Моноклональне антитіло людини, яке зв’язує антиген-4 цитотоксичного т-лімфоциту (ctla-4), нуклеїнова кислота, лінія клітин, спосіб одержання трансгенного ссавця, спосіб збільшення продукування il-2 або ifn-g

1. Моноклональне антитіло людини, яке зв'язує антиген-4 цитотоксичного Т-лімфоциту (CTLA4) або його антиген-зв'язуючий фрагмент, при цьому вказане антитіло або фрагмент інгібує зв'язування CTLA-4 і В7-2 з ІС50, яка дорівнює приблизно 100нМ або менше. 2. Антитіло або фрагмент за п.1, де вказане антитіло або фрагмент інгібує зв'язування CTLA-4 людини й В7-1 з ІС50, яка дорівнює приблизно 100нМ або менше, і інгібує зв'язування CTLA-4 людини й В7-2 з ІС50, яка дорівнює приблизно 100нМ або менше, і де вказане антитіло має щонайменше одну з властивостей, вибрану з групи, що складається з: (13) 76936 (21) 2001075213 (22) 23.12.1999 (24) 16.10.2006 (86) PCT/US99/30895, 23.12.1999 (31) 60/113,647 (32) 23.12.1998 (33) US (46) 16.10.2006, Бюл. № 10, 2006 р. (72) Хансон Дуглас Чарльз, US, Нев'ю Марк Джозеф, US, Мюллєр Ейлін Елліот, US, Ханк Джеффрі Герберт, US, Гілман Стівен Крістофер, US, Девіс К. Джеффрі, US, Корвалан Хосе Рамон, US (73) ПФАЙЗЕР ІНК., US, АБДЖЕНІКС, ІНК., US (56) WO A 9842752, 01.10.1998. WO A 9533770, 14.12.1995. WO A 9633735, 31.10.1996. WO A 9850433, 12.11.1998. A. JAKOBOVITS: "The long-awaited magic bullets: therapeutic himan monoclonal antibodies from transgenic mice". EXPERT OPINION ON 2 (11) 1 UA (54) МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ЛЮДИНИ, ЯКЕ ЗВ'ЯЗУЄ АНТИГЕН-4 ЦИТОТОКСИЧНОГО ТЛІМФОЦИТУ (CTLA-4), НУКЛЕЇНОВА КИСЛОТА, ЛІНІЯ КЛІТИН, СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ТРАНСГЕННОГО ССАВЦЯ, СПОСІБ ЗБІЛЬШЕННЯ ПРОДУКУВАННЯ IL-2 АБО IFN- У Т-КЛІТИНАХ ПАЦІЄНТА, СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ТА ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЯКА ВИКОРИСТОВУЄТЬСЯ ПРИ ЛІКУВАННІ РАКУ, ЗАПАЛЕННЯ АБО АУТОІМУННОГО ЗАХВОРЮВАННЯ, ЩО ВКЛЮЧАЄ ДАНЕ АНТИТІЛО C2 ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (19) ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ 3 76936 4 a) зв'язує CTLA-4 людини зі спорідненістю зв'язуc) амінокислотних послідовностей CDR1, CDR2 і вання приблизно 10-9 або більше; CDR3 антитіла 2.1.3, показаних на Фіг. 6; b) збільшує продукування цитокінів у тесті Т-клітин d) амінокислотних послідовностей CDR1, CDR2 і людини на 500 пг/мл або більше; CDR3 антитіла 12.3.1, показаних на Фіг. 7; і c) збільшує продукування ІЛ-2 у тесті Т-клітин люe) амінокислотних послідовностей CDR1, CDR2 і дини на 500 пг/мл або більше; CDR3 антитіла 12.9.1, показаних на Фіг. 8. d) збільшує продукування γ-інтерферону в тесті Т8. Антитіло або фрагмент за будь-яким з пп.1-7, клітин людини на 500 пг/мл або більше; що включає амінокислотну послідовність легкого e) не зв'язує CTLA-4 миші, щура і кролика; ланцюга, яка включає послідовність, вибрану з f) зв'язує CTLA-4 довгохвостих макак і макак-резус. групи, що складається з амінокислотних послідов3. Антитіло або фрагмент за п.1 або 2, де вказане ностей, представлених у SEQ ID NO:14-26, 65, 67, антитіло інгібує зв'язування між CTLA-4 людини й 69 або 71. В7-1 з ІС50, меншою ніж приблизно 50нМ, і інгібує 9. Антитіло або фрагмент за будь-яким з пп.1-8, зв'язування між CTLA-4 людини й В7-2 з ІС50, мещо має важкий ланцюг, що включає амінокислотну ншою ніж приблизно 0,38нМ. послідовність батьківської лінії гена VH3-33 (DP-50) 4. Антитіло або фрагмент за п.1, що включає амілюдини або вказану послідовність батьківської нокислотну послідовність легкого ланцюга, вибралінії, що містить щонайменше 1 мутацію. ну з групи, яка складається з: 10. Антитіло або фрагмент за п.1, що включає аміa) амінокислотної послідовності батьківської лінії нокислотну послідовність важкого ланцюга, вибрагена А27 vL людини або вказаної послідовності ну з групи, яка складається з: батьківської лінії, що містить щонайменше 1 мутаa) амінокислотної послідовності батьківської лінії цію; гена VH3-33 (DP-50) людини або вказаної послідоb) амінокислотної послідовності батьківської лінії вності батьківської лінії, що містить щонайменше 1 гена 012 vL людини або вказаної послідовності мутацію; батьківської лінії, що містить щонайменше 1 мутаb) амінокислотної послідовності батьківської лінії цію; гена VH4-33 (DP-65) людини або вказаної послідоc) амінокислотної послідовності батьківської лінії вності батьківської лінії, що містить щонайменше 1 гена А10/А26 vL людини або вказаної послідовносмутацію; ті батьківської лінії, що містить щонайменше 1 муc) амінокислотної послідовності батьківської лінії тацію; гена VH (DP-47) людини або вказаної послідовності d) амінокислотної послідовності батьківської лінії батьківської лінії, що містить щонайменше 1 мутагена А17 vL людини або вказаної послідовності цію. батьківської лінії, що містить щонайменше 1 мута11. Антитіло або фрагмент за пп.1 або 9, що вклюцію; чає амінокислотну послідовність CDR1, CDR2 або e) амінокислотної послідовності батьківської лінії CDR3 важкого ланцюга, представлених на фігугена A3/А19 vL людини або вказаної послідовності рі 2. батьківської лінії, що містить щонайменше 1 мута12. Антитіло або фрагмент за п.1, де важкий ланцію. цюг включає амінокислотні послідовності CDR1, 5. Антитіло або фрагмент за п.4, де вказана аміноCDR2 і CDR3 антитіла, представлені на фігурі 2. кислотна послідовність батьківської лінії гена А27 13. Антитіло або фрагмент за будь-яким з пп.1-12, vL людини містить щонайменше 1 мутацію, вибращо включає амінокислотну послідовність важкого ну з групи, яка складається з: ланцюга, вибрану з групи, яка складається з аміa) щонайменше однієї амінокислоти в CDR1, вилунокислотних послідовностей, представлених у ченої в порівнянні з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO:1-8, 10-13, 63, 66, 68 або 70. батьківської лінії гена А27 vL людини; 14. Антитіло або фрагмент за п.1, де вказане анb) залишку серину, заміщеного в положенні 6 у титіло або фрагмент вибраний із групи, яка склабатьківській лінії CDR3, показаній на Фіг. 4, гена дається з: А27 vL людини; а) антитіла або фрагмента, що включає варіабеc) щонайменше одного консервативного або нельну ділянку амінокислотної послідовності важкого консервативного заміщення в CDR1 в порівнянні з ланцюга, представлену у SEQ ID NO:63, і додаткоамінокислотною послідовністю батьківської лінії во включає амінокислотну послідовність варіабегена А27 vL людини. льної ділянки легкого ланцюга, представлену в 6. Антитіло або фрагмент за будь-яким з пп.1-5, SEQ ID NO:65; що включає послідовність CDR1, CDR2 або CDR3 b) антитіла або фрагмента, що включає варіабелегкого ланцюга, показану на одній з Фігур 4-8. льну ділянку амінокислотної послідовності важкого 7. Антитіло або фрагмент за п.6, де послідовність ланцюга, представлену у SEQ ID NO:66, і додаткоCDR1, CDR2 або CDR3 легкого ланцюга вибираво включає амінокислотну послідовність варіабеється з групи, яка складається з: льної ділянки легкого ланцюга, представлену в a) амінокислотних послідовностей CDR1, CDR2 і SEQ ID NO:67; CDR3 антитіла 4.1.1, антитіла 4.8.1, антитіла c) антитіла або фрагмента, що включає варіабе4.14.3, антитіла 6.1.1, антитіла 4.10.2 або антитіла льну ділянку амінокислотної послідовності важкого 4.13.1, показаних на Фіг. 4; ланцюга, представлену у SEQ ID NO:68, і додаткоb) амінокислотних послідовностей CDR1, CDR2 і во включає амінокислотну послідовність варіабеCDR3 антитіла 3.1.1, антитіла 11.2.1, антитіла льної ділянки легкого ланцюга, представлену в 11.6.1 або антитіла 11.7.1, показаних на Фіг. 5; SEQ ID NO:69; і 5 76936 6 d) антитіла або фрагмента, що включає варіабекислотну послідовність варіабельної частини легльну ділянку амінокислотної послідовності важкого кого ланцюга, представлену в SEQ ID NO:21; ланцюга, представлену у SEQ ID NO:70, і додаткоc) антитіла або фрагмента, що включає варіабево включає амінокислотну послідовність варіабельну частину амінокислотної послідовності важкольної ділянки легкого ланцюга, представлену в го ланцюга, представлену у SEQ ID NO:4, і аміноSEQ ID NO:71. кислотну послідовність варіабельної частини 15. Антитіло або фрагмент за п.14, яке включає: легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO:17; і a) амінокислотну послідовність важкого ланцюга d) антитіла або фрагмента, що включає варіабеSEQ ID NO:63 і амінокислотну послідовність легкольну частину амінокислотної послідовності важкого ланцюга SEQ ID NO:65, де вказане антитіло не го ланцюга, представлену у SEQ ID NO:1, і аміномає сигнальних пептидів, представлених у вказакислотну послідовність варіабельної частини них послідовностях; легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO:14. b) амінокислотну послідовність важкого ланцюга 20. Антитіло або фрагмент за п.1, вибране з групи, SEQ ID NO:66 і амінокислотну послідовність легкояка складається з: го ланцюга SEQ ID NO:67, де вказане антитіло не а) амінокислотної послідовності важкого ланцюга, має сигнальних пептидів, представлених у вказащо містить SEQ ID NO:3, і амінокислотної послідоних послідовностях; вності легкого ланцюга, що містить SEQ ID NO: 16; c) амінокислотну послідовність важкого ланцюга b) амінокислотної послідовності важкого ланцюга, SEQ ID NO:68 і амінокислотну послідовність легкощо містить SEQ ID NO:8, і амінокислотної послідого ланцюга SEQ ID NO:69, де вказане антитіло не вності легкого ланцюга, що містить SEQ ID NO: 21; має сигнальних пептидів, представлених у вказаc) амінокислотної послідовності важкого ланцюга, них послідовностях; і що містить SEQ ID NO:4 без сигнальної пептидної d) амінокислотну послідовність важкого ланцюга послідовності, й амінокислотної послідовності легSEQ ID NO:70 і амінокислотну послідовність легкокого ланцюга, що містить SEQ ID NO: 17 без сигго ланцюга SEQ ID NO:71, де вказане антитіло не нальної пептидної послідовності; має сигнальних пептидів, представлених у вказаd) амінокислотної послідовності важкого ланцюга, них послідовностях. що містить SEQ ID NO:1 без сигнальної пептидної 16. Антитіло або фрагмент за п.1, що виявляє одпослідовності, й амінокислотної послідовності легну або більше властивостей, вибраних із групи, кого ланцюга, що містить SEQ ID NO: 14 без сигяка складається з: нальної пептидної послідовності. a) конкурентно інгібувати зв'язування CTLA-4 з 21. Антитіло або фрагмент за п.1, вибране з групи, антитілом за п.14 або 15; яка складається з: b) зв'язувати такий же епітоп, як і антитіло за п.14 a) антитіла або фрагмента, що включають аміноабо 15; і кислотну послідовність важкого ланцюга, що місc) мати специфічність зв'язування по суті таку ж, тить послідовність CDR1, CDR2 і CDR3 антитіла як і в антитіла за п.14 або 15. 4.13.1, показану на фігурі 2, і амінокислотну послі17. Антитіло або фрагмент за будь-яким з пп.1-3, довність легкого ланцюга, що містить послідовщо включає щонайменше ність CDR1, CDR2 і CDR3 антитіла 4.13.1, показаодне з наступних: ну на фігурі 4; a) послідовності FR1, FR2 і FR3 людини, які кодуb) антитіла або фрагмента, що включають аміноються сімейством генів людини VH 3-33 або вказакислотну послідовність важкого ланцюга, що місним сімейством генів з консервативними замінами, тить послідовність CDR1, CDR2 і CDR3 антитіла одиничною неконсервативною заміною або з обо4.14.3, показану на фігурі 2, і амінокислотну посліма; або довність легкого ланцюга, що містить послідовb) послідовності FR1, FR2 і FR3 людини, які кодуність CDR1, CDR2 і CDR3 антитіла 4.14.3, показаються сімейством генів людини VK A27 або вказану на фігурі 4; і ним сімейством генів з консервативними замінами, c) антитіла або фрагмента, що включають аміноодиничною неконсервативною заміною або з обокислотну послідовність важкого ланцюга, що місма. тить послідовність CDR1, CDR2 і CDR3 антитіла 18. Антитіло за п.1, що включає варіабельну час6.1.1, показану на фігурі 2, і амінокислотну послітину амінокислотної послідовності важкого ланцюдовність легкого ланцюга, що містить послідовга, представлену у SEQ ID NO:70 і додатково ність CDR1, CDR2 і CDR3 антитіла 6.1.1, показану включає амінокислотну послідовність варіабельної на фігурі 4. частини легкого ланцюга, представлену в SEQ ID 22. Антитіло або фрагмент за п.1, яке включає NO:71. амінокислотну послідовність важкого ланцюга, що 19. Антитіло або фрагмент за п.1, вибране з групи, містить послідовність CDR1, CDR2 і CDR3 антитіяка складається з: ла 11.2.1, показану на фігурі 2, і амінокислотну a) антитіла або фрагмента, що включає варіабепослідовність легкого ланцюга, що містить послільну частину амінокислотної послідовності важкодовність CDR1, CDR2 і CDR3 антитіла 11.2.1, пого ланцюга, представлену у SEQ ID NO:3, і аміноказану на фігурі 5. кислотну послідовність варіабельної частини 23. Антитіло або фрагмент за п.1, вибране з групи, легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO:16; яка складається з: b) антитіла або фрагмента, що включає варіабеа) антитіла або фрагмента, що включають амінольну частину амінокислотної послідовності важкокислотну послідовність від CDR1 до CDR3 важкого го ланцюга, представлену у SEQ ID NO:8, і аміноланцюга антитіла 4.13.1, показану на фігурі 2, і амінокислотну послідовність від CDR1 до CDR3 7 76936 8 легкого ланцюга антитіла 4.13.1, показану на фігу28. Виділена нуклеїнова кислота, що кодує важкий рі 4; і/або легкий ланцюг антитіла або фрагмента за b) антитіла або фрагмента, що включають амінобудь-яким з пп.1-25. кислотну послідовність від CDR1 до CDR3 важкого 29. Виділена нуклеїнова кислота за п.28, операланцюга антитіла 4.14.3, показану на фігурі 2, і ційно зв'язана з послідовністю, що керує експреамінокислотну послідовність від CDR1 до CDR3 сією. легкого ланцюга антитіла 4.14.3, показану на фігу30. Спосіб одержання трансгенного ссавця, що не рі 4; є людиною, або рослини, що включає стадію ввеc) антитіла або фрагмента, що включають амінодення виділеної нуклеїнової кислоти за п.28 або 29 кислотну послідовність від CDR1 до CDR3 важкого в плюрипотентну клітину ссавця, що не є людиланцюга антитіла 6.1.1, показану на фігурі 2, і аміною, або рослини, де вказаний трансгенний ссанокислотну послідовність від CDR1 до CDR3 легвець або рослина експресує вказану нуклеїнову кого ланцюга антитіла 6.1.1, показану на фігурі 5. кислоту. 24. Антитіло або фрагмент за п.1, що включають 31. Спосіб збільшення продукування IL-2 або IFN-γ амінокислотну послідовність від CDR1 до CDR3 у Т-клітинах пацієнта, що включає стадію введенважкого ланцюга антитіла 11.2.1, показану на фіня пацієнту антитіла або фрагмента за будь-яким з гурі 2, і амінокислотну послідовність від CDR1 до пп.1-25 або фармацевтичної композиції за п.26. CDR3 легкого ланцюга антитіла 11.2.1, показану 32. Спосіб збільшення цитотоксичної відповіді Тна фігурі 5. клітин пацієнта, що включає стадію введення паці25. Антитіло або фрагмент за п.1, які включають єнту антитіла або фрагмента за будь-яким з пп.1амінокислотну послідовність важкого ланцюга, що 25 або фармацевтичної композиції за п.26. містить амінокислотні залишки 1-89 послідовності 33. Спосіб за п.32, при якому вказане антитіло або SEQ ID NO:9, і додатково включають амінокислотфрагмент не опосередковують комплементзалежну послідовність легкого ланцюга, представлену в ну цитотоксичність. SEQ ID NO:22. 34. Спосіб лікування пухлини у пацієнта, що вклю26. Фармацевтична композиція, яка використовучає стадії введення пацієнту комбінації, що вклюється при лікуванні раку, запалення або аутоімунчає антитіло або фрагмент за будь-яким з пп.1-25 ного захворювання, що включає антитіло або фраабо фармацевтичну композицію за п.26, і клітин, гмент за будь-яким з пп.1-25 і фармацевтично які експресують колонієстимулюючий фактор граприйнятний носій. нулоцитів-макрофагів. 27. Лінія клітин, що продукує антитіло або фрагмент за будь-яким з пп.1-25. У даній заявці декларується пріоритет попередньої [патентної заявки США. серійний №60/113647, зареєстрованої 23 грудня 1998p.], розкриття якої повністю включене тут як посилання. Відповідно до даного винаходу тут пропонуються цілком людські моноклональні антитіла проти антигена 4 цитотоксичних Т-лимфоцитів людини (CTLA-4). Пропонуються послідовності нуклеотидів, що кодують амінокислотні послідовності, що включають молекули важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, зокрема, прилеглі послідовності важких і легких ланцюгів, охоплюючі райони, що визначають комплементарність (CDRs), особливо від FR1 і/або CDR1 до CDR3 і/або в межах FR4. Додатково пропонуються антитіла, що мають схожі зв'язуючі властивості, і антитіла (або інші антагоністи), що мають функціональні властивості, схожі з розкритими тут антитілами. Регуляція імунної відповіді у хворих повинна забезпечити бажане лікування багатьох захворювань людини, що може вести до специфічності дії, яка рідко зустрічається при застосуванні традиційних ліків. Повинна бути можливою як позитивна, так і негативна регуляція імунної відповіді. У зв'язку з регуляцією імунної відповіді інтенсивно вивчається і характеризується роль Т-клітин і В-клітин. Внаслідок цих досліджень виявилося, що в бага тьох випадках роль Т-клітин особливо важлива для профілактики і лікування захворювань. Т-клітини володіють дуже складними системами контролю взаємодії між ними. Для процесу взаємодії між Т-клітинами використовується множина рецепторів і розчинних факторів. Таким чином, ефект, який може надавати будь-який конкретний сигнал на імунну відповідь, залежить від конкретних факторів, рецепторів і зворотних рецепторів, які залучені до даного шляху. Шляхи негативної регуляції відповідей також важливі, як і шляхи, необхідні для активації. Навчання тимусу, яке веде до Т-клітинної толерантності, являє собою один з механізмів запобігання імунній відповіді на конкретний антиген. Відомі також інші механізми, такі як секреція цитокінів, що придушують імунну відповідь. Активація Т-клітин вимагає не тільки стимуляції через рецептор антигена (Т-клітинний рецептор (TCR)), але і додаткового сигналу через костимуляторні молекули поверхні клітини, такі як CD28. Лігандами для CD28 є білки В7-1 (CD80) і В7-2 (CD86), які експресуються на антигенпредставляючих клітинах, таких як дендритні клітини, активовані В-клітини або моноцити, які взаємодіють з CD28 або CTLA-4 Т-клітин для надання костимуляторного сигналу. Роль костимуляторної сигналізації досліджена при експериментальному алергічному енцефаломієліті (ЕАЕ) [Perrin et al., 9 76936 10 Iminunol Res 14: 189-99 (1995)]. ЕАЕ являє собою ляють ключові структурні особливості або варіааутоімунне порушення, індуковане Thl-клітинами, бельного (V), або константного (С) домену моленаправленими проти антигенів мієліну, що є мокул Ig. Члени суперсімейства Ig включають, але не деллю для вивчення in vivo ролі костимуляції, опообмежуються цим, власне імуноглобуліни, молесередкованої В7, в індукції патологічної імунної кули класу головного комплексу гістосумісності відповіді. За допомогою розчинного гібридного (МНС) (тобто МНС класу І і II) і молекули TCR. білкового ліганду рецепторів В7, а також монокло[У 1991 році Linsley et al., J. Exp. Med. 174: нальних антитіл, специфічних у відношенні або 561-569 (1991)] передбачили, що CTLA-4 є другим CD80, або CD86, Perrin et al. показали, що костирецептором для В7. Схожим образом [Harper et al., муляція В7 грає важливу роль у визначенні клінічJ. Immunol. 147: 1037-44 (1991)] показали, що моного виходу захворювання при ЕАЕ. лекули CTLA-4 і CD28 є близько родинними у миші Взаємодія між В7 і CD28 є одним з декількох і людини по послідовності, по експресії месенджекостимуляторних шляхів проведення сигналу, ра, по структурі гена і по хромосомнійлокалізації. який, мабуть, істотний для ініціювання дозрівання і [Дивися також Balzano et al., Int. J. Cancer. Suppl. проліферації специфічних у відношенні антигена 7: 28-32 (1992)]. Подальший доказ цієї ролі отриТ-клітин. Відсутність костимуляції при одночасній маний завдяки функціональним дослідженням. неадекватній продукції ІЛ-2 запобігає подальшій [Наприклад, Lenschow et al., Science 257: 789-792 проліферації Т-клітин і спричиняє стан відсутності (1992)] показали, що CTLA-4-Ig спричиняє довготреакції, який називається "анергією". Множина ривале виживання трансплантатів острівців підшвірусів і пухлин можуть гальмувати активацію і лункової залози. [Freeman et al., Science 262: 907проліферацію Т-клітин, що веде до недостатньої 909 (1993)] досліджували роль CTLA-4 у мишей з активності або відсутності реакції імунної системи дефіцитом В7. Визначення лігандів CTLA-4 [опигосподаря по відношенню до інфікованих або трасане Lenschow et al., P.N.A.S. 90: 11054-11058 нсформованих клітин. Серед ряду можливих по(1993)]. [Linsley et al., Science 257: 792-795 (1992)] рушень Т-клітин анергія може, щонайменше, частописують імуносупресію in vivo розчинною форково відповідати за нездатність організму мою CTLA-4. [Linsley et al., J. Exp. Med. 176: 1595господаря видаляти патогенні або пухлинні кліти604 (1992)] отримали антитіла, які зв'язували ни. Застосування білка В7 для опосередкування CTLA-4 і які не реагували перехресно з CD28, і протипухлинної імунної відповіді було [описане в дійшли висновку, що CTLA-4 коекспресується з Chen et al., Cell 71:1093-1102 (1992) і Townsend CD28 на активованих Т-лімфоцитах і кооперативand Allison, Science 259:368 (1993)]. В огляді но регулює адгезію Т-клітин і активацію під дією [Schwartz Cell 71: 1065 (1992)] розглядається роль В7. [Kuchroo et al., Cell 80: 707-18 (1995)] показали, CD28, CTLA-4 і В7 в утворенні ІЛ-2 і імунотерапії. що костимуляторні молекули В7-1 і В7-2 диферен[Harding et al. Nature 356:607-609 (1994)] демонційовано активують шляхи розвитку Th1/Th2. [Yiструють, що опосередкована CD28 передача сигQun et al., Int. Immunol. 8: 37-44 (1996)] показали, налу костимулює Т-клітини миші і запобігає індукції що для костимуляторних сигналів від членів сіанергії в клонах Т-клітин. Дивися також [патенти мейства В7 при їх додаванні до недавно активоваСША №№5434131, 5770197 і 5773-253], а також них зберігаючих пам'ять Т-клітин є диференціальні [заявки на міжнародні патенти №№WO 93/00431, вимоги відносно розчинних викликаних з пам'яті WO 95/01994/ WO 95/03408, WO 95/24217 і WO антигенів. [Дивися також de Boer et al., Eur J. 95/33770]. Immunol. 23: 3120-5(1993)]. З вказаного вище ясно, що для активації і поДекількома групами висловлене припущення дальшої диференціації до ефекторної функції Тпро альтернативні або окремі рецептор/ліганд клітинам потрібно два типи сигналів від антигенвзаємодії для CTLA-4 в порівнянні з CD28 і навіть представляючої клітини (АРС). По-перше, при взапередбачено наявність третього В-7 комплексу, ємодіях між TCR Т-клітин і молекулами МНС, що який впізнається антитілом ВВІ. [Дивися, наприпредставляють пептиди на АРС, виникає специфіклад, Hathcock et al., Science 262: 905-7 (1993), чний у відношенні антигена сигнал. По-друге, є Freeman et al., Science 262: 907-9 (1993), Freeman незалежний від антигенна сигнал, який виникає et al., J. Exp. Med. 178: 2185-92 (1993), Lenschow et при взаємодії CD28 з членами сімейства В7 (В7-1 al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 11054-8 (1993), (CD80) або В7-2 (CD86)). Спочатку було неясно, Razi-Wolf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: на якому точно етапі імунної відповіді втручається 11182-6 (1993) і Boussiotis et al., Proc. Natl. Acad. CTLA-4. Мишачий CTLA-4 був уперше ідентифікоSci. USA 90: 11059-63 (1993)]. Однак, [Freeman et ваний і клонований [Brunei et al., Nature 328: 267al., J. Immunol. 161: 2708-15 (1998)], обговорюють 270 (1987)] як один з результатів пошуку молекул, дані про те, що антитіло ВВІ зв'язує молекулу, яка які переважно експресуються на цитотоксичних Тідентична поверхово-клітинній формі CD74, і, отлімфоцитах. Незабаром після цього був ідентифіже, ВВ1 mAb зв'язується з білком, відмінним від кований і клонований CTLA-4 людини [Dariavach et В7-1, і цей епітоп є також на білці В7-1. Таким чиal., Eur. J. Immunol. 18: 1901-1905 (1988)]. Молекуном, це спостереження вимагало перегляду робіт ли CTLA-4 миші і людини мають приблизно 76% в даній області із застосуванням ВВ1 mAb при спільної гомології послідовності і наближаються до аналізі експресії і функції CD 80. повної ідентичності послідовності в своїх цитоплаПочинаючи з 1993 року з кульмінацією в 1995 зматичних доменах [Dariavach et al. Eur. J. році, дослідники зробили подальше з'ясування Imiaunol. 18: 1901-1905 (1988)]. CTLA-4 є членом ролі CTLA-4 в стимуляції Т-клітин. По-перше, заімуноглобулінового (Ig) суперсімейства білків. Сувдяки застосуванню моноклональних антитіл проперсімейство Ig являє собою групу білків, які виявти CTLA-4 [Walunas et al., Immunity 1: 405-13 11 76936 12 (1994)] представили докази того, що CTLA-4 може захворювання було пов'язане з підвищеним утводіяти як негативний регулювальник активації Тренням енцефалітогенних цитокінів TNF-alpha, клітин. Після цього Waterhouse et al.. Science IFN-gamma і ІЛ-2. Таким чином, вони дійшли ви270:985-988 (1995) показали, що в лімфатичних сновку, що CTLA-4 регулює інтенсивність аутоімувузлах і селезінці дефіцитних по CTLA-4 мишей нної відповіді при ЕАЕ, послаблюючи утворення нагромаджуються Т-лімфобласти з підвищеним запального цитокіну і клінічні вияви захворювання. рівнем маркерів активації. Т-лімфобласти прони[Дивися також Hurwitz et al., J Neuroimmunol 73: 57кали також в печінкову тканину, тканину серця, 62 (1997) і Серего et al., J. Exp. Med. 188: 199-204 легеневу і панкреатичну тканину, кількість сирова(1998)] (анти-СTLА-4 шпильковий рибозим, який ткового імуноглобуліну була підвищеною, а після специфічно блокує експресію CTLA-4 після трансстимуляції через Т-клітинний рецептор їх Т-клітини фекції гена на моделі мишачих Т-клітин). проліферували спонтанно і сильно, але вони були Крім того, [Blair et al., J. Immunol. 160: 12-5 схильні до клітинної загибелі, індукованої перех(1998)] оцінили функціональні впливи групи моноресною зшивкою Fas-рецептора і гамаклональних антитіл (mAbs) на CTLA-4 на CD4+ опроміненням. Waterhouse et al., дійшли висновку, клітинах, що покояться. їх результати показали, що CTLA-4 діє як негативний регулювальник актищо деякі моноклональні антитіла до CTLA-4 мовації Т-клітин і є життєво важливим для контролю жуть гальмувати проліферативні відповіді CD4+ гомеостазу лімфоцитів. У коментарі в тому ж випуклітин, що покояться і перехід клітинного циклу з ску [Allison and Krummel, Science 270: 932-933 фази GO в фазу G1. Інгібіторні ефекти CTLA-4 (1995)] обговорили роботу Waterhouse et al., як були очевидними в межах 4год, в час, коли екстаку, що демонструє те, що CTLA-4 діє, знижуючи пресія CTLA-4 на поверхні клітини залишається відповідь Т-клітин, або володіє гальмовою сигнатакою, що не визначається. Однак інші CTLA-4 льною функцією в активації і розвитку Т-клітин. mAbs не мали інгібіторних ефектів, що вказує на [Tivol et al., Immunity 3: 541-7 (1995)] також створите, що скріплення mAbs з CTLA-4 саме по собі не ли дефіцитних по CTLA-4 мишей і показали, що у досить для опосередкування негативної регуляції таких мишей швидко розвивається лімфопроліфеТ-клітинних відповідей. Цікаво, що поки продукція ративне захворювання з мультіорганною лімфоциІЛ-2 була вимкнена, інгібіторні анти-СТLА-4 mAbs тарною інфільтрацією і руйнуванням тканини, зокдопускали індукцію і експресію гена виживання рема, з важким міокардитом і панкреатитом. Вони клітин bc1-X(L). Відповідно до даного спостередійшли висновку, що CTLA-4 грає ключову роль в ження клітини залишалися життєздатними, і після негативній регуляції активації Т-клітин і підтримці скріплення CTLA-4 апоптоз не визначався. імунологічного гомеостазу. [Krumm. el and Allison J. У зв'язку з анергією [Perez et al., Immunity Exp. Med. 182: 459-65 (1995)] пізніше з'ясували, що 6:411-7 (1997)] показали, що індукція анергії ТCD28 і CTLA-4 володіють протилежною дією на клітин запобігалася шляхом блокування CTLA-4, і відповідь Т-клітин на стимуляцію. Вони створили вони дійшли висновку, що вихід впізнавання антиантитіло проти CTLA-4 і досліджували ефекти його гена Т-клітинами визначається шляхом взаємодії скріплення з CTLA-4 в системі з використанням CD28 або CTLA-4 на Т-клітинах з молекулами В7. високо очищених Т-клітин. У їх повідомленні було Також [Van Parijs et al., J. Exp. Med. 186: 1119-28 показано, що присутність низьких кількостей В7-2 (1997)] досліджували роль інтерлейкіну 12 і костина свіжоотриманих Т-клітинах може частково гамуляторів в анергії Т-клітин in vivo і знайшли, що льмувати проліферацію Т-клітин і це гальмування при інгібуванні скріплення CTLA-4 при індукції анеопосередковується взаємодіями з CTLA-4. Зшиття ргії проліферація Т-клітин блокувалася, і не стиCTLA-4 разом з TCR і CD28 сильно гальмує промулювалася остаточне диференціювання Тh1. ліферацію і секрецію ІЛ-2 Т-клітинами. Нарешті, ці Однак Т-клітини, піддані дії толерогенного антигерезультати показали, що CD28 і CTLA-4 передана в присутності як ІЛ-12, так і анти-СТLА-4 антитіють протилежні сигнали, які, мабуть, підсумовула, не ставали анергічними і поводилися ідентично ються Т-клітиною в формуванні відповіді на антиТ-клітинам, які зустрічалися з імуногенним антигеген. Таким чином, вони дійшли висновку, що ном. Ці результати передбачали, що in vivo в індурезультат стимуляції рецептора антигенна Ткцію анергії вносять внесок два процеси: зустріч з клітини регулюється костимуляторними сигналами CTLA-4, яка веде до блокади здатності Т-клітин CD28, а також гальмовими сигналами, що йдуть проліферувати і відсутність цитокіну запального від CTLA-4. [Дивися також Krummel et al., Int. типу, ІЛ-12, який запобігає диференціюванню ТImmunol. 8: 519-23 (1996) і патент США №5811097 клітин в Thl ефекторні клітини. Поєднання ІЛ-12 і і заявку на міжнародний патент №WO 97/20574]. анти-СТLА-4 антитіла було достатнім для перетБула проведена множина додаткових експеворення звичайно толерантного стимулу в імунориментів для подальшого з'ясування згаданої вигенний. ще функції CTLA-4. Наприклад, [Walunas et al., J. Відносно інфекцій [McCoy et al., J. Exp. Med. Exp. Med. 183: 2541-50 (1996)] завдяки застосу186: 183-7 (1997)] показали, що анти-CTLA-4 антиванню антитіл проти CTLA-4 передбачили, що сигтіла істотно збільшують і прискорюють Т-клітинну нали CTLA-4 не регулюють виживаність клітин або імунну відповідь на Nippostrongylus brasiliensis, що відповідь на ІЛ-2, але насправді гальмують залежведе до значного зниження кількості дорослих ну від CD28 продукцію ІЛ-2. Також [Perrin et al., J. особів і ранньому закінченню відкладення яєць Immunol. 157: 1333-6 (1996)] показали, що антитіла паразитами. [Дивися також Murphy et al., J. проти CTLA-4 при експериментальному алергічImmunol. 161: 4153-4160 (1998) (Leishmania ному енцефаломієліті (ЕАЕ) загострюють захвоdonovani)]. рювання і підвищують смертність. Загострення 13 76936 14 Відносно рака [Kwon et al., PNAS USA 94: Одночасна блокада CD80+CD86 була менш ефек8099-103 (1997)] розробили модель сингенного тивною при придушенні відповідей антитіл, ніж рака простати мишей і вивчили два окремих вплиблокада будь-якого окремо. Посилення костимуви, призначених для з'ясування відповіді, направляції за допомогою спільного введення експресуленої проти рака простати, через посилену костиючіх В7 плазмід збільшувало відповіді CTL, але не муляцію Т-клітин: (і) забезпечення прямої відповіді антитіл, і не було отримано вказівок на костимуляції клітинами рака простати з трансдукозміщення Th1 в бік Th2. Ці дані дозволяють передваною експресією ліганду В7.1 і (іі) опосередковабачати складні і окремі функції для CD28, CTLA-4, на антитілом блокада in vivo CTLA-4 Т-клітин, яка CD80 і CD86 при костимуляції Т-клітин після вакзапобігає негативній регуляції Т-клітин. Було покацинації нуклеїновою кислотою. зано, що опосередкована антитілом блокада in У зв'язку з відторгненням алотрансплантату vivo CTLA-4 посилює імунні відповіді проти рака [Markees et al., J Clin Invest 101: 2446-55 (1998)] простати. Також [Young et al., Cancer Res 57: 4036виявили на мишачій моделі відторгнення шкіряно41 (1997)] досліджували, чи веде блокада функції го алотрансплантату, що приживаність початково CTLA-4 до підвищення протиракових відповідей Тзалежить від присутності IFN-gamma, CTLA-4 і клітин на різних стадіях пухлинного зростання. На CD4(+) Т-клітин. Додавання в схему протоколу основі результатів, отриманих in vitro і in vivo, вони mAb проти CTLA-4 або проти IFN-gamma було виявили, що блокада CTLA-4 в індивідуумів, хвопов'язане з швидким відторгненням трансплантарих на рак, підвищує здатність генерувати протита, тоді як mAb проти ІЛ-4 не надавали дії. ракові ефекти Т-клітин, але вираженість такої поУ зв'язку з вивченням ролі CTLA-4 відносно силюючої дії була обмежена ранніми стадіями CD28 [Fallarino et al., J. Exp. Med. 188: 205-10 пухлинного зростання в їх моделі. Додатково (1998)] створили трансгенних мишей по TCR з де[Hurwitz et al., Proc Nati Acad Sci USA 95: 10067-71 фектним активуючим рекомбіназу геном 2 і CD28 (1998)] досліджували залежність генерації опоседикого типу або дефектним CD28, яких імунізували редкованого Т-клітинами протипухлинної відповіді експресуючою антигенною пухлиною. Праймовані від зустрічі рецептора Т-клітин з головним комплеТ-клітини мишей обох типів продукували цитокіни і ксом гістосумісності/антигеном, а також від скріппроліферували у відповідь на стимуляторні клітилення CD28 з В7. Деякі пухлини, такі як карцинома ни, не експресуючі В7. Однак, в той час як відпомолочної залози SM1, не піддавалися aHTH-CTLAвідь CD28+/+ Т-клітин посилювався костимуляцією 4 імунотерапії. Так, завдяки застосуванню поєдВ7-1, відповідь CD28-/- Т-клітин сильно гальмуванання блокади CTLA-4 і вакцини, що складається з лася. Це гальмування знімалося моноклональниSM1 клітин, експресуючіх колонієстимулюючий ми антитілами проти В7-1 або CTLA-4. Таким чифактор, гранулоцитів-макрофагів, спостерігалася ном, CTLA-4 може значно гальмувати активацію Трегресія початкових пухлин SM1, незважаючи на клітин у відсутність CD28, що вказує на те, що аннеефективність будь-якого лікування, що застосотагонізм опосередкованого TCR сигналу достатній вується окремо. Ця спільна терапія приводила до для пояснення гальмової дії CTLA-4. Схожим обтривалої імунної реакції по відношенню до SM1 і разом, [Lin et al., J. Exp. Med. 188: 199-204 (1998)] залежала як від CD4(+), так і від CD8(+) Т-клітин. вивчали відторгнення серцевих алотрансплантатів Результати дозволили передбачити, що блокада у мишей, дефектних по CD28. Серця H-2(q) трансCTLA-4 діє на рівні антиген-представляючих клітин плантували алогенним мишам дикого типу або господаря. дефектним по CD28 (Н-2(b)). Відторгнення трансВідносно діабету [Luhder et al., J. Exp. Med. плантата у дефектних по CD28 мишей відбувало187: 427-32 (1998)] вводили mAb проти CTLA-4 ся пізніше, ніж у мишей дикого типу. Обробка ретрансгенним по TCR мишам, що моделюють діаципієнтів дикого типу CTLA-4-імуноглобуліном (Іg) бет на різних стадіях захворювання. Вони виявиабо mAbs проти В7-1 плюс mAbs проти В7-2 значли, що зустріч CTLA-4 в момент, коли потенційно но продовжувала виживання алотрансплантата. діабетогенні Т-клітини активуються уперше, є Навпаки, обробка дефектних по CD28 мишей центральною подією; якщо зустріч забезпечується, CTLA-4-Ig/ mAbs проти В7-1 плюс mAbs проти В7-2 то відбувається інвазія острівців, але вона залиабо блокуючим mAb проти CTLA-4 спричиняла шається абсолютно нешкідливою протягом місяприскорення відторгнення алотрансплантата. Ця ців. Якщо цього не відбувається, то інсульт стає підвищена швидкість відторгнення алотранспланнабагато більш агресивним і швидко розвивається тата була пов'язана з більш сильною інфільтрацідіабет. єю моноядерних клітин і підвищеним рівнем транУ зв'язку з імунізацією вакциною [Horspool et скриптів IFN-gamma і ІЛ-6 в серцях донорів у al., J. Immunol. 160: 2706-14 (1998)] виявили, що необроблених мишей дикого типу і у дефектних по інтактне mAb проти CTLA-4, але не Fab фрагменCD28 мишей, оброблених CTLA-4-Ig або mAb проти, придушує первинну гуморальну відповідь на ти CTLA-4. Таким чином, негативна регуляторна pCIA/beta gal, не торкаючись відповідей, що виклироль CTLA-4 виходить за межі здатності запобігакаються з пам'яті, що вказує на те, що активація ти активації CD28 за допомогою лігандної конкуCTLA-4 гальмує утворення антитіл, але не прайренції. Навіть у відсутність CD28 CTLA-4 грає інгімінг Т-клітин. Блокада лігандів для CD28 і CTLA-4, біторну роль в регуляції відторгнення CD80 (В7-1) і CD86 (В7-2), виявила окрему функалотрансплантату. цію, яка не перекривається. Блокада CD80 при Досліджували також додаткові характеристики початковій імунізації повністю блокувала первинні і експресії CTLA-4. Наприклад, [Alegre et al., J. повторні відповіді антитіл, тоді як блокада CD86 Immunol. 157: 4762-70 (1996)] передбачили, що придушувала первинні, але не повторні відповіді. CTLA-4 поверхні швидко інтерналізується, що мо 15 76936 16 же пояснити низький рівень експресії, що звичайно На Фіг.6 представлене порівняння послідовновизначається на клітинній поверхні. Вони дійшли стей між передбаченими амінокислотними послівисновку, що CD28 і ІЛ-2 грають важливу роль в довностями легкого капа ланцюга клону 2.1.3 і підвищенні експресії CTLA-4. Крім того, акумуляція амінокислотною послідовністю батьківської лінії CTLA-4 на клітинній поверхні, мабуть, регулюється А10/А26. Відмінності між послідовністю батьківсьголовним чином за рахунок його швидкого ендоцикої лінії А10/А26 і тією ж послідовністю в клоні позтозу. Також [Castan et al., Immunology 90: 265-71 начені жирним шрифтом. На Фіг.також вказані по(1997)] на основі імуногістохімічного аналізу ексложення послідовностей CDR1, CDR2 і CDR3 пресії CTLA-4 in situ передбачили, що Т-клітини антитіла у вигляді підкреслення. зародкового центра, які є CTLA-4-позитивними, На Фіг.7 представлене порівняння послідовномогли б бути важливими для імунної регуляції. стей між передбаченими амінокислотними посліВідповідно, в світлі широкої і важливої ролі, довностями легкого капа ланцюга клону 12.3.1 і яку CTLA-4, мабуть, грають в імунній відповіді, амінокислотною послідовністю батьківської лінії було б бажано створити антитіла до CTLA-4, які А17. Відмінності між послідовністю батьківської можуть бути ефективно застосовані в імунотерапії. лінії А17 і тією ж послідовністю в клоні позначені Більш того було б бажано створити антитіла проти жирним шрифтом. На Фіг. також вказані положенCTLA-4, які можуть бути застосовані при хронічних ня послідовностей CDR1, CDR2 і CDR3 антитіла у захворюваннях, при яких потрібні повторні ввевигляді підкреслення. дення антитіл. На Фіг.8 представлене порівняння послідовноНа Фіг.1 представлена серія нуклеотидних і стей між передбаченими амінокислотними посліамінокислотних послідовностей важкого ланцюга і довностями легкого капа ланцюга клону 12.9.1 і легкого капа ланцюга імуноглобулінових молекул амінокислотною послідовністю батьківської лінії відповідно до винаходу: 4.1.1 (Фіг.1А), 4.8.1 А3/А 19. Відмінності між послідовністю батьківської (Фіг.1В), 4.14.3 (Фіг.1С), 6.1.1 (Фіг.1D), 3.1.1 лінії А3/А 19 і тією ж послідовністю в клоні позна(Фіг.1E), 4.10.2 (Фіг.1F), 2.1.3 (Фіг.1G), 4.13.1 чені жирним шрифтом. На Фіг. також вказані поло(Фіг.1H), 11.2.1 (Фіг.1I), 11.6.1 (Фіг.1J), 11.7.1 ження послідовностей CDR1, CDR2 і CDR3 антиті(Фіг.1K), 12.3.1.1 (Фіг.1L) і 12.9.1.1 (Фіг.1М). ла у вигляді підкреслення. На Фіг.2 представлене порівняння послідовноНа Фіг.9 представлене узагальнення Nстей між передбаченими амінокислотними послікінцевих амінокислотних послідовностей, отримадовностями важкого ланцюга клонів 4.1.1, 4.8.1, них за допомогою прямого білкового секвенування 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, важкого і легкого ланцюгів антитіл. 11.7.1, 12.3.1.1 і 12.9.1.1 і амінокислотною посліНа Фіг.10 представлена певна додаткова індовністю батьківської лінії DP-50 (3-33). Відмінносформація, що характеризує деякі з антитіл відпоті між послідовністю батьківської лінії DP-50 і тією відно до даного винаходу. На Фіг.10А підсумовані ж послідовністю в клонах позначені жирним шрифдані, що відносяться до клонів 3.1.1, 41.1.1, 4.8.1, том. На Фіг. також вказані положення послідовнос4.10.2, 4.14.3 i 6.1.1. Представлені дані, що віднотей CDR1, CDR2 і CDR3 антитіл у вигляді затінень. сяться до концентрації, ізоелектричного фокусуНа Фіг.3 представлене порівняння послідовновання (IEФ), ДДС-Nа-ПАГЕ, розмірно-ексклюзійної стей між передбаченими амінокислотними посліхроматографії (SEC), рідинної хромато/массдовностями важкого ланцюга клону 2.1.3 і аміноспектроскопії (РХМС), мас-спектроскопії (MALD1), кислотною послідовністю батьківської лінії DP-65 N-кінцевим послідовностям легких ланцюгів. Дода(4-31). Відмінності між послідовністю батьківської ткова докладна інформація, що відноситься до лінії DP-65 і тією ж послідовністю в клоні позначені ІЕФ, представлена на Фіг.10В; що відноситься до жирним шрифтом. На Фіг. також вказані положенДЦС-Na-ПAAГ, представлена на Фіг.10С; і SEC ня послідовностей CDR1, CDR2 і CDR3 антитіла у антитіла 4.1.1 на Фіг.10D. вигляді підкреслення. На Фіг.11 представлена експресія В7-1 і В7-2 На Фіг.4 представлене порівняння послідовнона клітинах Raji із застосуванням mAbs проти CDстей між передбаченими амінокислотними послі80-PE і CD86-PE. довностями легкого капа ланцюга клонів 4.1.1, На Фіг.12 представлене залежне від концент4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 і 4.13.1 і амінокислотною рації збільшення продукції ІЛ-2 в тесті Тпослідовністю батьківської лінії А27. Відмінності лімфобластів/Raji, індуковане блокуючими антитіміж послідовністю батьківської лінії А27 і тією ж лами проти CTLA-4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 і 6.1.1). послідовністю в клоні позначені жирним шрифтом. На Фіг.13 представлене залежне від концентНа Фіг. також вказані положення послідовностей рації збільшення продукції IFN- в тесті ТCDR1, CDR2 і CDR3 антитіла у вигляді підкреслімфобластів/Raji, індуковане блокуючими антитілення. Уявні делеції в CDR1s клонів 4.8.1, 4.14.3 і лами проти CTLA-4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 і 6.1.1) (той 6.1.1 позначені як "0s". же донор Т-клітин). На Фіг.5 представлене порівняння послідовноНа Фіг.14 представлене середнє збільшення стей між передбаченими амінокислотними посліпродукції ІЛ-2 Т-клітинами від 6 донорів, індуковадовностями легкого капа ланцюга клонів 3.1.1, не антитілами що блокують проти CTLA-4, в тесті 11.2.1, 11.6.1 і 11.7.1 і амінокислотною послідовніТ-лімфобластів/Raji. стю батьківської лінії 012. Відмінності між послідоНа Фіг.15 представлене середнє збільшення вністю батьківської лінії 012 і тією ж послідовністю продукції INF- Т-клітинами від 6 донорів, індуков клоні позначені жирним шрифтом. На Фіг. також ване блокуючими антитілами проти CTLA-4, в тесті вказані положення послідовностей CDR1, CDR2 і Т-лімфобластів/Raji. CDR3 антитіла у вигляді підкреслення. 17 76936 18 На Фіг.16 представлене збільшення продукції яку вибирають з групи, що складається з послідоІЛ-2 в hPBMC від 5 донорів, індуковане блокуючивності, що включає SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, ми mAbs проти CTLA-4, виміряне через 72 години SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, після стимуляції SEA. SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, На Фіг.17 представлене збільшення продукції SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, ІЛ-2 в суцільній крові від 3 донорів, індуковане SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 65, блокуючими mAbs проти CTLA-4, виміряне через SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69 і SEQ ID NO: 71. 72 і 96 годин після стимуляції SEA. Відповідно до другого варіанту даного винахоНа Фіг.18 представлено гальмування зростанду пропонується антитіло, що включає амінокисня пухлини антитілами проти CTLA-4 миші в милотну послідовність важкого ланцюга, яка включає шачій пухлинній моделі фібросаркоми. SEQ ID NO: 1 і амінокислотну послідовність варіаНа Фіг.19 представлене збільшення продукції бельної частини легкого ланцюга, яка включає ІЛ-2, індуковане антитілами проти CTLA-4 (4.1.1 і SEQ ID NO: 14. 11.2.1) даного винаходу, через 72 години в тестах Відповідно до третього варіанту даного винаТ-лімфобластів/Raji і суперантигену (суцільна кров ходу пропонується антитіло, що включає амінокиі моноядерні клітини периферичної крові від 6 дослотну послідовність важкого ланцюга, яка вклюнорів). чає SEQ ID NO: 2 і амінокислотну послідовність На Фіг.20 представлене дозозалежне збільваріабельної частини легкого ланцюга, яка вклюшення продукції ІЛ-2, індуковане антитілами проти чає SEQ ID NO: 15. CTLA-4 (4.1.1 і 11.2.1) даного винаходу, через 72 Відповідно до четвертого варіанту даного вигодини в тесті Т-лімфобластів/Raj і. находу пропонується антитіло, що включає аміноНа Фіг.21 представлене дозозалежне збількислотну послідовність важкого ланцюга, яка шення продукції ІЛ-2, індуковане антитілами проти включає SEQ ID NO: 4 і амінокислотну послідовCTLA-4 (4.1.1 і 11.2.1) даного винаходу, через 72 ність варіабельної частини легкого ланцюга, яка години в тесті суперантигену з суцільною кров'ю включає SEQ ID NO: 17. при стимуляції 100нг/мл суперантигену. Відповідно до п'ятого варіанту даного винахоНа Фіг.22 представлені серії додаткових нукду пропонується виділене моноклональне антитіло леотидних і амінокислотних послідовностей настулюдини, яке здатне взаємодіяти з CTLA-4. У перепних ланцюгів антитіл проти CTLA-4: повнорозмірважному здійсненні антитіло здатне конкурувати ний важкий ланцюг 4.1.1 (кДНК 22(а)), геномна за скріплення з CTLA-4 з антитілом, яке вибирають ДНК 22(b) і амінокислотна послідовність 22(с), поз групи, що складається з 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, внорозмірний деглікозильований важкий ланцюг 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 і 4.1.1 (кДНК 22(d)), і амінокислотна послідовність 12.9.1.1. В іншому переважному здійсненні антиті22(е), легкий ланцюг 4.1.1 (кДНК 22(f)), і амінокисло володіє по суті схожою специфічністю скріплотна послідовність 22(g), повнорозмірний важкий лення з CTLA-4, що і антитіло, яке вибирають з ланцюг 4.8.1 (кДНК 22(h)), і амінокислотна послігрупи, що складається з 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, довність 22(і), легкий ланцюг 4.8.1 (кДНК 22(j)), і 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 і амінокислотна послідовність 22(k), повнорозмір12.9.1.1. В іншому переважному здійсненні антитіний важкий ланцюг 6.1.1 (кДНК 22(l)), і амінокислоло вибирають з групи, що складається з 3.1.1, тна послідовність 22(m), легкий ланцюг 6.1.1 (кДНК 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 22(n)), і амінокислотна послідовність 22(про), пов11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 і 12.9.1.1. В іншому переванорозмірний важкий ланцюг 11.2.1 (кДНК 22(р)), і жному здійсненні антитіло не реагує перехресно з амінокислотна послідовність 22(q) і легкий ланцюг CTLA-4 нижчих видів ссавців, переважно нижчі 11.2.1 (кДНК 22(r)), і амінокислотна послідовність види ссавців включають мишу, пацюка і кролика і 22(s). більш переважно мишу і пацюка. В іншому переВідповідно до першого варіанту даного винаважному здійсненні антитіло реагує перехресно з ходу пропонується антитіло, яке здатне зв'язувати CTLA-4 приматів, переважно примати включають CTLA-4, що включає амінокислотну послідовність довгохвостих макак і макак-резус. В іншому переваріабельної області важкого ланцюга, яка вклюважному здійсненні антитіло володіє вибірковістю чає прилеглу амінокислотну послідовність від посу відношенні CTLA-4 в порівнянні з CD28, В7-2, лідовності FR1 до послідовності FR3 включно, що CD44 і hlgG1, більш ніж приблизно 100:1 і перевакодується сімейством генів людини VH3-33, і яка жно приблизно 500:1 або більше. В іншому перевключає, щонайменше, одну з амінокислотних важному здійсненні спорідненість скріплення антизамін в послідовностях CDR1, послідовностях тіла становить приблизно 10-9М або вище і CDR2 або рамках послідовностей, представлених переважно приблизно 10-10М або вище. В іншому на Фіг.2. В переважному здійсненні амінокислотна переважному здійсненні антитіло гальмує скріппослідовність включає послідовність, яку вибиралення між CTLA-4 і В7-2 з IC50 менше, ніж приблиють з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ зно 100нМ і переважно менше, ніж приблизно ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 0,38нМ. В іншому переважному здійсненні антиті5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ло гальмує скріплення між CTLA-4 і В7-1 з ІС50 ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID менше, ніж приблизно 100нМ або вище і переважNO: 13, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID но менше, ніж приблизно 0,50нМ. В іншому переNO: 66, SEQ ID NO: 68 і SEQ ID NO: 70. В іншому важному здійсненні антитіло збільшує продукцію переважному здійсненні антитіло додатково вклюІЛ-2 в тесті Т-лімфобластів/Raji на приблизно чає амінокислотну послідовність варіабельної об500пг/мл або вище і переважно на приблизно ласті легкого ланцюга, включаючи послідовність, 3846пг/мл або вище. В іншому переважному здійс 19 76936 20 п.32 додатково включає будь-яку з соматичних ненні антитіло збільшує продукцію IFN- в тесті Тмутацій в послідовностях FR1, FR2 і FR3, як пролімфобластів/Raji на приблизно 500пг/мл або видемонстровано на Фіг.2. ще і переважно на приблизно 1233пг/мл або вище. Відповідно до восьмого варіанту даного винаВ іншому переважному здійсненні антитіло збільходу пропонується антитіло, яке взаємодіє з CTLAшує продукцію ІЛ-2 в тесті суперантигену в hPBMC 4, що включає амінокислотну послідовність важкоабо суцільній крові на приблизно 500пг/мл або го ланцюга, яка включає послідовності FR1, FR2 і вище. В іншому переважному здійсненні антитіло FR3 людини, що кодується сімейством генів людизбільшує продукцію ІЛ-2 в тесті суперантигену в ни VН 3-33, оперативно пов'язану в рамці з посліhPBMC або суцільній крові на приблизно 500пг/мл довністю CDR1, CDR2 і CDR3, причому антитіло або переважно на 1500пг/мл або вище, або вище має наступні властивості: спорідненість скріплення ніж на приблизно 30% або переважно на 50% по по відношенню до CTLA-4 приблизно 10-9 або вивідношенню до контролю. ще; гальмування скріплення між CTLA-4 і В7-1 з Відповідно до шостого варіанту даного винаІС50 приблизно 100нМ або менше; гальмування ходу пропонується гуманізоване (наближене до скріплення між CTLA-4 і В7-2 з ІС50 приблизно людського) антитіло, яке володіє по суті схожою 100нМ або менше; і збільшення продукції цитокінів специфічністю скріплення з CTLA-4, що і антитіло, в тесті Т-клітин людини на 500пг/мл або вище. яке вибирають з групи, що складається з 3.1.1, Відповідно до дев'ятого варіанту даного вина4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, ходу пропонується антитіло, яке взаємодіє з CTLA11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 і 12.9.1.1. У переважному 4, що включає амінокислотну послідовність важкоздійсненні антитіло не реагує перехресно з CTLA-4 го ланцюга, яка включає послідовності FR1, FR2 і нижчих видів ссавців, переважно нижчі види ссавFR3, оперативно пов'язану в рамці з послідовністю ців включають мишу, пацюка і кролика і переважно CDR1, CDR2 і CDR3, яку незалежно вибирають з мишу і пацюка. В іншому переважному здійсненні послідовностей CDR1, CDR2 і CDR3, представлеантитіло реагує перехресно з CTLA-4 приматів, них на фігурах 2 і 3, причому антитіло має наступні переважно примати включають довгохвостих мавластивості: спорідненість скріплення по віднокак і макак-резус. В іншому переважному здійсшенню до CTLA-4 приблизно 10-9 або вище; гальненні антитіло володіє вибірковістю по відношенмування скріплення між CTLA-4 і В7-1 з ІС50 прибню до CTLA-4 в порівнянні з CD28, В7-2, CD44 і лизно 100нМ або менш; гальмування скріплення hlgGl, більш ніж приблизно 100:1 і переважно приміж CTLA-4 і В7-2 з ІС50 приблизно 100нМ або близно 500:1 або більше. В іншому переважному менш; і збільшення продукції цитокінів в тесті Тздійсненні спорідненість скріплення антитіла стаклітин людини на 500пг/мл або вище. новить приблизно 10-9Μ або вище і переважно -10 Відповідно до десятого варіанту даного винаприблизно 10 Μ або вище. В іншому переважноходу пропонується система культур клітин для му здійсненні антитіло гальмує скріплення між визначення стимуляції Т-клітин, що включає кульCTLA-4 і В7-2 з IC50 менше, ніж приблизно 100нМ і туру Т-лімфобластів людини, що співкультивуєтьпереважно менше, ніж приблизно 0,38нМ. В іншося з клітинною лінією Raji. У переважному здійсму переважному здійсненні антитіло гальмує скріненні Т-лімфобласти промивають перед плення між CTLA-4 і В7-1 з IC50 менше, ніж прибкультивуванням з клітинною лінією Raji. лизно 100нМ або вище і переважно менше, ніж Відповідно до одинадцятого варіанту даного приблизно 0,50нМ. В іншому переважному здійсвинаходу пропонується метод вимірювання стиненні антитіло збільшує продукцію ІЛ-2 в тесті Тмуляції Т-клітин, що включає: надання культури Тлімфобластів/Raji на приблизно 500пг/мл або вилімфобластів людини і клітинної лінії Raji; контакще і переважно на приблизно 3846пг/мл або вище. тування культури з агентом; і вимірювання продуВ іншому переважному здійсненні антитіло збількції цитокінів культурою. шує продукцію IFN- в тесті Т-лімфобластів/Raji на Відповідно до дванадцятого варіанту даного приблизно 500пг/мл або вище і переважно на привинаходу пропонується функціональний метод близно 1233пг/мл або вище. В іншому переважноскринінгу частини зі стимуляторною функцією відму здійсненні антитіло збільшує продукцію ІЛ-2 в носно Т-клітин, що включає: надання культури Ттесті суперантигену в hPBMC або суцільній крові лімфобластів людини і клітинної лінії Raji; контакна приблизно 500пг/мл або вище. В іншому перетування культури з даною частиною; і вимірювання важному здійсненні антитіло збільшує продукцію продукції цитокінів культурою. ІЛ-2 в тесті суперантигену в hPBMC або суцільній Відповідно до тринадцятого варіанту даного крові на приблизно 500пг/мл або переважно на винаходу пропонується тест Т-клітинної стимуляції 1500пг/мл або вище, або вище ніж на приблизно для оцінки інгібіторної функції CTLA-4, що вклю30% або переважно 50% по відношенню до контчає: контактування культури, що включає Тролю. лімфобласти людини і клітинну лінію Raji, з агенВідповідно до сьомого варіанту даного винатом і визначення продукції цитокінів культурою. ходу пропонується антитіло, яке взаємодіє з CTLAВідповідно до чотирнадцятого варіанту даного 4, що включає амінокислотну послідовність важковинаходу пропонується спосіб скринінгу агента на го ланцюга, яка включає послідовності FR1, FR2 і стимуляторну активність відносно Т-клітин, що FR3 людини, що кодується сімейством генів людивключає: контактування агента з клітинною кульни VН 3-33, оперативно пов'язану в рамці з послітурою, що включає Т-лімфобласти людини і клідовністю CDR1, CDR2 і CDR3, причому послідовтинну лінію Raji; і визначення продукції цитокінів ності CDR1, CDR2 і CDR3 незалежно вибирають з культурою. послідовностей CDR1, CDR2 і CDR3, представлених на Фіг.2. В переважному здійсненні антитіло за 21 76936 22 У кожному з варіантів з десятого по чотирнадмається на увазі контекстом, окремі терміни поцятий даного винаходу в переважному здійсненні винні включати множини і множинні терміни поТ-лімфобласти промивають перед культивуванням винні включати окремі. Загалом, використані тут з клітинною лінією Raji. У іншому переважному номенклатури і способи, що застосовуються у відносинах з клітинною і тканинною культурою, молездійсненні цитокін являє собою ІЛ-2 або IFN-. У кулярною біологією, а також білковою і оліго- або переважному здійсненні агент являє собою антитіполінуклеотидною хімією і гібридизацією, добре ло і переважно взаємодіє з CTLA-4. відомі і загальноприйняті в техніці. Для рекомбінаВідповідно до п'ятнадцятого варіанту даного нтної ДНК, синтезу олігонуклеотидів, клітинної кувинаходу пропонується тест для вимірювання льтури і трансформації застосовуються стандартні стимуляції Т-клітин, що включає: надання популяспособи (наприклад, електропорація, ліпофекція). ції мононуклеарних клітин периферичної крові люФерментативні реакції і способи очищення здійсдини (hPBMC) або суцільної крові людини, стимунюють відповідно до вказівок виробника або як це льованої ентеротоксином А стафілокока; звичайно виготовляється в техніці, або як тут опиконтактування культури з агентом; і вимірювання сано. Вказані вище способи і процедури звичайно продукції цитокінів популяцією клітин. проводять відповідно до традиційних способів, Відповідно до шістнадцятого варіанту даного добре відомих в техніці, і як описано в різних загавинаходу пропонується функціональний тест для льних і більш спеціальних посиланнях, які цитускринінгу частини зі стимуляторною функцією відються і обговорюються в ході даного опису. Дивиносно Т-клітин, що включає: надання популяції ся, [наприклад, Sambrook et al., Molecular Cloning: мононуклеарних клітин периферичної крові людиA Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor ни або суцільної крові людини, стимульованої енLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))], теротоксином А стафілокока; контактування кульяка включена тут як посилання. Номенклатури, що тури з даною частиною; і визначення продукції використовуються тут і лабораторні процедури і цитокінів популяцією клітин. способи, що застосовуються в зв'язку з аналітичВідповідно до сімнадцятого варіанту даного ною хімією, синтетичною органічною хімією і медивинаходу пропонується тест Т-клітинної стимуляції чною і фармацевтичною хімією, добре відомі і задля оцінки інгібіторної функції CTLA-4, що включає гальноприйняті в техніці. Для хімічних синтезів, контактування популяції мононуклеарних клітин хімічних аналізів, отримання фармацевтичних периферичної крові людини або суцільної крові препаратів, їх складання і доставки, а також лікулюдини, стимульованої ентеротоксином А стафівання хворих застосовують стандартні способи. локока, з агентом і визначення продукції цитокінів Якщо це спеціально не вказане інакше, під напопуляцією клітин. ступними термінами, що застосовуються відповідВідповідно до вісімнадцятого варіанту даного но до даного розкриття, потрібно розуміти наступні винаходу пропонується спосіб скринінгу агента на значення: стимуляторну активність відносно Т-клітин, що Термін "виділений полінуклеотид", що застовключає: контактування агента з популяцією мосовується тут буде означати полінуклеотид геномнонуклеарних клітин периферичної крові людини ного, кДНК або синтетичного походження або їх або з суцільною кров'ю людини, стимульованих певне поєднання, причому "виділений полінуклеоентеротоксином А стафілокока; і визначення протид" внаслідок свого походження (1) не пов'язаний дукції цитокінів популяцією клітин. з цілим або з частиною полінуклеотиду, в якому У кожному з п'ятнадцятого по вісімнадцятий "виділений полінуклеотид" знаходиться в природваріанти даного винаходу в переважному здійсних умовах, (2) операційно пов'язаний з полінуклененні цитокін являє собою ІЛ-2. У іншому переваотидом, до якого він не приєднаний в природних жному здійсненні продукцію цитокінів вимірюють в умовах або (3) не існує в природі у вигляді частини супернатанті, виділеному з культури. У переважбільш довгої послідовності. ному здійсненні агент являє собою антитіло і пеТермін "виділений білок", що застосовується реважно взаємодіє з CTLA-4. тут означає білок, що кодується кДНК, рекомбінанВідповідно до даного винаходу пропонуються тною РНК, або синтетичного походження або що повністю людські моноклональні антитіла проти визначається їх певним поєднанням, причому "виCTLA-4 людини. Пропонуються нуклеотидні посліділений білок" внаслідок свого походження або довності, що кодують амінокислотні послідовності, джерела походження (1) не пов'язаний з білками, що включають важкий і легкий ланцюги молекул виявленими в природі, (2) вільний від білків з того імуноглобуліну, зокрема, послідовності, відповідні ж джерела, наприклад, вільний від білків миші, (3) близьким ним послідовностям важкого і легкого експресується клітинами різних видів або (4) не ланцюгів від FR1 і CDR1 до CDR3 і FR4 включно. існує в природі. Далі пропонуються антитіла, що володіють схожиТермін "поліпептид", що застосовується тут як ми зв'язуючими властивостями, і антитіла (або родове поняття відноситься до нативного білка, інші антагоністи), що володіють функціями, схожифрагментів або аналогів поліпептидної послідовми з функціями розкритих тут антитіл. Пропонуності. Отже, нативний білок, фрагменти і аналоги є ються також гібридоми, що експресують такі імуновидами роду поліпептидів. Переважні поліпептиди глобулінові молекули і моноклональні антитіла. відповідно до винаходу включають важкий ланцюг Визначення молекул імуноглобулінів людини і легкий капа лаЯкщо це не визначене тут інакше, наукові і тенцюг молекул імуноглобулінів людини, представхнічні терміни, що застосовуються в зв'язку з далені на Фіг.1, а також молекули антитіл, що утвоним винаходом, повинні мати значення, які загарюються поєднаннями, що включають важкий льнозрозумілі для фахівців. Далі, якщо це не 23 76936 24 ланцюг молекул імуноглобулінів і легкий ланцюг фосфорселеноатні, фосфордиселеноатні, фосфомолекул імуноглобулінів, такий як легкий капа ларанілтіоатні, фосфораніладатні, фосфорамідні і нцюг молекул імуноглобулінів, і навпаки, як і їх тому подібне. Дивися, [наприклад, LaPlanche et al., фрагменти і аналоги. Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al., J. Am. Термін "існуючий в природі", що застосовуєтьChem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al., Nucl. ся тут відносно об'єкта відноситься до того факту, Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer що об'єкт може бути виявлений в природі. НаприDrug Design 6: 539 (1991); Zon et al., клад, поліпептидна або полінуклеотидна послідовOligonucleotides and Analogues: A Practical ність, присутня в організмі (включаючи віруси), яка Approach, pp.87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford може бути виділена з природного джерела і яка не University Press, Oxford England (1991)); Stec et al., була навмисно модифікована людиною в лаборапатент США No.5151510; Uhlmann and Peyman торії або іншим способом, є "існуючою в природі". Chemical Reviews 90:543 (1990)], відкриття яких Термін "операційно пов'язаний", що застосовключені тут як посилання. Якщо це бажане, олівується тут відноситься до положень компонентів, гонуклеотиди можуть включати мітку для їх визнащо описується таким чином, які дозволяють їм чення. функціонувати властивим ним способом. Керуюча Термін "виборче гібридизований", що застосопослідовність, "операційно пов'язана" з кодуючою вується тут означає такий, що визначається і спепослідовністю таким способом, що при умовах, цифічно пов'язаний. Полінуклеотиди, олігонуклеосумісних з керуючими послідовностями, досягатиди і їх фрагменти відповідно до даного винаходу ється експресія кодуючої послідовності. виборчо гібридизуються з ланцюгами нуклеїнових Термін "керуюча послідовність", що застосовукислот в умовах гібридизації і промивки, які звоється тут відноситься до полінуклеотидних послідять до мінімуму кількість неспецифічного скріпдовностей, які необхідні для забезпечення експрелення, що визначається, яке піддається оцінці з сії і процесінгу кодуючих послідовностей, до яких нуклеїновими кислотами. Як відомо фахівцям в вони приєднані. Природа таких керуючих послідоданій області і як тут обговорюється, можуть бути вностей розрізнюється в залежності від організму застосовані дуже суворі умови для досягнення господаря; у прокаріот такі керуючі послідовності умов виборчої гібридизації. Звичайно гомологія звичайно включають промотор, сайт скріплення з послідовностей нуклеотидів між полінуклеотидарібосомою і послідовність термінації транскрипції; ми, олігонуклеотидами і фрагментами даного вив евкаріот керуючі послідовності звичайно вклюнаходу і цікавлячою послідовністю нуклеотидів чають промотори і послідовність термінації трансповинна бути, щонайменше, 80% і більш типово крипції. Термін "керуючі послідовності" призначегомологія, що переважно збільшується, щонаймений для включення, як мінімум, всіх компонентів, нше, до 85%, 90%, 95%, 99% і 100%. Дві амінокисприсутність яких необхідна для експресії і процесілотні послідовності є гомологічними, якщо між цингу, і може також включати додаткові компоненти, ми послідовностями існує часткова або повна присутність яких корисна, наприклад, лідируючі ідентичність. Наприклад, 85% гомологія означає, послідовності і послідовності гібридного партнера. що 85% амінокислот ідентичні, коли дві послідовТермін "полінуклеотид", що застосовується тут ності порівнюються на предмет максимального означає полімерну форму нуклеотидів довжиною, поєднання. Допускаються пропуски (в будь-якій з щонайменше, 10 основ, або рібонуклеотидів, або двох послідовностей, що порівнюються) для макдезоксирібонуклеотидів, або модифікованої форсимізації поєднання; причому переважні пропуски ми будь-якого типу нуклеотиду. Термін включає довжиною 5 або менш і більш переважні довжиодноспіральні і двоспіральні форми ДНК. ною 2 або менш. В іншому варіанті переважно дві Термін "олігонуклеотид", що застосовується білкові послідовності (або поліпептидні послідовтут включає існуючі в природі і модифіковані нукності, або ті, що беруть від них початок поліпептилеотиди, пов'язані один з одним існуючими в придні послідовності довжиною, щонайменше, 30 аміроді і природно не існуючими олігонуклеотидними нокислот) є гомологічними в значенні, що зв'язками. Олігонуклеотиди являють собою підгрузастосовується тут, якщо показник поєднання біпу полінуклеотидів, що звичайно має довжину в льше за 5 (в одиницях стандартного відхилення), 200 основ або менш. Переважно олігонуклеотиди що визначається за допомогою програми ALIGN із мають довжину від 10 до 60 основ і більш перевазастосуванням матриці даних по мутаціях і штражно довжину від 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або фними очками за пропуски 6-ти або більше. [Диви20 до 40 основ. Олігонуклеотиди звичайно є однося Dayhoff, М.О., in Atlas of Protein Sequence and спіральними, наприклад, для проб; хоч олігонукStructure, pp.101-110 (Volume 5, National Biomedical леотиди можуть бути двоспіральними, наприклад, Research Foundation (1972)) і Supplement 2 до цьодля застосування в конструкції мутантного гена. го тому, pp.1-10]. Дві послідовності або їх частини Олігонуклеотиди винаходу можуть бути або смисбільш переважно є гомологічними, якщо їх аміноловими, або антисмисловими олігонуклеотидами. кислоти ідентичні на 50% або більш при оптимаТермін "існуючі в природі нуклеотиди", що зальному поєднанні із застосуванням програми стосовується тут включає дезоксирібонуклеотиди і ALIGN. Термін "відповідає", що застосовується тут, рібонуклеотиди. Термін "модифіковані нуклеотиозначає, що послідовність нуклеотидів гомологічна ди", що застосовується тут включає нуклеотиди з (тобто є ідентичною, не маючи суворого загальномодифікованими або заміщеними групами цукрів і го еволюційного походження) всій полінуклеотидтому подібне. Термін "олігонуклеотидні зв'язки", ній послідовності порівняння або її частини, або що застосовується тут включає такі олігонуклеощо полінуклеотидна послідовність ідентична політидні зв'язки, як фосфортіоатні, фосфордитіоатні, пептидній послідовності порівняння. На відміну від 25 76936 26 цього термін "комплементарна чомусь" застосову(тобто ведучого до найбільшого процента гомолоється тут для позначення того, що комплементаргії у вікні порівняння). на послідовність гомологічна всій послідовності Термін "ідентичність послідовностей" означає, полінуклеотидів порівняння або її частини. Наприщо дві полінуклеотидні або амінокислотні послідоклад, нуклеотидна послідовність "ТАТАС" відповівності ідентичні у вікні порівняння (тобто на основі дає послідовності порівняння "ТАТАС" і комплемезбігу нуклеотиду з нуклеотидом або залишку із нтарна послідовності порівняння "GTATA". залишком). Термін "процент ідентичності послідоНаступні терміни застосовуються для опису вностей" розраховують шляхом порівняння двох взаємозв'язків послідовностей між двома або оптимально суміщених послідовностей у вікні побільш послідовностями полінуклеотидів або амінорівняння, визначення числа положень, в яких в кислот: "послідовність порівняння", "вікно порівобох послідовностях знаходиться ідентична осноняння", "ідентичність послідовностей", "процент ва нуклеїнових кислот (наприклад, А, Т, С, G, U ідентичності послідовностей" і "значна ідентичабо І) або залишок для отримання числа парних ність". "Послідовність порівняння" являє собою положень, розподілу числа парних положень на певну послідовність, що застосовується як основа загальне число положень у вікні порівняння (тобто для порівняння послідовностей; послідовність пона розмір вікна) і множення результату на 100 для рівняння може бути частиною більшої послідовноотримання процента ідентичності послідовностей. сті, наприклад, дільницею повнорозмірної кДНК Термін "значна ідентичність", що застосовується або послідовності гена, даної в списку послідовнотут означає характеристику полінуклеотидної або стей, або може включати повну послідовність амінокислотної послідовності, де полінуклеотидна кДНК або гена. Звичайно довжина послідовності або амінокислотна послідовність включає послідопорівняння становить, щонайменше, 19 нуклеотивність, в якій ідентичність послідовності становить, дів або 6 амінокислот, частіше, щонайменше, 24 щонайменше, 85 процентів, переважно, щонайменуклеотида або 8 амінокислот і часто, щонайменнше, від 90 до 95 процентів, більш звичайно, щоше, 48 нуклеотидів або 16 амінокислот. Оскільки найменше, 99 процентів при порівнянні з послідодві полінуклеотидні або амінокислотні послідовновністю порівняння у вікні порівняння з, сті можуть кожна (1) включати послідовність (тобто щонайменше, 18 нуклеотидних (6 амінокислотних) частина повної полінуклеотидної або амінокислотположень, де процент ідентичності послідовностей ної послідовності), яка схожа у двох молекул, і (2) розраховують шляхом порівняння послідовності можуть додатково включати послідовність, яка порівняння з послідовністю, яка може включати розрізнюється у двох полінуклеотідних або аміноделеції або добавки, які становлять сумарно 20 кислотних послідовностей, порівняння послідовнопроцентів або менше за послідовність порівняння стей двох (або більш) молекул для ідентифікації і у вікні порівняння. Послідовність порівняння може порівняння локальних районів схожості послідовбути частиною більш великої послідовності. ностей звичайно виконують шляхом порівняння Назви двадцяти амінокислот, що застосовупослідовностей двох молекул у "вікні порівняння". ються тут і їх абревіатура відповідають традиційТермін "вікно порівняння", що застосовується тут ним. Дивися [Immunology - A Synthesis, 2nd Edition, відноситься до концептуальної дільниці з, щонайE.S. Gollub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Assotiates, менше, 18 послідовних положень нуклеотидів або Sunderland, Mass. (1991)], яка включена тут як по6 амінокислот, в якому полінуклеотидна послідовсилання. Стереоізомери (наприклад, Dність або амінокислотна послідовність можуть поамінокислоти) двадцяти традиційних амінокислот, рівнюватися з послідовністю порівняння з 18 посне природні амінокислоти, такі як -, -дизаміщені лідовних положень нуклеотидів або 6 амінокислоти, N-алкіламінокислоти, молочна кисамінокислотних послідовностей, і в якому частина лота і інші нетрадиційні амінокислоти також мополінуклеотидної послідовності у вікні порівняння жуть бути відповідними компонентами для поліпеможе включати до 20 процентів або менше за доптидів даного винаходу. Приклади нетрадиційних бавки, делецій, замін і тому подібне (тобто пропусамінокислот включають: 4-гідроксипролін, ків) при порівнянні з послідовністю порівняння (яка карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Ν-триметиллізин, ε-Νне включає добавки або делеції) для оптимальноацетиллізин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, Nго поєднання двох послідовностей. За допомогою формілметіонін, 3-метилгістидин, 5-гідроксилізин, різних способів вибирають оптимальне поєднання o-N-метиларгінін і інші схожі амінокислоти і імінопослідовностей для поєднання вікна порівняння, кислоти (наприклад, 4-гідроксипролін). При записі яке може бути проведене за допомогою алгоритму послідовності поліпептиду, що застосовується тут локальної гомології Smith and Waterman, Adv. Appl. напрям в ліву сторону є напрямом до аміно-кінця, Math. 2: 482 (1981), за допомогою алгоритму гомоа напрям в праву сторону є напрямом до карбоклогічного поєднання Needleman and Wunsch J. си-кінця відповідно до угоди і стандартного застоМої. Biol. 48: 443 (1970), за допомогою способу сування. пошуку схожості Pearson and Lipman Proc. Natl. Схожим образом, якщо не обумовлено інакше, Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988), за допомогою лівий кінець одноланцюгових полінуклеотидних комп'ютерних способів здійснення цих алгоритмів послідовностей є 5'-кінцем; напрям в ліву сторону (GAP, BESTFIT, FASTA і TFASTA в Wisconsin дволанцюгових полінуклеотидних послідовностей Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics позначається як 5'-напрям. Напрям добавок зросComputer Group, 575 Science Dr., Medison, Wis.), таючих транскриптів РНК від 5" - до 3'-кінця познаGeneworks або MacVector software package), або чається як транскрипційний напрям; області посліза допомогою перевірки і найкращого поєднання довностей на ланцюги ДНК, які мають ту ж послідовність, що і РНК, і які є транскриптами РНК 27 76936 28 всередині 5'-кінця, позначаються як "вищележачі нокислоту не повинна мати істотного впливу на послідовності"; області послідовностей на ланцюги скріплення або властивості кінцевої молекули, ДНК, які мають ту ж послідовність, що і РНК, і які є особливо, якщо в заміну не залучена амінокислотранскриптами РНК всередині 3'-кінця, позначата, що знаходиться в місці рамки. Можна легко ються як "нижчележачі послідовності". перевірити, чи буде заміна амінокислоти впливати У застосуванні до поліпептидів термін "істотна на функцію пептиду, шляхом визначення специфіідентичність" означає, що дві пептидні послідовночної активності похідного пептиду. Методи визнасті при оптимальному поєднанні, такому як за дочення тут детально описані. Фрагменти або аналопомогою програм GAP або BESTFIT із застосуванги антитіл або молекул імуноглобулінів можуть ням ваги негомологічних пропусків, мають бути легко отримані фахівцями в цій області. Пепослідовності, ідентичні, щонайменше, на 80 прореважно, щоб аміно- і карбокси-кінці фрагментів центів, переважно послідовності, ідентичні, щоабо аналогів знаходилися поблизу кордонів функнайменше, на 90 процентів, більш переважно посціональних доменів. Структурні і функціональні лідовності, ідентичні, щонайменше, на 95 домени можуть бути ідентифіковані шляхом порівпроцентів і найбільш переважно послідовності, няння даних послідовностей нуклеотидів і/або аміідентичні, щонайменше, на 99 процентів. Переванокислот з опублікованими або власними базами жно положення залишків, які не є ідентичними, даних. Для ідентифікації мотивів послідовностей відрізняються по консервативних замінах амінокиабо передбаченої конформації доменів білків, які є слот. Під консервативними замінами амінокислот в інших білках з відомою структурою і/або функцімається на увазі взаємозамінність залишків, що єю, переважно застосовують комп'ютеризовані мають схожі бічні ланцюги. Наприклад, група аміспособи порівняння. Відомі способи ідентифікації нокислот, що мають аліфатичні бічні ланцюги, явпослідовностей білків, які формують відому трьохляє собою гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолеймірну структуру. [Bowie et al., Science 253: 164 цин; група амінокислот, що мають аліфатичні(1991)]. Таким чином, представлені вище приклади гідроксильні бічні ланцюги, являє собою серин і демонструють, що фахівець в даній області може треонін; група амінокислот, що мають аміддізнатися мотиви послідовностей і їх структурну утримуючі бічні ланцюги, являє собою аспарагін і конформацію, що може бути використано для виглутамін; група амінокислот, що мають ароматичні значення структурних і функціональних доменів бічні ланцюги, являє собою фенілаланін, тирозин і відповідно до даного винаходу. триптофан; група амінокислот, що мають основні Переважними амінокислотними замінами є ті, бічні ланцюги, являє собою лізин, аргінін і гістидін; які: (1) знижують схильність протеолізу, (2) знижуі група амінокислот, що мають утримуючі сірку ють схильність до окислення, (3) змінюють спорідбічні ланцюги, являє собою цистеїн і метіонін. Пененість скріплення для утворення білкових комреважні консервативні заміни груп амінокислот плексів, (4) змінюють спорідненість скріплення і (4) являють собою: валін-лейцин-ізолейцин, феніладодають або модифікують інші фізико-хімічні і фуланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін, глутамінкціональні властивості таких аналогів. Аналоги нова-аспарагінова кислота і аспарагін-глутамін. можуть включати різні мутеїни з послідовністю, Як тут обговорюється, мінорні варіації аміновідмінною від існуючої в природі пептидної послікислотних послідовностей антитіл або молекул довності. Наприклад, в існуючій в природі послідоімуноглобулінів розглядаються як такі, що охопвності (переважно в частині поліпептиду, лежачій люються даним винаходом, з умовою, що при ваза межами домену (доменів), утворюючого міжморіаціях в послідовності амінокислот зберігається, лекулярні контакти) можуть бути зроблені одиночні щонайменше, 75%, більш переважно, щонайменабо множинні амінокислотні заміни (переважно ше, 80%, 90%, 95% і найбільш переважно 99% консервативні амінокислотні заміни). Консерватиідентичності. Зокрема, розглядаються консервативна амінокислотна заміна не повинна істотно мінявні заміни амінокислот. Консервативними замінати структурні характеристики початкової послідовми є такі, які мають місце всередині сімейства аміності (наприклад, замінююча амінокислота не нокислот, що мають схожі бічні ланцюги. повинна викликати тенденції до порушення спіраАмінокислоти, що кодуються генетично звичайно лі, яка є в початковій послідовності, або руйнувати поділяють на сімейства: (1) кислі=аспартат, глутаінші типи повторної структури, характерні для помат; (2) основні=лізин, аргінін, гістидін; (3) неполячаткової послідовності). Приклади повторних і трерні=аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенітинних структур поліпептидів, що розрізнюються в лаланін, метіонін, триптофан; і (4) незаряджені техніці описані [в Proteins, Structures and Molecular полярні=тліцин, аспарагін, глутамін, цистеїн, сеPrinciples (Creighton, Ed., W. H. Freeman and рин, треонін, тирозин. Більш переважними сімейсCompany, New York (1984)); Introduction to Protein твами є: сімейство серину і треоніну з аліфатичStructure (3. Branden and J. Tooze, eds., Garland ними-гідроксильними бічними ланцюгами; Publishing, New York, ; і Thornton et al., Nature 354: сімейство аспарагіну і глутаміну з амід105 (1991)], які включені тут у вигляді посилання. утримуючими бічними ланцюгами; сімейство алаТермін "поліпептидний фрагмент", що викориніну, валіну, лейцину і ізолейцину з аліфатичними стовується тут відноситься до поліпептиду, що має бічними ланцюгами; і сімейство фенілаланіну, аміно-кінцеву або карбокси-кінцеву делецію, але в триптофану і тирозину з ароматичними бічними якому амінокислотна послідовність, що залишилаланцюгами. Наприклад, логічно передбачити, що ся ідентична відповідним положенням існуючої в ізольована заміна лейцину на ізолейцин або валін, природі послідовності, визначеної, наприклад, з аспартату на глутамат, треоніну на серин або схопослідовності повнорозмірної кДНК. Фрагменти жа заміна амінокислоти на структурно схожу амізвичайно мають довжину, рівну, щонайменше, 5, 29 76936 30 6, 8, або 10 амінокислотам, переважно, щонаймечного розщеплення інтактних антитіл. Зв'язуючі нше, 14 амінокислотам, більш переважно, щонайфрагменти включають Fab, Fab', F(ab')2, Fv і антименше, 20 амінокислотам, звичайно, щонайменше, тіла з одного ланцюга. Антитіло, відмінне від "біс50 амінокислотам, і навіть більш переважно, щопецифічного" або "біфункціонального" антитіла, найменше, 70 амінокислотам. Термін "аналог", що розуміється як таке, що має ідентичні зв'язуючі застосовується тут відноситься до поліпептидів, центри. Антитіло по суті гальмує взаємодію рецепщо включає сегмент з, щонайменше, 25 амінокистора з протирецептором, коли надлишок антитіла лот, який має значну ідентичність частини розразнижує кількість рецептора, пов'язаного з протихованої амінокислотної послідовності і який волорецептором, щонайменше, на приблизно 20%, діє, щонайменше, однією з наступних 40%, 60% або 80% і частіше більш ніж на 85% (при властивостей: (1) специфічним скріпленням з вимірюванні в тесті конкурентного скріплення in CTLA-4 при відповідних для скріплення умовах, (2) vitro). здатністю блокувати скріплення CTLA-4 зі своїми Термін "епітоп" включає будь-яку детермінанту рецепторами або (3) здатністю гальмувати зросбілка, здатну зв'язуватися з імуноглобуліном або тання експресуючих CTLA-4 клітин in vitro або in рецептором Т-клітин. Епітопні детермінанти звиvivo. Звичайно поліпептидні аналоги включають чайно складаються з хімічно активних поверхневих консервативну амінокислотну заміну (або добавку угрупувань молекул, таких як бічні ланцюги аміноабо делецію) в порівнянні з існуючою в природі кислот або цукрів, і звичайно мають специфічні послідовністю. Аналоги звичайно мають довжину, тримірні структурні характеристики, а також сперівну, щонайменше, 20 амінокислотам, переважно, цифічні зарядні характеристики. Кажуть, що антищонайменше, 50 або більш амінокислотам, і часто тіло специфічно зв'язує антиген, коли константа можуть мати ту ж довжину, що і повнорозмірний дисоціації становить