Вакцина, що включає ад’ювант на основі емульсії масло-у-воді

1. Імуногенна композиція, що включає антиген або антигенну композицію та ад'ювантну композицію, яка складається з емульсії масло-у-воді, де вказана емульсія масло-у-воді включає 1-6 мг сквалену, 1-7 мг токолу та 0,4-3 мг емульгувального агента на людську дозу. 2. Імуногенна композиція згідно з пунктом 1, де токол являє собою альфа-токоферол. 3. Імуногенна композиція, як заявлено у пунктах 1 або 2, де емульгувальний агент являє собою поліоксіетиленсорбіт моноолеат. 4. Імуногенна композиція, як заявлено у пункті 3, де поліоксіетиленсорбіт моноолеат є вибраним з групи, яка включає Полісорбат® 80 або Твін® 80. 5. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з попередніх пунктів, де об'єм вакцинної композиції складає від 0,4 до 1,5 мл. 6. Імуногенна композиція згідно з пунктом 5, де вказаний об'єм дози складає 0,5 мл. 7. Імуногенна композиція згідно з пунктом 5, де вказаний об'єм дози складає 0,7 мл. 8. Імуногенна композиція згідно з пунктом 5, де вказаний об'єм дози складає 1,0 мл. 9. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з попередніх пунктів, де антиген або антигенну композицію готують з вірусу грипу. 10. Спосіб лікування або запобігання захворювання, що включає введення пацієнтові, який страждає від захворювання або є чутливим до захворювання, імуногенної композиції згідно з будь-яким з пунктів 1-9. 11. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з пунктів 1-9 для застосування у профілактиці або терапії стану або захворювання. 12. Застосування імуногенної композиції згідно з будь-яким з пунктів 1-9 у виробництві лікарського засобу для використання у профілактиці або терапії стану або захворювання. UA (21) a200902223 (22) 10.10.2007 (24) 25.08.2011 (86) PCT/EP2007/060743, 10.10.2007 (31) 0620336.8 (32) 12.10.2006 (33) GB (31) 0620337.6 (32) 12.10.2006 (33) GB (31) 0620815.1 (32) 19.10.2006 (33) GB (31) 0620816.9 (32) 19.10.2006 (33) GB (31) PCT/EP2006/069977 (32) 20.12.2006 (33) EP (31) PCT/EP2006/069979 (32) 20.12.2006 (33) EP (31) 0707697.9 (32) 20.04.2007 (33) GB (31) 0711357.4 (32) 12.06.2007 (33) GB (31) 0712062.9 (32) 21.06.2007 (33) GB (46) 25.08.2011, Бюл.№ 16, 2011 р. (72) БАЛЛОУ ВІЛЛ'ЯМ РІПЛІ ДЖУНІОР, BE, ГАНОН ЕММАНУЕЛЬ ДЖУЛС, BE (73) ГЛАКСОСМІТКЛАЙН БАЙОЛОДЖІКАЛЗ С.А., BE (56) WO 99/12565 A 18.03.1999 WO 2006/100110 A 28.09.2006 C2 2 (19) 1 3 їх застосування у підвищенні імунних відповідей на різноманітні антигени, та до способів одержання, при цьому емульсія масло-у-воді включає токол, здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло та емульгувальний агент. Нові композиції або вакцини з поліпшеною імуногенністю завжди є необхідними. Як одна із стратегій, ад'юванти використовувалися для поліпшення імунної відповіді, що виникає у відповідь на будь-який даний антиген та/або для зниження реактогенності/токсичності у хазяїна. Емульсії масло-у-воді самі по собі є добре відомими в області техніки та були запропоновані як такі, що є корисними як ад'ювантні композиції (ЕР 399843;WO95/17210). WO95/17210 розкриває емульсії масло-у-воді, що включають від 2 до 10 % сквалену, від 2 до 10 % альфа-токоферолу та від 0,3 до 3 % Твіну 80, та їх самостійне застосування або застосування у комбінації з QS21 та/або 3D-MPL. WO99/12565 розкриває композиції емульсій масло-у-воді, що включають здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло, сапонін та стерин. Емульсії масло-у-воді додатково включають 3D-MPL. WO99/11241 розкриває емульсії масло-у-воді, що включають здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло та сапонін, при цьому масло та сапонін є представленими у співвідношенні 1:1 та 200:1. Все ще залишається необхідність у поліпшеній вакцині та імуногенних композиціях, які забезпечують прийнятну імунну відповідь та є менш реактогенними для хазяїна. Винахідники даного винаходу відкрили, що можуть використовуватися вакцини або імуногенні композиції, які включають більш низькі кількості кожного компоненту емульсії масло-у-воді, у той час як вони все ще підтримують порівняну імунну відповідь проти антигену або антигенної композиції у вказаній композиції. Це забезпечує перевагу підтримання рівня імуногенності проти антигену, у той час як реактогенність для хазяйського реципієнту знижується. Згідно з цим у першому аспекті даного винаходу забезпучується імуногенна композиція, що включає антиген або антигенну композицію та ад'ювантну композицію, яка містить емульсію масло-у-воді, де вказана емульсія масло-у-воді включає 0,5-10 мг здатного до перетворення у процесі обміну речовин масла, 0,5-11 мг токолу та 0,4-4 мг емульгувального агенту на людську дозу. В іншому аспекті даного винаходу забезпечується вакцинна композиція, що включає антиген або антигенну композицію та ад'ювантну композицію, що включає емульсію масло-у-воді, де вказана емульсія масло-у-воді включає 0,5-10 мг здатного до перетворення у процесі обміну речовин масла, 0,5-11 мг токолу та 0,4-4 мг емульгувального агенту на людську дозу. У додатковому аспекті винаходу забезпечується застосування вакцини або імуногенної композиції, що включає антиген або антигенну композицію та ад'ювантну композицію, яка містить емульсію масло-у-воді, де вказана емульсія мас 95646 4 ло-у-воді включає 0,5-10 мг здатного до перетворення у процесі обміну речовин масла, 0,5-11 мг токолу та 0,4-4 мг емульгувального агенту, у виробництві імуногенної композиції для запобігання інфекції та/або захворювання. У додатковому аспекті забезпечується спосіб або застосування, як визначено в даній заявці вище, для захисту від інфекції або захворювання, спричиненого патогеном, який являє собою варіант патогена, з якого походить антиген в імуногенній композиції. В іншому аспекті забезпечується спосіб або застосування, як визначено в даній заявці вище, для захисту від інфекцій або захворювання, спричиненого патогеном, який включає антиген, який є варіантом антигена в імуногенній композиції. Фіг.1: Клінічний дослід: середні геометричні значення титрів (GMT) для анти-НА антитіла у різні моменти часу (АТР група для визначення імуногенності). Фіг.2: Клінічний дослід: коефіцієнт серозахисту (SPR) для титру НІ антитіла з 95 % довірчим інтервалом у день 0 та день 21 (АТР група для імуногенності). Фіг.3: Клінічний дослід: показник сероконверсії (SCR) для титру НІ антитіла з 95 % довірчим інтервалом у день 21 (АТР група для імуногенності). Фіг.4: Клінічний дослід: індекс сероконверсії (SCF) для титру НІ антитіла з 95 % довірчим інтервалом у день 21 (АТР група для імуногенності). Фіг.5: Дослідження на мишах: реакція гальмування гемаглютинації (GMT +/- ІС95) у BALB/c мишей, примованих гетеросубтипічними штамами (інтервал доз AS03). Фіг.5А: НІ титри для антиA/New Caledonia/20/99; Фіг.5В: НІ титри для антиA/Panama/2007/99 HI. Фіг.5С: НІ титри для антиB/Shandong/7/97. Фіг.6: Дослідження на мишах: реакція гальмування гемаглютинації (GMT +/- ІС95) у С57ВІ/6 мишей, примованих гетеросубтипічними штамами (інтервал доз AS03). Фіг.7: Дослідження на мишах: клітинна імунна відповідь (CD4+ Т-клітини) у РВМС з С57ВІ/6 мишей, примованих гетеросубтипічними штамами (інтервал доз AS03). Фіг.8: Дослідження на мишах: клітинна імунна відповідь (CD4+ Т-клітини) у РВМС з С57ВІ/6 мишей, примованих гетеросубтипічними штамами та імунізованих низькою дозою антигену (0,5 мкг) з доданням ад'юванта в інтервалі доз AS03. Фіг.9: Дослідження на мишах: ELISA титри H5N1-специфічних lg (А та В) та анти-H5N1 lgG1 (С та D) та lgG2b (Ε та F) ізотипічні відповіді через 14 днів після імунізації (GMT +/- IC95) для двох різних доз антигену: 1,5 мкг (А, С та Е) або 0,38 мкг (В, D та F). Фіг.10: Дослідження на мишах: реакція інгібування гемаглютинації (GMT +/- ІС95) на день 21 після імунізації (GMT +/- ІС95) для двох різних доз антигену: 1,5 мкг (А) або 0,38 мкг (В). Фіг.11: Дослідження на мишах: клітинна імунна відповідь (CD4+ Т-клітини) в інтактних С57ВІ/6 мишей, імунізованих різними дозами H5N1 вакцини (1,5 або 0,38 мкг) з доданням ад'юванта в інте 5 рвалі доз AS03: (А) 1,5 мкг НА Аg (антиген) або (В) 0,38 мкг НА Аg (антиген). Фіг.12: Дослідження на свинях, реакція інгібування гемаглютинації (GMT +/- ІС95) у свиней, примованих гомологічними штамами (інтервал доз AS03). Терміни "такий, що включає", включають" та "включає" в даній заявці призначені авторами для необов'язкової заміни термінів "той, що складається з", "складається з" та "складаються з", відповідно у будь-якому. Втілення, які в даній заявці відносяться до "вакцинних композицій" винаходу є також такими, що відносяться до "імуногенних композицій" винаходу, та навпаки. В одному втіленні винаходу забезпечується вакцина або імуногенна композиція, що включає антиген або антигенну композицію та ад'ювантну композицію, яка складається з емульсії масло-уводі, де вказана емульсія масло-у-воді включає 0,5-10 мг здатного до перетворення у процесі обміну речовин масла, 0,5-11 мг токолу та 0,4-4 мг емульгувального агенту на людську дозу. У додатковому втіленні винаходу забезпечується вакцина або імуногенна композиція, що включає антиген або антигенну композицію та ад'ювантну композицію, яка включає емульсію масло-у-воді, де емульсія масло-у-воді включає 0,5-10 мг здатного до перетворення у процесі обміну речовин масла, (такого, як сквален), 0,5-11 мг токолу (такого, як альфа-токоферол) та 0,4-4 мг емульгувального агенту (такого, як поліоксіетиленсорбіт моноолеат) на людську дозу. Компонент емульсія масло-у-воді Ад'ювантна композиція винаходу включає ад'ювант на основі емульсії масло-у-воді, бажано, коли вказана емульсія включає здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло у кількості 0,5-10 мг, токол у кількості 0,5-11 мг та емульгувальний агент у кількості 0,4-4 мг та містить масляні краплі, 70 % яких за інтенсивністю мають діаметр, менший за 1 мкм. Для того, щоб композиція масло-у-воді була прийнятною для введення людині, масляна фаза емульсійної системи повинна включати здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло. Значення терміну здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло є добре відомим в області техніки. Здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло може бути визначеним як таке, що є здатним до трансформації у процесі обміну речовин (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25-е видання (1974)). Масло може являти собою будь-яку рослинну олію, риб'ячий жир, тваринні жири або синтетичні масла, які не є токсичними для реципієнта та які є здатними до трансформації в процесі обміну речовин. Горіхи, насіння та зернові культури є традиційними джерелами рослинної олії. Синтетичні масла також є частиною даного винаходу та можуть включати комерційно доступні масла NEOBEE® та інші. Найбільш прийнятне здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло являє собою сквален. Сквален (2,6,10,15,19,23гексаметил-2,6,10,14,18,22тетракозогексаєн) є 95646 6 ненасиченим маслом, яке виявляється у великих кількостях у маслі з печінки акули, та у низьких кількостях в оливковій олії, олії з проростків пшениці, олії з рисових висівок та у дріжджах, та є особливо прийнятним масло для використання у даному винаході. Сквален являє собою здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло, оскільки він є проміжною сполукою у біосинтезі холестерину (Merck index, 10-е видання, номер доступу 8619). Переважно здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло є присутнім в ад'ювантній композиції у кількості 0,5-10 мг, бажано 1-10, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7 або 5-6 мг (наприклад, 2-3, 5-6 або 910 мг), зокрема, 5,35 мг або 2,14 мг. У додатковому втіленні винаходу здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло є присутнім у вакцинній (або імуногенній) композиції у кількості 0,510 мг, бажано 1-10, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7 або 5-6 мг (наприклад, 2-3, 5-6 або 9-10 мг), зокрема, 5,35 мг або 2,14 мг. Кількість здатного до перетворення у процесі обміну речовин масла у вакцині або імуногенній композиції може бути виражена як процент від загального об'єму композиції. Переважно здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло є присутнім у вакцинній композиції у кількості від 0,5 % до 2 %, бажано 0,25-2, або 0,25-1,75, або 0,5-1,65, або 0,6-1,5, або 0,8-1,4 або 1-1,25 % (об./об.) масла в загальному об'ємі композиції. В іншому специфічному втіленні здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло є присутнім у вакцині у заключній кількості приблизно 1,25 % від загального об'єму вакцинної або імуногенної) композиції. В іншому специфічному втіленні здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло є присутнім у заключній кількості 0,25 % (об./об.) від загального об'єму композиції. Для пояснення, концентрації, приведені у об./об. можуть бути перетворені у концентрації у ваг./об. за допомогою застосування наступного коефіцієнту перетворення: 5 % (об./об.) концентрація сквалену є еквівалентною 4,28 % (ваг./об.) концентрації сквалену. Емульсія масло-у-воді включає токол. Токоли є добре відомими в області техніки та є описаними у ЕР0382271. Бажано, коли токол являє собою альфа-токоферол або його похідну, таку, як сукцинат альфа-токолу (що є також відомим як сукцинат вітаміну Е). Вказаний токол є переважно присутнім в ад'ювантній композиції у кількості 0,5-11 мг, бажано 1-11, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7, 5-6 (наприклад, 1011, 5-6, 2,5-3,5 або 1-3 мг). У специфічному втіленні токол є присутнім у кількості 5,94 мг або 2,38 мг. У додатковому втіленні вказаний токол є переважно присутнім у вакцинній (або імуногенній) композиції у кількості 0,5-11 мг, бажано 1-11, 2-10, 3-9, 48, 5-7, 5-6 (наприклад, 10-11, 5-6, 2,5-3,5 або 1-3 мг). У специфічному втіленні токол є присутнім у кількості 5,94 мг або 2,38 мг. Кількість токолу може бути виражена як процент від загального об'єму вакцинної або імуногенної композиції. Переважно токол є присутнім у вакцинній композиції у кількості від 0,25 % до 2 % (об./об.) від загального об'єму імуногенної компо 7 95646 зиції, бажано коли концентрація 0,25-2 включає 0,25-2 або 0,25-1,75, або 0,5-1,65, або 0,6-1,5, або 0,8-1,4, або 1-1,25 % (об./об.) токолу від загального об'єму. Переважно токол є присутнім у кількості від 0,2 % до 2 % (об./об.) від загального об'єму вакцинної (або імуногенної) композиції, більш бажано у кількості 1,25 % (об./об.) у 0,5 мл об'єму дози. У специфічному втіленні токол є присутнім у заключній кількості приблизно 1,25 % від загального об'єму вакцинної або імуногенної композиції. В іншому специфічному втіленні токол є присутнім у заключній кількості 0,25 % (об./об.) від загального об'єму або 1,25 % (об./об.) у 0,5 мл об'єму дози або 0,9 % (об./об.), у 0,7 мл об'єму дози, або 0,5 % (об./об.) у 0,5 мл дози, або 0,35-0,37 %, бажано 0,36 % у 0,7 мл вакцинної або імуногенної дози. Для пояснення, концентрації, приведені у об./об., можуть бути перетворені у концентрації у ваг./об. за допомогою застосування наступного коефіцієнту перетворення: 5 % (об./об.) концентрація є еквівалентною концентрації 4,8 % (ваг./об.) альфа-токоферолу. Емульсія масло-у-воді додатково включає емульгувальний агент. Емульгувальний агент переважно може являти собою поліоксіетиленсорбіт моноолеат. У конкретному втіленні емульгувальний агент може бути вибраним з групи, яка включає: Полісорбат® 80 або Твін® 80. Вказаний емульгувальний агент є переважно присутнім в ад'ювантній композиції у кількості 0,15, 0,2-5, 0,3-4, 0,4-3 або 2-3 мг (наприклад, 0,4-1,2, 2-3 або 4-5 мг) емульгувального агенту. У специфічному втіленні емульгувальний агент є присутнім у кількості 0,97 мг або 2,425 мг. Крім того, вказаний емульгувальний агент є переважно присутнім у вакцинній або імуногенній композиції у кількості 0,1-5, 0,2-5, 0,3-4, 0,4-3 або 2-3 мг (наприклад, 0,4-1,2, 2-3 або 4-5 мг) емульгувального агенту. У специфічному втіленні емульгувальний агент є присутнім у кількості 0,97 мг або 2,425 мг. Кількість емульгувального агенту може бути виражена як процент від загального об'єму вак 8 цинної або імуногенної композиції. Переважно емульгувальний агент є присутнім у вакцинній (або імуногенній) композиції у кількості 0,125-0,8 % (об./об.) від загального об'єму композиції, бажано у кількості 0,08-0,05, або 0,1-0,7, або 0,2-0,6, або 0,25-0,55, або 0,3-0,52, або 0,4-0,5 % (об./об.) від загального об'єму. У специфічному втіленні емульгувальний агент є присутнім у кількості 1 %, 0,5 % або 0,2 % (об./об.) від загального об'єму вакцинної або імуногенної композиції. Для пояснення, концентрації, приведені у об./об., можуть бути перетворені у концентрації у ваг./об. за допомогою застосування наступного коефіцієнту перетворення: концентрація 1,8 % (об./об.) полісорбату 80 є еквівалентною концентрації 1,91 % (ваг./об.) полісорбату 80. У специфічному втіленні 0,5 мл об'єму вакцинної або імуногенної дози містить 0,45 % (об./об.) Твіну 80, а 0,7 мл об'єму дози містить 0,315 % (об./об.) Твін 80. В іншому специфічному втіленні доза 0,5 мл містить 0,18 % (об./об.) емульгувального агенту, а 0,7 мл дози вакцинної або імуногенна композиція містить 0,126 % (об./об.) емульгувального агента. Під терміном "людська доза" розуміють дозу, яка за об'ємом є прийнятною для застосування у людини. В загальному випадку вона може знаходитися в інтервалі від 0,25 до 1,5 мл. В одному втіленні людська доза являє собою 0,5 мл. У додатковому втіленні доза є вищою за 0,5 мл, наприклад, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 або 1 мл. У додатковому втіленні людська доза складає від 1 мл до 1,5 мл. В іншому втіленні, зокрема, коли імуногенна композиція є такою для педіатричної популяції, то людська доза може бути меншою за 0,5 мл, такою, як від 0,25 до 0,5 мл. Винахід характеризується тим, що кожна або всі індивідуальні компоненти ад'юванта в імуногенній композиції мають більш низький рівень, ніж ті, що вважалися корисними раніше, та є такими, що приведені вище. Особливо прийнятні композиції включають наступні ад'ювантні компоненти у наступних кількостях, що містяться у заключному об'ємі людської дози 0,5 мл: Таблиця 1 Ад'ювант А Ад'ювант В Ад'ювант Ε Ад'ювант F Ад'ювант С Ад'ювант G Ад'ювант D Емульсія масло-уводі Компоненти: Токоферол Сквален Полісорбат 80 125 мкл 100 мкл 83,33 мкл 62,5 мкл 50 мкл 31,25 мкл 25 мкл 5,94 мг 5,35 мг 2,43 мг 4,28 мг 4,75 мг 1,94 мг 3,57 мг 3,96 мг 1,62 мг 2,58 мг 2,97 мг 1,21 мг 2,38 мг 2,14 мг 0,97 мг 1,34 мг 1,49 мг 0,61 мг 1,19 мг 1,07 мг 0,48 мг Винахід додатково забезпечує ад'ювантну композицію, що включає індивідуальні компоненти, як визначено в даній заявці вище, у кількостях, визначених вище, наприклад, але не винятково, такі, як проілюстровано у Таблиці 1. Типово, така ад'ювантна композиція буде міститися у прийнятному об'ємі людської дози. Якщо ад'ювант, що знаходиться у рідкій формі, поєднується з рідкою формою антигенної композиції, то ад'ювантна композиція буде знаходитися у прийнятному об'ємі людської дози, що є фракцією призначеного заключного об'єму людської дози, так, що, наприклад, приблизно половина призначеного заключного об'єму людської дози, наприклад, об'єм 350 мкл для призначеної людської дози 0,7 мл, або 250 мкл об'єму для призначеної людської дози 0,5 мл. Ад'ювантну композицію розводять, коли поєднують з антигенною композицією, для забезпечення одержання заключної дози вакцини. Заключний об'єм такої дози буде, звичайно, варіювати в за 9 лежності від початкового об'єму ад'ювантної композиції та об'єму антигенної композиції, що додається до ад'ювантної композиції. В альтернативному втіленні рідкий ад'ювант використовується для відтворення ліофілізованої антигенної композиції. У цьому втіленні прийнятний об'єм людської дози ад'ювантної композиції є приблизно рівним заключному об'єму людської дози. Рідку ад'ювантну композицію додають до пробірки, що містить ліофілізовану антигенну композицію. Заключна доза може варіювати від 0,5 до 1,5 мл. Спосіб одержання емульсій масло-у-воді є добре відомим спеціалістові в даній області техніки. Звичайно, спосіб включає змішування токолвмісної масляної фази з поверхнево-активним агентом, таким, як розчин PBS/Tвiн80™, після чого проводять гомогенізацію, використовуючи гомогенізатор, при цьому спеціалістові в даній області техніки є зрозумілим, що спосіб, який включає пропускання суміш двічі через голку шприца, буде прийнятним для гомогенізації невеликих об'ємів рідини. Крім того, процес емульгування у пристрої для мікропсевдозрідження (M110S пристрій для мікропсевдозрідження, максимально 50 пропускань, протягом періоду часу 2 хвилини при максимальному тиску на вході 6 бар (тиск на виході складає приблизно 850 бар)) може бути адаптований спеціалістом в даній області техніки для одержання більших або менших об'ємів емульсії. Адаптація може бути досягнута шляхом звичайних експериментів, що включають вимірювання параметрів одержаної емульсії до тих пір, поки не буде досягнутий необхідний діаметр масляних крапель. В емульсії масло-у-воді масло та емульгатор можуть знаходитися у водному носії. Водний носій може являти собою, наприклад, забуферений фосфатом фізіологічний розчин. Бажано, коли системи емульсії масло-у-воді згідно з даним винаходом мають невеликий розмір масляних крапель у субмікронному діапазоні. Прийнятний розмір крапель буде знаходитися в діапазоні від 120 до 750 нм, більш бажано від 120 до 600 нм у діаметрі Є найбільш бажаним, коли емульсія масло-у-воді містить масляні краплі, принаймні 70 % яких за інтенсивністю мають розмір, менше 500 нм у діаметрі, більш бажано принаймні 80 % яких мають розмір 300 нм у діаметрі, більш бажано принаймні 90 % яких знаходяться мають розмір, що знаходиться у діапазоні від 120 до 200 нм у діаметрі. Розмір масляних крапель, тобто діаметр, згідно з даним винаходом представлений за інтенсивністю. Існує декілька шляхів визначення діаметру розміру крапель масла за інтенсивністю. Інтенсивність вимірюють при використанні пристрою, прийнятного для визначення розміру за динамічним розсіюванням світла, такого, як Malvern Zetasizer4000 або бажано Malvern Zetasizer3000HS. Детальна процедура визначення наведена у Прикладі II.2. Перша можливість полягає у визначенні z середнього значення діаметру ZAD за динамічним розсіюванням світла (PCSфотон кореляційна спектроскопія); цей метод додатково забезпечує показник полідисперсності (PDI), як ZAD, так і PDI підраховують за допомогою 95646 10 семі-інварінтного алгоритму Ці значення не вимагають знання показника заломлення частинок. Другий спосіб полягає у підрахунку діаметра масляних крапель шляхом визначення розподілу розмірів цілих частинок при використанні іншого алгоритму або за допомогою Контін, або NNLS, або автоматичного "Malvern" (алгоритм по умовчанню забезпечується з пристроєм для вимірювання розміру). Більшу частину часу, оскільки показник заломлення частинок складної композиції є невідомим, тільки розподіл інтенсивності береться до уваги, і якщо це є необхідним, то середнє значення інтенсивності одержують з цього розподілу. Необов'язкові імуностимулятори У додатковому втіленні винаходу забезпечується вакцина або імуногенна композиція, що включає антиген або антигенну композицію та ад'ювантну композицію, яка містить емульсію масло-у-воді та необов'язково один або більше імуностимуляторів, де вказана емульсія масло-у-воді включає 0,5-10 мг здатного до перетворення у процесі обміну речовин масла, 0,5-11 мг токолу та 0,4-4 мг емульгувального агента. В одному втіленні ад'ювантна композиція включає масляну та водну емульсію, як описано в даній заявці. У додатковому втіленні ад'ювантна композиція може додатково включати один або більше додаткових ад'ювантів або імуностимуляторів. У додатковому втіленні ад'ювантна композиція необов'язково включає один або більше додаткових ад'ювантів або імуностимуляторів, відмінних від QS21 та/або MPL. Необов'язковий додатковий ад'ювант вибирають з групи: сапонін, ліпід А або його похідна, імуностимуляторний олігонуклеотид, алкілглюкозамінідфосфат, сіль металу, агоніст Toll-подібного рецептора або їх комбінація. Є бажаним, коли ад'ювант являє собою агоніст Toll-подібного рецептора, зокрема, агоніст Toll-подібного рецептора 2, 3, 4, 7, 8 або 9, або сапонін. Додатково є бажаним, коли ад'ювантна система включає два або більше ад'ювантів з приведеного вище списку. Комбінації бажано містять сапонін (зокрема, QS21) ад'ювант та/або агоніст Toll-подібного рецептора 4, такий, як 3D-MPL або агоніст Toll-подібного рецептора 9, такий, як імуностимуляторний олігонуклеотид, що містить CpG. Інші бажані комбінації включають сапонін (зокрема, QS21) та агоніст Toll-подібного рецептора 4, такий, як сапонін (зокрема, QS21) та ліганд Toll-подібного рецептора 4, такий, як 3DMPL або алкілглюкозамінід фосфат. В одному втіленні додатковий ад'ювант є лігандом Toll-подібного рецептора (TLR) 4, бажано агоністом, таким, як похідна ліпіду А, зокрема, 3деацилований монофосфорил ліпід A (3D-MPL). 3D-MPL продається під торговою маркою MPL® GlaxoSmithKline Biologicals North America та головним чином посилює CD4+ Т-клітинні відповіді з IFNγ (Th1) фенотипом. Він може бути одержаний згідно зі способами, розкритими в GB 2220211 А. З хімічної точки зору він являє собою суміш 3деацилованого монофосфорил ліпіду А з 3, 4, 5 або 6 ацилованими ланцюгами. Бажано, коли у композиціях згідно з даним винаходом використовують дрібні частинки 3D-MPL. Дрібна частинка 11 3D-MPL має такий розмір, що вона може стерильно фільтруватися через 0,22 мкм фільтр. Такі препарати описані в міжнародній патентній заявці W094/21292. Синтетичні похідні ліпіду А є відомими, деякі з них описані як агоністи TLR-4 та включають без обмеження наступні: ОМ 174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(R)-3додеканоїлокситетрадеканоїламіно]-4-о-фосфоно(3-D-глюкопіразоніл]-2-[(R)-3гідрокситетрадеканоїламіно]-α-Dглюкопіразонілдигідрогенфосфат), (WO95/14026) ОМ 294 DP (3S,9R)-3-[(R)додеканоїлокситетрадеканоїламіно]-4-оксо-5-аза9(R)-[(R)-3-гідрокситетрадеканоїламіно]декан-1,10діол,1,10-біс(дигідрогенфосфат), (WO99/64301 та WO00/0462) ОМ 197 МР-Ас DP (3S,9R)-3-[(R)додеканоїлокситетрадеканоїламіно]-4-оксо-5-аза9-[(R)-3-гідрокситетрадеканоїламіно]декан-1,10діол,1-дигідрогенфосфат 10-(6-аміноксеноат), (WO01/46127) Іншими прийнятними TLR4 лігандами, які можуть використовуватися, є алкілглюкозамінідфосфати (AGP), такі, як ті, що розкриті у WO9850399 або US6303347 (також є розкритими способи для одержання AGP), або фармацевтично прийнятні солі AGP, як розкрито в US6764840. Деякі AGP являють собою TLR4 агоністи, а деякі є TLR4 антагоністами. Як одні, так й інші, як передбачається, будуть корисними як ад'юванти. Деякі прийнятні TLR-4 ліганди, що є здатними викликати сигнальну відповідь за допомогою TLR4 (Sabroe та ін., JI 2003 стор. 1630-5), являють собою, наприклад, ліпополісахарид з грамнегативних бактерій та його похідні, або його фрагменти, зокрема, нетоксичну похідну LPS (таку, як 3D-MPL). Інші прийнятні TLR агоністи являють собою: білок теплового шоку (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 або 90; поверхневоактивну сполуку білок А, гіалуронові олігосахариди, фрагменти гепарансульфату, фрагменти фібронектину, пептиди фібриногену та b-дефенсін-2, мураміловий дипептид (MDP) або F білок респіраторно-синцитіального вірусу. В одному втіленні TLR агоніст являє собою HSP 60, 70 або 90. Toll-подібні рецептори (TLR) являють собою трансмембранні рецептори типу І та є еволюційно однаковими у комах та людей. На сьогоднішній день виявлено 10TLR (TLR 1-10) (Sabroe та ін., JI 2003 стор. 1630-5). Члени родини TLR мають спільні позаклітинні та внутрішньоклітинні домени; їх позаклітинні домени були продемонстровані як такі, що містять повторювані послідовності, збагачені лейцином; а їх внутрішньоклітинні домени є подібними з внутрішньоклітинною ділянкою рецептора інтерлейкіну-1 (IL-1R). Клітини TLR експресуються не так, як інші імунні клітини та інші клітини (включаючи епітеліальні клітини судин, адіпоцити, серцеві міоцити та епітеліальні клітини кишечнику). Внутрішньоклітинний домен TLR може взаємодіяти з адапторним білком Myd88, який також має IL-1R домен у своїй цитоплазматичній ділянці, що приводить до NF-KB активації цитокінів; цей Myd88 шлях є одним зі шляхів, за допомогою якого вивільнення піддається впливу за допомогою ак 95646 12 тивації TLR. Основна експресія TLR відбувається у таких типах клітин, як клітини, що презентують антиген (наприклад, дендритні клітини, макрофаги, тощо). Активація дендритних клітин шляхом стимуляції TLR приводить до дозрівання дендритних клітин та продукції запальних цитокінів, таких, як IL12. Проведені нещодавно дослідження виявили, що TLR впізнає різні типи агоністів, незважаючи на те, що деякі агоністи є спільними для декількох TLR. TLR агоністи переважно походять від бактерій або вірусів та включають такі молекули, як флагелін або бактеріальний ліпополісахарид (LPS). Під терміном "TLR агоніст" розуміють компонент, який є здатним спричинювати відповідь передачі сигналу за допомогою TLR шляху передачі сигналу, або як безпосередній ліганд, або опосередковано шляхом генерації ендогенного або екзогенного ліганду (Sabroe та ін., JI 2003 стор. 16305). В іншому втіленні використовуються природні або синтетичні агоністи TLR молекул як необов'язкові додаткові імуностимулятори. Такі можуть включати, але не обмежуються, агоністи для TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 та TLR9. В одному втіленні даного винаходу використовується TLR агоніст, що є здатним викликати відповідь передачі сигналу за допомогою TLR-1 (Sabroe та ін., JI 2003 стор. 1630-5). Є прийнятним, якщо TLR агоніст, здатний спричинити відповідь передачі сигналу через TLR-1, є вибраним з: Triацилованих ліпопептидів (LP); модуліну, що є розчинним у фенолі; LP Mycobacterium tuberculosis; S(2,3-біс(пальмітоїлокси)-(2-RS)-пропіл)-Nпальмітоїл-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, тригідрохлориду (Pam3Cys) LP, який імітує ацилований аміно кінець бактеріального ліпопротеїну, та OspA LP з Borrelia burgdorfei. В альтернативному втіленні використовується TLR агоніст, що є здатним спричинити відповідь передачі сигналу через TLR-2 (Sabroe та ін., JI 2003 стор. 1630-5). Є прийнятним, якщо TLR агоніст, здатний спричинити відповідь передачі сигналу через TLR-2, є одним або більше з ліпопротеїну, пептидоглікану, бактеріального ліпопептиду з М. tuberculosis, В. burgdorferi. Т. pallidum; пептидогліканів з видів, які включють Staphylococcus aureus; ліпотейхоєвих кислот, мануронових кислот, Neisseria po rins, бактеріальних фімбрій, факторів вірулентності Yersina, CMV віріонів, гемаглютиніну кіру та зимозану із дріжджів. В альтернативному втіленні використовується TLR агоніст, що є здатним спричинити відповідь передачі сигналу через TLR-3 (Sabroe та ін., JI 2003 стор. 1630-5). Є прийнятним, якщо TLR агоніст, здатний спричинити відповідь передачі сигналу через TLR-3, є дволанцюговою РНК (длРНК) або поліінозиновою-поліцитидиловою кислотою (Poly ІС), молекулярною структурою нуклеїнової кислоти, асоційованою з вірусною інфекцією. В альтернативному втіленні використовується TLR агоніст, що є здатним спричинити відповідь передачі сигналу через TLR-5 (Sabroe та ін., JI 2003 стор. 1630-5). Є прийнятним, якщо TLR аго 13 ніст, здатний спричинити відповідь передачі сигналу через TLR-5, являє собою бактеріальний флагелін. В альтернативному втіленні використовується TLR агоніст, що є здатним спричинити відповідь передачі сигналу через TLR-6 (Sabroe та ін., JI 2003 стор. 1630-5). Є прийнятним, якщо TLR агоніст, здатний спричинити відповідь передачі сигналу через TLR-6, є мікобактеріальним ліпопротеїном, діацилованим LP та розчинним у фенолі модуліном. Додаткові TLR6 агоністи є описаними у WO2003043572. В альтернативному втіленні використовується TLR агоніст, що є здатним спричинити відповідь передачі сигналу через TLR-7 (Sabroe та ін., JI 2003 стор.1630-5). Є прийнятним, якщо TLR агоніст, здатний спричинити відповідь передачі сигналу через TLR-7, є одноланцюговою РНК (олРНК), локсорибіном, аналогом гуанозину у положеннях N7 та С8 або сполукою імідазохіноліну або його похідною. В одному втіленні TLR агоніст являє собою іміквімод. Додаткові TLR7 агоністи є описаними у WO02085905. В альтернативному втіленні використовується TLR агоніст, що є здатним спричинити відповідь передачі сигналу через TLR-8 (Sabroe та ін., JI 2003 стор. 1630-5). Є прийнятним, якщо TLR агоніст, здатний спричинити відповідь з антивірусною активністю, наприклад, резиквімодом (R848); резиквімод є здатним до впізнання TLR-7. Інші TLR-8 агоністи, які можуть використовуватися, включають ті, що описані у WO2004071459. Можуть також використовуватися імуностимуляторні олігонуклеотиди або будь-які інші агоністи Toll-подібного рецептора (TLR) 9. Бажані олігонуклеотиди для застосування в ад'ювантах або вакцинах згідно з даним винаходом являють собою CpG-вмісні олігонуклеотиди, бажано такі, що містять два або більше динуклеотидних CpG фрагментів, відокремлених принаймні трьома, більш бажано принаймні шістьома або більше нуклеотидами. CpG фрагмент являє собою цитозиновий нуклеотид, після якого йде гуаніновий нуклеотид. CpG олігонуклеотиди згідно з даним винаходом типово являють собою дезоксинуклеотиди. У бажаному втіленні інтернуклеотид в олігонуклеотиді являє собою фосфородитіоат або більше бажано фосфородитіоатний зв'язок, хоча фосфодіестер та інші інтернуклеотидні зв'язки також передбачаються в об'ємі даного винаходу. Також в об'єм даного винаходу включаються олігонуклеотиди зі змішаними інтернуклеотидними зв'язками. Способи одержання фосфородитіоатних олігонуклеотидів або фосфородитіоату є описаними в US 5,666,153, US 5,278,302 та WO95/26204. Приклади бажаних олігонуклеотидів мають наступніпослідовності. Послідовності бажано містять фосфородитіоатний модифікований інтернуклеотидний зв'язок. ОЛІГО 1 (SEQ ID NO:1): ТСС ATG ACG ТТС CTG ACG ТТ (CpG 1826) ОЛІГО 2 (SEQ ID NO:2): ТСТ ССС AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) ОЛІГО 3 (SEQ ID NO:3): АСС GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG 95646 14 ОЛІГО 4 (SEQ ID NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) ОЛІГО 5 (SEQ ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) ОЛІГО 6 (SEQ ID NO:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG5456) Альтернативні CpG олігонуклеотиди можуть включати бажані послідовності, приведені вище, в яких вони мають несуттєві делеції або доповнення. CpG олігонуклеотиди, що використовуються в даному винаході, можуть бути синтезовані у відповідності з будь-якими способами, відомими в області техніки (наприклад, див. ЕР 468520). Так, ці олігонуклеотиди можуть бути синтезовані при використанні автоматичного синтезатора. Згідно з цим в іншому втіленні ад'ювантна композиція додатково включає додатковий імуностимулятор, який є вибраним з групи, яка складається з: TLR-1 агоніста, TLR-2 агоніста, TLR-3 агоніста, TLR-4 агоніста, TLR-5 агоніста, TLR-6 агоніста, TLR-7 агоніста, TLR-8 агоніста, TLR-9 агоніста або їх комбінації. Інший бажаний імуностимулятор для застосування в даному винаході являє собою Quil А та його похідні. Quil А є препаратом сапоніну, ізольованим з південноамериканського дерева Quilaja Saponaria Molina, він був вперше описаний як такий, що володіє ад'ювантною активністю Dalsgaard та ін. у 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol.44, Springer Verlag, Berlin, p. 243-254). Очищені фрагменти Quil А були ізольовані шляхом ВЕРХ та зберігають ад'ювантну активність без токсичності, асоційованої з Quil А (ЕР 0362278), наприклад, QS7 та QS21 (що є також відомими як QA7 та QA21). QS-21 є природним сапоніном, що одержаний з кори Quillaja saponaria Molina, він індукує CD8+ цитотоксичність Т-клітин (CTL), Th1 клітин та переважну відповідь lgG2a антитіла, а також є переважним сапоніном у контексті даного винаходу. Були описані окремі композиції QS21, які, зокрема, додатково включають стерин (WO96/33739). Коли у композицію включаються сквален та сапонін (необов'язково QS21), є вигідним також включати у композицію стерин (необов'язково, холестерин), оскільки він дозволяє знизити загальний рівень масла в емульсії. Це приводить до зниження затрат на виробництво, до поліпшення загальної прийнятності вакцинації, а також до поліпшення кількісних та якісних показників одержаних імунних відповідей, таких, як продукція IFN-γ. Таким чином, ад'ювантна система згідно з даним винаходом типово має співвідношення здатне до перетворення у процесі обміну речовин масло:сапонін (ваг./ваг.) в інтервалі від 200:1 до 300:1, крім того, даний винахід може використовуватися у формі з низьким вмістом масла, необов'язковий інтервал, якого складає від 1:1 до 200:1, необов'язково, від 20:1 до 100:1, або суттєво 48:1, ця вакцина зберігає бажані ад'ювантні властивості усіх компонентів та має профіль зі значно зниженою реактогенністю. Згідно з цим деякі втілення мають співвідношення сквален:QS21 (ваг./ваг.) в інтервалі від 1:1 до 250:1 або від 20:1 до 200:1, або від 15 20:1 до 100:1, або суттєво 48:1. Також необов'язково включається стерин (наприклад, холестерин), при цьому він є присутнім у співвідношенні сапонін:стерин, як описано в даній заявці. Антигени та антигенна композиція Вакцинні або імуногенні композиції будуть містити антиген або антигенну композицію, здатну викликати імунну відповідь проти людського або тваринного патогена. Є бажаним, коли вказаний антиген або антигенна композиція походять від одного або більше з наступних: HIV-1, (такого, як gag або його фрагменти, такі, як р24,tat, nef, gp120 або gp160 або фрагменти будь-якого з них), вірусів герпесу людини, таких, як, gD або його похідні або безпосередньо ранній білок, такий, як ІСР27 з HSV1 або HSV2, цитомегаловірусу ((esp людський) (такий, як gВ або його похідні), ротавірусу (включаючи живі атенуйовані віруси), вірусу Епштейна-Барра (такого, як gp350 або його похідні), вірусу вітряної віспи (такого, як gpl, II та ІЕ63), або такими, що походять від вірусу гепатиту, такого, як вірус гепатиту В (наприклад, поверхневий антиген вірусу гепатиту В або його похідна), вірус гепатиту А, вірус гепатиту С та вірус гепатиту Е, від інших вірусних патогенів, таких, як параміксовіруси: респіраторносинцитіального вірусу (такого, як F, Ν, Μ та G білки або їх похідні), SARS вірусу, вірусу парагрипу, вірусу кору, вірусу паротиту, людських папіломавірусів (наприклад, HPV6, 11, 16, 18), флавівірусів (наприклад, вірусу жовтої лихоманки, вірусу лихоманки Денге, вірусу енцефаліту, який передається кліщами, вірусу японського енцефаліту) або вірусу грипу (цільного живого або інактивованого вірусу, розщепленого вірусу грипу, вирощеного на курячих ембріонах або клітинах MDCK, або цільних віросом вірусу грипу (як описано R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) або його очищених або рекомбінантних білків, таких, як НА, NP, NA, або Μ білків, або їх комбінацій), або походять від бактеріальних патогенів, таких, як Neisseria spp, включаючи N. gonorrhea та N. meningitidis (наприклад, капсулярні сахариди та їх кон'югати, білки, які зв'язують трансферин, білки, які зв'язують лактоферин, РіІС, адгезини); S. pyogenes (наприклад, Μ білки або їх фрагменти, С5А протеаза, ліпотейхоєві кислоти), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, включаючи Μ catarrhalis, що є також є відомою, як Branhamella catarrhalis (наприклад, адгезини та інвазини з високою або низькою молекулярною вагою; Bordetella spp, включаючи В. pertussis (наприклад, пертактин, токсин коклюшу або їх похідні, філаментний гемаглютинін, аденілатциклаза, фімбрії), В. parapertussis та В. bronchiseptica; Mycobacterium spp., включаючи Μ. tuberculosis (наприклад, ESAT6, антиген 85А, -В або -С), М. bovis, Μ. leprae, M. avium, Μ. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp., включаючи L pneumophila; Eschehchia spp, включаючи ентеротоксичну Ε. coli (наприклад, фактори колонізації, термолабільний токсин або його похідні, термостабільний токсин або його похідні), ентерогеморагічна Е. coli, ентеропатогенна Е. coli (наприклад, токсин, подібний до шига-токсину, або його похідні); Vibrio spp., включаючи V. cholera (на 95646 16 приклад, холерний токсин або його похідні); Shigella spp, включаючи S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, включаючи Υ. enterocolitica (наприклад, Yop білок), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, включаючи С. jejuni (наприклад, токсини, адгезини та інвазини) та С. coli; Salmonella spp, включаючи S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., включаючи L. monocytogenes; Helicobacter spp., включаючи Η. pylori (наприклад, уреаза, каталаза, вакуолізуючий токсин); Pseudomonas spp., включаючи P. aeruginosa; Staphylococcus spp., включаючи S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., включаючи Ε. faecalis, Ε. faecium; Clostridium spp., включаючи С. tetani (наприклад, стовбнячний токсин та його похідна), С. botulinum (наприклад, ботулінічний токсин та його похідна), С. difficile (наприклад, клостридіальні токсини А або В та їх похідні); Bacillus spp., включаючи В. anthracis (наприклад, ботулінічний токсин та його похідні); Corynebacterium spp., включаючи С. diphtheriae (наприклад, дифтерійний токсин та його похідні); Borrelia spp., включаючи В. burgdorferi (наприклад, OspA, OspC, DbpA, DbpB), В. gаrіnіі (наприклад, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (наприклад, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (наприклад, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., включаючи Ε. equi та агент людського гранулоцитарного ерліхіозу; Rickettsia spp, включаючи R.rickettsii; Chlamydia spp., включаючи С. trachomatis (наприклад, МОМР, білки, що зв'язують гепарин), С. рnеumоnіае (наприклад, МОМР, білки, що зв'язують гепарин), С. psittaci; Leptospira spp., включаючи L. interrogans; Treponema spp., включаючи T. pallidum (наприклад, розведені білки зовнішньої оболонки), Т. denticola, T. hyodysenteriae; або такі, що походять від паразитів, таких, як Plasmodium spp., включаючи P. falciparum; Toxoplasma spp., включаючи Т. gondii (наприклад, SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., включаючи E. histolytica; Babesia spp., включаючи B. microti; Trypanosoma spp., включаючи Т. cruzi; Giardia spp., включаючи G. lamblia; Leshmania spp., включаючи L. major; Pneumocystis spp., включаючи P. carinii; Trichomonas spp., включаючи Т. vaginalis; Schisostoma spp., включаючи S. mansoni, або такі, що походять від дріжджів, таких, як Candida spp., включаючи С. albicans; Cryptococcus spp., включаючи С. neoformans. Композиції даного винаходу можуть використовуватися для профілактики або для терапії алергії. Такі вакцини будуть включати специфічні для алергену та неспецифічні для алергену антигени. Інші бажані специфічні антигени для М. tuberculosis являють собою, наприклад, Тb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 та hTCC1 (WO99/51748). Білки для М. tuberculosis також включають злиті білки та їх варіанти, в яких принаймні два, бажано, три поліпептиди М. tuberculosis є злитими у білок більших розмірів. Бажані злиті білки включають Ra12-TbH9Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPVMTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTIMSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO99/51748). 17 Найбільш бажані антигени для Chlamydia включають, наприклад, білок з високою молекулярною вагою (HMW) (WO99/17741), ORF3 (ЕР 366412), та путативні мембранні білки (Рmр). Інші антигени Chlamydia для вакцинної композиції можуть бути вибрані з групи, яка є розкритою в WO99/28475. Бажані бактеріальні вакцини включають антигени, які походять від Streptococcus spp., включаючи S. рпеитопіае (наприклад, PsaA, PspA, стрептолізин, білки, що зв'язують холін), білковий антиген пневмолізину (Biochem Biophys Acta, 1989,67,1007; Rubins та ін., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342) та їх мутантні знешкоджені похідні (WO90/06951; WO99/03884). Інші бажані бактеріальні вакцини включають антигени, які походять від Haemophilus spp., включаючи Η. influenzae типу Б, нетиповану Н. influenzae, наприклад, ОМР26, адгезини, що мають високу молекулярну вагу, Р5, Р6, білок D та ліпобілок D, фімбрин та пептиди, які походять від фімбрину (US 5,843,464) або їх мультикопійні варіанти або білки злиття. Похідні поверхневого антигену гепатиту В є добре відомими в області техніки та включають, поряд з іншими, такі, як набір PreS1, PreS2S антигенів, як представлено в європейських патентних заявках ЕР-А-414374; ЕР-А-0304578 та ЕР 198474. В одному бажаному аспекті вакцинна композиція згідно з винаходом включає HIV-1 антиген, др120, зокрема, коли експресується у клітинах СНО. У додатковому втіленні вакцинна композиція згідно з винаходом включає gD2t, як визначено вище. У бажаному втіленні даного винаходу вакцини, що містять заявлений ад'ювант, включають антиген, що походить від папіломавірусу людини (HPV), який, як вважають, відповідає за генітальні бородавки (HPV6 або HPV11 та інші), та від HPV вірусів, які відповідають за цервікальний рак (HPV16, HPV18 та інші). Особливо бажані форми вакцин для профілактики або терапевтичного лікування бородавок включають L1 білок та злиті білки, що містять один або більше антигенів, вибраних з HPV білків Е1, Е2, Е5, Е6, Е7, L1 та L2. Найбільш бажані форми злитого білка являють собою: L2E7, як розкрито у WO96/26277, та білок D(1/3)-E7, розкритий у WO99/10375. Бажана вакцинна композиція проти HPV цервікальної інфекції або раку, профілактична або терапевтична, може включати HPV16 або 18 антигени. Особливо бажані HPV16 антигени включають ранні білки Е6 або Е7, злиті з білком D носія з утворенням злитого продукту білок D - Е6 або Е7 з HPV16, або їх комбінації; або комбінації Е6 або Е7 з L2 (WO96/26277). Альтернативно, HPV16 або 18 ранні білки Е6 та Е7 можуть бути присутніми у тій самій молекулі, бажано у продукті злиття білок D - Е6/Е7. Така вакцина може необов'язково містити або один з або обидва Е6 та Е7 білки з HPV18, бажано у формі злитого продукту білок D - Е6 або злитого продукту білок D - Е7 або білок D E6/E7. 95646 18 Вакцина даного винаходу може додатково включати антигени з інших штамів HPV, бажано зі штамів HPV31 або 33. Вакцинні або імуногенні композиції даного винаходу додатково включають антигени, які походять від паразитів, які спричинюють малярію, наприклад, антигенів з Plasmodia falciparum, включаючи білок, що оточує спорозоїт (CS білок), RTS, S, MSP1, MSP3, LSA1, LSA3, АМА1 та TRAP. RTS являє собою гібридний білок, який містить суттєво усю С-термінальну частину білка, що оточує спорозоїт (CS) P. falciparum, зв'язаний за допомогою чотирьох амінокислот preS2 частини поверхневого антигену гепатиту В з поверхневим (S) антигеном вірусу гепатиту В. Його повна структура є розкритою у міжнародній патентній заявці №РСТ/ЕР92/02591, опублікованій під номером WO93/10152, що заявляє пріоритет заявки UK №9124390,7. При експресії у дріжджах RTS одержують як ліпопротеїнову частинку, а коли він сумісно експресується з S антигеном з HBV це забезпечує утворення змішаної частинки, відомої, як RTS, S. TRAP антигени є описаними у міжнародній патентній заявці №PCT/GB89/00895, опублікованій під номером WO90/01496. Антигени Plasmodia, що є ймовірними кандидатами як компоненти мультистадійної малярійної вакцини, являють собою Р. falciparum MSP1, АМА1, MSP3, ЕВА, GLURP, RAP1, RAP2, секвестрин, PfEMPI, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPI, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 та їх аналоги у Plasmodium spp. Одне втілення даного винаходу являє собою малярійну вакцину, в якій антигенний препарат включає RTS, S або CS білок або його фрагмент, такий, як CS частина RTS, S, у комбінації з одним або більше додатковими малярійними антигенами, кожний з яких або усі можуть бути приєднані до субодиниці Shiga токсину В у відповідності з винаходом. Один або більше додаткових малярійних антигенів можуть бути вибраними, наприклад, з групи, яка складається з MPS1, MSP3, АМА1, LSA1 або LSA3. Композиції можуть також містити антипухлинний антиген та є корисними для імунотерапевтичного лікування різних форм раку. Наприклад, ад'ювантна композиція може знайти своє застосування при використанні антигенів відторгнення пухлини, таких, як форми раку передміхурової залози, молочних залоз, колоректальний рак, рак легенів, підшлункової залози, нирки або меланома. Приклади антигенів включають MAGE 1 та MAGE 3 або інші MAGE антигени (для лікування меланоми), PRAME, BAGE, або GAGE (Robbins та Kawakami, 1996,Current Opinions in Immunology 8, стор. 628-636; Van den Eynde та ін., International Journal of Clinical & Laboratory Research (представлена у 1997); Correale та ін… (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, стор. 293. Звичайно, ці антигени експресуються у широкій різноманітності типів пухлин, таких, як меланома, карцинома легень, саркома та карцинома жовчного міхура. Інші специфічні для пухлини антигени є прийнятними для застосування з ад'ювантами згідно з даним винаходом та включають, але не обмежуються ними, специфічні для пухлини гангліозиди, проста 19 та-специфічний антиген (PSA) або Her-2/neu, KSA (GA733), PAP, маммаглобін, MUC-1, онкофетальний антиген (СЕА), p501S (простеїн). Згідно з одним аспектом даного винаходу забезпечується вакцина, що включає ад'ювантну композицію згідно з даним винаходом та антиген відторгнення пухлини. В одному аспекті пухлинний антиген являє собою Her-2/neu. Аспект даного винаходу забезпечує той факт, що вакцини включають пухлинний антиген, такий, як при раку передміхурової залози, молочних залоз, колоректальному раку, раку легень, підшлункової залози, нирки, яєчника, або при меланомі. Згідно з цим композиції можуть містити антиген, асоційований з пухлиною, а також антигени, асоційовані з механізмами підтримання пухлини (наприклад, ангіогенезом, інвазією пухлини). Крім того, антигени, які є особливо релевантними для вакцин у терапії, також включають специфічний для передміхурової залози мембранний антиген (PSMA), антиген стовбурових клітин передміхурової залози (PSCA), p501S (простеїн), тирозиназу, сурвівін, NY-ESO1, простазу, PS108 (WO98/50567), RAGE, LAGE, HAGE. Крім того, вказаний антиген може сам по собі являти пептидний гормон, такий, як гормон вивільнення гонадотропного гормону повної довжини (GnRH, WO95/20600), короткий пептид, що містить 10 амінокислот, при цьому він є корисним у лікування багатьох видів раку або в імунокастрації. Вакцинація Такі вакцинні препарати, що містять імуногенні композиції згідно з даним винаходом, можуть використовуватися для захисту або лікування ссавця, чутливого до інфекції, за допомогою введення вказаної вакцини системним шляхом, або через слизові оболонки. Ці введення можуть включати ін'єкцію шляхом внутрішньом'язового, інтраперитонеального, інтрадермального або підшкірного введення, або введення через слизову оболонку до орального/травного, респіраторного, сечостатевого трактів. Інтраназальне введення вакцин для лікування пневмонії або середнього отиту є переважним (оскільки назофарингеальне носійство пневмококів може більш ефективно запобігатися, послаблюючи, таким чином, інфекцію на ранній стадії). Незважаючи на те, що вакцина згідно з винаходом може вводитися як одинична доза, її компоненти можуть також сумісно вводитися одночасно або в різні моменти часу (наприклад, пневмококові сахаридні кон'югати можуть вводитися окремо, у той самий час або через 1-2 тижні після введення будь-якого компоненту бактеріального білка для оптимальної координації імунних відповідей стосовно кожної іншої). На доповнення до цього, вакцини згідно з винаходом можуть вводитися IМ для примуючих дозувань, та IN для введення бустерних доз. Вміст білкових антигенів у вакцині бути типово знаходитися у межах 1-100 мкг, бажано 5-50 мкг, найбільш типово в інтервалі 5-25 мкг. Після початкової вакцинації, особи можуть одержувати одну або декілька бустерних імунізацій, розділених у часі. 95646 20 Вакцинний препарат є в загальному вигляді описаним у Vaccine Design ("The subunit та adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Інкапсуляція у ліпосоми є описаною Fullerton, патент США №4,235,877. Вакцини або імуногенні композиції згідно з даним винаходом можуть зберігатися у розчині або бути ліофілізованими. Бажано, коли розчин є ліофілізованим у присутності цукрів, таких, як сахароза або лактоза. Додатково є бажаним, коли вони є ліофілізованими та піддаються відновлюванню перед застосуванням. В одному аспекті згідно з винаходом забезпечується вакцинний набір, що включає пробірку, яка містить вакцинну композицію згідно з винаходом, необов'язково у ліофілізованій формі, та додатково включає пробірку, яка містить ад'ювант, як описано в даній заявці. Є очевидним, що у цьому аспекті згідно з винаходом ад'ювант буде використовуватися для відновлення ліофілізованої імуногенної композиції. Незважаючи на те, що вакцини згідно з даним винаходом можуть вводитися будь-яким шляхом, введення описаних вакцин у шкіру (ID) утворює одне втілення згідно з даним винаходом. Шкіра людини включає зовнішню "рогову" кутикулу, що називається роговим шаром, що покриває епідерму. Внизу цієї епідерми є шар, який називається дерма, який, у свою чергу, покриває підшкірну тканину. Дослідники показали, що ін'єкція вакцини у шкіру, та зокрема, дерму, стимулює імунну відповідь, що може бути асоційовано з рядом додаткових переваг. Інтрадермальна вакцинація з використанням вакцин, описаних в даній заявці утворює бажану ознаку згідно з даним винаходом. Традиційна методика для інтрадермальнихх ін'єкції, "процедура Манту", включає етапи очищення шкіри, та потім натягування однією рукою, та за допомогою голки зі скошеним краєм з вузьким каналом (калібр 26-31) скошений край голки вводять під кутом 10-15°. Як тільки скос голки введений, тіло голки вводять нижче у шкіру та далі просувають при слабкому тиску до послаблення її під шкірою. Потім рідину вводять дуже повільно, формуючи, таким чином пухирець або шишку на шкірній поверхні, після чого повільно витягають голку. Нещодавно були описані спеціально розроблені пристрої для введення рідких агентів у або через шкіру, наприклад, пристрої, описані у WO99/34850 та ЕР 1092444, а також пристрої для впорскування струменем описані, наприклад у WO01/13977; US 5,480,381, US 5,599,302, US 5,334,144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569,189, US 5,704,911, US 5,383,851, US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339,163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520,639, US 4,596,556, US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, WO97/37705 та WO97/13537. Альтернативні способи для інтрадермального введення вакцинних препаратів можуть включати традиційні шприци та голки, або пристрої, призначені для балістичної доставки твердих вакцин (WO99/27961) або трансдермальні 21 пластирі (WO97/48440; WO98/28037); або такі, що застосовуються до поверхні шкіри (трансдермальна або трансшкірна доставка WO98/20734; WO98/28037). Коли вакцини згідно з даним винаходом вводяться у шкіру, або зокрема, у дерму, вакцина знаходиться у малому об'ємі рідини, зокрема, об'єм складає від приблизно 0,05 мл до 0,2 мл. Вміст антигенів у шкірних або інтрадермальних вакцинах згідно з даним винаходом може бути подібним до традиційних доз, як це є у внутрішньом'язових вакцинах (див. вище). Проте ознакою шкірних та інтрадермальних вакцин є те, що композиції можуть бути у "низькій дозі". Відповідно до цього білкові антигени у вакцинах "низької дози" є бажано присутніми у дозі від 0,1 до 10 мкг, бажано у дозі від 0,1 до 5 мкг на дозу; сахаридні (бажано кон'юговані) антигени можуть бути присутніми у межах 0,01-1 мкг, та бажано від 0,01 до 0,5 мкг сахариду на дозу. Як використовується в даній заявці, термін "інтрадермальна доставка" означає доставку вакцини у район дерми у шкірі. Проте вакцина не буде з необхідністю розташовуватися у дермі. Дерма є шаром у шкірі, який розміщений між приблизно 1,0 та приблизно 2,0 мм від поверхні шкіри людини, проте існує деяка кількість варіацій між індивідуумами та у різних частинах тіла. В загальному випадку, слід очікувати досягнення дерми шляхом проходження 1,5 мм нижче поверхні шкіри. Дерма розміщена між роговим шаром та епідермою на поверхні та підшкірним шаром, розміщеним нижче. У залежності від способу доставки вакцина може в основному розміщуватися виключно або в основному у межах епідерми та дерми. Кількість кон'югату антигену в кожній вакцинній дозі є вибраною як кількість, яка індукує імунопротективну відповідь без значних шкідливих побічних ефектів у типових вакцинах. Така кількість буде варіювати у залежності від специфічного імуногену, що використовується та від того, як він представлений. У додатковому втіленні забезпечується спосіб лікування індивідууму, чутливого до, або такого, що страждає від захворювання, шляхом введення композиції, як суттєво описано в даній заявці. Також забезпечується спосіб захисту індивідуума від захворювання, вибраного з групи, яка включає інфекційні бактеріальні та вірусні захворювання, паразитичні захворювання, зокрема, внутрішньоклітинне патогенне захворювання, проліферативні захворювання, такі, як рак передміхурової залози, молочних залоз, колоректальний рак, рак легень, підшлункової залози, нирки, яєчника, або меланома, неракові хронічні розлади, алергію, що включає введення композиції, як суттєво описано в даній заявці, вказаному індивідууму. У додатковому втіленні забезпечується вакцинна композиція для застосування у профілактиці або терапії стану або захворювання, де вакцинна композиція включає антиген або антигенну композиція та ад'ювантну композицію, що складається з емульсії масло-у-воді, яка включає 0,5-10 мг здатного до перетворення у процесі обміну речовин 95646 22 масла, 0,5-11 мг токолу та 0,1-4 мг емульгувального агенту на людську дозу. У додатковому втіленні забезпечується застосування вакцинної композиції у виробництві лікарського засобу для застосування у профілактичній терапії або терапії стану або захворювання, де вакцинна композиції включає антиген або антигенну композицію та ад'ювантну композицію, що складається з емульсі ї масло-у-воді, яка включає 0,5-10 мг здатного до перетворення у процесі обміну речовин масла, 0,5-11 мг токолу та 0,1-4 мг емульгувального агента на людську дозу. Винахід буде додатково описаний з посиланням на наступні, необмежувальні приклади: Приклад І описує імунологічні методи одержання інформації, що використовуються у дослідження на мишах, тхорах, свинях та людях. Приклад II описує приготування та характеристику емульсії масло-у-воді та ад'ювантних композицій, що використовуються у представлених у прикладах дослідженнях. Приклад III описує клінічне дослідження у популяції дорослих людей у віці 18-59 років при використанні вакцини, що містить препарат розщепленого антигену вірусу грипу та різні дози ад'юванта AS03. Приклад IV показує попередню клінічну оцінку розщеплених вакцин вірусу грипу з ад'ювантом та без ад'юванта у BALB/C мишей. Приклад V показує попередню клінічну оцінку розщеплених вакцин вірусу грипу з ад'ювантом та без ад'юванта (що включають різні дози ад'ювант AS03) у примованих С57ВІ/6 мишей. Приклад VI показує попередню клінічну оцінку розщеплених вакцин вірусу грипу з ад'ювантом та без ад'юванта (що включають різні дози ад'юванта AS03 та низьку дозу антигену) у примованих С57ВІ/6 мишей. Приклад VII показує попередню клінічну оцінку розщеплених H5N1 вакцин з ад'ювантом та без ад'юванта (що включають різні дози ад'юванта AS03 та антигену) в інтактних С57ВІ/6 мишей. Приклад VIII показує попередню клінічну оцінку вакцин проти грипу у примованих великих білих свиней. Приклад І - Імунологічні методи одержання інформації І.1. Способи на мишах І.1.1. Реакція інгібування гемаглютинації Титри антигемаглютинінових антитіл до трьох (сезонних) штамів вірусу грипу визначали при використанні реакції інгібування гемаглютинації (НІ). Принцип НІ аналізу базується на здатності специфічних антитіл до вірусу грипу інгібувати гемаглютинацію курячих еритроцитів (RBC) гемаглютиніном вірусу грипу (НА). Інактивовану прогріванням сироватку попередньо обробляли каоліном та RBC для видалення неспецифічних інгібіторів. Після попередньої обробки двократні розведення сироватки інкубували з 4 одиницями гемаглютинації кожного штаму вірусу грипу. Потім додавали курячі еритроцити та підраховували аглютинацію. Титри виражали як такі, що є оберненими до найвищого ступеню розведення сироватки, яке є здатним повністю інгібувати гемаглютинацію. Оскільки перше 23 розведення складало 1:20, нездатний до визначення рівень позначали як титр, рівний 10. Адаптація для H5N1 (специфічний опис НІ при використанні конячих еритроцитів): Оскільки класичний НІ аналіз для визначення анти-НА антитіл був задокументований як такий, що не досить добре працює для H5N1 штаму, використовували адаптований пропис при використанні конячих RBC. Еритроцити коней використовували для H5N1 пандемічних штамів. 0,5 % (заключна концентрації) суспензію конячих еритроцитів у фосфатному буфері, що містить 0,5 % БСА (бичачий сироватковий альбумін, заключна концентрація). Цю суспензію одержували кожного дня шляхом промивання еритроцитів тим самим фосфатним буфером та при використанні подальшого етапу центрифугування (10 хв., 2000 об./хв.). Цей етап промивання необхідно повторити один раз. Після додання конячих еритроцитів до реакційної суміші сироватки та вірусної суспензії планшети необхідно інкубувати при кімнатній температурі (КТ, 20 °C +/- 2 °C) протягом двох годин завдяки низькій швидкості седиментації конячих еритроцитів. Статистичний аналіз Статистичний аналіз проводили на титрах НІ, одержаних після вакцинації, використовуючи UNISTAT. Пропис, що застосовується для дисперсійного аналізу, може бути коротко описаний наступним чином: - Log перетворення даних - Критерій Шапіро-Уілка для кожної популяції (групи) для того, щоб перевірити нормальність розподілу груп - Критерій Кокрена для того, щоб перевірити гомогенність дисперсії між різними популяціями (групами) - Аналіз дисперсії на відібраних даних - Аналіз на взаємозв'язок двостороннього SNOVA - HSD критерій Такі для множинних порівнянь І.1.2. Забарвлювання внутрішньоклітинного цитокіну Ця методика дозволяє кількісно оцінювати антиген-специфічні Т-лімфоцити на основі продукції цитокіну: ефекторні Т-клітини та/або ефекторні Тклітини пам'яті, які продукують IFN-γ та/або центральні Т-клітини пам'яті, які продукують IL-2. РВМС (мононуклеарні клітини периферичної крові) збирали на 7 день після імунізації. Лімфоїдні клітини повторно стимулювали in vitro у присутності інгібітора секреції (Brefeldine). Ці клітини потім обробляли за допомогою традиційної імунофлуоресцентної процедури при використанні флуоресцентних антитіл (CD4, CD8, IFN-γ та IL-2). Результати виражали як частоту зустрічальності цитокін-позитивних клітин серед CD4/CD8 Тклітин. Забарвлювання внутрішньоклітинних цитокінів Т-клітин проводили на РВМС через 7 днів після другої імунізації. Кров брали у миші та піддавали розділенню на пули клітин у гепаринізованому середовищі RPMI + добавки. Для крові PBL суспензії, розведені RPMI + добавки, розділяли на шари на градієнті Lympholyte-Mammal згідно з рекомендованим прописом (центрифугування протягом 20 хвилин при 2500 об./хв. та кімнатній темпе 95646 24 ратурі). Мононуклеарні клітини на границі розділення видаляли, промивали 2х у RPMI + добавки, та суспензії РВМС доводили до значення концент6 рації 2×10 клітин/мл у RPMI 5 % фетальної сироватки теляти. In vitro антигенну стимуляцію РВМС проводи7 ли при заключній концентрації 1×10 клітин/мл (пробірка FACS) з цільним вірусом грипу (1 мкг НА/штам) та потім інкубували 2 години при 37 °C з доданням анти-СD28 та анти-СD49d (1 мкг/мл для обох). Після етапу повторної стимуляції антигену РВМС інкубували протягом ночі при 37 °C у присутності Brefeldin (1 мкг/мл) при 37 °C для інгібування секреції цитокінів. IFN-γ/IL-2/CD4/CD8 забарвлювання проводили так, як описано нижче: Промивали клітинні суспензії, ресуспендували їх у 50 мкл PBS 1 % FCS, що містить 2 % Fc блокувального реагенту (1/50; 2.4G2). Через 10 хвилин після інкубації при температурі 4 °C додавали 50 мкл суміші анти-СD4-РЕ (2/50) та анти-СD8 реrСр (3/50) та інкубували протягом 30 хв. при 4 °C. Після промивання у PBS 1 % FCS клітини перміабілізували шляхом ресуспендування у 200 мкл Cytofix-Cytoperm (Kit BD) та інкубували протягом 20 хв. при 4 °C. Потім клітини промивали Perm Wash (Kit BD) та ресуспендували з 50 мкл суміші анти-IFN-γ АРС (1/50) + анти-ІL-2 FITC (1/50), розведеній Perm Wash. Після інкубування протягом мінімум 2 годин, максимум - протягом ночі при 4 °C, клітини промивали за допомогою Perm Wash та ресуспендували в PBS 1 % FCS+1 % параформальдегіду. Аналіз зразків здійснювали за допомогою FACS. Живі клітини відбирали (FSC/SSC) та збір даних проводили на ~ 20000 подіях (для лімфоцитів) або 35000 подіях для CD4+ Т-клітин. Процентне значення IFN-γ+ або IL2+ розраховували на CD4+ та CD8+ відібраних популяціях. I.1.3. Aнти-H5N1 ELISA. Кількісну оцінку анти-Н5N1 lg, титрів lgG1 та lgG2b антитіла проводили за допомогою ELISA, використовуючи розщеплений H5N1 як покриття. Розчини вірусу та антитіла використовували у кількості 100 мкл на комірку. Розщеплений H5N1 вірус розводили при заключній концентрації 1 мкг/мл у PBS та піддавали адсорбції протягом ночі при 4 °C до комірок 96 Потім планшети інкубували plates протягом 1 години при 37 °C з 200 мкл на комірку PBS, що містить 1 % БСА та 0,1 % Твіну 20 (буфер насичення). Додавали дванадцять двократних розведень сироватки у буфері насичення до планшетів, покритих H5N1 та інкубували протягом 1 години 30 хвилин при 37 °C. Планшети промивали чотири рази за допомогою PBS 0,1 % Твін 20. Біотинільований та кон'югований антимишачий Ig (Prozan-E0413) розводили 1/500, або біотинільований та кон'югований антимишачий lgG1 (lmtech 1070-08), або біотинільований антимишачий lgG2b (Imtech 1090-08) розводили 1/4000 у PBS 1 % БСА 0,1 % Твіну 20 додавали до кожної комірки та інкубували протягом 1 години 30 хвилин при 37 °C; після етапу промивання планшети інкубували 30 хвилин з кон'югатом стрептавідин-біотин 25 пероксидаза (Prozan P0397), розведеним 1/10000 у PBS 1 % БСА Твін 20. Для колориметричного виявлення планшети інкубували протягом 20 хвилин при 22 °C з розчином о-фенілдіаміну (Sigma P4664) 0,04 % Н2О2 0,03 % у 0,1 Μ цитратному буфері рН 4,2. Реакцію зупиняли при використанні 2Ν H2SO4 та мікропланшети зчитували при 490-630 нм. I.2. Способи при використанні тхорів I.2.1. Дослідження інгібування гемаглютинації Процедура дослідження Титри антигемаглютинінових антитіл до трьох штамів вірусу грипу визначали при використанні реакції інгібування гемаглютинації (НІ). Принцип НІ аналізу базується на здатності специфічних антитіл до вірусу грипу інгібувати гемаглютинацію курячих еритроцитів (RBC) гемаглютиніном вірусу грипу (НА). Сироватку спочатку обробляли 25 % розчином нейрамінідази (RDE) та піддавали інактивації прогріванням для видалення неспецифічних інгібіторів. Після попередньої обробки двократні розведення сироватки інкубували з 4 одиницями гемаглютинації кожного штаму вірусу грипу. Потім додавали курячі еритроцити та підраховували аглютинацію. Титри виражали як такі, що є оберненими до найвищого ступеня розведення сироватки, яке є здатним повністю інгібувати гемаглютинацію. Оскільки перше розведення складало 1:10, нездатний до визначення рівень позначали як титр, рівний 5. Статистичний аналіз Статистичний аналіз проводили на титрах НІ (день 41 перед контрольним зараженням), використовуючи UNISTAT Пропис, що використовувався для дисперсійного аналізу, може бути коротко описаний наступним чином: - Log перетворення даних - Критерій Шапіро-Уілка для кожної популяції (групи) для того, щоб перевірити нормальність групованого розподілу - Критерій Кокрена для того, щоб перевірити гомогенність дисперсії між різними популяціями (групами) - Однофакторний дисперсійний аналіз на взаємодію ANOVA - HSD критерій Такі для множинних порівнянь I.2.2. Моніторинг температури тіла Індивідуальні температури піддавали моніторингу під час періоду контрольного зараження при використанні передавального пристрою та телеметричної реєстрації. Усі імплантати перевіряли, ремонтували та нове калібрування проводили за допомогою DSI (Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 ТС Tilburg, The Netherlands) перед тим, як помістити їх у інтраперитонеальну порожнину. Усіх тварин розміщували окремо в окремі клітки під час цих вимірювань. Температури реєстрували кожні 15 хвилин протягом 4 днів перед контрольним зараженням та протягом 7 днів після контрольного зараження. I.2.3. Носові змиви Промивання носових ходів проводили шляхом введення 5 мл PBS в обидві ніздрі тварини, яких не піддавали наркозу. Інокулят збирали у чашку 95646 26 Петрі та поміщали у контейнери для зразків на сухий лід. Титрування вірусу з носових змивів Усі носові зразки спочатку стерильно фільтрували через фільтри Spin X (Costar) для видалення будь-якого бактеріального забруднення. 50 мкл серійних десятикратних розведень носових змивів переносили на мікротитрувальні планшети, які містили 50 мкл середовища (10 комі5 рок/розведення). 100 мкл MDCK клітин (2,4×10 клітин/мл) потім додавали до кожної комірки та інкубували при 35 °C протягом 5-7днів. Через 5-7 днів інкубування культуральне середовище обережно видаляли та додавали 100 мкл середовища, що містить 1/20WST-1, та інкубували протягом подальших 18 годин. Інтенсивність жовтого забарвлення формазаном, який виробляється при відновленні WST-1 життєздатними клітинами, є пропорційною кількості життєздатних клітин, що є присутніми у комірці наприкінці аналізу титрування вірусу, інтенсивність забарвлення є здатною для кількісної оцінки шляхом вимірювання поглинання кожної пробірки при прийнятній довжині хвилі (450 нанометрів). Величину фону визначали як середнє значення OD неінфікованих контрольних клітин - 0,3 OD (0,3 OD відповідає +/- 3 StDev OD неінфікованих контрольних клітин). Позитивне значення визначали, коли OD фону. Титри виділення вірусу з організму визначали за допомогою способу Ріда та Мюнча та виражали як Log ТСID50/мл. І.3. Способи при використанні свиней I.3.1. Дослідження інгібування гемаглютинації Процедура дослідження Титри антигемаглютинінових антитіл до трьох штамів вірусу грипу визначали при використанні реакції інгібування гемаглютинації (НІ). Принцип НІ аналізу базується на здатності специфічних антитіл до вірусу грипу інгібувати гемаглютинацію курячих еритроцитів (RBC) гемаглютиніном вірусу грипу (НА). Сироватку спочатку обробляли 25 % розчином нейрамінідази (RDE) та піддавали інактивації прогріванням для видалення неспецифічних інгібіторів. Після попередньої обробки двократні розведення сироватки інкубували з 4 одиницями гемаглютинації кожного штаму вірусу грипу. Потім додавали курячі еритроцити та підраховували аглютинацію. Титри виражали як такі, що є оберненими до найвищого ступеня розведення сироватки, яке є здатним повністю інгібувати гемаглютинацію. Оскільки перше розведення складало 1:10, нездатний до визначення рівень позначали як титр, рівний 5. Статистичний аналіз Статистичний аналіз проводили на титрах НІ (день 41 перед контрольним зараженням), використовуючи UNISTAT Пропис, що використовувався для дисперсійного аналізу, може бути коротко описаний наступним чином: - Log перетворення даних - Критерій Шапіро-Уілка для кожної популяції (групи) для того, щоб перевірити нормальність групованого розподілу 27 - Критерій Кокрена для того, щоб перевірити гомогенність дисперсії між різними популяціями (групами) - Однофакторний дисперсійний аналіз на взаємодію ANOVA - HSD критерій Такі для множинних порівнянь I.4. Аналізи для оцінки імунної відповіді у людей I.4.1. Аналіз інгібування гемаглютинації Імунну відповідь визначали шляхом вимірювання НІ антитіл при використанні способу, описаного Центром співробітництва з грипу Всесвітньої організації охорони здоров'я, Центрами контролю захворювань, Атланта, США (1991). Вимірювання титру антитіл проводили на розморожених зразках сироватки згідно зі стандартизованим та повністю узгодженим мікрометодом, використовуючи 4 одиниці інгібування гемаглютинації (4 HIU) прийнятних антигенів та 0,5 % суспензію еритроцитів птахів. Неспецифічні інгібітори сироватки видаляли шляхом теплової обробки та за допомогою ферментів, що руйнують рецептори. Одержану сироватку оцінювали на рівні НІ антитіл. Починаючи з вихідного розведення 1:10 готували серії розведень (фактор 2) до заключного розведення 1:20480. За кінцеву точку титрування брали найбільше розведення, що демонструє повне інгібування (100 %) гемаглютинації. Усі аналізи проводили у двократній повторності. I.4.2. Аналіз інгібування нейрамінідази Аналіз проводили на мікротитрувальних планшетах, вкритих фетуїном. Готували серії двократних розведень антисироватки та змішували їх зі стандартизованою кількістю H3N2, H1N1 вірусу грипу А або вірусу грипу В. Аналіз базується на біологічній активності нейрамінідази, яка ферментативно вивільняє нейрамінову кислоту з фетуїну. Після відщеплення термінальної нейрамінової кислоти виявляється β-D-галактоза-Nацетилгалактозамін. До комірок додавали аглютинін земляного горіху, мічений пероксидазою хрону ((НРР)-мічений) з Arachis hypogaea, який специфічно зв'язується зі структурами галактози. Кількість зв'язаного аглютиніну можна визначити та кількісно оцінити у субстратній реакції з тетраметилбензидином (ТМВ). Найвище розведення антитіла, що все ще інгібує вірусну нейрамінідазну активність принаймні на 50 %, позначали як титр NI. I.4.3. Аналіз визначення нейтралізуючих антитіл Вимірювання нейтралізуючих антитіл проводили на розморожених зразках сироватки. Нейтралізацію вірусу антитілами, що містяться у сироватці, визначали в аналізі мікронейтралізації. В аналізі використовували сироватку без додаткової обробки. Кожну сироватку титрували у трикратній повторності. Стандартизовану кількість вірусу змішували з серійними розведеннями сироватки та інкубували для зв'язування антитіл з вірусом. Клітинну суспензію, що містить визначену кількість клітин MDCK, додавали до суміші вірусу та антисироватки та інкубували при 33 °C. Після періоду інкубації реплікацію вірусу візуалізували за допомогою гемаглютинації еритроцитів курки. Титр 95646 28 50 % нейтралізації підраховували за допомогою способу Ріда та Мюнча. I.4.4. Опосередкований клітинами імунітет оцінювали шляхом цитокінової проточної цитометрії (CFC) Антиген-специфічні CD4 та CD8 Т-клітини периферичної крові можуть бути повторно стимульовані in vitro для продукції IL-2, CD40L, TNF-альфа та IFN, якщо їх інкубувати з відповідним антигеном. Згідно з цим антиген-специфічні CD4 та CD8 Т-клітини можуть бути підраховані шляхом проточної цитометрії, що супроводжується традиційним імунофлуоресцентним міченням клітинного фенотипу, а також внутрішньоклітинної продукції цитокінів. У даному дослідженні вакцинний антиген грипу, як і пептиди, що походять від специфічного білка вірусу грипу, використовували як антиген для повторної стимуляції специфічних для грипу Тклітин. Результати виражали як частоту зустрічальності цитокін-позитивних CD4 або CD8 Т-клітин у межах субпопуляції CD4 або CD8 Т-клітин. I.4.5. Статистичні методи I.4.5.1. Первинні критичні точки • Процент, інтенсивність та зв'язок з вакцинацією представлених на вимогу місцевих та загальних ознак та симптомів протягом семиденного періоду спостереження (тобто, у день вакцинації та наступні 6 днів) після вакцинації та взагалі. • Процент, інтенсивність та зв'язок з вакцинацією представлених добровільно місцевих та загальних ознак та симптомів протягом двадцятиодноденного періоду спостереження (тобто, у день вакцинації та наступні 20 днів) після вакцинації та взагалі. • Виникнення серйозних побічних ефектів під час усього періоду дослідження І.4.5.2. Вторинні критичні точки Для гуморальної імунної відповіді: Дослідні величини: • У дні 0 та 21: титри сироваткових гемаглютинінінгібуючих (НІ) та NI антитіл, досліджували окремо проти кожного з трьох штамів вірусу грипу, представлених у вакцині (анти-H1N1, анти-Н3N2 та анти-В-антитіла). • У дні 0 та 21: титри нейтралізуючих антитіл, досліджували окремо проти кожного з трьох штамів вірусу грипу, представлених у вакцині. Похідні величини (з 95 % довірчими інтервалами): • Середнє геометричне титрів (GMT) сироваткових НІ антитіл (95 % СІ) до та після вакцинації • Індекси сероконверсії* з 95 % СІ на день 21 • Коефіцієнти конверсії** з 95 % СІ на день 21 • Показники серозахисту*** з 95 % СІ на день 21 • GMT сироваткового NI антитіла (з 95 % довірчими інтервалами) в усіх кінцевих точках. *Індекс сероконверсії, визначений як процент вакцинованих, які мали принаймні чотирьохкратне підвищення сироваткових НІ титрів на день 21 у порівнянні з днем 0, для кожного вакцинного штаму. **Коефіцієнт конверсії, визначений як кратність підвищення GMT сироваткових НІ на день 21 29 у порівнянні з днем 0, для кожного вакцинного штаму. ***Показник захисту, визначений як частина вакцинованих з сироватковим НІ титром = 40 після вакцинації (для кожного вакцинного штаму), що звичайно приймають як такий, що свідчить про захист. При цьому є зрозумілим, що деякі з клінічних дослідів, реактогенність/безпечність можуть бути вторинними кінцевими точками, а імуногенність може бути первинною кінцевою точкою. Для опосередкованої клітинами імунної відповіді (СМІ) Дослідні величини: У дні 0 та 21: частота зустрічальності цитокін6 позитивних CD4/CD8 клітин на 10 клітин у різних аналізах. Кожний аналіз кількісно оцінює відповідь CD4/CD8 Т-клітин на: • Пептидний антиген вірусу грипу (pf) (точна природа та походження цих антигенів потребує зазначення/пояснення) • Антиген розщепленого вірусу грипу (sf) • Цільний антиген вірусу грипу (wf). Похідні величини: • клітини, що продукують принаймні два різні цитокіни (CD40L, IL-2, IFNγ, TNFα) • клітини, що продукують принаймні CD40L та інший цитокін (IL-2, TNFα, IFNγ) • клітини, що продукують принаймні IL-2 та інший цитокін (CD40L, TNFα, IFNγ) • клітини, що продукують принаймні IFNγ та інший цитокін (IL-2, TNFα, CD40L) • клітини, що продукують принаймні TNFα та інший цитокін (IL-2, CD40L, IFNγ) I.3.5.3. Аналіз імуногенності Аналіз імуногенності базувався на загальній групі вакцинованих. Для кожної групи обробки розраховували наступні параметри (з 95 % довірчими інтервалами): • Середнє геометричне значення титрів (GMT) НІ та NI антитіл на дні 0 та 21 • Середнє геометричне значення титрів (GMT) нейтралізуючого антитіла на дні 0 та 21. • Коефіцієнти конверсії на день 21. • Індекси сероконверсії (SC) на день 21, визначені як процент вакцинованих, які мали принаймні чотирьохкратне підвищення сироваткових НІ титрів на день 21 у порівнянні з днем 0. • IПоказники захисту на день 21, визначені як процент вакцинованих з сироватковим титром НІ = 1:40. • Частота зустрічальності CD4/CD8 Тлімфоцитів, які секретуються у відповідь, підсумовували (описова статистика) для кожної групи вакцинації, у кожній критичній точці (День 0, День 21) та для кожного антигену (пептид вірусу грипу (pf), розщеплений вірус грипу (sf) та цільний вірус грипу (wf)). • Описова статистика індивідуальних відмінностей між відповідями кінцевої точки (до-після) для кожної групи вакцинації та для кожного антигену (pf, sf, та wf) у 5 різних аналізах. • Непараметричний аналіз (критерій КрускалаУоліса) використовували для порівняння відмінностей між трьома групами, а статистичне р 95646 30 значення підраховували для кожного антигену у кожному з 5 різних аналізів. Усі критерії значущості були двосторонніми. Р-значення, менші або рівні 0,05, вважали статистично значущими. Приклад II - Приготування та характеристика емульсії масло-у-воді та ад'ювантних композицій Якщо не вказано інше, то масляно/водна емульсія, що використовується у подальших прикладах, складається з органічної фази, яка включає 2 масла (альфа-токоферол та сквален), та водної фази PBS, яка включає Твін 80 як емульгувальний агент. Якщо не вказано інше, то композиції з ад'ювантом на основі емульсії масло-у-воді, що використовуються у подальших прикладах, приготовлені такими, що включають наступний компонент емульсії масло-у-воді (приведена заключна концентрація): 2,5 % сквалену (об./об.), 2,5 % альфатокоферолу (об./об.), 0,9 % поліоксіетиленсорбіт моноолеату (об./об.) (Твіну 80), див. WO95/17210. Цю емульсію, що позначається AS03 у подальших прикладах, готують як концентрат двократної концентрації. II.1. Одержання емульсії SB62 Цей спосіб використовували у дослідженнях, що викладені у розділах клінічних та доклінічних прикладів. Препарат SB62 емульсії одержували шляхом змішування при інтенсивному перемішуванні масляної фази, яка складається з гідрофобних компонентів (DL-α-токоферол та сквален), та водної фази, яка містить розчинні у воді компоненти (аніонний детергент Твін 80 та PBS мод. (модифікований), рН 6,8). При перемішуванні масляну фазу (1/10 загального об'єму) переносили у водну фазу (9/10 загального об'єму), та суміш перемішували протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Одержану суміш потім піддавали впливу сил зсуву, дії ударних сил та сил кавітації у камері взаємодії пристрою для мікропсевдозрідження (15000 фунтів на кв. дюйм - 8 циклів, або 3 цикли в ад'юванті, який використовується у клінічних дослідженнях, представлених у Прикладі III) для одержання субмікронних крапель (розподіл між 100 та 200 нм). Одержане значення рН складало 6,8±0,1.SB62 емульсію потім піддавали стерилізації шляхом фільтрації через фільтр 0,22 мкм та стерильний об'єм емульсії зберігали у замороженому вигляді у Сирас контейнерах при температурі від 2 до 8 °C. Стерильний інертний газ (азот або аргон) вносили у незаповнений простір контейнера для заключної маси SB62 емульсії протягом принаймні 15 секунд. Заключна композиція SB62 емульсії мала наступний склад: Твін 80:1,8 % (об./об.) 19,4 мг/мл; сквален: 5 % (об./об.) 42,8 мг/мл; α-токоферол: 5 % (об./об.) 47,5 мг/мл; PBS-мод.: NaCI 121 мМ, КСІ 2,38 мМ, Na2HPO4 7,14 мМ, КН2РО4 1,3 мМ; рН 6,8±0,1. Приклад III - Клінічний дослід у популяції дорослих людей у віці 18-59 років з вакциною, що та різні дози of AS03 ад'юванта (Flu-LD-004) III.1. Введення Фаза II, контрольоване, рандомізоване, одноцентрове, сліпе дослідження у популяції дорослих людей у віці 18-59 років у 2006 році проводили для того, щоб оцінити імуногенність, безпечність та 31 імуногенність кандидатної вакцини проти вірусу грипу низької дози GlaxoSmithKline Biologicals (тобто такої, що містить 5 мкг НА на штам) з двома дозами AS03 ад'юванта. Гуморальну імунну відповідь (тобто антигемаглютинін) вимірювали через 21 день після внутрішньом'язового введення однієї дози вакцини з ад'ювантом AS03. Fluarix™ використовували як контроль. III.1 Модель дослідження Три групи осіб паралельно одержували наступну вакцину внутрішньом'язово: - одна група зі 100 осіб, що одержувала одну ін'єкцію розщепленої вакцини з низькою дозою вірусу грипу, що містить 5 мкг НА з ад'ювантом AS03 (FluLD1/1) - одна група зі 100 осіб, що одержувала одну ін'єкцію розщепленої вакцини з низькою дозою вірусу грипу, що містить 5 мкг НА з половинною дозою ад'юванта AS03 (AD03 1/2) (FluLD1/2) - одна група і 100 осіб, що одержувала одну дозу Fluarix™ (Fluarix). Розклад вакцинації: одна внутрішньом'язова ін'єкція вакцини грипу у день 0, візити для дослідження сайту введення у день 0 та у день 21 із забором зразків крові (визначення НІ антитіл) та додатковий телефонний контакт у день 30. Стандартна тривалентна розщеплена вакцина грипу - Fluarix™, яка використовується у цьому дослідженні, являє собою комерційну вакцину з 2006 року, що вдосконалена та виробляється GlaxoSmithKline Biologicals. III.3. Задача дослідження III.3.1. Первинна задача - Для оцінки гуморальної імунної відповіді, індукованої досліджуваними вакцинами, у значеннях титрів антигемаглютинінових антитіл: Досліджувані величини у дні 0 та 21: титри сироваткового антитіла, що інгібує гемаглютинацію. Похідні величини (з 95 %-ними довірчими інтервалами): - Середнє геометричне значення титрів (GMT) сироваткових антитіл у дні 0 та 21 - Індекси сероконверсії* у день 21 - Коефіцієнт конверсії** у день 21 - ІПоказники захисту*** у дні 0 та 21 *Індекс сероконверсії для відповіді антигемаглютинінового антитіла визначається як процент вакцинованих, що мають або титр до вакцинації 1:40, або титр до вакцинації ≥1:10 та принаймні чотирьохкратне підвищення титру після вакцинації. "Коефіцієнт конверсії визначається як підвищення кратність підвищення GMT НІ у сироватці після вакцинації у порівнянні із днем 0; ***ІПоказники захисту визначається як процент вакцинованих із титром НІ у сироватці г 40 після вакцинації, що звичайно приймають як такий, що свідчить про захист. III.3.2. Вторинна задача - Для оцінки безпечності та реактогенності досліджуваних вакцин у значеннях наданих на вимогу місцевих та загальних побічних ефектів та серйозних побічних ефектів: 1. Виникнення, інтенсивність та взаємозв'язок з вакцинацією наданих на вимогу місцевих та за 95646 32 гальних ознак та симптомів протягом 7-денного періоду (тобто, день вакцинації та 6 подальших днів) після кожної вакцинації у кожній групі. 2. Виникнення, інтенсивність та взаємозв'язок з вакцинацією наданих добровільно місцевих та загальних ознак та симптомів протягом 30-денного періоду (тобто, день вакцинації та 29 подальших днів) після кожної вакцинації у кожній групі. 3. Виникнення та взаємозв'язок серйозних побічних ефектів протягом усього періоду дослідження у кожній групі. III.4. Вакцинна композиція та введення III.4.1. Вакцинний препарат Вакцина проти грипу без ад'юванта являє собою інактивовану вакцину на основі тривалентного розщепленого віріону, що містить три моновалентні маси вірусних антигенів (які є приготовленими відповідно зі штамів вірусу грипу A/H1N1, A/H3N2 та В). Антигени, що є присутніми у цій вакцині є такими самими, що й у ліцензованій вакцині Fluarix™, яка є доступною на ринку як Fluarix ™ (αRix®) з1992 року та містить 15 мкг НА/штаму на дозу. Штами вірусу грипу, що є включеними у FluLD клінічні партії, являють собою штами, які є вибраними для сезону 2006/2007 та для північної півкулі: • A/New Caledonia/20/99 (Н1N1)-подібний штам: A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116 • A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)-подібний штам: A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) NYMCX-161 • B/Malaysia/2506/2004. Антигени є такими, що походять від вірусів, вирощених на курячих ембріонах. Розщеплення виконували при використанні дезоксихолату натрію перед проведення етапу інактивації, які здійснювали за допомогою послідовної дії дезоксихолату натрію та формальдегіду. Вакцина, що містить низьку дозу вірусу грипу (FluLD) та ад'ювант AS03, (клінічні партії) базується на комерційно доступній вакцині Fluarix™ (яка є приготовленою відповідно зі штамів вірусу грипу A/H1N1, A/H3N2 та В), але з низьким вмістом антигену та з ад'ювантною системою GSK AS03.AS03 складається з емульсії масло-у-воді (SB62), що містить два здатні до біорозкладання масла, сквален та α-токоферол (вітамін Е), та поверхневоактивну сполуку, полісорбат 80 (Твін 80). Антигени вірусу грипу є введеними у водну фазу ад'ювантної система шляхом простого перемішування з емульсією. Було проаналізовано два склади, які відрізняються кількістю ад'юванта, введеного з Flu антигенами у вакцинну партію. Вакцини з ад'ювантом містять 5 мкг гемаглютиніну (НА) кожного штаму вірусу грипу на дозу, що є поєднаним з повною дозою (AS03) або половинною дозою (AS03 14) ад'ювантної системи AS03. Наповнювачі є наступними: полісорбат 80 (Твін 80), октоксинол 10 (Тритон Х-100), альфа-токоферол гідросукцинат, хлорид натрію, гідрогенфосфат динатрію, дигідрогенфосфат калію, хлорид калію, вода для ін'єкцій. Вакцини з низькою дозою вірусу грипу, які містять ад'ювант AS03 (FluLD, повна або половинна доза AS03) є вакцинами, що не містять у своєму складі консервантів. Проте вони містять слідові кількості тіомерсалу (