність, ідентичну середовище, що містить Cam, і інкубували прибтільки одну відомому білку, і ця ідентичність дуже лизно протягом 16 годин при температурі 30°С. низка. Було виявлено, що повна амінокислотна pEG-1246-трансформовані клітини повинні бути послідовність білка CryЕТ33 (267 амінокислот) на резистентними до хлорамфеніколу. Одна СаmR27% ідентична повній амінокислотній послідовносколонія, позначена штамом EG11403 ті кристалічного білка B.thuringiensis підвиду B.thuringiensis, містила плазміду, рестрикційна thompsoni (340 амінокислот), [описаного Brown & карта якої була ідентична рестрикційній карті плаWhiteley, 1992], який є токсичним для гусениць. зміди pEG1246. ДНК-послідовність, розташовану безпосередКлітини штаму EG11403 культивували в сереньо вище гена cryЕТ33 (Фіг.1А, 1В і 1С, нуклеотиди довищі для споруляції DSG, що містить Cam, при 1-135), досліджували на гомологію з усіма відомитемпературі від 22 до 25°С, доти, поки не відбувами вищерозташованими ДНК-послідовностями лася споруляція і клітинний лізис (4-5 днів). Оцінка генів кристалічних білків, і з ДНК-послідовностями за допомогою мікроскопа виявила, що спорильоусіх відомих генів у базі даних геномних послідоввана культура штаму EG11403 містила спори і ностей (таблиця 5). ДНК-послідовності, розташоневеликі кристали веретеноподібної форми, що вані безпосередньо вище областей генів, що копереміщаються вільно, і неправильної форми. Ці дують, часто містять промотори для експресії кристали були подібні з кристалами, що спостерівідповідних генів. Якоїсь гомології в результаті гаються у спорульованої культури штаму цього дослідження виявлено не було. EG10327. ПРИКЛАД 7 Спори, кристали і клітинний дебріс із споруЕкспресія рекомбінантних генів cryЕТ33 і льованої культури штаму EG11403 збирали шляcryЕТ34 хом центрифугування. Осад після центрифугуванЕксперимент показав, що клоновані гени крисня один раз промивали деіонізованою водою, і цей талічного токсину B.thuringiensis слабко експресуосад суспендували в деіонізованій воді. вались у Е.соlі, але в більшості випадків, добре Кристалічні білки в суспензії EG11403 охаракекспресувапись у рекомбінантних штамах теризовували шляхом солюбілізації й аналізу за B.thuringiensis. pEG246, яка містить гени cryЕТ33 і допомогою електрофорезу в ПААГ із ДСН. ДСНcryЕТ34 (Фіг.2), здатна реплікуватися в Е.соlі, але ПААГ-аналіз виявив, що штам EG11403 продукуне реплікується в B.thuringiensis. Для одержання вав два мажорних білки 29кДа і 14кДа. Як і очікуплазміди, що містить гени cryЕТ33 і cryЕТ34, і здавалося, 29кДа-білок і 14кДа-білок штаму EG11403 тної реплікуватися в B.thuringiensis, плазміду були ідентичні за розміром з 29кДа-білком Bacillus spp. вводили в pEG246, як описано нижче. CryЕТ33 і 14кДа-білком CryЕТ34, відповідно, проПлазміду pNN101 Bacillus spp. (Norton et al., дукованими штамом EG10327. Штам EG11403 був 1985), здатну реплікуватися в B.thuringiensis, і тадепонований 14 грудня 1994 року під номером ку, що мае резистентність до хлорамфеніколу доступу №NRRL У-21367 у Науково-дослідній ко(CamR) і резистентністю до тетрацикліну (TetR), лекції сільськогосподарських культур Північної гідролізували ферментом ВаmНІ, і цю гідролізоварегіональної науково-дослідної лабораторії ну плазміду змішували з плазмідою pEG246, що (NRRL) відповідно до Будапештському договору була гідролізована ферментом ВаmНІ. Дві плазміпро депонування мікроорганізмів. ди легували разом із лігазою Т4+АТР. Потім легоГеном, що кодує 29кДа-білок CryЕТ33 штаму вану суміш використовували для трансформації EG11403, є ген cryЕТ33, а геном, що кодує 14кДакомпетентних клітин DH5α Е.соlі. Після інкубуванбілок CryЕТ34 штаму EG11403, є ген cryЕТ34. ня із сумішшю плазмід, клітини висівали на чашки Штам EG11403 і штам EG10327 B.thuringiensis з агаром, що містять тетрациклін. Як і очікувалося, продукували приблизно рівні кількості білка клітини, у які була включена плазміда, яка складаCryЕТ33. На відміну від цього, штам EG2158 ється з pNN101, лігованої із pEG246, були резістеB.thuringiensis продукувал приблизно 1/10 кількості нтними до тетрацикліну (TetR). Після інкубування білка CryЕТ33, як і штам EG10327 або штам приблизно протягом 20 годин, декілька резистентEG11403. них до тетрацикліну (TetR) колоній Е.соlі вирощуПРИКЛАД 8 вали на чашках з агаром, що містять тетрациклін. Штам EG11402 B.thuringiensis, що містить Плазмідну ДНК виділяли з однієї TetR-колонії. cryІІІВ3, cryЕТ33 і cryЕТ34 Плазміду гідролізували ферментом ВаmΗІ і піддаРаніше було виявлено, що кристалічний білок вали електрофорезу у агарозному гелі. Плазміда, B.thuringiensis, позначений cryІІІВ3, є токсичним позначена pEG1246, складалася з двох BamHIдля личинок японського жука [Патент США фрагментів ДНК розміром 5,8т.і.о і 9,6т.і.о., що №5264364]. У нижченаведеному прикладі було відповідають плазмідам pNN101 і pEG246, відповівиявлено, що білки CryЕТ33 і CryЕТ34 є токсичнидно. Рестрикційна карта pEG1246 показана на ми для личинок довгоносика бавовняного і личиФіг.3. нок японського жука. Білок CryЗВ3 не має загальПотім, штам EG10368 B.thuringiensis трансфоної амінокислотної послідовності, гомологічної або рмували шляхом електропорації плазмідою з білком CryЕТ33, або з білком CryЕТ34. У спробі pEG1246 із використанням описаних раніше метопродукування штаму, що має підвищену токсич 59 75317 60 ність для японського жука, ген CryЗВ3, ген cryЕТ33 ка CryЕТ34 приблизно еквівалентна кількості білка і cryЕТ34 об'єднували в один штам, як описано CryЕТ34 у штамах EG10327 I EG11402. нижче. Процедуру біоаналізу для личинки японського Штам EG10364 є штамом B.thuringiensis дикожука здійснювали наступним способом. Ліофілізого типу, що містить ген cryІІІВ3. Штам EG10364 вані порошки кожного штаму, що тестується, супродукує білок CryЗВ3, токсичний для личинок спендували в розріджувачі (водяному розчині, що японського жука. pEG1246 (Фіг.3), що містить гени містить 0,005% Тритону Х-100®), і вводили в cryЕТ33 і cryЕТ34, використовували для трансфо100мл гарячого (50-60°С) рідкого штучного корму, рмації EG10364 шляхом електропорації з одеротриманого на основі попередньо розробленого жанням штаму EG11402. Штам EG11402 ідентичраціону (Ladd, 1986). Ці суміші залишали для ний штаму EG10364, за винятком того, що ствердження в чашках Петрі, а потім диски отверEG11402 також містить плазміду pEG1246 (несучу дженого корму діаметром 19мм поміщали в пласклоновані гени cryЕТ33 і cryЕТ34), і отже, має ретикові чашки ємністю 5/8 унцій. У кожну чашку зистентність до Cam (CamR). вводили одну личинку японського жука, після чого Штам EG11402 вирощували на середовищі чашки закривали кришкою і витримували протягом для споруляції DSG+Cam при кімнатній темперачотирнадцятьох днів при 25°С, а потім оцінювали турі доти, поки не відбувалася споруляція і клітинвідсоток загибелі личинок. Це дослідження провоний лізис (4-5 днів). Кристалічні білки солюбілізудили в двох дублікатах із шістнадцятьох личинок вали зі спорульованої культури EG11402, і ці кожний. Солюбілізовані білки фракціонували за розміром Результати цього тесту на токсичність подані шляхом електрофорезу в ПААГ із ДСН. Цей аналіз нижче в таблиці 6, де інсектицидна активність вивиявив, що штам EG11402 продукував три кристаражена у відсотках загиблих личинок; при цьому, лічних білка: кристалічний 70кДа-білок, що відповідсоток загибелі личинок був скоректований на відає білку CrylllВ3, кристалічний 29кДа-білок, що загибель контрольних личинок, а в контрольний відповідає білку CryЕТ33, і кристалічний 14кДакорм був уведений тільки розріджувач. білок, що відповідає білку CryЕТ34. Аналіз, провеТаблиця 6 дений за допомогою електрофорезу в ПААГ із ДСН показав, що штам EG10364, який був вироАктивність CryЕТ33, щений тим же способом, що і EG11402, але без CryЕТ34 і CryЗВ3 для личинок японського жука хлорамфеніколу, продукував 70кДа-білок CrylllВ3 у кількостях, аналогічних кількостям, що продукуШтам Присутній білок Доза білка % загибелі комах ються штамом EG11402. Штам EG11402 був депоEG10327 cryЕТ33 ~4000мл.д. 95% a нований 14 грудня 1994 Науково-дослідною колекcryЕТ34 Nd цією сільськогосподарських культур Північною EG10364 cryЗВ3 500мл.д. 38% регіональною науково-дослідною лабораторією EG11402 cryЗВ3 560мл.д. 58% (NRRL) під номером доступу №NRRL У-21366. cryЕТ33 ~1000мл.д. ПРИКЛАД 9 cryЕТ34 ND Токсичність CryЕТ33 і CryЕТ34 для личинок a ND=нe визначали. японського жука Токсичність для личинок японського жука (Popillia japonica) визначали для трьох штамів Результати, подані в таблиці 6, показали, що B.thuringiensis: (1) для штаму EG10327, що продубілки CryЕТ33 і CryЕТ34 мають значну токсичність кує кристалічні білки CryЕТ33 і CryЕТ34; (2) штаму для личинки японського жука. EG10327, що продуEG10364, що продукує кристалічний білок CryЗВ3; кує білки CryЕТ33 і CryЕТ34, є також токсичним і (3) штаму EG11402, що продукує кристалічні білдля личинки японського жука. Якщо в EG 10327 ки CryЕТ33, CryЕТ34 і CryЗВ3. додати гени cryЕТ33 і cryЕТ34, то це приведе до Штами EG10327, EG10364 і EG11402 вирощуодержання EG11402, що, крім білка CryЗВ3, провали в середовищі для споруляції DSG при кімнадукує білки CryЕТ33 і CryЕТ34 і, як спостерігалося, тній температурі (20-23°С) до тих пір, поки не відмає підвищену токсичність для личинки японського бувалася споруляція і клітинний лізис (4-5 днів). жука. Для штаму EG11402, середовище містило 5мкг/мл ПРИКЛАД 10 Cam. Бульйон для ферментації концентрували Токсичність CryЕТ33 і CryЕТ34 для личинки шляхом центрифугування, і осади, що містять хрущака каштанового спори, кристалічні білки, і клітинний дебріс, або Токсичність для личинок хрущака каштанового ліофілізували з одержанням порошків, або ресус(Tribolium castaneum) визначали для трьох штамів пендували в деіонізованій воді з одержанням воB.thuringiensis: (1) для штаму EG10327, що продудяних суспензій. Кількості кристалічних білків кує кристалічні білки CryЕТ33 і CryЕТ34; (2) штаму CryЕТ33 і CryЗВ3 у ліофілізованих порошках і в EG10364, що продукує кристалічний білок CryЗВ3; суспензіях кількісно оцінювали за допомогою елеі (3) штаму EG11402, що продукує кристалічні білктрофорезу в ПААГ із ДСН, і простежували за доки CryЕТ33, CryЕТ34 і CryЗВ3. Чотири штами випомогою денситометра кумаси-забарвлених ДСНрощували в середовищі для споруляції DSG при ПААГ-гелей з очищеним і кількісно оціненим білкімнатній температурі (20-23°С) доти, поки не відком Cry3А, використовуваним у якості стандарту. бувалася споруляція і клітинний лізис, після чого Кількість білка CryЕТ34 оцінювали шляхом візуаодержували водяні суспензії або ліофілізовані польної оцінки Кумаси-забарвлених ДСН-ПААГрошки, як описано в прикладі 9. Токсичність кожногелей. Ця оцінка вказувала на те, що кількість біл