Ізольоване моноклональне антитіло людини, що зв’язується з il-12

1. Ізольоване моноклональне антитіло людини, що зв’язується з IL-12, яке має варіабельний регіон важкого ланцюга, що містить SEQ ID NO: 7, та варіабельний регіон легкого ланцюга, що містить SEQ ID NO: 8. C2 2 UA 1 3 81100 4 підходів для зниження імуногенності таких антитіл Інтерлейкин-12 (IL-12) є гетеродимерним та їх частин, включаючи химеризацію та цитокіном, який складається з глікозильованих гуманізацію. Ці та інші підходи, тим не менш, поліпептидних ланцюгів із масою 35 та 40кДа, можуть забезпечувати антитілами чи їх зв'язаних дисульфідним зв'язком. Цитокін фрагментами з деякою імуногенністю, низькою синтезується та секретується антигенафінністю, низькою авидністю або зі складнощами презентованими клітинами, включаючи дендритні в клітинній культурі, при збільшенні масштабу, при клітини, моноцити, макрофаги, В-клітини, клітини продукуванні та/або низьким виходом продукту. Лангерганса та кератиноцити, так само як і Таким чином, такі антитіла чи фрагменти можуть природними клітинами-кілерами (NK-клітинами). бути недостатньо ідеально придатними для IL-12 опосередковує різноманітні біологічні виробництва або використання в якості процеси, та згадується як фактор стимуляції NKтерапевтичних протеїнів. клітин (NKSF), фактор стимуляції Т-клітин, Звідси випливає, що існує потреба як у цитотоксичний фактор дозрівання Т-лімфоцитів та запровадженні антитіл до IL-12 або їх фрагментів, фактор EBV-трансформованих ліній В-клітин які подолають ще одну з зазначених проблем, так і [Curfs, J. Η. A. J., et al, Clinical Microbiology в удосконаленні відомих антитіл чи їх фрагментів. Reviews, 10: 742-780 (1997)]. Інтерлейкин-12 може Даний винахід пропонує виділені антитіла зв'язуватися з рецептором IL-12, експресованим людини, приматів, гризунів, ссавців, химерні, на плазматичній мембрані клітин (напр., Т-клітин, гуманізовані та/або CDR-гібридизовані антитіла до NK-клітин), таким чином змінюючи (напр., IL-12, імуноглобуліни, продукти розщеплення та ініціюючи, попереджуючи) біологічні процеси. інші вказані їхні частини чи варіанти, так само, як Наприклад, зв'язування IL-12 із рецептором IL-12 композиції антитіл до IL-12, кодуючі чи може стимулювати проліферацію Т-клітин та NKкомплементарні нуклеїнові кислоти, вектори, клітин, посилити цитолітичну активність клітини-хазяї, композиції, склади, пристрої, цитотоксичних Т-клітин (CTL), LAK-клітин та NKтрансгенні тварини, та способи їх одержання та клітин (кілерів, активованих лімфокіном), застосування, як описано та здійснено тут, в викликати вироблення гама-інтерферону (IFN комбінації з відомими з рівня техніки. GAMMA) Τ- та NK-клітинами та викликати Даним винаходом також запропоновано хоча б диференціацію простих Th0-клітин у Th1-клітини, одне виділене антитіло до IL-12, як описано тут. що продукують IFN GAMMA та IL-2 [Trinchieri, G., Антитіло згідно з даним винаходом включає будьAnnual Review of Immunology, 13: 251-276 (1995)]. який протеїн чи пептид, що містить молекулу, яка Зокрема, IL-12 є життєво необхідним для представлена хоча б частиною молекули утворення цитолітичних клітин (напр., NK, CTL) та імуноглобуліну, такою як, але не обмежено нею, для створення клітинної імунної відповіді (напр., регіон, що визначає компліментарність (CDR) клітинна відповідь, опосередкована Th1 важкого чи легкого ланцюга, чи регіон зв'язування клітинами). з його лігандом, регіон варіабельності важкого чи Таким чином, IL-12 є критично важливим для легкого ланцюга, регіон константності важкого чи вироблення та регулювання як захисної імунної легкого ланцюга, каркасний регіон, або його (напр., пригнічення інфекцій), так і патологічної частина, котрий може бути включений в антитіло імунної відповіді (напр., аутоімунітет) [Hendrzak, J. даного винаходу. Антитіло винаходу може A. and Brunda, M. J., Laboratory Investigation, 72: включати чи бути одержаним від будь-якого 619-637 (1995)]. Таким чином, імунна відповідь ссавця, такого як, але не обмеженого ним, (напр., захисна та патогенна) може бути людина, миша, кролик, щур, гризун, примат чи їх підсилена, пригнічена або попереджена через комбінації, та подібне. маніпулювання біологічною активністю IL-12 in Даним винаходом запропоновано, в одному з vivo, наприклад через антитіло. аспектів, молекули виділеної нуклеїнової кислоти, Химерні, поліклональні (напр., антисироватки) включаючи комплементарні чи гібридизовані, та/або моноклональні антитіла (Mabs) та полінуклеотид, який кодує хоча б один ідіотип фрагменти (напр., протеїнові продукти їх антитіл до IL-12, включаючи хоча б одну вказану протеолітичного розщеплення або злиття) ссавців послідовність, домен, частину або його варіант. крім людини, є потенційними терапевтичними Даний винахід також пропонує рекомбінантні засобами, котрі були вивчені у деяких випадках вектори, що включають згадувані нуклеїнові при спробі лікування певних захворювань. Однак, молекули, які кодують антитіло до ідіотипу IL-12, такі антитіла або фрагменти можуть викликати клітину-хазяїн, яка містить таку нуклеїнову кислоту імунну відповідь при застосуванні на людях. Така та/або вектори, так само як і способи одержання імунна відповідь може спричинити опосередковане та/або використання таких нуклеїнових кислот імунокомплексом вивільнення антитіл або їх антиідіотипічних антитіл, векторів та/або клітинфрагментів з циркуляції і зробити повторне хазяїв. застосування неприйнятним для терапії, знижуючи Даний винахід також пропонує принаймні один таким чином терапевтичну користь для пацієнта та спосіб експресії хоча б одного антитіла до IL-12 чи обмежити повторне застосування антитіл чи антитіла до ідіотипу IL-12 в клітині-хазяїні, який фрагментів. Наприклад, повторне застосування полягає в культивуванні клітини-хазяїна як антитіл або фрагментів, які включають частини описано тут, за умови, що хоча б одне антитіло до антитіл не людини, можуть призвести до IL-12 експресується в кількостях, достатніх для сироваткових захворювань та/або анафілаксії. Як детектування та/або виділення. відомо з рівня техніки, для того, щоб попередити ці та інші проблеми, було випробувано багато 5 81100 6 оброблених IL-2, IL-12, IL-2+IL-12 з або без антиДаний винахід також пропонує принаймні одну ІL-12 антитіл С340, 8.6.2, ізотипом контрольних композицію, яка містить (а) виділену нуклеїнову антитіл. Загальна RNA була обернено кислоту антитіла до IL-12 та/або антитіло як транскрибована, ампліфікована за допомогою показано тут; та (b) придатний носій або дилюент. PCR з використанням ген-специфічних праймерів. Носій чи дилюент може бути, але не обов'язково, фармацевтично прийнятним, відповідно до Також було визначено рівень b-актинової mRNA в відомих носіїв чи дилюентів. Композиція може, не кожному зразку, що слугувало контролем для обов'язково, далі включати принаймні одну цілісності та вмісту mRNA. складову, протеїн чи композицію. Фігура 4: є гістограмою, яка відображає те, що Даний винахід також пропонує принаймні один анти-ІL-12 mAb людини (С340) пригнічує спосіб чи композицію антитіла до IL-12 для вироблення інтерферону-g (IFNg) моноцитами застосування в терапевтично ефективній кількості збідненими на CD3+ мононуклеарними клітинами для модуляції чи лікування хоча б одного стану периферичної крові (РВМС), стимульованими ILклітини, тканини, органу, тварини чи пацієнта, 2+IL-12. РВМС були культивовані на протязі п'яти пов'язаного із IL-12, та/або такого, що передує годин в контрольних середовищах (без додавання йому, слідує за ним, перебігає за пов'язаних цитокінів), середовищах з додаванням IL-12 причин, як показано тут. (0.1нг/мл) плюс IL-2 (50МО/мл) (IL-12/IL-2), Даний винахід також пропонує принаймні одну контрольних середовищах з додаванням mAb композицію, пристрій та/або спосіб доставки C340 (10mg/ml) та середовищах IL-12/IL-2, які терапевтично чи профілактично ефективної містили mAb C340 (10mg/ml). Міжклітинний IFN-g кількості принаймні одного антитіла до IL-12, був визначений за допомогою двокольорового згідно з даним винаходом. імунофарбування CD3-PE та IFNg-FITC. Дані Даний винахід далі пропонує хоча б один наведено для одного донора. спосіб чи композицію з антитілами до IL-12, для Фігура 5: Діаграма, яка показує залежне від діагностики хоча б одного стану клітини, тканини, дози інгібування секреції IFN-g лімфоцитами органу, тварини чи пацієнта, пов'язаного із IL-12, периферичної крові, стимульованими IL-2 плюс ILта/або такого, що передує йому, слідує за ним, 12 двома різними групами анти-ІL-12 mAb (C340) перебігає за пов'язаних причин, як показано тут. людини. PBL людини (8´106/ml) культивувалися Даний винахід також пропонує принаймні одну на протязі 24 годин із 10U/ml IL-2, IL-2 плюс композицію, пристрій та/або спосіб доставки для 400pg/ml IL-12, або IL-2 плюс IL-12 та mAb C340 як діагностики хоча б одного антитіла до IL-12, показано. Супернатанти культур було видалено та відповідно до даного винаходу. досліджено на IFNg за допомогою ЕІА. Фігури 1А та 1В: діаграми, які демонструють Фігура 6: Гістограма, яка показує залежне від зв'язування, що залежить від концентрації дози інгібування цитотоксичності LАК-клітин моноклональних анти-ІІ.-12 антитіл з індукованих IL-12 плюс IL-2 aHTM-IL-12 mAb іммобілізованим IL-12 людини. Анти-ІL-12 антитіла (C340) людини. Клітини LAK-ефектори (PBL послідовно були промиті 1% BSA/PBS та людини, 8´106/ml) культивувалися на протязі 24 інкубовані на платівках, покритих rhlL-12 на протязі годин з IL-12 (400pg/ml) плюс IL-2 (10U/ml) та mAb однієї години при 37°С. Потім платівки двічі C340 (5000ng/ml чи 50ng/ml як показано). Клітини промивали 0.02% Твином 20 (поліоксиетилен (20) LAK-ефектори відмивалися та культивувалися із монолаурат сорбітану), 0.15М сольовим розчином клітинами-мішенями Raji, міченими 51Сr на протязі і потім тестували пероксидазою хрону (HRP) чотирьох годин при співвідношенні ефектор до міченими антитілами козла специфічними до IgG мішені (Ε: Τ) 80:1, та була визначена кількість каппа людини на протязі 1 години при кімнатній 51Сr, вивільненого у середовище, внаслідок лізису температурі. Платівки потім знову промивали, клітин Raji. Результати представлено як середнє обробляли субстратом о-фенілендиаміну (OPD) і при стандартній похибці трьох нормальних оптична щільність (OD) кожної лунки донорів. IL-12 позитивний контроль (IL-12) є вимірювалася при 490нм. ефекторними клітинами, інкубованими з та без ILФігура 2: смуги з ліва на право на Фігурах А та 12 антитіл. Фоном (BKGD) є ефекторні клітини, В відповідають IL-12 людини, IL12 р40 людини, ILінкубовані без IL-12 або антитіл. 12 миші та маркерам молекулярної маси. На Фігурі Фігури 7А та 7В: є гістограмами, які А показано зони пофарбовані загальним демонструють, що IL-12 плюс IL-2-індукована протеїном. Первісні зони з кожної смуги є IL-12 експресія CD95 на мононуклеарні клітини людини (75кДа), р40 людини IL-12 (40кДа), та IL-12 периферичної крові CD3+ інгібується анти-ІL-12 миші (75кДа). На Фігурі 2В показано western blot, mAb (C340) людини. РВМС культивувалися на одержаний з гелю, ідентичного до приведеного на протязі 72 годин на середовищі з вмістом IL-12 Фігурі 2А. Пляму, обробляли С340 після HRP 0.1ng/ml та субоптимальній дозі IL-2 (50IU/ml) в міченими антитілами козла, специфічними до присутності чи відсутності mAb C340 (10mg/ml). анти-lgG людини та специфічно виявляли лише ILЕкспресія CD95 вимірювалася проточною 12 людини (мономери та мультимери) та IL-12 р40 цитометрією клітин, оброблених анти-CD95-FITC. людини. Контрольні плями (не приведено) Світлопропускання виконувалося за допомогою оброблені HRP, міченими антитілами козла двоколіроного аналізу (CD3 чи CD56-PE vs. CD95специфічними до анти-lgG людини зовсім не FITC) та прямим vs. ортогональним виявляли зон. світлорозсіювання. Фігура 3: Аналіз оберненою PCRтранскрипцією експресії гену IFNg у PBL's людини 7 81100 8 зв'язуватися принаймні з одним IL-12, з його Фігура 8: На діаграмі показано, що зазначеною частиною, варіантом чи доменом. рекомбінантні антитіла людини (rС340) до IL-12 Прийнятне анти-ІL-12 антитіло, зазначена частина людини зв'язуються з імобілізованим IL-12 у чи варіант може також необов'язково впливати на спосіб, що не відрізняється від очищених mAb принаймні одну активність чи функцію IL-12, таку C340. Було визначено концентрацію rС340 в як, але не обмежуючись нею: синтез RNA, DNA чи супернатанті трьох рекомбінантних клітинних ліній, протеїну, вивільнення IL-12, передачу сигналів які продукують rС340, та було визначено рецептора IL-12, розщеплення мембран IL-12, зв'язування супернатанту з IL-12 в ELISA. активність IL-12, вироблення та/або синтез IL-12. Платівки було покрито 2mg/ml IL-12 людини та Термін "антитіло" в подальшому описує антитіла в інкубовано з очищеними mAb С340 з оригінальної цілому, фрагменти розщеплення, їхні зазначені гібридоми (стандарт) або супернатантами частини та варіанти, включаючи антитіла міметики рекомбінантних клітинних ліній. IL-12-поріг антитіл або такі, що містять частини які імітують структуру було визначено за допомогою антитіл козла до IgG та/або функцію антитіл чи зазначених фрагментів (важкий ланцюг+легкий ланцюг) людини, чи частини їх, включаючи одноланцюгові антитіла кон'югованими з лужною фосфатазою. та їхні фрагменти. Функціональні фрагменти Фігура 9А-9С: є діаграмами, що показують включають антиген-зв'язуючі фрагменти, котрі кінетику росту та кількості антитіл, секретованих зв'язують IL-12 людини. Даним винаходом трьома незалежно одержаними RC-340 охоплюються, наприклад, фрагмент антитіла продукуючими субклонами рекомбінантних клітин здатний зв'язуватись із IL-12 чи його частина, (Фіг.9А, субклон С379В; Фіг.9В, субклон С381А; включаючи, але не обмежуючись цим: Fab (напр., Фіг.9С, субклон 389А). Рекомбінантні клітини було гідроліз папаіном), Fab' (напр., гідроліз пепсином висаджено в колби Т75 із початковою щільністю та часткове відновлення) та F(ab') (напр., гідроліз 2´105клітин/ml в стандартному середовищі. Через пепсином), facb (напр., гідроліз папаіном) pFc' різні проміжки часу клітини ресуспендували і (напр., гідроліз пепсином чи плазміном) Fd (напр., визначали кількість живих клітин та значення гідроліз пепсином, часткове відновлення та (mg/ml) rС340в середовищі. реагрегація),Fv або scFv (напр., методами Даний винахід пропонує виділені молекулярної біології) (див. напр., Colligan, рекомбінантні та/або синтетичні анти-ІL-12 Immunology, supra). людини, приматів, гризунів, ссавців, химерні, Такі фрагменти можуть бути одержані гуманізовані чи CDR-гібридизовані, антитіла та їх ферментативним розщепленням, методами антиідіотипічні IL-12 антитіла, крім того, композиції синтезу чи рекомбінації, як відомо з рівня техніки та кодуючі молекули нуклеїнової кислоти, які та/або як описано тут. Антитіла також можуть бути включають хоч би один полінуклеотид, який кодує одержані у вигляді різноманітних вкорочених хоч би одне анти-ІL-12 антитіло або форм, використовуючи гени антитіл, в яких один антиідіотипічне антитіло. Даний винахід також чи більше стоп-кодонів вставлені вище ніж включає, але не обмежується цим, способи природні стоп-сайти. Наприклад, комбінація генів, одержання та використання таких нуклеїнових що кодують частину важкого ланцюга F (аb')2 може кислот, антитіл та антиідіотипічних антитіл, бути сконструйована включенням послідовності включаючи діагностичні та терапевтичні DNA, що кодує СН, домен та/або петельну ланку композиції, способи та пристрої. важкого ланцюга. Різні частини антитіл можуть В цьому описі використані поняття, "антитіло бути з'єднані разом звичайним хімічним способом, до антиінтерлейкіну-12", " анти-IL-12 антитіло", чи виготовлені як цілий протеїн методами "частина анти-ІL-12 антитіла", "фрагмент анти-ІLгенетичної інженерії. 12 антитіла" та/або "варіант анти-ІL-12 антитіла" та Як використано тут, термін "антитіла людини" подібні, включають будь-який протеїн чи пептид, відноситься до антитіла в якому переважно кожна що містить молекулу, представлену принаймні частина протеїну (напр., CDR, каркас, CL, CH частиною молекули імуноглобуліну, такою як, але домени (напр., СН1, СН2, СН3), петля, (VL, VH)) є, не обмежуючись, хоч би один регіон, який переважно, неімуногенними для людини, лише з визначає компліментарність (CDR) важкого або незначними змінами в послідовності та легкого ланцюга чи його частину, що зв'язує варіантами. Подібним чином, антитіла зазначені, ліганд, або регіон варіабельності важкого або як приматів (мавп, бабуїнів, шимпанзе та ін.), легкого ланцюга, або константний регіон важкого гризунів (мишей, щурів, кролів, морських свинок, або легкого ланцюга, каркасний регіон, чи будь-яка ховрахів та ін.) та інших антитіл, зазначених як їхня частина, чи хоча б одна частина рецептора ILспецифічних для ссавців, виду, підроду, роду, 12 чи зв'язуючого протеїну, який може бути підсімейства, сімейства. Далі, химерні антитіла включений в антитіло даного винаходу. Таке включають будь-яку комбінацію вищезгаданих антитіло може діяти на специфічний ліганд, таким антитіл. Такі зміни чи варіації необов'язково та чаном, але не обмежуючись ним, що таке антитіло переважно зберігають чи знижують імуногенність у модулює, знижує, підвищує, антагонізує, агонізує, людини чи інших видів, відносяться до стримує, стимулює, блокує, інгібує, анулює та/або немодифікованих антитіл. Отже, антитіла людини інтерферує з хоча б однією дією IL-12, хоча б з відмінними від химерних чи гуманізованих. однією активністю чи зв'язуванням IL-12 або Відмічено, що антитіла людини можуть активністю чи зв'язуванням рецептора IL-12, in продукуватися іншими тваринами, vitro, in situ та/або in vivo. Як необмежуючий прокаріотичними чи еукаріотичними клітинами, приклад, прийнятне анти-ІL-12 антитіло, зазначена здатними експресувати функціонально частина чи варіант даного винаходу може 9 81100 10 ніж на 50% у пацієнтів та/або перевищення перегрупований ген імуноглобуліну людини (напр., низьких титрів у пацієнтів (менш ніж 300, важкий та/або легкий ланцюг). Далі, коли антитіло переважно менш ніж 100 визначених людини є одноланцюговим антитілом, воно може ферментативним імуноаналізом подвійного містити лінкерний пептид, який не зустрічається в антигену) [див., напр., Elliott ег al., Lancet 344: природних антитілах людини. Наприклад, Fv може 1125-1127 (1994), які повністю включено сюди містити лінкерний пептид, з такими як два-вісім шляхом посилання]. гліцини чи іншими амінокислотними залишками, Модель які з'єднують різні регіони важкого ланцюга та різні Виділені нуклеїнові амінокислоти даного регіони легкого ланцюга. Такий лінкерний пептид винаходу можуть бути використані для може бути визнано як пептид людського виробництва принаймні одного антитіла до IL-12 походження. чи вказаного його варіанту, який може бути Біспецифічні, гетероспецифічні, використаний для визначення чи дії на клітину, гетерокон'югатні чи подібні антитіла також можуть тканину, орган чи тварину (включаючи ссавця та бути використані як моноклональні, переважно людей), діагностування, моніторингу, людські чи гуманізовані, антитіла які мають модулювання, лікування, підвищення, допомоги у специфічне зв'язування з принаймні двома попередженні погіршення, зниження симптомів різними антигенами. В даному випадку, однією із хоча б одного зі станів, пов'язаних з IL-12, специфічностей зв'язування має бути принаймні вибраних з, але не обмежених ними, принаймні одна до IL-12 протеїну, а друга має бути до іншого одного імунного розладу чи захворювання, протеїну. Способи одержання біспецифічних кардиоваскулярного розладу чи захворювання, антитіл відомі з рівня техніки. Традиційно, інфекції, злоякісних новоутворень, та/або рекомбінантні способи одержання біспецифічних нейрологічних розладів чи захворювань, чи інших антитіл базуються на одночасній експресії двох відомих чи визначених як станів, пов'язаних із ILпар важких ланцюгів-легких ланцюгів 12. імуноглобуліну, де два важких ланцюги мають різні Такий спосіб може включати застосування специфічності (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 ефективної дози складу чи фармацевтичної (1983)). Завдяки випадковому виборові важких та композиції, яка містить принаймні одне анти-ІL-12 легких ланцюгів, ці гібридоми (квадроми) антитіло до клітини, тканини, органу, тварини чи потенційно виробляють суміш з 10 різних молекул пацієнта для потреб такої модуляції, лікування, антитіл, з яких лише одна має правильну підвищення, попередження чи зниження біспецифічну структуру. Очищення правильних симптомів, ефектів чи механізмів. Ефективна молекул, зазвичай проводиться за допомогою кількість може становити від 0.001 до 500mg/kg на афінної хроматографії, яка є досить складною, що одиницю (напр., болус), багатократне чи тривале призводить до низького виходу продукту. Подібні вживання, чи для досягнення концентрації в процедури описано, наприклад, [WO 93/08829, патенти US 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, сироватці 0.01-5000mg/ml на однократне, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, багатократне чи тривале вживання, чи будь-який її 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, ефективний діапазон чи значення, як зроблено та 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, визначено з використанням відомих методів та, як WO 91/00360, WO 92/00373, ЕР 03089, Traunecker описано тут чи відомо з подібних робіт. et al., EMBO J. 10: 3655 (1991), Suresh et al., Усі публікації чи патенти, процитовані тут є Methods in Enzymology 121: 210 (1986), які повністю включеними сюди шляхом посилання повністю включено сюди шляхом посилання]. так, як вони відображають рівень техніки на час Анти-IL-12 антитіла (які також називають даного винаходу та/або допомагають розкриттю та антитілами до IL-12) застосовні в способах та можливості здійснення даного винаходу. До композиціях даного винаходу, можуть, публікацій віднесено будь-які наукові чи патентні необов'язково, характеризуватися високою публікації, чи будь-яка інформація доступна на афінністю зв'язування з IL-12 та необов'язково та носіях, включаючи всі записані, електронні чи переважно, низькою токсичністю. Зокрема, друковані носії. Наступні посилання повністю придатними для даного винаходу є антитіла, включено шляхом посилання: зазначені фрагменти чи варіанти винаходу, де [Ausubel, et al., ed., Current Protocols in індивідуальні складові, такі як регіон Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY варіабельності, регіон константності та каркас, (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A поодиноко та/або разом, необов'язково та Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, переважно мають низьку імуногенність. Антитіла, NY (1989); Harlowand Lane, aHTMbodies, a які можуть бути застосовані в даному винаході, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); необов'язково можуть характеризуватися їхньою Colligan, et al., eds., Current Protocols in здатністю лікувати пацієнтів на протязі тривалого Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994періоду із явним полегшенням симптомів та 2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein низькою та/або прийнятною токсичністю. Низька Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)]. чи прийнятна імуногенність та/або висока Антитіла даного винаходу афінність, так само як прийнятні властивості, Принаймні одне анти-IL-12 антитіло даного можуть складати отримані терапевтичні винаходу може, необов'язково, бути вироблено результати. "Низька імуногенність" визначається клітинною лінією, змішаною клітинною лінією, як перевищення значень НАНА, НАСА чи НАМА іморталізованими клітинами чи клональною відповідей менш ніж на 75%, чи переважно менш популяцією іморталізованих клітин, як відомо з 11 81100 12 обмеженим розведенням чи відбором клітин, чи рівня техніки. [Див. напр., Ausubel, et al., ed., іншим відомим способом. Клітини, які виробляють Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & антитіла з бажаною специфічністю можуть бути Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., відібрані прийнятним аналітичним методом (напр., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2'''Edition, ELISA). Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane; Можуть бути використані інші прийнятні антиbodies, a Laboratory Manual, Cold Spring способи одержання чи виділення антитіл Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current необхідної специфічності, включаючи, але не Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., обмежуючись цим, способи за допомогою яких NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in відбирають рекомбінантні антитіла з пептидної чи Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997протеїнової бібліотеки напр., але не обмежуючись 2001), всі повністю включено шляхом посилання]. цим, бактеріофагової, рибосомної, Антитіла людини, специфічні до протеїну IL-12 олігонуклеотидної, RNA, cDNA чи подібних; [напр., людини чи його фрагментів, можуть мати перевагу якщо доступні, з дисплейних бібліотек Cambridge порівняно з відповідним імуногенним антигеном, antibody Technologies, Cambridgeshire. UK; таким як виділений та/або протеїном IL-12 чи його MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, частиною (включаючи синтетичні молекули, такі як Aberdeen, Scotland, UK: Biolnvent, Lund, Sweden; синтетичні пептиди). Інші специфічні чи загальні Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, антитіла ссавців також можуть одержати перевагу. CA; Ixsys. See, напр., ЕР 368, 684, Виготовлення імуногенних антигенів та PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; виробництво моноклональних антитіл може бути PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; виконано за прийнятною методикою. PCT/GB93/00605; US 08/350260 (5/12/94); Наприклад, гібридома може бути одержана PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; злиттям прийнятних іморталізованих клітинних PCT/GB97/01835; (CАТ/MRC); W090/14443; ліній (напр., мієломні клітинні лінії такі, як, але не W090/14424; WO90/14430; PCT/US94/1234; обмежуючись цими, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, W092/18619; W096/07754; (Scripps); EP 614989 NS2, АЕ-1, L. 5, >243, P3X63Ag8. 653, Sp2 SA3, (MorphoSys); W095/16027 (Biolnvent); W088/06630; Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT W090/3809 (Dyax); US 4,704,692 (Enzon); IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, PCT/US91/02989 (Affymax); W089/06283; EP RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 371998; EP 550400; (Xoma); EP 229046; PCT, 2A, чи подібні, чи гетеромієломи, продукти їх 07149 (Ixsys)]; чи стохастично генерованих злиття), чи будь-які клітини або злиті клітини, пептидів чи протеїнів - [US 5723323, 5763192, одержані з них, чи інші прийнятні клітинні лінії 5814476, 5817483, 5S24514, 5976862, WO відомі з рівня техніки [Див. напр., www.atcc.org, 86/05803, ЕР 590689 (Ixsys, тепер Applied www.lifetech.com] та подібні, до клітин, що Molecular Evolution (ANIE) кожну з яких повністю продукують антитіла, такими, як але не включено шляхом посилання)], або такі, що обмежуючись ними, виділені чи клоновані клітини застосовуються при імунізації трансгенних тварин селезінки, периферичної крові, лімфи, [напр., SCID mice, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. мигдалеподібної залози, чи інших, які містять 41: 901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. імунні чи В-клітини, чи інші клітини, які Biotechnol. 16: 95-118 (1996); Eren et al., Immunol. експресують важкий чи легкий ланцюг, 93: 154-161 (1998), які повністю включено шляхом константний чи варіабельний регіон чи каркас чи посилання], котрі здатні виробляти певний перелік CDR-послідовність, ендогенні так само, як антитіл людини, як відомо з рівня техніки та/або гетерогенні нуклеїнові кислоти, рекомбінантні чи описано тут. Такі методики, включаючи, але не ендогенні вірусів, бактерій, водоростей, обмежуючись цим, "ribosome display" [Hanes et al., прокаріотів, амфібій, комах, рептилій, риб, ссавців, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4937-4942 (May гризунів, коней, баранів, кози, приматів, еукаріотів, 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: геномну DNA, cDNA, rDNA, мітохондріальну DNA 14130-14135 (Nov. 1998)]; методики виробництва чи RNA, хлоропластну DNA чи RNA, hnRNA, антитіл за допомогою поодиноких клітин [напр., mRNA, tRNA, одно-, дво-, чи три ланцюгову, спосіб одержання антитіл селектованих гібридизовану, та подібну чи їх комбінацію. [Див. лімфоцитів ("SLAM") (US pat. No. 5,627,052, Wen et напр., supra, and Colligan, Immunology, supra, al., J. Immunol. 17: 887-892 (1987); Babcook et al., chapter 2, який повністю включено шляхом Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848 (1996)]; посилання]. мікракрапельно-гелева та проточна цитометрія Клітини, що продукують антитіла можуть бути [Powell et al., Biotechnol. 8: 333-337 (1990); One Cell одержані з периферичної крові чи переважно, Systems, Cambridge, MA; Gray et al., J. Imm. селезінки чи лімфатичних вузлів людини чи інших Meth.182: 155-163 (1995); Kenny et al., Biotechnol. прийнятних тварин, котрі були імунізовані 13: 787-790 (1995)]; відбір В-клітин [Steenbakkers et цільовим антигеном. Інша прийнятна клітинаal., Molec. Biol. Reports 19: 125-134 (1994); Jonak et хазяїн може також бути використана для експресії al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in гетерогенної чи ендогенної нуклеїнової кислоти, Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier яка кодує антитіло, специфічний фрагмент чи його Science Publishers B. V., Amsterdam, Netherlands варіант, згідно з представленим винаходом. Злиті (1988)]. клітини (гібридоми) чи рекомбінантні клітини Також можуть бути використані способи можуть бути виділені з використанням створення чи гуманізації антитіл не людини та селективних культуральних умов чи інших людини, які є загально відомими з рівня техніки. прийнятних відомих методів, та клоновані 13 81100 14 властивостей. Щоб досягти цієї мети, гуманізовані Загалом, гуманізовані чи сконструйовані антитіла антитіла можуть бути, необов'язково, одержані в мають один чи більше амінокислотних залишків з результаті аналізу батьківських послідовностей та джерела, яке не є людиною, напр., але не різноманітних концептуальних гуманізованих обмежуючись до, миші, щура, кроля, примата - не продуктів з використанням тривимірних моделей людини чи інших ссавців. Ці амінокислотні батьківських та гуманізованих послідовностей. залишки людини часто називають "імпортні" Тривимірні моделі імуноглобуліну, взагалі, залишки, котрі звичайно одержуються з доступні та добре знайомі тим, хто обізнаний в "імпортного" варіабельного, константного чи рівні техніки. іншого домену відомих послідовностей людини. Доступні комп'ютерні програми, які ілюструють Відомі послідовності Іg людини надано, напр., та відображають можливі тривимірні [www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; конформаційні структури відібраних кандидатів www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; серед імуноглобулінових послідовностей. www.abcam.com/; Дослідження цих відображень дозволяє www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; проаналізувати можливі ролі залишків у www.public.iastate.edu/~pedro/researchtools.html; функціонуванні кандидатних імуноглобулінових www.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html; послідовностей, напр., аналіз залишків, які www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; впливають на здатність кандидатних www.library.thinkquest.org/12429/lmmune/AHTMbody імуноглобулінів на зв'язування з антигеном. Таким .html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; чином FR залишки можуть бути відібрані та www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html; комбіновані з консенсних та імпортних www.antibodyresource.com/; послідовностей, таким чином, що будуть одержані mcb.harvard.edu/BioLinks/lmmunology.html; бажані характеристики антитіл, такі як збільшена www.immunologylink.com/; афінність до цільового антигену(ів). Загалом, CDRpathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html; залишки прямо та більш значно включаються у www.biotech.ufl.edu/~hcl/; вплив на зв'язування антигену. Гуманізація та www.pebio.com/pa/340913/340913.html; конструювання антитіл даного винаходу може бути www.nal.usda.gov/awic/pubs/aнтиbody/; виконана за допомогою будь-якого відомого www.rn.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html; способу, такого як, але не обмежуючись цим, www.biodesign.com/table.asp; описані в: [Winter (Jones et al., Nature 321: 522 www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988); www.biotech.ufl.edu/~fccl/protocol.html; Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et www.isacnet.org/sites_geo.html; aximt1.imt.unial., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, marburg.de/~rek/AEPStart.html; J. Моl. Biol. 196: 901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. baserv.uci.kun.nl/~jraats/links1.html; www.recab.uniAcad. Sci. U. S. A. 89: 4285 (1992); Presta et al., J. hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrcImmunol. 151: 2623 (1993), US patent Nos : cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, imgt.cnusc.fr:8104/; 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539, www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html; 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978, aHTnbody.bath.ac.uk/; US91/09630, US91/05939, US94/01234, abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01.html; W090/14443, W090/14424, W090/14430, EP229246, www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/; усі повністю включено шляхом посилання, www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; включаючи посилання приведені в них]. www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.ht Анти-ІL-12 антитіла також можуть бути ml; www.ibt.unam. mx/vir/structure/stat_aim. html; одержані імунізацією трансгенних тварин (напр., www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; мишей, щурів, ховрахів, приматів, але не людей, www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolina/Webта їм подібних) здатних виробляти різноманітні pages/Pept/spottech.html; антитіла людини, як описано та/або відомо з рівня www.jerini.e/fr_products.htm; техніки. www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat et al., Клітини, що продукують анти-ІL-12 антитіла Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. також можуть бути виділені з таких тварин та бути S. Dept. Health (1983), повністю включено шляхом іморталізованими прийнятними способоми, такими посилання]. Дані імпортні послідовності можуть як способи приведені тут. бути використані зниження імуногенності чи Трансгенні миші, які можуть виробляти спектр зниження, підвищення чи модифікації зв'язування, антитіл людина, що зв'язуються з антигенами афінності, on-rate, off-rate, авідності, людини, можуть бути одержані відомими специфічності, періоду напів-розкпаду, чи інших способами [напр., але не обмежуючись ними, U. S. прийнятних характеристик, як відомо з рівня Pat. Nos: 5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, техніки. Загалом, частина чи вся CDR5,625,126, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 and послідовність людини чи не людини зберігається 5,789,650 видані на Lonberg et al.; Jakobovits et al. тоді як константний та варіабельний регіони WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, заміщуються амінокислотами людини чи іншими. Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO Антитіла також, необов'язково, можуть бути 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate гуманізовані зі збереженням високої афінності до et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463151 антигену та інших бажаних біологічних 15 81100 16 Антитіла даного винаходу можуть також бути B1, Kucherlapate et al. EP 0710719 A1, Surani et al. вироблені з використанням принаймні однієї US. Pat. No. 5,545,807, Bruggemann et al. WO нуклеїнової кислоти, що кодує анти-ІL-12 антитіло 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438474 В 1, для створення трансгенних тварин чи ссавців Lonberg et al. EP 0814259 A2, Lonberg et al. GB таких як козлів, корів, коней, овець, та подібних, 2272440 A, Lonberg et al. Nature 368: 856-859 для вироблення таких антитіл в їхньому молоці. (1994), Taylor et al., Int. Immunol. 6 (4) 579-591 Такі тварини можуть бути створені з (1994), Green et al, Nature Genetics 7: 13-21 (1994), використанням відомих методів. [Див. напр., але Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), не обмежуючись цими, US patent nos. 5,827,690; et al., Nucleic Acids Research 20 (23): 6287-6295 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; (1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90 (8) 5,565,362; 5,304,489, та подібними, кожне з яких 3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13 повністю включено шляхом посилання]. (1): 65-93 (1995) and Fishwald et al., Nat Biotechnol Антитіла даного винаходу додатково можуть 14 (7): 845-851 (1996), котрі повністю включено бути вироблені з використанням принаймні однієї шляхом посилання]. нуклеїнової кислоти, що кодує анти-ІL-12 антитіло В загалі, ці миші включають принаймні одну для створення трансгенних рослин та DNA, що містить трансген з принаймні одного культивованих рослинних клітин (напр., але не локусу імуноглобуліну людини, що функціонально обмежуючись ними, тютюн, кукурудза) котрі перебудований, чи такий, що може бути підданий продукують такі антитіла, зазначені частини чи функціонаній перебудові. Ендогенні локуси варіанти в частинах рослин чи в клітинах імуноглобуліну в таких мишей можуть бути культивованих з них. Як не обмежуючий приклад, подрібнені чи видалені для того, щоб пригнітити трансгенние листя тютюну, які експресує здатність тварини виробляти антитіла, кодовані рекомбінантні протеїни було успішно застосовано ендогенними генами. для створення великої кількості рекомбінантних Скринінг антитіл на специфічність зв'язування протеїнів, напр., з використанням індуцибельного з подібними протеїнами чи фрагментами може промотору. [Див. напр., Cramer et al., Curr. Top. бути просто проведений за допомогою дисплейних Microbol. Immunol. 240: 95-118 (1999) та пептидних бібліотек. Цей метод включає скринінг посилання, цитовані в ній]. Також, трансгенна великих колекцій пептидів для виявлення окремих, кукурудза була використана для експресування які мають потрібні функції чи властивості. Скринінг протеїнів ссавців в комерційних кількостях, та з антитіл в пептичних дисплейних бібліотеках є дуже біологічними властивостями еквівалентними до відомим в практиці. Дисплейні пептидні таких, що продуковані в інших рекомбінантних послідовності можуть мати довжину від 3 до 5000 системах чи виділені з природних джерел. [Див. чи більше амінокислот, найчастіше довжина напр., Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 становить 5-100 амінокислот, та ще частіше від 8 (1999) та цитовані там посилання], антитіла також до 25 амінокислот. На додаток до способів були вироблені у великих кількостях з насіння генерування пептидних бібліотек прямим хімічним трансгенних рослин, включаючи фрагменти синтезом, описано декілька методів антитіл, такі як одноланцюгове антитіло (scFv's), рекомбінантної DNA. включаючи насіння тютюну та коренеплоди Один тип включає відображення пептидної картоплі. [Див. напр., Conrad et al., Plant Моl. Biol. послідовності на поверхні бактеріофагу чи клітини. 38: 101- 109 (1998) та цитовані там посилання]. Кожний бактеріофаг чи клітина містить Таким чином, антитіла даного винаходу також нуклеотидну послідовність, що кодує, зокрема можуть бути вироблені з використання дисплейну пептидну послідовність. Такий метод трансгенних, відповідно до відомих способів. [Див. описано в [РСТ Patent Publication Nos 91/17271, також, напр., Fischer et al., Biotechnol. Appl. 91/18980, 91/19818, та 93/08278]. Інші системи Biochem. 30: 99-108 (Oct., 1999), Ma et al., Trends генерування бібліотек пептидів мають риси як Biotechnol. 13: 522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. хімічного синтезу in vitro так і рекомбінантних 109: 341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. методів. [Див. РСТ Patent Publication Nos. Trans.22: 940-944 (1994); та посилання в них]. 92/05258, 92/14843, та 96/19256. Див. також, U. S. Також загальні для експресії антитіл у рослин, але Patent Nos. 5,658,754; and 5,643,768]. Пептидні не обмежуючись цим. Кожні з приведених вище дисплейні бібліотеки, вектори та скринінгові посилань повністю включено шляхом посилання. набори комерційно доступні у таких поставників як: Антитіла винаходу можуть зв'язувати анти-ІL[Invitrogen (Carlsbad, CA), and Cambridge Антиbody 12 людини з широким спектром афінності (KD). У Technologies (Cambridgeshire, UK). See, напр., U. переважному втіленні принаймні одне mAb S. Pat. Nos. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, людини може зв'язувати IL-12 людини з високою 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, афінністю. Наприклад, mAb людини може 5767260, 5856456, виданих на Enzon; 5223409, зв'язувати IL-12 з KD рівним чи менше ніж 1077М, 5403484, 5571698, 5837500, виданих на Dyax, так само як, але не обмежуючись цим, 0.1-9.9 (чи 5427908, 5580717, виданих на Affymax; 5885793, інше значення чи діапазон з) X 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, виданих на Cambridge антиbody Technologies; 10-11, 10-12, 10-13 чи інше значення чи діапазон з 5750373, виданих на Genentech, 5618920, них. 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, Афінність чи авидність антитіла до антигену виданих на Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra; може бути визначена експериментально з or Sambrook, supra. Кожний з перерахованих використанням відповідного методу, [див. напр., патентів та публікацій включено повністю шляхом Berzofsky, et al., "Антиbоdу-Антиgеn Interactions", In посилання]. 17 81100 18 Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven LC CDR1. LC CDR2, LC CDR3, НС варіабельний Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis регіон LC варіабельний регіон. Immunology, W. H. Freeman and Company: New З іншого боку, винахід пропонує виділені York, NY (1992); та способи приведені тут]. молекули нуклеїнової кислоти, які кодують а(n) Значення афінності, окремих взаємодій антитілоанти-ІL-12 антитіло, що має амінокислотну антиген можуть змінюватися в залежності від послідовність, що кодується нуклеїновою різних умов визначення (напр., концентрації солей, кислотою, яка міститься в плазміді, за депонованій рН). Таким чином, визначення афінності та інших як зазначене ім'я клону________________ та параметрів зв'язування антигену (напр., KD, Ka, Kd) АТСС Deposit Nos.________________ відповідно, переважно виконують із стандартизованими задепоновані в _________________. розчинами антигену та антитіла, Як вказано тут, молекули нуклеїнової кислоти стандартизованим буфером, таким як буфер даного винаходу, котрі містять нуклеїнову кислоту, описаний тут. що кодує анти-ІL-12 антитіла можуть включати, Молекули нуклеїнової кислоти але не обмежуються цим, таку кодуючу За допомогою інформації наведеної тут, такої амінокислотну послідовність фрагменту антитіла, як нуклеотидна послідовність, що кодує принаймні саму себе; кодуючу послідовність для повного 70-100% безперервних амінокислот принаймні антитіла частина її; кодуюча послідовність однієї з SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, антитіла, фрагмент чи частина, так само як специфічних фрагментів, варіантів чи додаткові послідовності, так як і кодуюча консенсусних їх послідовностей, депонованих послідовність принаймні одного сигнального векторів, які містять принаймні одну з цих лідерного чи злитого пептиду, з чи без послідовностей, молекулу нуклеїнової кислоти вищезгаданої додаткової кодуючої послідовності, даного винаходу та принаймні одне антитіло антитакий як, принаймні один інтрон разом із ІL-12 можуть бути одержані за допомогою методів додатковою, некодуючою послідовністю, описаних тут чи відомих з рівня техніки. включаючи але не обмежуючи до, некодуючі 5' та Молекули нуклеїнової кислоти даного 3' послідовності, такі як транскрибовані, не винаходу можуть бути у вигляді RNA, таких як трансльовані послідовності, котрі грають роль в mRNA, hnRNA, tRNA чи будь-яких інших форм, чи транскрипції, процесингу mRNA, включаючи у вигляді DNA, включаючи але не обмежуючсь, сплайсинг та сигнали поліаденілування cDNA та геномної DNA, одержаної клонуванням чи (наприклад - зв'язування рибосоми та стабільність синтетично, чи будь-яких їх комбінацій. DNA може mRNA); додаткова кодуюча послідовність, що бути триланцюгова, дволанцюгова чи будь-які їх кодує додадкові амінокислоти, такі як ті, що комбінації. Будь-яка частина принаймні одного надають додаткові функціональні характеристики. ланцюга DNA чи РNАможе біти кодуючим Таким чином, послідовність, що кодує антитіло ланцюгом, також відомим як смислова може бути злита з маркерною послідовністю, так послідовність, чи може бути некодуючим як послідовність, що кодує пептид, котрий ланцюгом, також відомим як антисмислова полегшує очищення злитого антитіла, що включає послідовність. фрагменти чи частину. Виділені молекули нуклеїнової кислоти даного Полінуклеотиди, котрі вибірково винаходу можуть включити молекули нуклеїнової гібридизуються з полінуклеотидом, описаним тут кислоти які мають одну відкриту рамку зчитування Даний винахід пропонує виділені нуклеїнові (ORF), необов'язково з одним чи більше інтронів, кислоти, котрі гібридизуються за певних умов напр., але не обмежуючись до, принаймні одна гібридизації з нуклеотидом описаним тут. Отже, зазначена частина принаймні однієї CDR, як полінуклеотиди даної реалізації можуть CDR1, CDR2 та/або CDR3, принаймні одного використовуватися для виділення, визначення важкого ланцюга (напр., SEQ ID NOS: 1-3) чи та/або підрахунку кількості нуклеїнової кислоти, легкого ланцюга (напр., SEQ ID NOS: 4-6); та яка містить такі полінуклеотиди. Наприклад, молекули нуклеїнової кислоти, котрі містять полінуклеотиди даного винаходу можуть нуклеотидну послідовність значно відмінну від використовуватися для ідентифікації, виділення чи такої, що наведена, але котра завдяки ампліфікації часткових чи повних клонів в виродженості генетичного коду, все ще може депозитній бібліотеці. В деяких реалізаціях, кодувати принаймні одне анти-ІL-12 антитіло, як полінуклеотиди є геномними чи виділеної показано тут чи відомо з рівня техніки. Звичайно, послідовності cDNA, чи комплементарними до генетичний код є дуже відомим на практиці. Таким cDNA з бібліотеки нуклеїнових кислот людини чи чином, для обізнаного в даній галузі було б лише ссавців. механічною процедурою створити такі вироджені Переважно, бібліотека cDNA містить варіанти нуклеїнової кислоти, що кодують принаймні 80% повних послідовностей, переважно специфічні анти-ІL-12 антитіла. [Див. напр., принаймні 85% чи 90% послідовностей повної Ausubel, et al., supra], і такі варіанти нуклеїнової довжини, більш переважно принаймні 95% повних кислоти також включено до даного винаходу. послідовностей. Необмужуючі приклади виділених молекул Бібліотеки cDNA можуть бути нормалізовані нуклеїнової кислоти даного винаходу включають для збільшення присутності послідовностей, що SEQ ID NOS: 10-15, і відносяться до не рідко зустрічаються. Низькі чи посередні умови обмежуючих прикладів нуклеїнової кислоти, яка жорсткості гібридизації є типовими, але не кодує, відповідно НС CDR1, НС CDR2, НС CDR3, виключними, та застосовуються при послідовностях з низхькою схожістю до 19 81100 20 комплементарних послідовностей. Помірні чи Скринінг нуклеїнових кислот та методи жорсткі умови можуть, іноді, застосовуватися для виділення послідовностей з більшою схожістю. cDNA чи геномна бібліотека може бути Умови низької жорсткості забезпечують сринінгована з використанням зразку, який селективну гібридизацію послідовностей із 70%-ю базується на послідовності полінуклеотиду даного ідентичністю послідовностей та можуть винаходу, такого як описано тут. Зразки можуть застосуватися для ідентифікації ортологічних чи бути використані для гібридизації з геномними паралогічних послідовностей. послідовностями DNA та cDNA для виділення Необов'язково, полінуклеотиди даного гомологічних генів з того самого чи іншого винаходу будуть кодувати принаймні частину організму. Спеціалісти в даній галузі оцінять які антитіла, кодованого полінуклеотидами описаними різноманітні рівні жорсткості гібридизації можуть тут. Полінуклеотиди даного винаходу охоплюють бути використані при аналізі; також жорсткими послідовності нуклеїнової кислоти, котрі можуть можуть бути середовища гібридизації та бути використані для селективної гібридизації з відмивання. При створенні більш жорстких умов полінуклеотидом, що кодує антитіло даного гібридизації, збільшується ступінь винаходу. [Див. напр., Ausubel, supra; Colligan, компліментарності між зразком та цільовим supra, які повністю включено шляхом посилання]. продуктом для створення дуплексу. Рівень Конструювання нуклеїнових кислот жорсткості може контролюватися одним або Виділені нуклеїнові кислоти даного винаходу більше параметрами, такими як: температура, можуть бути виготовлені з використанням (а) іонна сила, рН та присутність частково рекомбінантних методів, (b) синтетичних методів, денатуруючого агенту, такого як формамід. (с) методів очищення, чи їх комбінацій, які відомо з Наприклад, жорсткості гібридизації може бути рівня техніки. легко змінена зміною полярності реагуючого Нуклеїнові кислоти можуть включати розчину через, наприклад, маніпулювання послідовності на додаток до полінуклеотиду концентрацією формаміду в межах від 0% до 50%. даного винаходу. Наприклад, мультиклонований Рівень компліментарності (ідентичності сайт, який включає один або більше сайтів послідовності) потрібен для того, щоб зв'язування, рестрикції ендонуклеази, може бути вставлений в яке визначається змінювалося відповідно до нуклеїнову кислоту, для полегшення виділення жорсткості гібридизаційного середовища та/або полінуклеотиду. середовища для відмивання. Рівень Також, послідовності здатні до трансляції компліментарності буде оптимальним 100% чи 70можуть бути введені для полегшення виділення 100% чи інше значення чи діапазон в цих межах. полінуклеотиду даного винаходу. Наприклад, Однак, має бути зрозуміло, що варіації гексагістидинова маркерна послідовність дзеркальної послідовності в зразках та праймерах забезпечує прийнятний спосіб для очищення можуть бути компенсовані зниженням жорсткості протеїнів даного винаходу. Нуклеїнова кислота гібридизаційного середовища та/або середовища даного винаходу, крім кодуючої послідовності для відмивання. необов'язково є вектором, адаптером чи лінкером Методи ампліфікації DNA чи RNA є добре для клонування та/або експресії полінуклеотиду відомими для спеціалістів в галузі та можуть бути даного винаходу. використані відповідно до даного винаходу без Додаткові послідовності можуть бути додані до зайвого експериментування, з використанням такого клонування та/або експресії послідовностей навчальних засобів та керівництв присутні в них. для оптимізації їхньої функції при клонуванні Методи ампліфікації DNA чи RNA включають, та/або експресії, для полегшення виділення але не обмежуються цим, реакцію полімеразного полінуклеотиду, чи покращення введення ланцюга (PCR) та схожі ампліфікаційні процеси, поінуклеотиду в клітину. Використання векторів [див. напр., U. S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202, клонування, експресивних векторів, адаптерів та 4,800,159, 4,965,188, to Mullis, et al.; 4,795,699 and лінкерів добре відоме з практики. [див. напр., 4,921,794 to Tabor, et al.; 5,142,033 to Innis: Ausubel, supra; or Sambrook, supra]. 5,122,464 to Wilson, et al.; 5,091,310 to Innis; Рекомбінантні методи конструювання 5,066,584 to Gyllensten, et al.; 4,889,818 to Gelfand, нуклеїнових кислот et al.; 4,994,370 to Silver, et al.; 4,766,067 to Biswas; Композиції виділених нуклеїнових кислот 4,656,134 to Ringold] та RNA-опосередковані даного винаходу, такі як RNA, cDNA, геномна DNA ампліфікації, котрі використовують антисмислові чи будь-яка їх комбінація, можуть бути одержана з RNA до цільової послідовності як шаблон для біологічних джерел з використанням багатьох синтезу дволанцюгової DNA [U. S. Patent No. методик клонування, відомих спеціалістом в даній 5,130,238 to Malek, et al., із комерційною назвою галузі. У деяких втіленнях, олігонуклеотидні NASBA], повний зміст котрого повністю включено зразки, які вибірково гібридизуються, за суворих шляхом посилання [Див. напр., Ausubel, supra; or умов, з полінуклеотидами даного винаходу Sambrook, supra]. Наприклад, технологія реакції використовуються для ідентифікації бажаної полімеразного ланцюга (PCR) може бути послідовності в бібліотеках DNA чи геномної використана для ампліфікації послідовностей cDNA. Виділення RNA та конструювання cDNA та полінуклеотидів даного винаходу та подібних генів геном них бібліотек, є добре відомим для прямо з геномної DNA чи cDNA бібліотеки. PCR та спеціаліста в даній галузі, [див. напр., Ausubel, інші методи ампліфікації in vitro можуть бути supra; or Sambrook, supra]. корисні, наприклад, для клонування послідовностей нуклеїнових кислот, які кодують 21 81100 22 протеїни, які будуть експресовані, для того, щоб Даний винахід також відноситься до векторів, створити нуклеїнові кислоти для їх використання котрі включають виділені нуклеїнові кислоти як зразків для визначення присутності бажаної даного винаходу, генетично сконструйовані mRNA в зразку, для секвенування нуклеїнових клітини-хазяї з рекомбінантними векторами, та кислот, чи для інших потреб. Приклади способів, продукування принаймні одного анти-ІL-12 достатніх для осіб, обізнаних в методах антитіла рекомбінантними методами які відомі з ампліфікації in vitro знаходяться в [Berger, supra, рівня техніки. [Див. напр., Sambrook, et al., supra; Sambrook, supra, та Ausubel, supra, так само як і в Ausubel, et al., supra, кожний з яких повністю Mullis, et al., U. S. Patent No. 4,683,202 (1987); та включено шляхом посилання]. Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Полінуклеотиди можуть, необов'язково, бути Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, введеними в вектор, котрий містить селективний CA (1990)]. Комерційно доступні набори для маркер для вирощування в клітині. Взагалі, плаз геномних PCR-ампліфікацій відомі. [Див. напр., мідний вектор вводиться в преципітат, такий як Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech)]. преципітат фосфату кальцію, чи в комплекс із Додатково, напр., може біти використаний Т4 ген зарядженими ліпідами. Якщо вектор є вірусом, він 32 протеїну (Boehringer Mannheim) для може бути спакований in vitro за допомогою покращення виходу продукту довгих PCR відповідної пакуючої клітинної лінії і потім продуктів. перенесений в клітину хазяїна. Синтетичні методи конструювання нуклеїнових DNA-вставка має бути безпосередньо кислот прив'язана до відповідного промотора. Експресій Виділені нуклеїнові кислоти даного винаходу ний конструкт в подальшому буде містити сайти можуть бути одержані прямим хімічним синтезом ініціації транскрипції, термінації та, в за допомогою відомих методів [див., напр., транскрипційному регіоні, сайт зв'язування Ausubel, et al., supra]. Хімічний синтез взагалі дає рибосоми для трансляції (напр., UAA, UGA чи одноланцюговий олігонуклеотид, котрий може UAG) відповідно розташований на кінці бути перетворений на дволанцюговий DNA трансльованої mRNA, із переважанням UAA та гібридизацією із комплементарною послідовністю UAG для експресії еукаріотичних клітин. чи полімеризацією DNA-полімеразою з Вектори експресії бажано, але не обов'язково використанням одноланцюгової DNA як шаблону. будуть включати принаймні один селективний Спеціалісти в даній галузі можуть побачити, що маркер. Такі маркери включають, напр., але не тоді як хімічний синтез DNA може бути обмежений обмежуючи цим, метотрексат (МТХ), дигідрофолат послідовністю близько 100 чи більше основ, довші редуктазу [DHFR, US Pat. Nos. 4,399,216; послідовності можуть бути одержані 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; об'єднуванням коротших послідовностей. 5,179,017], ампіцилін, неоміцин (G418), Касети рекомбінантної експресії мікофенолову кислоту, глютамат синтетазу [GS, Даний винахід також пропонує касети US Pat. Nos. 5,122,464; 5,770,359; 5,827,739], рекомбінантної експресії, які включають нуклеїнові резистентність до культури еукаріотичних клітин, кислоти даного винаходу. Послідовності та гени резистентності до тетрацикліну чи нуклеїнових кислот даного винаходу, наприклад, ампіциліну для культивування Е. соlі та інших DNA чи геномні послідовності, що кодують бактерій чи прокаріотів (вище приведені патенти антитіла даного винаходу, можуть бути повністю включено сюди шляхом посилання). використані для конструювання касет Відповідні культуральні середовища та умови рекомбінантної експресії, які можуть бути введені, описаних вище клітин-хазяїв добре відомі для принаймні, в одну клітину хазяїна. Касета спеціалістів в даній галузі. рекомбінантної експресії буде, як правило, Прийнятні вектори є очевидними для включати полінуклеотид даного винаходу, обізнаних професіоналів. Введення векторного операбельно зв'язаний з регуляторними конструкту до клітини хазяїна може бути виконано послідовностями ініціації транскрипції котрі будуть шляхом трансфекції фосфату кальцію, DEAEспрямовувати транскрипцію полінуклеотиду в декстран опосередкованої трансфекції, катіонної конкретній клітині-хазяїні. Для прямого ліпід-опосередкованої трансфекції, експресування нуклеїнових кислот даного електропорації, трансдукції, інфекції, чи іншими винаходу можуть бути застосовані як відомими способами. Такі способи описано в гетерологічні, так і негетерологічні (напр., роботах, таких як [Sambrook, supra, Chapters 1-4 та ендогенні) промотори. 16-18; Ausubel. supra, Chapters 1, 9, 13, 15, 16]. У деяких втіленнях, виділенні нуклеїнові Принаймні одне антитіло даного винаходу кислоти можуть слугувати промотором, може бути експресоване в модифікованій формі, енхансером, чи інший елемент може бути такій як злитий протеїн, та може включати не лише введений у відповідне місце (вище чи нижче, чи в сигнали експресії, але також додатковий інтрон) негетерологічної форми полінуклеотиду гетерологічний функціональний регіон. Наприклад, даного винаходу для підвищення чи зниження регіон додаткових амінокислот, зокрема експресії полінуклеотиду даного винаходу. заряджених амінокислот, може бути доданим до Наприклад, ендогенні промотори можуть бути N-ткінця антитіла для підвищення стабільності та змінені in vivo чи in vitro мутаціями, делеціями стійкості в клітині-хазяїні, під час очищення, та/або заміною. використання та зберігання. Вектори та клітини-хазяї Також частини пептидів можуть бути додані до антитіл даного винаходу для полегшення 23 81100 24 послідовність поліаденілування з бичачого гену очищення. Такі регіони можуть бути видалені гормону росту. Також можуть включатися перед кінцевим приготуванням антитіла чи послідовності для точного сплайсингу транскрипту. принаймні його фрагменту. Такі методи описані в Прикладом сплайсингової послідовності є інтрон багатьох стандартних лабораторних керівництвах, VP1 з SV40 [Sprague, et al., J. Virol. 45: 773-781 таких як, [Sambrook, supra, Chapters 17.29-17.42 та (1983)]. До того ж, для контролю за реплікацією в 18.1-18.74; Ausubel, supra, Chapters 16, 17 та 18]. клітині-хазяїні генетичні послідовності можуть бути Такі пересічні навички в роботі є дуже включені у вектор, що є добре відомим з рівня поширеними в багатьох системах експресії техніки. придатних для експресування нуклеїнових кислот, Очищення антитіл які кодують протеїн даного винаходу. Антитіла до анти-ІL-12 можуть бути одержані з Інакше, нуклеїнові кислоти даного винаходу рекомбінантної культури клітин добре відомими можуть бути експресовані включанням методами, але не обмежуючись ними, очищенням (маніпуляцією) в клітині хазяїні, що містить протеїну А, преципітацією сульфатом амонію чи ендогенну DNA, яка кодує антитіла даного етанолом, кислотною екстракцією, аніоно- чи винаходу. Такий метод є добре відомим катіонообмінною хроматографією, спеціалістам, напр., як описано в [US patent Nos. фосфоцелюлозною хроматографією, гідрофобною 5,580,734, 5,641,670, 5,33,46, та 5,733,761, які інтеракційною хроматографією, афінною повністю включено шляхом посилання]. хроматографією, гідроксиапатитною Наочним прикладом клітинних культур, хроматографією та пектиновою хроматографією. корисних для вироблення антитіл, зазначених Також може бути використана високо ефективна частин та їхніх варіантів є клітини ссавців. рідинна хроматографія ("HPLC") [див. напр., Клітинна система ссавців часто буває у вигляді Colligan, Current Protocols in Immunology, або моношарів, хоча також використовуються суспензії Current Protocols in Protein Science, John Wiley & чи біореактори клітин ссавців. Було розроблено Sons, NY, NY, (1997-2001), Chapters 1, 4, 6, 8, 9, багато ліній клітин-хазяїв, придатних для 10, кожен повністю включено шляхом посилання]. експресування інтактних глікозильованих Антитіла даного винаходу звичайно протеїнів, включаючи COS-1 (напр., АТСС CRL включають очищені продукти, продукти процедури 1650), COS-7 (напр., АТСС CRL 1651), НЕК293, хімічного синтезу, продукти одержані методом ВНК21 (напр., АТСС CRL-10), СНО (напр., АТСС рекомбінації з еукаріотичного хазяїна, включаючи, CRL 1610) та клітинні лінії BSC-1 (напр., АТСС наприклад, клітини дріжджів, вищих рослин, комах CRL-26), клітини Cos-7, клітини СНО, клітини hep та ссавців. Залежно від застосованого хазяїна в G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, клітини 293, процесі рекомбінантного продукування, антитіла клітини HeLa та їм подібні, котрі завжди є в даного винаходу можуть бути глікозильовані чи розпорядженні, наприклад в [American Type неглікозильованими, з відданням переваги Culture Collection, Manassas, Va (www.atcc.org)]. глікозильваним. Такі методи описано в багатьох Переважні клітини-хазяї включають клітини стандартних лабораторних керівництвах, таких як, лімфоїдного походження такі, як клітини мієломи [Sambrook, supra, Sections 17.37-17.42; Ausubel, та лімфоми. Зокрема переважними клітинамиsupra, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 and 20, Colligan, хазяями є РЗХ63Аg8, клітини 653 (АТСС Accession Protein Science, supra, Chapters 12-14, котрі Number CRL-1580) та клітини SP2/0-Agl4 (АТСС повністю включено шляхом посилання]. Accession Number CRL-1851). Анти-IL-2 антитіла Експресивні вектори цих клітин можуть Виділені антитіла даного винаходу включають включати одну чи більше послідовностей антитіла, кодовані будь-яким з полінуклеотидів управління експресією, таких як, але не даного винаходу, як буде тут розглянуто більш обмежуючи до походження реплікації: промотор докладно, чи інше виділене чи приготоване (напр., пізній чи ранній промотори SV40, промотор антитіло. Переважно, антитіло людини, чи CMV [US Pat. Nos. 5,168,062; 5,385,839), промотор антиген-зв'язуючий фрагмент, що зв'язує IL-12 HSV tk, промотор pgk (фосфогліцерат кіназа), людини, і таким чином, частково чи суттєво alpha промотор EF-1 [US Pat. No. 5,266,491], нейтралізує принаймні одну з біологічних принаймні один промотор імуноглобуліну людини, активностей протеїну. Антитіло чи зазначена його енхансер, та/або сайти інформації процесингу, такі частина чи варіант, котра частково чи, переважно, як сайти зв'язування рибосоми, сайти сплайсингу значною мірою, нейтралізує, принаймні одну RNA, сайти поліаденілування [напр., SV40 великий біологічну активність принаймні одного протеїну Τ Ag poly А додатковий сайт], послідовності IL-12 чи фрагменту, може зв'язувати протеїн чи термінаторів транскрипції. [Див. Ausubel et al., фрагмент, і таким чином інгібувати дії, supra; Sambrook, et al., supra]. Інші клітини опосередковані зв'язуванням IL-12 з рецептором придатні для вироблення нуклеїнових кислот та IL-12 або через інші залежні чи опосередковані ILпротеїнів даного винаходу є відомими та/або 12 механізми. Термін "нейтралізуюче антитіло", як доступними. Напр., з [American Type Culture воно вживається тут, відноситься до антитіла, Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas котре може інгібувати активність залежну від IL-12 (www.atcc.org)] чи інших відомих комерційних до 20-120%, переважно до 10, 20, 30, 40, 50, 55, джерел. 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, Коли застосовуються еукаріотичні клітини98, 99, 100%, чи більше, в залежності від проби. хазяї, у вектор звичайно вводяться послідовності Здатність анти-ІL-12 антитіл пригнічувати IL-12поліаденілування чи термінації транскрипції. залежну активність переважно визначалася, Прикладом послідовності термінатора є 25 81100 26 різними частинами (напр., CDRs, каркас) антитіл з принаймні однією прийнятною пробою протеїну чи використанням загальноприйнятих методик, рецептору IL-12, як описано тут, чи відомо з рівня виготовленням чи експресією (напр., однієї чи техніки. Антитіла людини згідно з винаходом більше) молекул нуклеїнової кислоти, котра кодує можуть належати до будь-якого класу (IgG, IgA, антитіла з використанням загально відомих IgM, IgE, IgD, etc.) чи ізотипу, і можуть включати методик технологій рекомбінантних DNA чи з легкі ланцюги каппа чи лямбда. В одному з використанням будь-якого іншого придатного втілень, антитіла людини включають важкий методу. ланцюг IgG чи визначений фрагмент, наприклад, Анти-ІІ-12 антитіла можуть включати принаймні один з ізотипів, lgG1, lgG2, lgG3 чи lgG4. принаймні один легкий чи важкий ланцюг Антитіла цього типу можуть бути виготовлені із варіабельного регіону визначеної амінокислотної застосуванням принаймні одного тарансгену послідовності. Наприклад, в переважній реалізації, легкого ланцюга людини (напр., IgG, IgA та IgM анти-ІL-12 антитіла включають принаймні одне з (напр., g1, g2, g3, g4), як описано тут та/або відомо принаймні один варіабельний регіон важкого з рівня техніки. В іншому втіленні, антитіло до ILланцюга, який необов'язково має амінокислотну 12 людини включає важкий ланцюг lgG1 та легкий послідовність SEQ ID NO:7 та/або принаймні один ланцюг lgG1. варіабельний регіон легкого ланцюга, який Принаймні одне антитіло винаходу, зв'язує необов'язково має амінокислотну послідовність принаймні один зазначений епітоп, специфічний SEQ ID NO:8. Антитіла, котрі можуть зв'язувати ILдо принаймні одного протеїну IL-12, субодиниці, 12 людини, та включають визначені варіабельні фрагменту, частини чи їх комбінації. Принаймні регіони важкого та легкого ланцюгів можуть бути один епітоп може включати, принаймні один регіон виготовлені придатними методами, такими як зв'язування антитіла, який включає принаймні фаговий дисплей [Katsube, Y., et al., Int JMol. Med, частину згаданого протеїну, епітоп котрого, 1 (5): 863-868 (1998)] чи методами, які переважно включає принаймні одну екстра використовують трансгенних тварин, як відомо з целюлярну, розчинну чи цитоплазматичну частину рівня техніки та/або описано тут. Наприклад, вказаного протеїну. Принаймні один вказаний трансгенна миша, яка має функціонально епітоп може включати будь-яку комбінацію з перебудований трансген важкого ланцюга принаймні одного амінокислотного ланцюга з імуноглобуліну людини та трансген, який містить принаймні 1-3 амінокислот до повної зазначеної DNA з локусу легкого ланцюга імуноглобуліну частини безперервних амінокислот SEQ ID NO:9. людини, котрий було піддано функціональній В загальному випадку, антитіло людини чи перебудові, може бути імунізована IL-12 людини фрагмент зв'язування антигену даного винаходу чи його фрагментом для викликання вироблення буде включати регіон зв'язування антигену, котрий антитіл. При потребі, клітини, що продукують включає принаймні один регіон визначення антитіла, можуть бути виділені й гібридоми чи компліментарності (CDR1, CDR2 та CDR3) чи можуть бути виготовлені інші іморталізовані варіант принаймні одного варіабельного регіону клітини, що продукують антитіла, як описано тут важкого ланцюга, та принаймні один регіон та/або відомо з рівня техніки. визначення компліментарності (CDR1, CDR2 та Як альтернатива, можуть бути експресовані CDR3) чи варіант принаймні одного варіабельного антитіла, за допомогою кодуючих нуклеїнових регіону легкого ланцюга. Як не обмежуючий кислот чи їх частин в придатній клітині хазяїні. приклад, антитіло чи частина зв'язування Винахід, також стосується антитіл, антигенантигену,чи варіант може включати принаймні зв'язуючих фрагментів, імуноглобулінових один важкий ланцюг CDR3, який має ланцюгів та CDR-ів, котрі містять амінокислоти в амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3 та або послідовності, котра, значно схожа на один легкий ланцюг CDR3, який має амінокислотну амінокислотну послідовність, описану тут. послідовність SEQ ID NO:6. В конкретному Переважно, такі антитіла чи фрагменти випадку, антитіло чи антиген-зв'язуючий фрагмент зв'язування антигену та антитіла, котрі включають може мати регіон зв'язування антигену, який такі ланцюги чи CDR-и, можуть зв'язувати IL-12 включає принаймні частину принаймні одного людини з високою афінністю (напр., KD менше чи важкого ланцюга CDR (напр., CDR1, CDR2 та/або дорівнює приблизно 10-9М). Амінокислотні CDR3), котра має амінокислотну послідовність, що послідовності, котрі значно схожі на послідовність, відповідає CDR-ам 1, 2 та/або 3 (напр., SEQ ID описану тут, включають послідовності, які мають NOS: 1, 2 та/або 3). В іншому окремому втіленні, замінені консервативні амінокислоти, так само як антитіло чи антиген-зв'язуюча частина, чи варіант делеції та/або інерції амінокислот. Заміна може мати регіон зв'язування антигену, який консервативної амінокислоти відноситься до такої включає принаймні частину одного легкого заміни однієї амінокислоти другою, котра має ланцюга CDR (напр., CDR1, CDR2 та/або CDR3) хімічні та/або фізичні властивості (такі як, заряд, яка має амінокислотну послідовність, що структура, полярність, відповідає CDR-ам 1, 2 та/або 3(напр., SEQ ID гідрофобність/гідрофільність) схожі до таких у NOS: 4. 5. та/або 6). В переважному втіленні три першої амінокислоти. Консервативні заміщення важкі ланцюги CDR-и та три легкі ланцюги CDR-и включають заміну однієї кислоти іншою в межах антитіла чи антиген-зв'язуючого фрагменту мають таких груп: лізин (K), аргінін (R) та гістидин (Н); амінокислотні послідовності, які відповідають CDR, аспартат (D) та глютамат (Е); аспарагін (N), принаймні одного з mAb 12B75, С340, чи будьглютамін (Q), серин (S), треонін (Т), тирозин (Y). K, якому іншому, як описано тут. Такі антитіла можуть R, Н, D та Е; аланін (А), валін (V), лейцин (L), бути виготовлені хімічним введенням разом з 27 81100 28 ізолейцин (І), пролін (Р), фенілаланін (F), фотоафінне мічення [Smith, et al., J. Моl. ВіоІ. 224: триптофан (W), метионін (М), цистеїн (С) та гліцин 899-904 (1992) and de Vos, et al., Science 255: 306(G); F, W та Y; C, S та Т. 312 (1992)]. Амінокислотні коди Анти-IL-12 антитіла даного винаходу можуть Амінокислоти, що складають анти-ІL-12 включати, не обмежуючи до, принаймні одну антитіла даного винаходу зазвичай скорочують. частину, послідовність чи комбінацію від 5 до всіх Позначення амінокислот можуть бути проставлені безперервних амінокислот принаймні однієї з SEQ однолітерним кодом амінокислот, трилітерним ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6. кодом амінокислот чи тринуклеотидним IL-12 антитіла чи зазначені частини чи кодоном(и) як це добре відомо з літератури [див. варіанти даного винаходу можуть включати, але Alberts, В., et al., Molecular Biology of The Cell, Third не обмежуючись до, принаймні одну частину, Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994]: послідовністі чи комбінації вибраних з 3-5 безперервних амінокислот з SEQ ID NO: 1, 5-17 Однолітерний код Трьохлітерний код Назва безперервних амінокислот SEQ ID NO: 2, 5-10 Триплет(и) безперервних амінокислот з SEQ ID NO: 3, 5-11 A Ala Alanine GCA, GCC, GCG, GCU безперервних амінокислот з SEQ ID NO: 4, 5-7 С Cys Cysteine UGC, UGU безперервних амінокислот з SEQ ID NO: 5; 5-9 D Asp Aspartic GAC, GAU безперервних амінокислот з SEQ ID NO: 6; Leu21, Ε Glu Glutamic GAA, GAG F Phe PhenylanineLys76, Met83, Ser85 з SEQ ID NO: 7. UUC, UUU Анти-ІL-12 антитіла також необов'язково G Gly Glycine GGA, GGC, GGG, GGU можуть включати поліпептид з принаймні 70-100% Η His Histidine CAC, CAU з 5, 17, 10, 11, 7, 9, 119, чи 108 безперервних I He Isoleucine амінокислот, принаймні однієї з SEQ ID NOS: 1, 2, AUA, AUC, AUU K Lys Lysine AAA, AAG 3, 4, 5, 6, 7 чи 8. L Leu Leucine CUC, CUG, амінокислотна В UUA, UUG, CUA,реалізацій, CUU одній з Μ Met Methionine послідовність ланцюга імуноглобуліну, чи його AUG N Asn Asparagine частини (напр., варіабельний регіон, CDR) має AAC, AAU приблизно 70-100% подібності (напр., 70, 71, 72, Ρ Pro Proline CCA, CCC, CCG, CCU O Gin Glutamine 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, CAA, CAG 87, 88, 89, 90, 91,CGA, CGC, 95, 96, 97, 98, 99, 100 R Arg Arginine AGA, AGO, 92, 93, 94, CGG, CGU чи будь-який їх діапазонUCG, UCU чи значення) до S Ser Serine AGC, AGU, UCA, UCC, відповідного Τ Thr Threonine амінокислотної ACG, ACU АСА, ACC, послідовності, ланцюга з принаймні одного з SEQ ID NOS: 7, 8. V Val Valine GUA, GUC, GUG, GUU Наприклад, амінокислотна послідовність w Trp Tryptophan UGG варіабельного регіону легкого ланцюга може бути Υ Tyr Tyrosine UAC, UAU порівняна з послідовністю SEQ ID NO: 8, чи амінокислотна послідовність важкого ланцюгу Анти-IL-12 антитіла даного винаходу можуть CDR3 може бути порівняна з SEQ ID NO: 3. включати одну чи більше амінокислотних замін, Переважно, 70-100% подібності до амінокислот делецій чи вставок, як природніх мутацій так і (напр., 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 чи маніпульованих людиною, як зазначено тут. будь-який їх діапазон чи значення) визначено за Звісно, що багато амінокислотних замін допомогою добре відомого на практиці кваліфікована особа в даній галузі може зробити комп'ютерного алгоритму. залежно від багатьох факторів, включаючи вище Зразкові послідовності варіабельного регіону описані. Взагалі говорячи, кількість амінокислотних легкого та важкого ланцюгів представлені в SEQ замін, вставок та делецій для будь-якого даного LD NOS: 7 and 8. Антитіла даного винаходу, чи протеїну, фрагменту чи його варіанту, що зазначені їх варіанти, можуть включати будь-яку походить від анти-ІL-12 Іg, не може бути більшою кількість безперервних амінокислотних залишків з за 40, 30, 20, 19, 18.17, 16, 15, 14, 13, 12,11. 10, 9, антитіла даного винаходу, де це число вибрано з 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, так як і 1-30 чи значення в їх групи цілих значень, які знаходяться в межах 10межах, як тут зазначено. 100% від кількості безперервних залишків з антиАмінокислоти в анти-ІL-12 антитілі даного ІL-12 антитіл. Необов'язково, підпослідовність винаходу, котрі є основними для функції, можуть неперервних амінокислот має довжину принаймні бути визначені добре відомими з рівня техніки приблизно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, методами, такими як сайт-спрямованим 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, мутагенезом чи аланін-скануючим мутагенезом 210, 220, 230, 240, 250 чи більше амінокислот, чи [напр., Ausubel, supra, Chapters 8, 15; Cunningham будь-який інтервал чи значення з них. Також, and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)]. кількість таких підпослідовностей може бути будьПодальша процедура призводить до поодиноких яким цілим числом, вибраним з групи від 1 до 20, аланінових мутацій в кожному залишку молекули. таким як, принаймні 2, 3, 4, чи 5. Одержані мутантні молекули потім перевіряються Спеціалістам у даній галузі зрозуміло, що на біологічну активність, таку як, але не обмежену даний винахід включає принаймні одне біологічно до, принаймні однієї дії нейтралізації IL-12. Сайти, активне антитіло даного винаходу. Біологічно які є критичними для зв'язування антитіла, також активні антитіла мають специфічну дію, принаймні, можуть бути виявлені структурним аналізом, таким 20%, 30%, чи 40%, та переважно, принаймні, 50%, як кристалізація, ядерний магнітний резонанс чи 60%, чи 70%, та більш переважно, принаймні, 29 81100 30 може бути приєднаний до карбоксилату жирної 80%, 90%, чи 95%-1000% активності природних кислоти чи естеру жирної кислоти, та активований (несинтетичних), ендогенних чи подібних та карбоксилат (такий як, активований Ν,Νвідомих антитіл. Методи визначення та підрахунку карбонілдиімідоазолем) на жирній кислоті чи ферментативної активності та специфічності до естері жирної кислоти може бути приєднаний до субстрату є добре відомими спеціалістам у даній гідроксильної групи на полімері. галузі. Жирні кислоти та естери жирних кислот, В іншому аспекті, винахід відноситься до придатні для модифікування антитіл винаходу антитіл людини та антиген зв'язуючих фрагментів, можуть бути насиченими чи мати одну чи більше як описано тут, які модифіковані ковалентним одиниць ненесиченості. Жирні кислоти, придатні приєднанням органічної частини. Така модифікація для модифікування антитіл винаходу, включають, може давати антитіла чи антиген зв'язуючий наприклад, n-додеканоат (С12, лаурат), nфрагмент із поліпшеними фармакокінетичними тетрадеканоат (С14, мирістат), n-октадеконоат (С18, показниками (такими як, збільшений періодом стеарат), n-еікозаноат (С20, арахідат) n-докозаноат напіврозпаду сироватки in vivo). Органічна частина (С22, бегенат), n-триаконтаноат (С30), nможе бути лінійною чи розгалуженою гідрофільною полімерною групою, групою жирної тетраконтаноат (С40), цис-D9-октадеканоат (С18, кислоти, чи групою естеру жирної кислоти. В олеат), усі цис-D5,8,11,14-еікозатетраеноати (С20, окремому випадку даного винаходу, гідрофільна арахідонат), октандіонову кислоту, полімерна група може мати молекулярну масу від тетрадекандіонову кислоту, актандіонову кислоту, приблизно 800 до приблизно 120,000Да та може докозандіонова кислота та подібні. бути поліалкановим гліколем (таким як, Придатні естери жирних кислот включають поліетиленгліколь (PEG), поліпропіленгліколь моноестери дикарбонових кислот, які мають (PEG)), вуглеводним полімером, амінокислотним лінійну чи розгалужену нижню алкильну групу. полімером чи полівінілпіролідоном, та Нижня алкильна група може мати від одного до жирнокислотна група чи естерна жирно кислотна дванадцяти, переважно, від одного до шести, група може містити від восьми до чотирнадцяти атомів вуглецю. атомів вуглецю. Модифіковані антитіла людини та антиген Модифіковані антитіла та антиген зв'язуючі зв'язуючі фрагменти можуть бути одержані з фрагменти винаходу можуть містити одну або використанням придатних методів, таких як більше органічних часток які є прямо чи непрямо реакцією з одним чи більше модифікуючих агентів. ковалентно зв'язаними з антитілом. Кожна Термін "модифікуючий агент", використовується органічна частка, зв'язана з антитілом чи антиген тут, по відношенню до придатних органічних груп зв'язуючим фрагментом винаходу може (таких як, гідрофільний полімер, жирна кислота чи незалежно бути гідрофільною полімерною групою, естер жирної кислоти) котрі мають активуючі жирнокислотною групою чи естерною групи. Термін "активуюча група" є хімічною жирнокислотною групою. Як використано тут, одиницею чи функціональною групою, котра може, термін "жирна кислота" охоплює монокарбоксильні за відповідних умов, реагувати з другою хімічною та дикарбоксильні кислоти. Термін "гідрофільна групою, утворюючи, таким чином, ковалентний полімерна група", як вжито тут, відноситься до зв'язок між модифікуючим агентом та другою органічних полімерів, котрі більш розчинні в воді хімічною групою. Наприклад, аменореактивна ніж октан. Наприклад, полілізин є більш розчинним активуюча група включає електорофільні групи у ваді ніж октан. Таким чином, антитіла, такі як, тозилат, мезилат, гало (хлоро, бромо, модифіковані ковалентним приєднанням фторо, йодо), N-гідроксисукцинімідил естери полілізину охоплені винаходом. Гідрофільні (NHS), та подібні. Активуючі групи можуть полімери, прийнятні для модифікування антитіл реагувати з тіолами, включаючи, наприклад, винаходу можуть бути лінійні чи розгалужені та малеімідин, йодоацетил, акрололіл, піридин включати, наприклад, поліалканові гліколі (такі як, дисульфіди, тиол 5-тиол-2-нітробензойної кислоти PEG, монометоксиполіетиленгліколь (mPEG), PPG (TNB-тиол) та подібні. Альдегідна функціональна та подібні), вуглеводи (такі як, декстрин, група може бути приєднана до молекули, що целюлоза, олігосахариди, полісахариди та містить амін- чи гідразид, та азидна група може подібні), поліалканові оксиди (такі як, реагувати з тривалентною фосфорною групою, поліетиленоксид, поліпропілен оксид та подібні) та утворюючи фосфоамідат чи фосфоімідний зв'язки. полівінілпіролідон. Переважно, гідрофільний Придатні способи введення груп в молекули відомі полімер, котрий модифікує антитіло винаходу має з рівня техніки [див., наприклад, Hermanson, G. Т., молекулярну вагу від приблизно 800 до приблизно Bioconjugate Techniques, Academic Press: San 150,000Да, як окрема молекулярна одиниця. Diego, CA (1996)]. Активуючі групи можуть бути Наприклад, може бути використаний PEG5000 та зв'язані безпосередньо до органічних груп (таких PEG20,000, де нижній індекс вказує на середню як, гідрофільні полімери, жирні кислоти та естери молекулярну вагу полімеру в дальтонах. жирних кислот), чи через лінкерні частки, Гідрофільна полімерна група може бути заміщена наприклад, двовалентну С1-С12 групу в якій один від одного до шести алкілів, жирнокислотною чи чи більше атомів вуглецю можуть бути заміщені на естерною жирнокислотною групами. гетероатом, такий як кисень, азот чи сірку. Гідрофільні полімери, заміщені жирними Придатні лінкерні частки включають, наприклад, кислотами чи естерами жирних кислот можуть тетраетиленгліколь, -(СН2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, бути одержані прийнятними способами. (CH2)2-NH- та -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CHНаприклад, полімер, котрий включає аміногрупу NH-. Модифікуючі агенти, які мають лінкерні 31 81100 32 шість чи більше анти-ІL-12 його антитіл, як частки можуть бути одержані, наприклад, показано тут та/або відомо з рівня техніки, котрі реагуванням моно-Вос-алкілдиамінів (таких як, представлені у вигляді композиції, суміші чи у моно-Вос-етилендиамін, моно-Вос-диаміногексан) формі, що не зустрічається в природі. Такі із жирною кислотою в присутності 1-етил-3-(3композиції включають, принаймні, композиції, що диметиламінопропил)-карбодиіміду (EDC), не зустрічаються в природі, включаючи, утворюючи амідний зв'язок між вільним аміном та принаймні, одну чи дві амінокислотні послідовності карбоксилатом жирної кислоти. Захисна група Вос анти-ІL-12 антитіла повної довжини, варіанти, може бути видалена з продукту обробленням три домени, фрагменти чи зазначені варіанти хлороцтовою кислотою (TFA), для того, щоб позбавлені Ста/або N-термінальної відкрити первинний амін, котрий може бути послідовності, вибрані з групи, що містить 70-100% приєднаний до іншого карбоксилату, як показано, від повних амінокислотних послідовностей з SEQ чи може взаємодіяти з малеїновим ангідридом, та ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 чи 8 чи зазначених, циклізацією отриманого продукту для одержання фрагментів, доменів чи їх варіантів. Переважні активованого малеїмідного похідного жирної композиції похідних анти-ІL-12 протеїнів, кислоти [див., наприклад, Thompson, et al., WO фрагментів чи варіантів, включають принаймні 92/16221, повний зміст якого повністю включено одну чи дві повної довжини, фрагмент чи варіант сюди шляхом цитування]. частини послідовності анти-ІL-12 антитіла, що Модифіковані антитіла винаходу можуть бути містить CDR, 70-100% SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, одержані взаємодією антитіла людини чи антиген чи зазначений фрагмент, домен чи їх варіант. Така зв'язуючого фрагменту з модифікуючим агентом. композиція може мати процентний склад по масі, Наприклад, органічна частка може бути приєднана об'єму, концентрації, полярності чи моляльності як до антитіла, несайт-специфічрим чином з на рідкий так і на сухий розчин, суміш. Суспензію, використанням амінорективного модифікуючого емульсію чи колоїд, як відомо з рівня техніки чи агенту, наприклад, NHS естер PEG. описано тут. Модифіковані антитіла людини чи антигенКомпозиції анти-ІL-12 антитіл даного винаходу зв'язуючі фрагменти можуть, також, бути одержані також можуть включати принаймні одну з будьвідновленням дисульфідних зв'язків (таких як, яких придатних та ефективних кількостей міжланцюгові дисульфідні зв'язки) антитіл чи композиції чи фармацевтичної композиції, що антиген-зв'язуючих фрагментів. Відновлені включає принаймні одне анти-ІL-12 антитіло в антитіла чи антиген-зв'язуючі фрагменти, потім клітині, тканині, органі, тварині чи пацієнті за можуть реагувати з тиол-реагуючим потреби в модуляції, лікуванні чи терапії, яка модифікуючим фрагментом для одержання необов'язково включає принаймні один TNFмодифікованих антитіл винаходу. Модифіковані антагоніст (такий як, яле не обмежуючи ним, TNFантитіла людини та/чи антиген-зв'язуючі антитіло, чи фрагмент, розчинний TNF-рецептор фрагменти, які містять органічні частки, котрі чи фрагмент, злитий його протеїн чи мала специфічно зв'язуються з сайтами антитіла даного молекула TNF-антагоніста), анти ревматичний винаходу, можуть бути отримані використанням засіб (такий як, метотрексат, ауранофін, придатних методів, таких як реверс ний протеолізи ауротіоглюкоза, азатіоприн, етанерсепт, золото[Fisch et al., Bioconjugate Cheent., 3: 147-153 натрію тіомалат, гадроксихлорохін сульфат, (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5: 411лефлюномід, сульфазалзин), м'язовий релаксант, 417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6 (10): 2233наркотик, нестероїдний протизапальний засіб 2241 (1997); Itoh et al., Bioarg. Chem., 24 (1): 59-68 (NSAID), анальгетик, анестетик, седативний засіб, (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56 (4): місцевий анестетик, нервово-м'язовий блокатор, 456-463 (1997)], та методами описаними в протимікробний (такий як, аміноглікозид, [Hermanson, G. Т. Bioconjugate Techniques, протигрибковий, протипаразитний, антивірусний, Academic Press: San Diego, CA (1996)]. карбапенем, цефалоспорин, фторохінолон, Похідні протеїнові композиції антиідioтипічних макроліт, пеніцилін, сульфонамід, тетрациклін, анти-IL2 IG антитіл інший антимікробний засіб), антипсоріатичний, На додаток до моноклональних чи химерних корти костероїд, анаболічний стероїд, діабетичний анти-ІL-12 антитіл, даний винахід також агент, мінеральні й харчові добавки, тироїдний спрямований на антиідіотипічні (анти-Id) антитіла, агент, вітамін, гормон пов'язаний з кальцієм, специфічні до таких антитіл винаходу. Анти-Id протидіарейний засіб, засіб проти кашлю, проти антитіла є антитілами, котрі розпізнають унікальні виразковий, послаблюючий, антикоагулянт, детермінанти звичайно пов'язані з регіоном еритропоетин (такий як епоетин альфа), фіграстим зв'язування антигену іншого антитіла. Анти-Id (такий як, G-CSF, Neupogen), саграмостим (GMможуть бути одержані імунізацією тварин того ж CSF, Leukine), імунізатор, імуноглобулін, виду та генетичного типу (такихяк, мишачі лінії) так імуносупресор, (такий як базіліксимаб, як і джерело Id-антитіл чи його регіон, який CDR. циклоспорин, даклизумаб), гормон росту, Імунізовані тварини будуть розпізнавати та замінюючі гормони ліки, модулятор рецептору відповідати на ідиотипічні детермінанти естрогену, мідріатичний, циклопедичний, імунізуючих антитіл та виробляти анти-Id антитіла. алкілуючий агент, антиметаболіт, інгібітор мітозу, Похідні протеїнові композиції анти-IL-2 IG радіо фармацевтичний засіб, антидепресант, Даний винахід також пропонує принаймні одну антиманійний агент, антипсихотичний, композицію анти-ІL-12 антитіл, котра містить антиксиолітичний, гіпнотичний, симпатомемічний принаймні одне, принаймні два, принаймні три, засоби, стимулятор, донепезіл, такрин, асматичні принаймні чотири, принаймні п'ять, принаймні 33 81100 34 Co., New York (1991); Mandell et al, Principles and ліки, бета агоніст, інгаляційний стероїд, інгібітор Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill лейкотриену, метилксантин, хромолин, епінефрин Livingstone. New York (1990); Berkow et al, eds., The чи аналог, дорназа альфа(Рulmоzуmе), цитокін чи Merck Manual, 16th edition, Merck and Co., Rahway, агоніст цитокіну. Необмежуючі приклади таких N. J., 1992; Wood et al, FEMS Microbiology цитокінінів включають, але не обмежують до, Immunology, 76: 121-134 (1991); Marrack et al, будь-який з від IL-1 до IL-23. придатні дозування є Science, 248: 705-711 (1990), зміст цих посилань добре відомини. [Див. напр., Wells et al., eds., повністю включено шляхом посилання]. Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton Суміші, композиції чи комбінації aнти-IL-12 and Lange, Stamford, CT (2000); PDR антитіл даного винаходу, також можуть включати Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia принаймні один будь-який придатний допоміжний 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma компонент, такий як, але не обмежуючись ними, Linda, CA (2000), кожен з яких повністю включено розбавник, зв'язувач, стабілізатор, буфери, солі, шляхом посилання]. ліофільні сольвенти, консерванти, ад'ювант, або Протиракові та проти інфекційні засоби подібний. можуть також включати молекули токсинів, котрі Фармацевтично придатні допоміжні агенти є пов'язані, зв'язані, разом формулюються чи разом переважними. Не обмежуючі приклади та методи приймаються з принаймні одним антитілом даного отримання таких стерильних розчинів є добре винаходу. Токсин може, необов'язково діяти, відомими, такі як, але не обмежуючись ними, селективно вбиваючи патогенні клітини чи [Gennaro, Ed., Rentington's Pharmaceutical тканини. Патогенні клітини можуть бути раковими Sciences, 18h Edition, Mack Publishing Co. (Easton, чи іншими клітинами. Такі токсини можуть бути, PA) 1990]. Фармацевтично придатні носії, які але не обмежуючись цим, очищеними чи можуть бути підібрані звичайним чином, є рекомбінантними токсинами, чи фрагментом придатними за способом вживання, розчинністю токсину, який включає принаймні один та/або стабільністю композицій aнти-IL-12 антитіл, цитотоксичний домен токсину, такий як, вибраний фрагментів чи варіантів, як добре відомо з з принаймні одного з, рицин, зміїний (тваринний) практики чи описано тут. токсин, чи бактеріальний токсин. Термін "токсин" Фармацевтичні наповнювачі та добавки також включає як ендотоксини, так і екзотоксини, корисні в даній композиції включають, але не які виробляються будь-якими природніми, обмежують до, протеїни, пептиди, амінокислоти, мутантними чи рекомбінантними бактеріями чи ліпіди та вуглеводи (такі як, цукри, включаючи вірусами, котрі можуть призводити до будь-яких моносахариди, ди-, три-, тетра- та олігосахариди; патологічних станів у людей та інших ссавців, похідні сахаридів такі як алдитоли, альдонові включаючи токсиновий шок, котрий може кислоти, естерифіковані цукри та подібні; призвести до смерті. Такі токсини можуть полісахариди та полімери цукрів), котрі можуть включати, але не обмежуючись до них, бути представлені окремо чи в комбінації, теплолабільний ентеротоксин (LT), та тепловключаючи один чи комбінацію 1-99.99% за вагою стабільний ентеротоксин (ST), ентеротоксигенної чи об'ємом. Показовий протеїновий екципієнт Е.соlі, цитотоксин Shigella, ентеротоксини включає сироватковий альбумін, такий як, Aeromonas, toxin-1 синдрому токсичного шоку сироватковий альбумін людини (HSA), (TSST-1), стафілококовий ентеротоксин A (SEA), рекомбінантний альбумін людини (rНА), желатин, enterotoxin В (SEB), чи С (SEC), стрептококові казеїн та подібні. Представником амінокислотного ентеротоксини та подібні. Такі бактерії включають, /антитіло компоненту, котрий може діяти з але не обмежуються ними, штами та види буферною здатністю, включаючи аланін, гліцин, ентеротоксигенної Е. соlі (ЕТЕС), аргінін, бетаїн, гістидин, глютамінову кислоту, ентерогеморрагічної Е. соlі (такі як, штами аспарагінову кислоту, цистеїн, лізин, лейцин, серотипу 0157:Н7), Staphylococcus species (такі як, ізолейцин, валін, метіонін, фенілаланін, аспартам, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), та подібні. Переважною амінокислотою є гліцин. Shigella species (такі як, Shigella dysenteriae, Вуглеводневі наповнювачі, придатні для Shigella flexneri, Shigella boydii, and Shigella використання у винаході включають, наприклад, sonnei), Salmonella species (такі як, Salmonella моносахариди, такі як, лактозу, сахарозу, typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella трегалозу, целобіозу, та подібні; полісахариди, такі enteritidis), Clostridium species (такі як, Clostridium як, рафінозу, мелезітозу, мальтодекстрини, perfringens, Clostridium dificile, Clostridium декстрини, крохмалі, та подібні, альдитоли, такі як, botulinum), Campylobacter species (такі як, манітол, ксилітол, малтітол, лактітол, ксилітол Campylobacter jejuni, Campylobacter fetus), сорбітолу (глюцитол) міоінозитол, та подібні. Helicobacter species, (такі як, Helicobacter pylori), Переважним вуглеводним наповнювачем для Aeromonas species (такі як, Aeromonas sobria, використання у винаході є манітол, трегалоза та Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), рафіноза. Plesiomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, Композиції анти-ІL-12 антитіл також можуть Vibrios species (e. g., Vibrios cholerae, Vibrios включати буфер чи агент, що корегує рН; parahemolyticus), Klebsiella species, Pseudomonas звичайно, буфером є сіль, одержана з органічної aeruginosa, and Streptococci. [Див., такі як, Stein, кислоти чи основи. Типовими представниками ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp.1-13, Little, буферів є солі органічних кислот, таких як солі Brown and Co., Boston, (1990); Evans et al., eds., лимонної кислоти, аскорбінової кислоти, Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and глюконової кислоти, вугільної кислоти, тартакової Control, 26. Ed., pp.239-254, Plenum Medical Book 35 81100 36 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005-1.0% алкилпарабен(и) кислоти, бурштинової кислоти, оцтової кислоти, (напр., 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, фталевої кислоти; Тріс, трометамін гідрохлорид чи 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, фосфатний буфер. Переважними буферами для 0.75, 0. 9, 1.0%), та подібне. використання в даних композиціях є солі Як було зазначено вище, винаходом органічних кислот, такі як цитрат. запропоновано виріб, який складається Також, композиції анти-ІL-12 антитіл винаходу зпакувального матеріалу та принаймні одиного можуть включати полімерні наповнювачі/добавки флакону, який містить розчин принаймні одного такі як полівінілпіролідони, фіколи (полімерні анти-ІL-12 антитіла, із певними буферами та/або цукри), декстрати (такі як, циклодекстрини, такі як консервантами, необов'язково у водному 2-гідроксипропіл-(3-циклодекстрин), розчиннику, де зазначений пакувальний матеріал поліетиленгліколі, ароматизуючи агенти, має зазначення, котре вказує на те, що цей розчин атимікробні агенти, підсоллоджувачі, може зберігатися на протязі 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, антиоксиданти, антистатичні агенти, сурфактанти 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 годин чи (такі як, полісорбати, напр., "ТВИН 20" та "ТВИН більше. 80"), ліпіди (такі як, фосфоліпіди, жирні кислоти) Винахід також включає виріб, який стероїди (напр., холестирол) та хелатоутворюючі складається з пакувального матеріалу, пешого агенти (напр., EDTA). флакону із ліофілізованим принаймні одним Ці та інші відомі фармацевтичні наповнювачі антитілом, та другого флакону із водним та/або добавки придатні для використання в розчинником з буфером чи консервантом, де композиціях анти-ІL-12 антитіл, їх частин чи зазначений пакувальний матеріал має зазначення варіантів, відповідно до винаходу є добре з інструкцією для пацієнта, як правильно відомими спеціалістам, як це описано в розчинити принаймні одне анти-ІL-12 антитіло у ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", водному розчиннику для одержання розчину, 19'h ed., Williams & Williams, (1995), and in котрий може зберігатися на протязі двадцяти the"Physician's Desk Reference", 52"d ed., Medical чотирьох годин чи більше. Economics, Montvale, NJ (1998), дані розкриття Принаймні одне анти-ІL-12 антитіло, яке повністю включено шляхом посилання]. застосовується у відповідності з даним винаходом Переважним носієм чи наповню вальним і може бути одержане методом рекомбінації, та матеріалом є вуглеводи (такі як, сахариди та включає приготування з клітин ссавців чи алдітоли) та буфери (напр., цитрат) чи полімерні трансгенні, чи може бути виділено з біологічних агенти. джерел, як описано тут чи відомо з практики. Склади Певний набір принаймні одного анти-ІL-12 Як було зазначено вище, винаходом антитіла в продукті даного винаходу може передбачуються стабільні склади, котрі переважно включати певну кількість отриману в наслідок є фосфатним буфером із сольовим розчином чи регідратації, якщо в системі вологий/сухий, розчином певної солі, так само як консервований концентрації будуть становити від приблизно розчин містить консерванти, а консервовані склади широкого призначення придатні для 1.0mg/ml до приблизно 1000mg/ml, хоча нижчі чи фармацевтичного чи ветеринарного використання, вищі концентрації є допустимими та залежними від які включають принаймні одне анти-ІL-12 антитіло призначеного носія чи засобу доставки, у фармацевтично прийнятному складі. наприклад, склади у розчині будуть відрізнятися Консервовані склади містять принаймні один від трансдермального пластиру, легеневого, відомий консервант чи, необов'язково, вибраний з трансмукозного чи осмотичного чи мікронасосного групи, яка має принаймні один фенол, m-крезол, рметоду. крезол, о-крезол, хлорокрезол, бензольний спирт, Переважно, водний розчинник необов'язково фенілртутний нітрил, феноксиетанол, може включати фармацевтично прийнятну формальдегід, хлорбутанол, магнію хлорид, кількість консерванту. Переважні консерванти (напр., гексагідрат), алкилпарабен (метил, етил, включають вибрані з групи: фенол, m-крезол, рпропил, бутил, та ін.), бензалконій хлорид, крезол, о-крезол, хлорокрезол, бензольний спирт, бензетоній хлорид, натрію дегідроацетат та алкилпарабен (метил, етил, пропил, бутил, та ін.), тримерозал, чи їхні суміші в водному розчиннику. бензалконій хлорид, бензетоній хлорид, натрію Можуть бути використані будь-які придатні дегідроацетат та тримерозал, чи їхні суміші. концентрації чи суміші, як відомо з рівня техніки, Концентрації консерванту, що використовується у такі як 0.001-5%, чи будь-який інтервал чи складах є концентраціями, достатніми для значення в ньому, такі як, але не обмежуючись досягнення антимікробного ефекту. Такі ними, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, концентрації залежать від вибраного консерванту 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, та завжди можуть бути визначені досвідченим 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, професіоналом. 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, Інші наповнювачі, наприклад, ізотонічні агенти, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, буфери, антиоксиданти, підсилювачі консервантів, 4.9 чи будь-який інтервал чи значення в ньому. Не можуть, необов'язково, бути доданими до обмежуючі приклади включають: без консервантів, розчинника. Ізотонічний агент, такий як гліцерин, є 0.1-2% m-крезол (напр., 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, загально вживаним у відомих концентраціях. 1.0%), 0.1-3% бензил алкоголь (напр., 0.5, 0.9, 1.1, Фізіологічно толерантний буфер, переважно 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001-0.5% тримерозал (напр., додається для покращення контролю рН. Склади 0.005, 0.01), 0.001-2.0% фенол (напр., 0.05, 0.25, можуть мати широкий спектр значень рН, такий як 37 81100 38 Існуючі заявлені вироби є придатними для від приблизно рН 4 до приблизно рН 10, та вживання на протязі до двадцяти чотирьох годин переважні значення від приблизно рН 5 до чи більше. Відповідно до цього, нині заявлені приблизно рН 9, та більш переважні значення від вироби, надають більше переваг для пацієнтів. приблизно рН 6.0 до приблизно рН 8.0. Переважні Склади винаходу можуть, необов'язково, надійно склади даного винаходу мають значення рН від зберігатися при температурах від приблизно 2° до приблизно рН 6.8 до приблизно рН 7.8. Переважні приблизно 40°С та зберігати біологічні властивості буфери включають фосфатні буфери, біль протеїну на протязі тривалого періоду часу, переважно фосфат натрію, закрема забуферений дозволяючи таким чином, зазначення на етикетці сольовий розчин (PBS). упаковки, що розчин може зберігатися та/або Інші добавки, такі як фармацевтично прийнятні використовуватися через 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, солюбілізатори, як Твин 20 (поліоксиетилен (20) чи 96 годин чи більше. Якщо використовується сорбітан монолаурат), Твин 40 (поліоксиетилен консервований розчинник, таке зазначення може (20) сорбітан монолаурат), Твин 80 містити термін використання до 1-12 місяців, (поліоксиетилен (20) сорбітан монолаурат), півроку, півтора року, та/або два роки. Pluronic F68 (блок сополімери поліоксиетилен Розчин принаймні одного анти-ІL-12 антитіла полаоксипропілен) та PEG (поліетиленгліколь) чи винаходу може бути виготовлений способом, який неіонні сурфактанти, такі як полісорбати 20 чи 80, включає змішування принаймні одного антитіла у чи poloxamer184 чи 188 PluronicÒ поліли, інші блок водному розчиннику. Змішування проводиться за сополімери та хелатори, такі як EDTA та EGTA, допомогою загальноприйнятих методик необов'язково можуть бути додані до складів чи розчинення та змішування. Для виготовлення композицій для зменшення агрегації. Ці добавки, придатного розчиннику, наприклад, відміряна зокрема, є корисними, якщо для введення складу кількість, принаймні одного антитіла у воді чи використовується пластиковий контейнер си буфері з'єднується в кількості достатній для помпа. Присутність фармацевтично прийнятного одержання протеїну та, необов'язково, сурфактанту знижує схильність протеїну до консерванту чи буферу в бажаних концентраціях. агрегації. Варіанти цього процесу є зрозумілими звичайному Склад за даним винаходом може бути спеціалісту в даній галузі. Наприклад, для виготовлений у спосіб, котрий включає змішування додавання компонентів, при використанні принаймні одного анти-ІL-12 антитіла та додаткових добавок, потрібно створити відповідні консерванту вибраного з групи: фенол, m-крезол, температурні умови та рН, а також оптимізувати р-крезол, о-крезол, хлорокрезол, бензольний усі фактори для концентрації та способу спирт, алкилпарабен (метил, етил, пропил, бутил, приймання. та ін.), бензалконій хлорид, бензетоній хлорид, Заявлений продукт може бути приготований натрію дегідроацетат та тримерозал, чи їхні суміші для пацієнтів як готовий розчин чи як в водному розчиннику. Змішування принаймні двофлаконовий із флаконом ліофілізованого, одного анти-ІL-12 антитіла та консерванту в принаймні одного, анти-ІL-12 антитіла, котре водному розчиннику проводиться з використанням розводиться другим флаконом, котрий містить загальноприйнятих методів розчинення та воду, консервант та/або наповнювач, переважно змішування. Для виготовлення прийнятного фосфатний буфер та або сольовий розчин та складу, наприклад, відміряну кількість принаймні вибрану сіль, у водному розчиннику. І флакон з одного анти-ІL-12 антитіла в буферному розчині одним розчином, і двофлаконовий набір, що комбінують із бажаним консервантом в буферному потребує розведення, можуть бути використані розчині в кількості достатній для одержання повторно багато разів та можуть задовольнити протеїну та консерванту в бажаних концентраціях. пацієнтів при одно- чи багатоциклічному лікуванні Варіації цього процесу є зрозумілими для будьі, таким чином, може бути застосований більш кого кваліфікованого спеціаліста в даній галузі. зручний режим лікування ніж доступні тепер. Наприклад, для додавання компонентів, при Заявлений продукт може бути виготовлений використанні додаткових добавок, потрібно не безпосередньо для пацієнтів, а через створити відповідні температурні умови та рН, а виготовлення для аптек, клінік чи інших подібних також оптимізувати усі фактори для концентрації установ та закладів, у вигляді готового розчину чи та способу приймання. як двофлаконовий із флаконом ліофілізованого, Заявлений склад може бути приготований для принаймні одного, анти-ІL-12 антитіла, котре пацієнтів як готовий розчин чи як двофлаконовий розводиться другим флаконом, котрий містить із флаконом ліофілізованого, принаймні одного, водний розчинник. Готовий розчин в даному анти-ІL-12 антитіла, котре розводиться другим випадку може бути до одного літра чи більшого флаконом, котрий містить воду, консервант та/або розміру, з такого великого резервуару менші порції наповнювач, переважно фосфатний буфер та або розчину принаймні одного антитіла можуть бути сольовий розчин та вибрану сіль, у водному одержані одноразово чи багаторазово для розчиннику. І флакон з одним розчином, і перенесення їх у менші флакони та запропоновані двофлаконовий, що потребує розведення, можуть аптеками чи клініками для своїх покупців та/або бути використані повторно багато разів та можуть пацієнтів. задовольнити пацієнтів на одно чи багато циклічне Загально прийнятними пристроями, лікування, і таким чином може бути застосований включаючи однофлаконові системи та більш зручний режим лікування, ніж доступні пенін'єкторні пристрої для доставки розчину, такі тепер. як, BD Pens, BD AutojectorÒ, HumajectÒ, 39 81100 40 Принаймні одне анти-ІL-12 антитіло як в NovoPenÒ, B-DÒPen, AutoPenÒ, and OptiPenÒ, стабільному так і в консервованому складах чи GenotropinPenÒ, Genotronorm PenÒ, Humatro розчинах, як описано тут, можуть вживатися PenÒ, Reco-PenÒ, Roferon PenÒ, BiojectorÒ, пацієнтами, у відповідності з даним винаходом ijectÒ, J-tipÒ, Needle-Free InjectorÒ, IntrajectÒ, різними способами даставки, включаючи SC чи IМ Medi-JectÒ, напр., як виготовлені чи розроблені ін'єкції; трансдермальний, легеневий, Becton Dickensen [Franklin takes, NJ, трансмукозний способи, імплантат, осмотичний www.bectondickenson.com], Disetronic [Burgdorf, насос, картридж, мікро насос чи інший спосіб, Switzerland, www.disetronic.com], Bioject, Portland, названий спеціалістом у даній галузі, як добре Oregon [www.bioject.com]; National Medical відомий у практиці. Products, Weston Medical [Peterborough, UK, Терапевтичні Застосування www.weston-medical.com], Medi-Ject Corp Даний винахід також пропонує спосіб для [Minneapolis, MN, www.mediject.com]. Загально модуляції чи лікування принаймні одного імунного прийнятними пристроями двофлаконових систем, захворювання клітини, тканини, органу, тварини чи включаючи пенін'єкторні пристрої для розведення пацієнта, включаючи, але не обмежуючись, ліофілізованих ліків в картриджі для доставки принаймні один з: ревматоїдний артрит, розведеного розчину є такий як HumatroPenÒ. підлітковий ревматоїдний артрит, системний прояв Продукти, заявлені тут, включають підліткового ревматоїдного артриту, псоріатичний пакувальний матеріал. Пакувальний матеріал артрит, анкілозний спондиліт, виразка шлунку, надає, на додачу до інформації, що вимагається серонегативна артропатія, остеоартрит, запальні дозволяючими органами, умови, за яких продукт кишкові хвороби, виразкові коліти, системна може застосовуватись. Пакувальний матеріал ериматозна вовчанка, антифосфоліпідний даного винаходу надає інструкціє пацієнтам по синдром, іридоцикліт/уреїт/очний неврит, розведенню принаймні одного анти-ІL-12 антитіла ідіопатичний легеневий фіброз, системний у водному розчиннику для утворення розчину, та васкуліт/грануломатоз Вегнера, саркоїдоз, використанню розчину на протязі 2-24 годин чи орхіт/процедури повної вазектомії, більше для двох флаконів сухого/рідкого продукту. алергічні/атопічні захворювання, астма, алергічний Для одного флаконового розчину продукт може риніт, екзема, алергічний контактний дерматит, містити зазначення, що такий розчин може бути алергічний конюктивіт, гіперчетливий пневмоніт, використаний на протязі 2-24 годин чи більше. трансплантації, відторгнення трансплантованих Заявлені тут продукти є придатними для органів, захворювання "трансплантат проти фармацевтичних продуктів для людей. хазяїна", синдром системної запальної відповіді, Склади даного винаходу можуть бути синдром сепсису, грам-позитивний сепсис, грамвиготовлені способом, котрий включає змішування негативний сепсис, сепсис негативний до принаймні одного анти-IL-12 антитіла з вибраним культури, грибковий сепсис, нейропенічна буфером, переважно фосфатним буфером, що лихоманка, уросепсис, менінгококкемія, містить сольвий розчин чи вибрану сіль. травма/геморрагія, опіки, опромінення іонізуючою Змішування принаймні одного антитіла та буфера радіацією, гострий панкреатит, синдром дихальної у водному розчиннику проводиться загально недостатності дорослих, ревматоїдний артрит, прийнятими мотодами розчинення чи змішування. гепатит спричинений алкоголем, хронічні запальні Для приготування прийнятного складу, наприклад, патології, саркоідози, патологія Крона, серпововідміряну кількість принаймні одного антитіла у клітинна анемія, діабет, нефроз, атопічні воді чи буфері комбінують із бажаним буферним захворювання, реакції гіперчутливості, алергічні агентом у воді в концентраціях, достатніх для риніти, сінна лихоманка, затяжний риніт, одержання протеїну та буферу в бажаних кон'юнктивіт, ендометріоз, астма, кропивниця, концентраціях. Варіації цього процесу мають бути системна анафілаксія, дерматит, злоякісна анемія, зрозумілі будь-кому середньому спеціалісту у гемолітичні захворювання, тромбоцитопенія, даній галузі. Наприклад, для додавання відторгнення трансплантатом ореану чи тканини, компонентів, при використанні додаткових відторгнення транпоантованої нирки, відторгнення добавок, потрібно створити відповідні транплантованоого серця, відторгнення температурні умови та рН, а також оптимізувати трансплантованої печінки, відторгнення усі фактори для концентрації та способу трансплантованої підшлункової залози, приймання. відторгнення трансплантованої легені, Заявлені стабільні чи консервовані склади відторгнення трансплантованого кісткового мозку можуть бути надані пацієнтам як готові розчини чи (ВМТ), відторгнення алотрансплантату шкіри, як двофлаконові препарати, із флаконом відторгнення трансплантованого хряща, ліофілізованого, принаймні одного, анти-ІL-12 відторгнення трансплантованої кістки, антитіла, котре розводиться другим флаконом, відторгнення трансплантованого тонкого котрий містить консервант чи буфер і наповнювач кишківнику, відторгнення вживленого у водному розчиннику. І флакон з одним розчином, ембріонального тимусу, відторгнення і двофлаконовий препарат, що потребує трансплантованої пара щитовидної залози, розведення, можуть бути використані повторно відторгнення ксенотрансплантату будь-якого багато разів та можуть задовольнити пацієнтів при органу чи тканини, відторгнення одно- чи багатоциклічному лікуванні і таким чином, алотрансплантатів, реакції анти рецепторної може бути застосований більш зручний режим гіперчутливості, хвороба Грейва, хвороба Рейнода лікування ніж доступні тепер. (віброхвороба), інсулін-резистентний діабет типу 41 81100 42 кортикостероїд, анаболічний стероїд, діабетичні В, астма, злоякісна міастенія, сито токсичність агенти, мінерали, харчові добавки, тифоїдні опосередкована антитілами, реакції агенти, вітаміни, гормон пов'язаний з кальцієм, гіперчутливостит типу III, системна ериматозна протидіарейний, протикашльовий, протинудотний, вовчанка, POEMS синдром (поліневропатія, противиразковий, послаблюючий, антикоагулянт, органомегалія, ендокринопатія, моноклональні еритропоетин (напр., епоетин альфа), філграстим грамопатія, та синдром змін в шкірі), (напр., G-CSF, Neupogen), саргамостим (GM-CSF, поліневропатія, органомегалія, ендокринопатія, лейкин), імунізатор, імуноглобулін, імуносупресор моноклональні грамопатія, та синдром змін в шкірі, (напр., базиліксимаб, циклоспорин, даклізумаб), антифосфоліпідний синдром, пемфігус, гормон росту, гормонозамісний препарат, склеродерма, змішане захворювання сполучної модулятор рецептору естрогену, мідріатичний, тканини, ідіопатична хвороба Аддісона, цукровий мідріатичний, алкілуючий агент, антиметаболіт, діабет, хронічний активний гепатит, первинний мітотичний інгібітор, радіопрепарати, міліарний цироз, вітіліго, васкуліт, синдром пост-ІМ антидепресант, антиманійний агент, кардіотомії, гіперчутливість IV типу, контактний антипсихотичний, нейролептик, гіпнотичний, дерматит, пневмоніт гіперчутливості, відторгнення симпатоміметик, стимулятор, донепезіл, такрин, алотрансплантату, грануллома спричинена асматичні препарати, бета антагоністи, інгаляторні внутрішньоклітинними організмами, чутливість до ліки, інгібітор лейкотриену, метилксантин, ліків, метаболічний/ідіопатичний, хворобі Вілсона, хромолін, епінефрин чи аналог, дорназа альфа гемахроматоз, недостатність альфа-1(Pulmozyme), цитокін чи антагоніст цитокіну. антитрипсину, діабетична ретинопатія, тироїдит Прийнятні дозування добре відомі спеціалістам. Хашимото, остеопороз, оцінка гіпоталамо[Див. наприклад, Wells et al., eds., Pharmacotherapy гіпофізарно-адренальнальної вісі, первинний Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, міліарний цироз, тироїдит, енцефаломієліт, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon кахексія, цистичний фіброз, хронічне Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, захворювання легенів новонароджених, хронічне Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), кожне обструктивне захворювання легенів (COPD), з цих посилань повністю включено шляхом спадковий гематофогоцитний лімфогістіцистоз, посилання]. дерматологічні стани, псоріаз, алопеція, TNF-антагоністи придатні для композицій, нефротичний синдром, нефрит, гломерулярний комбінації терапевтичних пристроїв та/або нефрит, гостра ниркова недостатність, гемодіаліз, способів даного винаходу (також включає уремія, токсичність, прееклампсія, оkt3 терапія, принаймні одне антитіло даного винаходу, анти-сd3 терапія, цитокінінова терапія, зазначену частину, чи його варіант), включаючи, хіміотерапія, радіаційна терапія (напр., включає, але не обмежуючись, анти-TNF антитіла, TNF-TNF але не обмежується, тоастенія, анемія, кахексія, антитіла, антиген-звязуючі його фрагменти, та та подібні), хронічні отруєння саліцилатами, та рецепторні молекули, котрі специфічно подібні. [Див., наприклад, Merck Manual, 12th-17th зв'язуються з TNF; сполуки, котрі попереджують Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, та/або інгібують синтез TNF, вивільнення TNF чи 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy його дію на клітини-мішені, такі як талідомід, Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, тенідап, інгібітори фосфодіестирази (напр., Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000), пентоксифілін та роліпрам), А2b антагоніст всі повністю включено шляхом посидання]. аденозинового рецептора та A2b підсилювач Даний винахід також пропонує спосіб аденозинового рецептора; сполуки, котрі модуляції чи лікування принаймні одного попереджують та/або інгібують сигналювання TNFкардіоваскулярного захворювання в клітині, рецептора, такі як інгібітори кінази протеїну тканині, органі, тварині чи пацієнті, включаючи але активованого мітогеном (МАР); сполуки, що не обмежуючи до, блокують та/або інгібують мембранне Втрачено при публікації розщеплення TNF, такі як, інгібітори Втрачено при публікації металопротеїнази; сполуки, що блокують та/або одночасно та/або після, принаймні одного інгібують TNF-дію, такі як, інгібітори ферменту вибраного з принаймні одного TNF-антагоніста, конвертуючого ангіотензин (напр., каптоприл); (напр., але не обмежуючи до, TNF-антитіла чи сполуки, що блокують та/або інгібують синтез фрагмента, розчинного TNF-рецептора чи та/або вироблення TNF, такі як інгібітори МАРфрагмента, їхніх злитих протеїнів, чи малих кінази. молекул TNF-антагоніста), анти ревматичного Як використано тут, "антитіла фактору некрозу (напр., метотрексат, ауронафін, ауротіоглюкоза, пухлини", "антитіла TNF" "антитіла TNF" чи азатіопрін, етанерсепт, тіомалат натрію золота, фрагменти та подібні знижують, блокують, сульфат гідроксихлорохінону, лефлюномід інгібують анулюють чи перешкоджають активності сульфазалзіну) мязевий релаксант, наркотик, TNF in vitro, in situ та/або in vivo. Наприклад, нестероїдні протизапальні ліки (NSAID), придатні TNF-антитіла людини даного винаходу анальгетик, анестетик, седативні ліки, місцевий анестетик, нейромязевий блокатор, протимікробні можуть зв'язувати TNFa, включаючи анти-TNF (напр., аміноглікозид, протигрибковій, антитіла, антиген-звязуючі їх фрагменти, та протипаразитний, противірусний препарати, зазначені їх мутанти чи домени, котрі специфічно карбапенем, цефалоспорин, фторхінон, макроліт, зв'язуються з TNFa. Придатні TNF-антитіла чи їх пеніцилін, сульфонамід, тетрациклін, інший фрагменти здатні також знижувати блоккування, протимікробний засіб), протипсоріатик, інгібування, анулювання чи перешкоджання 43 81100 44 and Loetscher et al., Cell 61 : 351-359 (1990), ці синтезу RNA, DNA чи протеїну TNF, вивільнення посилання повністю включено сюди шляхом TNF, сигналювання рецептора TNF, мембранного посилання], та не обов'язково мають низьку розщеплення TNF, активності TNF, вироблення імуногенність. Зокрема, 55kDa (p55 TNF-R) та та/або синтезу TNF. 75kDa (p75 TNF-R) клітинні поверхневі рецептори Химерні антитіла сА2 складаються з антигенTNF є корисними в даному винаході. Вкорочені зв'язуючого варіабельного регіону високоафінного форми цих рецепторів, які містять мишачого антитіла до TNFa IgG І людини, зовнішньоклітинні домени (ECD) цих рецепторів чи зазначеного як А2, та константного регіону IgG I, їх функціональні частини [див. напр., Corcoran et каппа імуноглобуліну. Регіон Fc IgG I людини al., Eur. J. Biochem. 223: 831-840 (1994)], є також надає галогенним антитілам ефекторну функцію, придатними для даного винаходу. Вкорочені збільшує півперіод циркуляції сироватки та знижує форми TNF-рецепторів, які містять ECD, були імуногенність антитіл. Авидність та епітопна знайдені в сечі та сироватці та ідентифіковані, як специфічність химерного антитіла сА2 походить 30kDa та 40kDa інгібіторні протеїни зв'язування від варіабельного регіону мишачого антитіла А2. В TNF [Engelmann, Η. et al., J. Biol. C/aem. 265: 1531окремому виконанні, перевожним джерелом 1536 (1990)]. Мультимерні молекули TNFнуклеїнових кислот, що кодують варіабельний рецепторів та злиті молекули TNFрегіон мишачого антитіла А2 є клітинна лінія імунорецептора, та їх похідні, фрагменти чи гібридоми А2. частини є додатковими прикладами TNFХимерні А2 (сА2) нейтралізують цитотоксичну рецепторних молекул, котрі є придатними для дію природніх та рекомбінантних TNFa людини в методів та композицій даного винаходу. Молекули залежності від дозування. При аналізуванні TNF-рецептора, котрі можу використовуватися у зв'язування антитіл А2 та рекомбінантного TNFa винаході, характеризуються їхньою здатністю людини, константа афінності була визначена лікувати пацієнтів на протязі тривалого періоду із рівною 1.04х1010М-1. Переважні методи від доброго до відмінного полегшення симптомів визначення специфічності моноклональних та низькою токсичністю. Низька імуногенність антитіл та афінності конкурентним інгібуванням та/або висока афінність, так само як інші можуть бути знайдені в [Harlow, et al., антиbodies: невизначені властивості, можуть робити внесок в A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory досягнення терапевтичних результатів. Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan Мультимерні молекули TNF-рецептора корисні et al., eds., Current Protocols in Imnzunology, Greene для даного винаходу включають всю чи Publishing Assoc. and Wiley Interscience, New York, функціональну частину ECD чи ще TNF-рецептори (1992-2000); Kozboretal., Immunol. Today, 4: 72-79 одним чи більше поліпептидними лінкерами чи (1983); Ausubel et al., eds. Current Protocols in іншими неполіпептидними лінкерами, такими як Molecular Biology, Wiley Interscience, New York поліетиленгліколь (PEG). Мультимерні молекули (1987-2000); and Muller, Meth. Erazymol., 92: 589також можуть містити сигнальний пептид 601 (1983), ці посилання повністю включено сюди декретованого протеїну для спрямування експресії шляхом посилання]. мультимерної молекули. Ці мультимерні молекули В окремому втіленні, моноклональні мишачі та способи їх одержання були описані в антитіла А2 вироблялися клітинною лінією, [U.S.Patent Application No.08/437,533 (filed May 9, позначеною як с134А. Химерні антитіла сА2 1995), зміст посилання повністю включено сюди вироблялися клітинною лінією, позначеною як через посилання]. с168А. Злиті молекули TNF-імунорецептора корисні Додаткові приклади моноклональних анти-TNF для методів і складів даного винаходу, охоплюють антитіл, котрі можуть бути використані в даному як мінімум одну частину одієї або більше молекул прикладі описані в спеціальній літературі [див. імуноглобуліну та всю або функціональну частину напр., U.S.Patent No. 5,231,024; Moller, A. et al., одого або більше рецепторів TNF. Ці злиті Cytokine 2 (3): 162-169 (1990); U.S.Patent молекули імунорецептора можуть збиратися як Application No.07/943,852 (filed September 11, мономери, або гетеро- або гомо-мультимери. 1992); Rathjen et al., International Publication Злиті молекули імунорецептора можуть також бути NO.WO91/02078 (published February 21,1991); моно валентні або мультивалентні. Приклад такої Rubin et al., ЕРО Patent Publication No.0218868 злитої молекули TNF-імунорецептора - це злитий (published April 22, 1987); Yone et al., ЕРО Patent протеїн TNF-receptor/lgG. Злиті молекули TNFPublication No.0288088 (October 26,1988) Liang, et імунорецептора і методи для їх одержання були al., Biochem.Biopphys.Res.Comm. 137:847-854 описані в літературі [Lesslauer et al., Eur. J. IR*tZ (1986); Meager, et al., Hybridoma 6:305-311 (1987); 101. 21: 2883-2886 (1991); Ashkenazi et al., Proc. Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (19S7); Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539 (1991); Peppel Bringman, et al., Hybridoma 6:489-507 (1987); and et al., J. E, rp. Med. 174: 1483-1489 (1991); Kolls et Hirai, et al., J.Immunol. Meth. 96:57-62 (1987), ці al., Proc. iVcltl., Ictzcl. Sci. С SA 91: 215-219 (1994); посилання повністю включено сюди шляхом Butler etal., Cytokine 6(6): 616623 (1994); Baker посилання]. etal., eur. J. Immunol. 24: 2040-2048 (1994); Beutler Молекули рецептора TNF et al., U. S. Patent No. 5,447,851; and U. S. Переважними молекулами рецептора TNF Application No. 08/442, 133 (filed May 16, 1995), данного винаходу є такі, котрі зв'язують TNF з кожне з цих посилань повністю включено тут через високою афінністю [див. напр., Feldmann et al., посилання]. Методи одержання злитиз молекул International Publication No. WO 92/07076 (published імунорецептора можуть бути також знайдені в April 30, 1992); Schall et al., Cell 61 : 361-370 (1990); 45 81100 46 протигрибковий засіб, антипаразитичний, [Capon et al., U. S. Patent No. 5,116,964; Capon et противірусний, карбапенем, цефалоспорин, al., U. S. Patent No. 5,225,538; and Capon et al., фторохінолон, макролід, пеніцилін, сульфонамід, Nature 337: 525-531 (1989), це посиланння тетрациклін, інший антимікробний засіб), повністю включено тут через посилання]. антипсоріатичний засіб, кортикостероїд, Функціональний еквівалент, похідне, фрагмент анаболічний стероїд, агент пов'язаний з діабетом, або регіон молекули рецептора TNF відноситься мінерал, харчова добавка, тироїдний агент, до частини молекули рецептора TNF, або частини вітамін, гормон пов'язаний з кальцієм, послідовності молекули рецептора TNF, яка кодує притилиарейний, притикашльвий, антиблювотне, молекулу рецептора TNF, яка має достатній противиразковий засіб, послаблюючий засіб, розмір і послідовності, щоб функціонально мати антикоагулятн, еритропеотин (напр., епоетин схожість до молекул рецептора TNF, які можуть альфа), філграстим (напр. G-CSF, Neupogen), використовуватися в даному винаході (напр., сарграмостим (GM-CSF, лейкін), імунізатор, зв'язувати TNF з високою афінністю та мати імуноглобулін, імуносупресант (напр., низьку імуногенність). Функціональний еквівалент базілікксимаб, циклоспорин, даклізумаб), гормон молекули рецептора TNF також включає росту, ліки заміни гормону, модулятор рецептора модифіковані молекули рецептора TNF, які естрогену, мідриатичний засіб, циклоплегік, функціонально схожі до молекул рецептора TNF, аклілуючий агент, антиметаболіт, мітотичний які можуть використовуватися в даному винаході інгібітор, радіо фармацевтичний засіб, (напр., зв'язувати TNF з високою афінністю та антидепресант, антиманійний агент, мати низьку імуногенність). Наприклад, антипсихотичний, транквілізатор, снодійний засіб, функціональний еквівалент молекули рецептора симпатоммемічний засіб, стимулято, донепезіл, TNF може містити "мовчазний" кодон або одну або такрин, засіб для лікування астми, бета агоніст, більше замін амінокислот, делецій або доповнень вдихальний стероїд, інгібітор лейкотрену, (e. g., заміна однієї кислотної амінокислоти на іншу метилксантин, хромолін, епінефрин або аналог, з кислотну амінокислоту; або заміна одного дорназа альфа (Pulmozyme), цитокінін або кодону, що кодує гідрофобну амінокислоту на антагоніст цитокініну. такий же чи інший кодон, що кодує гідрофобну Звичайно, лікування патологічних станів амінокислоту). [Див. Ausubel et al., Current проводиться за допомогою застосування Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing ефективної кількості або дози як мінімум однієї Assoc. and, Wiley-lnterscience, New York (1987композиції анти-ІL-12 антитіла, що повністю, в 2000)]. середньому, чи проміжок з як мінімум приблизно Цитокініни включають будь-який відомий 0.01 до 500 міліграмів, принаймні одого анти-ІL-12 цитокінін. Див. напр., www.CopewithCvtokines.com. антитіла /кілограм хворого на дозу, і переважно від Антагоністи цитокініну включають, але не як мінімум близько 0.1 до 100 міліграмів, антитіла обмежують цими, будь-яке антитіло, фрагмент або /кілограм хворого на одне чи багаторазове міметик, будь-який розчинний рецептор, фрагмент вживання, залежно від специфічності дії, яка або міметик, будь-який малу молекулу антагоніста, міститься в складі. Альтернативно, ефективна або будь-яку їхню комбінацію. концентрація сироватки може становити 0.1Терапевтичні Лікування. Будь-який метод даного винаходу може охоплювати метод 5000mg/ml сироватки, за одноразове або тікування розладу опосередкованого IL-12, багаторазове застосування. Прийнятні дозування включаючи застосування ефективної кількості відомі медичним практикуючим фахівцям і буде, композиції або фармацевтичного композиції, що звичайно, залежати від специфіки стану хвороби, включає як мінімум одне антитіло анти-ІL-12 до специфічності активності застосовуваної клітини, тканини, органу, тварини або хворого за композиції, і специфіки перебігу лікування. В потреби такої модуляції, лікування або терапії. деяких прикладах, для досягнення бажаної Такий метод може необов'язково включати терапевтичної кількості, може бути необхідно охоплюють одночасне застосування або запровадити багаторазове вживання, напр., комбінаційну терапію для лікування таких імунних повторювані індивідуальні вживання хвороб, там, де застосування зазначеного як контрольованої або відміряної дози, де мінімум одного антитіла анти-ІL-12, його індивідуальні вживання повторюються, поки зазначеної частини або варіанту, також охоплює бажана щоденна доза або результат не буде застосування, перед, одночасно, та/або після, як досягнута. мінімум одного вибраного з антагоніста (напр., але Переважні можуть необов'язково включати не обмежено цим, антитіло TNF або фрагмент, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, розчинний рецептор TNF або фрагмент, їх 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, злитими протеїнами, або малою молекулою 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, антагоніста TNF), антиревматик (е. g., 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46. 47, 48, 49, метотрексат, ауранофін, ауротіоглюкоза, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, азатіопірин, етенерсепт, ауротіомалат натрію, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76. 77, 78, сульфат гідроксихлорохінону, леффлюномід, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, сульфазалзін), мязевий релаксант, наркотик, не 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 та/або 100стероїдні протизапальні ліки, болезаспокійливий 500mg/kg/застосування, чи будь-який проміжок, засіб, анестезуючий засіб, заспокійливий засіб, значення чи його частина, чи до досягнення місцевий анестетик, нейромязевий блокатор, концентрації сироватки 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, антимікробний засіб (напр., аміноглікозид, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 47 81100 48 ізотонічність (напр., хлорид натрію, маннітол) і 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, хімічну стабільність (напр., буфери і консерванти). 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 12, 12.5, 12.9, Склади стерилізовані відомими або придатними 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, методами. 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, Придатні фармацевтичні носії, описані в 10.9, 11, 11.5, 11.9, 12, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, останньому виданні, [Remington's Pharmaceutical 14, 14.5, 15, 15.5, 15.9, 16, 16.5, 16.9, 17, 17.5, 17.9, Sciences, A. Osol, стандартний текст посилання в 18, 18.5, 18.9, 19, 19.5, 19.9, 20, 20.5, 20.9, 21, 22, цьому полі]. 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, Альтернативне Застосування 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, Багато відомих і тих що розробляються 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, методів може що використовується згідно даного 3500, 4000, 4500, та/або 5000m/ml концентрація винаходу для застосування фармацевтично сироватки за єдине або багаторазове ефективних кількостей як мінімум одного анти-ІLзастосування, або будь-який проміжок, значення 12 антитіла, згідно даного винаходу. Тоді як або його частину. легеневе вживання приводилося в даному описі, Альтернативно, дозування вживання може інші методи вживання можуть бути використувані зміватися, залежно від відомих чинників, як згідно даного винаходу з прийнятними наприклад особливості фармакодинаміки результатами. специфічного агенту, і його способу та шляху Антитіла IL-12 даного винаходу можуть застосування; віку, здоров'я, і ваги одержувача; представлені в носії, як розчин, емульсія, колоїд, природи і тривалості симптомів, виду сумісного або суспензія, або як сухий порошок, з лікування, частоти застосування, та бажаного використанням будь-яких з різноманітних результату. Звичайно дозування активного пристроїв і методів, придатних для інгаляторного інгредієнта може становити від близько 0.1 до 100 застосування або іншими методами, описаними міліграмів на кілограм ваги тіла. Звичайно 0.1-50, і тут або відомими в практиці. переважно 0.1-10 міліграмів на кілограм за Парентеральні Склади і Застосування застосування або в формі повільного вивільнення, Склади для парентерального застосування є ефективним, для отримання бажаних можуть містити, як звичайннаповнювач стерильну результатів. воду або сольовий розчин, поліалкильні гліколі, як Як необмежуючий приклад, лікування людини наприклад поліетиленгліколь, олії рослинного або тварини може проведене як одноразове або походження, гідрогенований нафталін і подібні. періодичне дозування принаймні одного антитіла Водні або масляні суспензії для ін'єкцій можуть даного винаходу 0.1-100mg/kg, як наприклад 0.5, виготовлені, використовуючи відповідний 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, емульгатор або зволожувач і суспензійний агент, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, згідно відомих методів. Агенти для ін'єкції можуть 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 або 100mg/kg, бути нетоксичними, не для орального прийому за день, принаймні одне з на день 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, розбавлювач, як наприклад водні розчини або 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ін'єкційний стерильний розчин або суспензія в 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, розчиннику. Як придатний до вживання носій або 37, 38, 39, або 40, або альтернативно або розчинник можуть бути використані, вода, розчин додатково, принаймні одне з на тиждень 1, 2, 3, 4, Рінгера, ізотонічний сольовий розчин, і т.п. 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, дозволений; як звичайний носій, або суспензійний 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, розчинник може використовуватися стерильне 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, нелетке масло. Для цих цілей може що 49, 50, 51, або 52, або альтернативно або використовується, будь-який вид нелеткого масла додатково, принаймні одне з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, і жирної кислоти, включаючи природні або 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, або 20 років, синтетичні або напівсинтетичні жирні масла або або будь-якої комбінації цього, використовуючи жирні кислоти; природні або синтетичні або одноразове вливання або повторювані дози. напівсинтетичні моно- або ди- або тригліцериди. Форми (композиції) дозування, відповідні для Парентеральне застосування, є відомим в внутрішнього вживання, загалом містять від практиці, і включає, але не обмежує, звичайний близько 0.1 міліграмів до близько 500 міліграмів засіб для ін'єкцій, безголковий пристрій для ін'єкції активного інгредієнта на одиницю або контейнер. стислого газу як описано в [U.S.Pat.No.5,851,198], В цих фармацевтичних комподиціях активний та лазерний перфоруючий пристрій як описано в інгредієнт звичайно присутній в кількості близько [U.S.Pat.No.5,839,446 повністю включений тут 0.5-99.999% маcи, від загальної ваги складу. посиланням]. Для парентерального вдивання, антитіло може Альтернативне Доставления бути у вигляді розчину, суспензії, емульсії або Винахід крім того стосується вживання як ліофілізованого порошку в поєднанні, або окремо мінімум одного антитіла анти-ІL-12 парентерально, поданим, з прийнятним фармацевтичним підшкірно, внутрішньом'язево, внутрішньовенно, парентеральним носієм. Приклади такого внутрішньосуглобово, внутрішньобронхіально, транспорту - це - вода, сольовий розчин, розчин внутрішньоочеревинно, intracapsular Зінгера, розчин глюкози, і 1-10%-на сироватка внутрішньосуглобово, внутрішньохрящово. альбуміну людини. Ліпосоми і неводний носій, як внутрішньопорожнинно, внутрішньоцеліарно, наприклад нелеткі олії також можуть внутрішньоцеребрально, використовуватися. Носій або ліофілізований внутрішньоцеребровентрикулярно, порошок може містити добавки, які підтримують 49 81100 50 аерозолі. Такі аерозолі можуть включати або внутрішньоободочно, внутрішньоцервікально, розчини (як водний, так і не водний) або тверді внутрішньошлунково, внутрішньопечінково, частки. Міряні інгаляторні дозатори подібно внутрішньоміокардіально, внутрішньокістково, мірному інгалятору дозатору Ventolins, звичайно внутрішньотазово, внутрішньоперікардіально, використовують рушійний газ і вимагають внутрішньоперіотонально, внутрішньоплеврально, приведення в дію за допомогою вдиху [див. напр., внутрішньопростатно, внутрішньолегенево, WO 94/16970, WO 98/35888]. Сухі інгалятори пудри внутрішньоректально, внутрішньонирково, внутрішньосітківково, внутрішньоспінально, подібні до TurbuhalerÔ (Astra), RotahalerÒ (Glaxo), внутрішньосиновіально, внутрішньоторакально, DiskusÒ (Glaxo), Spiros®inhaler (Dura), пристрої, внутрішньоутробно, внутрішньоміхурово, за що продаються, Inhale Therapeutics, і SpinhalerÒ допомогою болюса, вагінально, ректально, інгалятор пудри (Fisons) котрий приводиться в дію буккально, підязиково, інтраназально, або вдиханням змішаної пудри [US 4668218 Astra, ЕР трансдермальні засоби. Як мінімум один склад 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 антитіла анти-ІL-12 може призначений для Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, використовування парентерально (підшкірно, повністю включено тут посиланням]. Розпилювачі внутрішньом'язево або внутрішньовенно) або подібно AERxÔAradigm, UltraventÒnebulizer будь-якого іншого застосування особливо у формі (Mallinckrodt), і розпилювач Acorn IIÒ (Медична рідких розчинів або суспензій; для Продукція Marquest) [US 5404871 Aradigm, WO використовування у вагінальному або ректальному 97/22376], вище згадані, повністю включено тут застосуванні особливо у напівтвердих формах, як посиланням, утворюють аерозолі з розчинів, тоді наприклад, але не обмежено до таких, креми і як дозовані аерозолі, сухі інгалятори пудри, і т.п. суппозиторії: для буккального, або підязикового генерують малі аерозольні частки. Ці специфічні застосування, як наприклад, але не обмежений до приклади комерційно доступних пристроїв для таких, у формі таблеток або капсул; або інгаляцій є представниками специфічних інтранозально, як наприклад, але не обмежено пристроїв, придатних для цього винаходу, і не є ними, у форма порошкув, носових крапель або обмеженням даного винаходу винаходу. аерозолів або певних агентв; або трансдермально, Переважно, композиція, яка включає як наприклад, не обмежуючий, гель, мазь, принаймні одне антитіло анти-ІL-12, примочка, суспензія або пластирна системою доставляється як інгалятор сухої пудри або доставки з хімічним наповнювачем, як наприклад пульверизатор. Це є окремі бажані особливості диметил сульфоксид, для зміни структури шкіри пристрою вдиху для застосування як мінімум або збільшення концентрації ліків в одного антитіла даного винаходу. Наприклад, трансдермальному пластирі [Junginger, et al. In доставления інгаляційним пристроєм значно "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., вигіднішою, легше відтворюваною, і точною. pp.59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994, Пристрій вдиху може необов'язково доставляти повністю включено посиланням)], або з малі сухі частки, наприклад менш ніж близько окислюючими агентами, які уможливлюють 10mm, краще близько 1-5mm, для покращення використання формулювань, що містять протеїни і вдихуваності. пептиди на шкірі [WO98/53847], або використання Застосування композицій антитіла IL-12 електричних полів, для створення швидкоплинні Аерозолем транспортих шляхів, як наприклад електропорація, Аерозоль, що включає протеїн композиції для збільшення рухливості заряджених ліків через антитіла IL-12, може отримуватися, шкіру, як наприклад іонофорез, або використання випирскуванням під тиском через насадку ультразвуку, як наприклад сонофорез суспензій чи розчинів як мінімум одного антитіла [U.S.Pat.Nos.4,309,989 та 4,767,402] (згадані вище анти-IL-12. публікації і патенти, що є повністю включені тут Розмір насадки і конфігурація, тиск посиланням). застосовується, і рідка швидкість подачі можуть Легеневе/Назальне застосування бути вибрані таким чином, щоб досягти бажаного Для легеневої адміністрації, переважно як виходу і розміру часток. Електроаерозоль може мінімум один склад з антитілом анти-ІL-12, отримуватися, наприклад, електричним полем у доставлений в розмірі частинки, ефективному для поєднанні з капіляром або живлючою насадкою. досягнення більш низьких повітряних шляхів Переважно, частки як мінімум композиції одного легенів або пазух. Згідно винаходу, як мінімум протеїну антитіла анти-ІL-12, доставляються одне антитіло анти-ІL-12 може доставлене будьпульверизатором, мають розмір частоки менш ніж яким з різноманітних інгаляторних або назальних близько 10mm, краще межах від приблизно 1mm до пристроїв, відомих в практиці для застосування приблизно 5mm, і краще за все від приблизно 2mm терапевтичного агента вдихом. Ці пристрої, здатні до приблизно 3mm. до депонування аерозолізованих формулювань в Формулювання як мінімум одного протеїну синусні пазухи або альвеоли хворого, включають композиції антитіла анти-ІL-12, придатне для мірне дозування інгаляторів, розпилювачів, використання пульверизатором, звичайно генераторів сухих пудр, пульверизаторів, і включають протеїн композиції антитіла у водному подібних. Інші пристрої, придатні для застосування розчині з концентрацією від приблизно 0.1mg до для легеневого або носового застосування приблизно 100mg 0.1 як мінімум одного протеїу антитіл, також відомі в практиці. Всі такі пристрої композиції антитіла анти-ІL-12 на ml розчину або можуть використовувати формулювання, придатні mg/gm, або будь-який проміжок або значення в для застосування для розподілу антитіла в 51 81100 52 Формулювання як мінімум одного антитіла ньому, напр., але не не обмежуючись до нього, 1, анти-ІЬ-12, придатне для використання або з 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, струйним або ультразвековим розпилювачем, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, звичайно мають концентрацію від близько 0.1mg 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 або до близько 100mg як мінімум одного протеїну 100mg/ml або mg/g. Композиція може включати антитіла анти-ІL-12 на ml розчину. Формулювання агенти, як наприклад наповнювач, буфер, може включати такі агенти, як наприклад ізотонічний агент, консервант, сурфактант, і, наповнювач, буфер, ізотонічний агент, консервант, краще, цинк. Композиція може також включати сурфактант, і, краще, цинк. Формулювання може наповнювач або агент стабілізації протеїну також включати наповнювач або стабілізатор як композиції антитіла, як наприклад буфер, мінімум одного протеїну композиції антитіла антивідновлюючий засіб, додатковий протеїн, або ІL-12, як наприклад буфер, відновлюючий засіб, вуглевод. Додаткові протеїни, корисні у додатковий протеїн, або вуглевод. Додаткові формулюванні протеїнів композиції антитіла, протеїни, корисні у формулюванні як мінімум включають альбумін, протамін, або подібний. одного протеїну складу антитіла анти-ІL-12, Типові вуглеводи, корисні у формулюванні включають альбумін, протамін, або подібний. протеїнів композиції антитіла, включають Типові вуглеводи, корисні у формулюванні як сахарозу, манітол, лактозу, трегалозу, глюкозу, мінімум одного антитіла анти-ІL-12, включають або подібний. Формулювання протеїну композиції сахарозу, манітол, лактоза, трегалозу,глюкоза, антитіла може також включати сурфактант, який або подібний. Як мінімум одне формулювання може знизити або запобігти поверхневу агрегацію антитіла анти-IL-12 може також включати протеїну композиції антитіла, викликану сурфактант, який може знизити або запобігти атомізацією розчину у формуванні аерозоля. поверхневій агрегації як мінімум одного антитіла Можуть використовуватися різні традиційні анти-ІL-12, викликаній атомізацією розчину у сурфактанти, як наприклад жирні кислотні формуванні аерозоля. Можуть використовуватися поліоксиетиленефіри і алкоголі, та жирнокислотні різні придатні сурфактанти, як наприклад естери поліоксиетилен сорбітолу. Кількості жирнокислотні ефіри поліоксиетилену, алкоголі і загалом можуть мати значення у проміжку 0.001жирнокислотні ефіри поліоксиетилен сорбіталу. 14% ваги формулювання. Особливо переважним Кконцентрація речовини звичайно становить від сурфактантами, для цілей цього винаходу є приблизно 0.001 до приблизно 4% ваги поліоксиетилен сорбітан моноолеал, полісорбат формулювання. Особливо переважні сурфактанти, 80, полісорбат 20, або подібний. Додаткові агенти, для цілей цього винаходу - це поліоксиетилен відомі в практиці для формулювань протеїну, як сорбітан моноолеат, полісорбат 80, полісорбат 20, наприклад антитіла IL-12, або вказаних частин або або подібний. Додаткові агенти, відомі в практиці варіантів, також можуть входити у формулювання. для формулювань протеїну, як наприклад протеїну Застосування композицій антитіла IL-12 за антитіла можуть також увійти до формулювання. допомогою розпилювача Застосування композицій антитіла IL-12 Протеїнова композиція антитіла може бути дозований Інгалятор В дозованому інгаляторі застосована як розпилювач, як наприклад (MDI), газ-витіснювач, як мінімум одне антитіло струйний розпилювач або ультразвуковий анти-IL-12, і будь-хто з наповнювачів або інші розпилювач. Звичайно, в струйному розпилювачі! добавки, що містяться в контейнері у вигляді використовується джерело стислого повітря, для мікстури, включаючи зріджений, стислий газ. створення повітряного струменя високої швидкості Приведення в дію дозуючого клапану випускає через отвір. Оскільки газ розширяється після мікстуру у вигляді аерозоля, котра переважно насадки, зона низького тиску створюється, який містить частки розміром від менш ніж близько витягує розчин протеїну композиції антитіла через капілярну трубку, сполучену з резервуаром рідини. 10mm, краще близько 1mm до близько 5mm, і краще Потік рідини від капілярної трубки, розпадається в за все від близько 2 до близько 3mm. Бажаний нестабільні філаменти і крапельки, на виході з розмір частки аерозоля може отриманий, при трубки, створюючи аерозоль. Може використанні формулювання протеїну композиції використовуватися ряд конфігурацій, норм витоку, антитіла, одержуваної різними методами, і типу перегородки, для досягнення бажаних відомими з приктики, включаючи такі, як струйні, особливостей від даного струйного розпилювача. розпилювальну сушку, конденсація критичної В ультразвуковому розпилювачі, звичайно точки, або подібні. Переважні дозовані інгалятори, використовується п'єзоелектричний перетворювач включають вироблювані 3М або Glaxo і для перетворення електричної енергії високої використовують як витіснюючий газ частоти, у вібраційну, механічну енергію. Ця фторвуглеводень. енергія, передана формулюванню протеїну Формулювання як мінімум одного антитіла композиції антитіла або безпосередньо, або через анти-ІL-12 для використовування з пристроєм зчіпну рідину, створюючи аерозоль, який включає дозуючого інгалятора загалом включають тонко протеїн композиції антитіла. Більше переваг надає дисперговану пудру, містячи як мінімум одне виконання в якому, частинки протеїну композиції антитіло анти-ІL-12 як суспензію в неводному антитіла, доставленого розпилювачем, мають середовищі, наприклад, суспендований в розмір частинки менш ніж близько 10mm, краще в витіснюючому газі за допомогою сурфактанту. проміжку від близько 1mm до близько 5mm, і краще Витіснюючий газ може бути будь-яким загально прийнятним матеріалом, що використовується для всього від близько 2mm до близько 3mm. цієї мети, як наприклад хлорфторвуглець, 53 81100 54 описані в [U. S. Pat. No. 5,879,681 і U. S. Pat. No. гідрохлорфторвуглець, гідрофторвуглець, або 5,5,871,753] які використовувалися, для доставки вуглеводень, включаючи трихлорфторометан, біологічно активних агентів, для внутрішнього диихлордифторометан, дихлортетрафторетанол і прийому відомі в практиці. 1,1,1,2-тетрафторметан, HFA-134a --------стали здесь------(гідрофторалкан-134а), HFA-227 (гідрофторалкан Формулювання для слизової і застосування 227), або подібний. Кращий пропелянт - це Для абсорбції через поверхні слизових гідрофторвуглець. Сурфактант може бути оболонок, композиції і методи застосування як вибраний, для стабілізації як мінімум одного мінімум одного антитіла анти-ІL-12 включають антитіла анти-ІL-12 як як суспензії в пропелянті, емульсію, що включає велику кількість щоб захисту активного агента від хімічної субмікронних часток, макромолекули адгезивні до деградації, і подібне. Відповідний сурфапктант слизової, біоактивні пептиди, і водну безперервну включає сорбітан триолеат, соєвий лецитин, фазу, яка здійснює абсорбцію через поверхні олеїнова кислота, або подібний. В деяких слизових оболонок за допомогою досягнення випадках аерозолі розчину, яким віддана мікроадгезії часток емульсії [U.S.Pat.No. перевага, використовують розчинники, як 5,514,670]. Слизисті оболонки, придатні для наприклад етанол. застосування емульсій даного винаходу, можуть Додаткові агенти, відомі в практиці для включати рогівковий, конюктивний, буккальний, формулювань протеїну, як наприклад протеїн підязиковий, носовий, вагінальний, легеневий, можуть також увійти до формулювання. шлунковий, кишковий, і ректальний маршрути Бідь-хто досвідчений в даній галузі розуміє, застосування. Формулювання для вагінального що методи даного винаходу можуть бути включати або ректального застосування, наприклад легеневе застосування як мінімум одного складу суппозиторії, можуть містити, як ноповнювачі, антитіла анти-ІL-12 за допомогою пристрої, не наприклад, поліалкенгліколі, вазелін, масло какао, описаних тут. і подібні. Формулювання для інтраназального Ротові Формулювання і Застосування застосування можуть бути твердими і містити, як Формулювання для ротового вживання наповнювачі, наприклад, лактозу або можуть бути залежать від одночасного застосування із водними чи маслянистими розчинами носових адювантами (напр., резорциноли і неіонні крапель. Наповнювачі для буккального сурфактанти, як наприклад олеіловий ефір застосування включають цукри, стеарат кальцію, поліоксиетилену і ефір n-гексадецилполіутилену), стеарат магнію, крохмаль прежелатинізований, і для штучного збільшення проникності стін подібне [U.S.Pat.No. 5,849,695]. кишківнику, також як і ферментативних інгібіторів Трансдермальні Формулювання і застосування (напр., інгібітори панкреатичного трипсину, Для трансдермального застосування, як диізопропілфторфосфату (DFF) і триазоліл), для мінімум одне анти-ІL-12антитіло, інкапсульоване в перешкоджання ферментативної деградації. засоби доставки, як наприклад ліпосоми або Основа активної суміші для твердої форми полімерні наночастки, мікрочастки, макрокапсули дозування для орального застосування може дути або мікросфери (звичайно усі називаються одержана з принаймні однією добавкою з мікрочастками, хоча іноді їх розрізняють), існує перерахованих сахароза, лактоза, целюлоза, ряд відомих засобів доставки, включаючи манітол.трегалоза, рафіноза, мальтитол, декстран, синтетичні полімерні мікрочастки, зроблених, як крохмалі, агар, аргінати, хітини, хітозани, пектини, наприклад з полігідрокси кислот, як наприклад полі трагакантова камідь, гуміарабік, желатин, колаген, молочна кислота, поліглікольна кислота і їх казеїн, альбумін, синтетичний або сополімери, поліортоестери, поліангідриди, і напівсинтетичний полімер, і гліцерид. Ці форми поліфосфазени, і природні полімери, як наприклад дозування можуть також містити інший вид(и) колаген, поліамінокислоти, альбумін і інші добавок, напр., інертний розбавлюючий агент, протеїни, альгінати та інші полісахариди, і їх любрикант, як наприклад стеарат магнію, парабен, комбінації [U.S.Pat.No. 5,814,599]. консервеючі агента, як наприклад сорбінова Тривале застосування і формулювання кислота, аскорбінова кислота, альфа-токоферол, Іноді може бути бажаним, щоб доставляти антиоксидант, як наприклад цистеїн, суміші даного винаходу до суб'єкта на протязі дезинтегратор, звязувач, загущувач, буферний тривалого часу, наприклад, на протязі від одного агент, підсолоджуючий агент, смаковий агента, тижня до одного року від одніго застосування. ароматизуючий агент, і т.п. Можуть використовуватися різні дозувальні форми Таблетки і пілюлі можуть також мати кишковоповільного вивільнення, депо або імплант. розчинне покриття. Рідкі препарати для орального Наприклад, форма дозування може містити застосування включають емульсію, сироп, еліксир, фармацевтично прийнятну неотруйну сіль сполук, суспензію і розчин, придатні для медичного які мають низький ступінь розчинності в використовування. Ці препарати можуть містити біологічних рідинах, наприклад (а) кислотна сіль з інертні розбавлюючі агенти, що звичайно багатоосновною кислотою, такою як фосфорна використовуються в даній галузі, напр., вода. кислота, сірчана кислота, лимонна кислота, Ліпосоми також зустрічаються як системи доставки тартарова кислота, дубильна кислота, кислота ліків для інсуліну і гепарину [U.S.Pat.No.4,239,754]. раmoіс, альгінінова кислота, кислота Також штучні полімерні мікросфери суміші поліглютамінова, нафталенові моноабо використовувалися, для доставити дисульфонові кислоти, полігалактуронова кислота, фармпрепаратів амінокислот (протеіноїдів), [U. S. і подібне; (b) сіль з багатовалентним катіоном Pat. No. 4,925,673]. До того ж, носієві суміші, 55 81100 56 Плазміда рС4 експресії цільового гену містить металу, як наприклад цинк, кальцій, вісмут, барій, сильний промотор довгого кінцевого повтору (LTR) магній, алюміній, мідь, кобальт, нікель, кадмій і вірусу саркоми Роуса [Cullen, et al., Molec. Cell. подібні, або з органічним катіоном, утвореним від Biol.5: 438-447 (1985)] плюс фрагмент, ізольований напр., Ν,Ν'-дибензил-етилендиаміну або з енхансера безпосереднього раннього гену етилендиаміну; або (с) комбінації (а) і (b) цитомегаловірусу людини (CMV) [Boshart, et al., наприклад сіль танату цинку. Додатково, сполуки Cell 41: 521-530 (1985)]. Пізніше розташованим за даного винаходу або, краще, відносно нерозчинна промотором є ВаmНІ, Xbal, і Asp718 сайти сіль, як наприклад тільки що описані, можуть бути рестрикції літичними ферментами, які дозволяють сформульовані в гелі, наприклад, гель інтеграцію генів. Після клону вальних сайтів моностеарату алюмінію з, наприклад маслом плазміда містить 3' інтрон та сайт сезаму, придатне для ін'єкцій. Особливо поліаденілування щурячого препроінсулінового переважними солями, - є солі цинку, солі таннату гену. Також можуть бути використані інші цинку, солі pamoate, і подібні. Інший тип високоефективні промотори для експресії, депонувального формулювання для повільного наприклад, промотор б-актину людини, ранній чи вивільнення для ін'єкцій могли б містити суміш або пізній промотори SV40 чи довгий термінальний сіль, диспергована для інкапсуляції в повільно повтор з іншого ретровірусу, наприклад, ВІЛ та розкладаючийся, нетоксичний, неатнтигенний, HTLVI, Clontech's Tet-Off та Tet-On системи генної полімер, як наприклад полімер полімолочної експресії та подібні системи можуть бути кислоти acid/полігліколевої кислоти наприклад як використані для експресії регульованого типу IL-12 описано в [U.S.Pat.No.3,773,919]. Суміші або, в клітинах ссавців [М. Gossen, and H. Bujard, Proc. краще, відносно нерозчинні солі, як наприклад Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)]. Для описані вище можуть також бути сформульовані в поліаденілування mRNA також можуть силастикові пілюлі з холестерольною матрицею, застосовуватися інші сигнали, наприклад, з зокрема для використання на тваринах. гормону росту людини чи тобі нового гену. Додатково, формулювання повільного Стабільні клітинні лінії, які несуть цільовий ген вивільнення, депо або імплантів, наприклад газові інтегрований в хромосому також можуть бути або рідинні ліпосоми, відомі в літературі [U. S. Pat. виділені сотрансфекцією селектовним маркером Nos. 5,770,222 and "Sustained and Controlled таким як gpt, G418 чи гігроміцин. Використання Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., більше ніж одного маркера на початку, наприклад, Marcel Dekker, Inc., N. Y., 1978]. G418 із метотрексатом дає значні переваги. Те саме, що приведено в описі винаходу, Плазміда рС4 розщеплюється ферментами може бути так зрозуміло з наступних прикладів, рестрикції і потім дефосфорилюється за котрі приводяться як ілюстрації і не, що маються допомогою телячої кишкової фосфатази, загально на увазі як обмеження. відомим методом. Потім вектор виділяється з 1% Втрачено при публікації агарозного гелю. Вектор рС4 використовується для експресії Використовується послідовність DNA, що антитіла IL-12. Плазміда рС4 - це похідне плазміди кодує повне антитіло IL-12, наприклад, SEQ ID pSV2-dhfr (ATCC Accession No.37146). Плазміда NOS: INSERT МАВ АА SEQ ID 1, та INSERT МАВ містить ген миші DHFR під контролем більш АА SEQ ID N02, відповідно до варіабельний раннього промотора SV40. Клітини яєчнику або регіонів НС та LC антитіла IL-12 даного винаходу, інші китайського хом'яка, з недостатньою відповідними відомими методами. Віділення активністю дигідросульфолату, яка є нуклеїнової кислоти, що кодує придатний трансфековані цими плазмідами, можуть бути константний регіон людини (напр., регіони НС та вибрані, вирощуванням клітин на селективному LC) також використовуються для цього конструкту середовищі [напр., alpha minus MEM, Life [напр., як у векторі p 1351: INSERT ATCC Technologies, Gaithersburg, MD] доповнене з ACCESSION NUMBER AND ADDITIONAL HC/LC хемотерапевтичним агентом метатрексату. плазмід). Ампліфікація генів DHFR в клітинах, стійких до Виділені DNA, що кодують варіабельні та метотрету (МТХ), добре описана [див., напр., F. W. константні регіони, та дефосфорильований вектор Alt, et al., J. Biol. Chem. 253: 1357-1370 (1978); J. L. потім лігуються Т4 DNA лігазою. Клітини Е. coli HB Hamlin and С. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097: 101 чи XL-1 Blue потім трансформують та 107-143 (1990); and M. J. Page and M. A. ідентифікують бактерії, котрі містять фрагмент, Sydenham, Biotechnology 9: 64-68 (1991)]. Клітини, вставлений в плазміну рС4 за допомогою, вирощені за збільшених концентрацій МТХ, наприклад, аналізу рестрикцій ними ферментами. розвивають резистентність до ліків, Для трансфекції використовуються яєчникові перевиробляючи цільовий фермент, DHFR, в клітини китайського хомяка (СНО), позбавлені результаті ампліфікації гена DHFR. Якщо другий активного гену DHFR. 5g плазміни експресії рС4 ген зв'язаний з геном DHFR, то він звичайно котрансфекуються з 0,5g плазміди pSV2neo, за коампліфікується і переекспресовується. Є допомогою ліпофесцину. Плазміда pSV2neo відомим в практиці, що цей підхід може містить домінантний селектабельний маркер, ген використовуватися, для одержання клітинних пео з Тn5 кодує фермент, який призводить до ліній, які несуть більш ніж 1, 000 копій резистентності до групи антибіотиків включаючи ампліфікованого гену(ів). Згодом, коли G418. Після 2 днів, клітини трипсинізують й метотрексат видалено, отримані клітинні лінії, які висівають на платівки клонування гібридом містять ампліфікований ген, з'єднаний з однією (Greiner, Germany) в альфа мінус MEM із або більше хромосомою(ми) клітини хазяїна. 57 81100 58 w/v - вага на об'єм доданням 10, 25, чи 50ng/ml метотрексату з 1g/ml Матеріали та методи G418. після приблизно 10-14 днів поодинокі клони Тварини трипсинізують й висівають в 6-лункові чашки Петрі Добре відомими з літератури є трансгенні чи 10ml колби з використанням різних миші, здатні експресувати антитіла людини, котрі концентрацій метотрексату 50nМ, 100nМ, 200nМ, експресують імуноглобуліни людини, але не 400nМ, 800nМ). Клони, що росли з найвищими мишачий ІgМ чи Іg, вoни також є комерційно концентраціями метотрексату потім було доступними [напр., від GenPharm International, San перенесено в нові 6-лункові чашки з ще більшим Jose, CA; Abgenix, Freemont, CA, та інших]. вмістом метотрексату (1mМ, 2mМ, 5mМ, 10mМ, Наприклад, такі трансгенні миші мають 20mМ). Така ж процедура повторялася, поки не послідовність трансгенів людини, котрі було були одержані клони котрі росли при концентрації піддано V(D)J введенню, перемикача класу 100-200mМ. Експресія бажаного генного продукту важкого ланцюга, та соматичним мутаціям для вивчалася, наприклад, за допомогою SDS-PAGE одержання переліку імуноглобулінів з людською та Western blot за допомогою реверсивно фазного послідовністю [Lonberg, et al., Nature 368: 856-859 HPLC-аналізу. (1994)]. Трансген легкого ланцюга може бути Приклад 2: Одержання,за допомогою отриманий, наприклад, частково з клону штучної трансгенних мишей, високоафінних хромосоми дріжджів, котрий включає приблизно моноклональних антитіл IgG людини, що реагують половину регіону V геметних ліній людини. з IL-12 людини Додатково, трансген важкого ланцюга може Стисле викладення Для одержання високоафінних, повністю кодувати як m так і І [Fishwild, et al., Nature людських, моноклональних антитіл, котрі можуть Biotechnology 14: 845-851 (1996)] та/або 3 бути терапевтично застосовані для інгібування дії константні регіони людини. Миші отримані з IL-12 для лікування одного чи більше захворювань відповідних генотипових ліній можуть бути опосередкованих IL-12, було використано використані в імунізаційних процесах та процесах трансгенних мишей, котрі мали гени легкого та злиття для одержання моноклональних антитіл важкого ланцюгів імуноглобуліну людини. Гібридні людини до IL-12. миші (CBA/J x C57/BL6/J) F, які мали трансгени Імунізація варіабельного та константного регіонів важкого та Один чи більше імунізаційних регламентів легкого ланцюгів людини, були імунізовані можуть бути використані для одержання гібридом рекомбінантним IL-12 людини [Taylor et al., Intl. анти-ІL-12 людини, перші декілька злиттів можуть Immunol. 6: 579-591 (1993); Lonberg, et al., Nature бути виконані після наступного зразкового 368: 856-859 (1994); Neuberger, M., Nature Biotech. протоколу імунізації, але можуть також бути 14: 826 (1996); Fishwild, et al., Nature Biotechnology використані й інші відомі подібні протоколи. 14: 845-851 (1996)]. Декілька злиттів дали одне чи Декілька 14-20-и тижневих самок та/або хірургічно більше панелей повністю людських IL-12 кастрованих трансгенних самців мишей реактивних моноклональних антитіл IgG. Повністю імунізовано IP та/або ID з 1-1000mg людські анти-ІL12 антитіла буде описано далі. Усі рекомбінантних IL-12 людини емульсованих з вони є IgG. Було визначено, що такі антитіла рівним об'ємом TITERMAX чи повного адюванту мають константу афінності десь між 1x109 та Фройнда з остаточним об'ємом 100-400mL (напр., 9x1012, неочікувано високі афінності цих повністю 200). Кожна миша може також необов'язково людських моноклональних антитіл робить їх отримати 1-10mg в 100mL фізіологічного розчину на придатними кандидатами для терапевтичних кожний з двох SQ сайтів. Миші потім можуть бути застосувань в захворюваннях, патологіях чи імунізовані на 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 та/або 21-34 розладах пов'язаних з IL-12. день після IP (1-400mg) та SQ (1-400mgx2) Скорочення емульгованими IL-12 з рівним об'ємом TITERMAX BSA - бичачий сироваточний альбумін чи неповним адювантом Фройнда. У мишей може СО2 - диоксид вуглецю бути взята кров на 17-25 та 25-40 дні після ретроDMSO - диметисульфоксид орбітальної пунктири без антикоагулянта. Потім ЕІА - ферментативний імуноаналіз кров може бути залишена для зсідання при RT на FBS - ембріональний бичача сироватка одну годину, а сироватка зібрана й титрована IL-12 Н202-пероксид водню EIA пробою відповідно до відомих методів. Злиття HRP - пероксидаза хріну виконуються коли повторювані ін'єкції не ID - інтрадермальний призводять до підвишення титру. В цей час, Іg - імуноглобулін можуть бути передані в фінальну IV посилену IL-12 - інтерлейкин-12 ін'єкцію 1-400mg IL-12 розсинених в 100mL ІР - внутрішньоочеревинний фізиологічного розчину. IV - внутрішньовенний Трьома днями пізніше, миші можуть бути Mab - моноклональні антитіла евтаназовані шийною дислокацією та асепрично OD - оптична щільність видалено селезінку та поміщено в 10mL холодного OPD-o - фенілендиамін дихлорид фосфатного буферного розчину (PBS), котрий PEG - поліетиленгліколь містив 100U/mL пеніциліну, 100mg/mL PSA - пеніцилін, стрептоміцин, амфотеріцин стрептоміцину, та 0.25mg/mL амфотеріцину В RT - кімнатна температура (PSA). Клітини селезінки збиралися стерильною SQ - підшкірний перфузією селезінки PSA-PBS. Клітини ν/ν - об'єм на об'єм 59 81100 60 відмивалися одноразово в холодному PSA-PBS, вкриті 10mg/mL козячими IgG Fc до людини в підраховувалися ексклюзією з використанням буфері карбонату натрію на ніч при 4°С. Платівки барвнику Трипану синього та ресуспендувалися в відмивають та блокують 1% BSA-PBS на протязі 1 середовищі RPMI 1640, яке містило 25mМ Hepes. години при 37°С й можуть використовуватися Злиття клітин негайно чи заморожуватися при -20°С. Злиття проводилося при відношенні від 1:1 до Нерозведені супернатанти гібридоми інкубуються 1:10 клітин мишачої мієломи до життєздатних в платівках на протязі однієї години при 37°С. клітин селезінки, відповідно до відомих методів, Платівки відмивали та тестували HRP-міченими тобто методів відомих з літератури. Як не козячими IgG каппа до людини розведеними обмежуючий приклад, клітини селезінки та клітини 1:10,000 в 1% BSA-PBS на протязі однієї години мієломи можуть бути пелетовані разом. Пелети при 37°С. Платівки потім інкубували як описано потім можуть бути повільно ресуспендовані, за 30 вище. секунд, в 1mL 50% (w/v) розчину PEG/PBS Визначення реактивності повністю людських (молекулярна маса PEG 1.450, Sigma) at 37°С. Анти-IL-12 Злиття потім може бути зупинено повільним Гібридоми, такі як вище описано, можуть бути додаванням 10.5mL середовища RPMI 1640, яке одночасно опротестовані на реактивність до IL-12 містить 25mM Hepes (37°C) на протязі 1 хвилини. з використанням RIA чи іншого тесту. Наприклад, Злиті клітини центрифугуються на протязі 5 супернатанти інкубуються козячими IgG Fc до хвилин при 500-1500об/хв. клітини потім людини платівках, як зазначено вище, відмито і ресуспендуються в середовищі HAT (RPMI 1640, потім випробувано радіоміченим IL-12 з відпорною яке містить 25mМ Hepes, 10% сироватки кількістю на лунку на протязі однієї години при RT. Ембріонального Клону І (Нусіоnе), 1mМ пирувату Лунки промивали двічі PBS та зв'язаний радіомічений IL-12 підраховевався відповідним натрію, 4mМ L-глютаміну, 10mg/mL гентаміцину, лічильником. 2.5% культуральної добавки Origen (Fisher), 10% Гібридоми, що секретували анти-ІL-12 lgG1 653-стандартизованого RPMI 1640/середовища людини можуть бути розвинені в клітинній культурі Hepes, 50mΜ 2-меркаптоетанолу, 100mΜ та послідовно субклоновані в лімітуючому гіпоксантину, 0.4mΜ аміноптерину, та 16mΜ розведенні. Одержані клон альні популяції можуть тимідину) та потім поміщені в 200mL/weΙΙ в бути розширені та кріоконсеквовані в п'ятнадцяти 96-луночних платівках з плоским дном заморожуючому середовищі (95% FBS, 5% DMSO) для тканинної культури. Платівки потім поміщали у й збережені в рідкому азоті. зволожений інкубатор при 37°С з 5% СО2 та 95% Ізотипування повітря на 7-10 днів. Визначення ізотипу антитіл може бути Визначення IgG Анти-ІL-12антитіл людини в проведено з використанням ЕІА у спосіб подібний сироватці миші до того, який було застосовано для скринування Для скринінгу мишиних сироваток на IgG імунних сироваток мишей на специфічні тітри. ILантитіла специфічні до IL-12 людини може бути 12 може бути нанесений на 96-лункові платівки, як використано твердофазну ElA's. Коротко, платівки описано вище, та очищені антитіла 2mg/mL можуть можуть бути вкриті IL-12 в кількості 2mg/mL в PBS бути інкубовані на платівках на протязі однієї на ніч. Після відмивання в 0,15М сольовому години при RT. Платівки відмиваються та розчині, котрий містить 0.02% (ν/ν) Твин 20, лунки тестуються козячими IgG до людини чи HRP можуть бути блоковані 1% (w/v) BSA в PBS. міченими козячими lgG3 до людини розведеними 200mL/лунку на 1 годину при RT. Платівки можуть 1:4000 в 1% BSA-PBS на протязі однієї години при використовуватися негайно чи заморожені при RT. Платівку знову відмивають й інкубують з 20°С для подальшого використання. Розведена субстратним розчином як показано вище. мишина сироватка інкубується на вкритих IL-12 Кінетика зв'язування антитіл людини до IL-12 платівках з 50mL/лунку при RT на протязі одного людини з IL-12 людини часу. Платівки відмиваються й тестуються Характеристики зв'язування антитіл можуть 50mL/лунку HRP-міченими козячими IgG до бути прийнятно оцінено за допомогою, наприклад, людини, Fc специфічно розведених 1:30,000 в 1% IL-12 захвату ЕІА та ВІАсоге technology. BSA-PBS на протязі 1 години при RT. Платівки Ступінчасті концентрації очищених антитіл до ILзнову можуть бути промиті та додаванням 12 людини можуть бути протестестовані на 100mL/лунку розчином цитрат-фосфатним зв'язування на платівках ЕІА, вкритих 2mg/mL субстрату (0.1Μ лимонної кислоти та 0.2М антитіл IL-12 за методом, описаним вище. фосфату натрію, 0.01% Н2О2 and 1mg/mL OPD) на Оптичтична щільність може бути представлена як протязі 15 хвилин при RT. Потім додається стопнапівлогарифмічний графік, який відображає розчин (4Н сірчана кислота) в кількості 25mL/лунку відносну ефективність зв'язування. та вимірюється OD's при 490nm на Може бути отримана кількісна константа автоматизованому пластинчастому зв'язування, наприклад, як показано далі, чи будьспектрофотометрі. яким іншим придітним методом. Чіп BIAcore CM-5 Визначення повністю людських (карбоксиметил) поміщують в BIAcore 2000. Буфер імуноглобулінів в гібридом них супернатантах HBS (0.01Μ HEPES, 0.15Μ NaCI, 3mM EDTA, Декретування ріст-позитивними гібрид омами 0.005% ν/ν Ρ20 сурфактант, рН 7.4) пропускається повністю людських імуноглобулінів може бути через потік клітин чіпу із швидкістю 5mL/хв до визначено придатним ЕІА. Коротко, 96-лункові досягнення вихідного рівня. Розчин (100mL) 5mg платівки з виступами (VWR, 610744) можуть бути EDC (N-етил-N'-(3-диметил-амінопропіл)