Застосування комбінації вірусу міксоми та рапаміцину для лікування

1. Спосіб лікування хворобливого стану, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, який включає введення хворому, що потребує цього, ефективної кількості комбінації вірусу міксоми та рапаміцину. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хворобливим станом є рак. 3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що раком є солідна пухлина, рак гемопоетичних клітин, рак товстої кишки, рак легенів, рак нирок, рак підшлункової залози, рак ендометрія, рак щитовидної залози, рак ротової порожнини, рак яєчника, рак гортані, гепатоцелюлярний рак, рак жовчних протоків, плоскоклітинний рак, рак передміхурової залози, рак молочної залози, рак шийки матки, рак анастомозу ободової та прямої кишок або меланома. 4. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що раком є рак легенів, меланома, рак яєчника, рак передміхурової залози, рак нирок, гліома або астроцитома. 5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що хворим є людина. 6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що вірусом міксоми є вірус дикого типу. 7. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що вірус міксоми є генетично модифікованим. 2 (19) 1 3 96412 4 достатню вроджену противірусну реакцію, який включає введення хворому, який цього потребує, ефективної кількості вірусу міксоми, що не експресує функціонально активний M135R, та рапаміцину. 22. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що хворобливим станом є рак. 23. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що раком є солідна пухлина, рак гемопоетичних клітин, рак товстої кишки, рак легенів, рак нирок, рак підшлункової залози, рак ендометрія, рак щитовидної залози, рак ротової порожнини, рак яєчника, рак гортані, гепатоцелюлярний рак, рак жовчних протоків, плоскоклітинна карцинома, рак передміхурової залози, рак молочної залози, рак шийки матки, рак анастомозу ободової та прямої кишок або меланома. 24. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що раком є рак легенів, меланома, рак яєчника, рак передміхурової залози, рак нирок, гліома або астроцитома. 25. Спосіб за п. 24, який відрізняється тим, що хворим є людина. 26. Спосіб за п. 24, який відрізняється тим, що вірус міксоми є генетично модифікований для експресії терапевтичного гена. 27. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що введення здійснюють шляхом ін'єкції на ділянці раку. 28. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що введення є системним. 29. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що хворобливим станом є хронічна вірусна інфекція. 30. Застосування ефективної кількості вірусу міксоми, що не експресує функціонально активний M135R, та рапаміцину, для лікування у хворого хворобливого стану, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію. 31. Застосування ефективної кількості вірусу міксоми, що не експресує функціонально активний M135R, для виготовлення лікарського засобу для лікування у хворого хворобливого стану, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, причому лікарський засіб має форму, що уможливлює введення введення вірусу міксоми у комбінації з ефективною кількістю рапаміцину. 32. Застосування за п. 30 або п. 31, причому хворобливим станом є рак. 33. Застосування за п. 32, причому раком є солідна пухлина, рак гемопоетичних клітин, рак товстої кишки, рак легенів, рак нирок, рак підшлункової залози, рак ендометрія, рак щитовидної залози, рак ротової порожнини, рак яєчника, рак гортані, гепатоцелюлярний рак, рак жовчних протоків, плоскоклітинна карцинома, рак передміхурової залози, рак молочної залози, рак шийки матки, рак анастомозу ободової та прямої кишок або меланома. 34. Застосування за п. 32, причому раком є рак легенів, меланома, рак яєчника, рак передміхурової залози, рак нирок, гліома або астроцитома. 35. Застосування за п. 30 або п. 31, причому хворобливим станом є хронічна вірусна інфекція. 36. Застосування за будь-яким із пп. 30-35, причому хворим є людина. 37. Застосування за будь-яким із пп. 30-36, причому вірус міксоми є генетично модифікованим для експресії терапевтичного гена. 38. Фармацевтична композиція, яка містить вірус міксоми, який не експресує функціонально активний M135R, та рапаміцин. 39. Фармацевтична композиція за п. 38, яка додатково містить додатковий терапевтичний засіб. 40. Фармацевтична композиція за п. 38, яка відрізняється тим, що додатковим терапевтичним засобом є хіміотерапевтичний засіб. [0001] Ця заявка претендує на пріоритет за тимчасовою заявкою на патент США № 60/658,816, що була подана 7 березня 2005 року, яка включена до цього опису у повному обсязі шляхом посилання. [0002] Цей винахід, взагалі, має відношення до терапевтичного застосування вірусу міксоми та рапаміцину. [0003] У сучасних методах лікування, що застосовуються для терапії раку різних типів, вдаються до отруєння або убивання пухлинної клітини. На жаль, методи лікування, токсичні для ракових клітин, є, як правило, токсичними також і для здорових клітин. Окрім того, неоднорідна природа пухлин є однією з головних причин того, що ефективні методи лікування раку залишаються важкодосяжними. Сучасні головні методи лікування, наприклад, хіміотерапія і радіотерапія, застосовуються у вузькому терапевтичному діапазоні токсичності. Методи лікування цих типів вважаються недосконалими засобами з обмеженими можливостями застосування, з огляду на різноманітність типів ракових клітин і обмеженість "діапазону", у якому ці методи лікування можуть бути застосовані. [0004] Сучасні протиракові методи лікування, що розробляються, спрямовуються на вибіркове ураження ракових клітин із намаганням бути менш токсичними для здорових клітин, щоб завдяки цьому з більшою ймовірністю залишати здорові клітини неураженими. [0005] Онколітична вірусна терапія є одним із варіантів підходу, спрямованим на використання цитологічних різниць між пухлинними та нормальними клітинами. У цьому терапевтичному методі роль протиракових засобів відіграють реплікаційнокомпетентні, пухлиноселективні вектори на основі вірусного геному. Онколітичний вірус або специфічно і цілеспрямовано інфікує ракові клітини, або є більш придатним для ефективної реплікації у ракових клітинах, порівняно зі здоровими клітинами. Ці реплікаційнокомпетентні, онколітичні ві 5 руси є або природними, або їх одержують засобами рекомбінантних ДНК, завдяки чому вони перетворюються на високоселективні та високоефективні засоби цілеспрямованої доставки до гетерогенної популяції пухлин. Оскільки у нормальних клітинах ефективної реплікації реплікаційноселективного онколітичного вірусу не відбувається, токсичність для пацієнта повинна бути низькою, зокрема, порівняно з традиційними методами лікування, наприклад, променевою терапією або хіміотерапією. [0006] Численними дослідженнями надані відомості про онколітичну активність різноманітних вірусних штамів, причому найперспективнішими онколітичними вірусами є природні або генетично модифіковані варіанти аденовірусу, вірусу простого герпесу 1 ("HSV1"), реовірусу, вірусу коров'ячої віспи, вірусу везикулярного стоматиту ("VSV") або вірусу поліомієліту. До модифікованих онколітичних вірусів, які на сучасному етапі піддають дослідженням, як протиракові засоби, належать HSV, аденовірус, вірус хвороби Ньюкасла ("NDV"), реовірус і вірус коров'ячої віспи, вірус кору, VSV і вірус поліомієліту. Різні онколітичні віруси піддають клінічним випробуванням Фази І і Фази II, причому деякі з них демонструють тривалу ефективність. Невідомо, однак, які віруси найкращим чином забезпечать досягнення онколітичних цілей, якими є тривала реплікація, специфічність та ефективна літична активність. Абсолютно ефективним "кандидатом" на роль онколітичного вектора на основі вірусного геному міг би бути такий, що має короткий життєвий цикл, швидко утворює зрілі віріони, ефективно розповсюджується з клітини на клітину і має великий геном, готовий до введення вставок. Дані також свідчать про те, що для ефективності онколітичної терапії важливим є пригнічення ранньої вродженої імунної реакції і уповільнення розвитку Th1-клітинних імунних реакцій. Зрозуміло, що людські віруси є високоімуногенними, про що свідчить інтенсивна гуморальна імунна відповідь та Т-клітинна імунна реакція, що спостерігаються у населення у цілому, на численні віруси, що розглядаються як претенденти на розробку онколітичних вірусів. [0007] Клінічні дослідження показали, що сучасні онколітичні віруси є дійсно безпечними, але недостатньо сильнодіючими як монотерапевтичні засоби для того, щоб бути повністю клінічно ефективними. Оскільки, як правило, спостерігається недостатній або неефективний рівень інфікування ракових клітин, суттєву складову сучасних зусиль становить піддання вірусів-"кандидатів" обробці методами генної інженерії для того, щоб вони експресували терапевтичний трансген для підвищення їх ефективності. Більшість із вищезгаданих онколітичних вірусів також піддається випробуванням у поєднанні з іншими традиційними методами онколітичної терапії. [0008] Аденовірус легко піддається генетичному маніпулюванню і має добре відому функцію домішкового вірусного білка. На додаток до цього, він асоціюється із захворюванням із дуже легким перебігом. Людський аденовірус ONYX-015 (фірма Onyx Pharmaceuticals Inc.) є одним з онколітичних 96412 6 вірусів, оптимізованих для клінічного застосування, що піддається найекстенсивнішим випробуванням. Вважають, що цей вірус переважно розмножується у р53-негативних пухлинах і демонструє потенціал у клінічних випробуваннях на пацієнтах, що страждають на пухлини голови та шиї. Повідомлення, однак, показують, що ONYX-015 викликав об'єктивну клінічну реакцію лише у 14% хворих, що були піддані лікуванню (Немунаітіс Дж. (Nemimaitis J.), Курі Ф. (Khuri F.), Ганлі І. (Ganly І.), Арсено Дж. (Arseneau J.), Познер Μ. (Posner M.), Вокс Е. (Vokes E.), Кун Дж. (Kuhn J.), Маккарті Т. (McCarty Т.), Ландерс С. (Landers S.), Блекберн A. (Blackburn Α.), Ромел Л. (Romel L.), Рандлев Б. (Randlev В.), Кей С. (Кауе S.), Кірн Д. (Kirn D.) J. Clin. Oncol. 2001 Jan. 15; 19(2):289-98). [0009] WO 96/03997 і WO 97/26904 описують мутантний онколітичний HSV, що інгібує ріст ракових клітин і є специфічним відносно нервових клітин. Додаткові переваги полягають у тому, що HSV може з легкістю піддаватись генетичному модифікуванню, і існують лікарські засоби, що припиняють будь-яку небажану реплікацію вірусу. Однак застосування такого розповсюдженого людського патогену є обмеженим, оскільки ймовірним є те, що населення у цілому піддавалось дії цього вірусу і набуло імунної реакції до нього, що може послабити літичний ефект цього вірусу. HSV може також викликати серйозні побічні ефекти або потенційно смертельне захворювання. [0010] Реовірус типу III пов'язується із захворюванням із відносно м'яким перебігом, і функція його вірусного гена є відносно добре зрозумілою. Реовірус типу III зараз розробляється фірмою Oncolytic Biotech як протираковий лікарський засіб, що демонструє посилені реплікаційні властивості у клітинах, що експресують мутантний онкоген ras, і переважно росте у PKR (протеїнкіназа R) -/- клітинах (Стронг Дж.Е. (Strong J.E.), П.У. Лі (P.W. Lee), J. Virology, 1996, 70:612-616). Однак реовірус важко піддається генетичному маніпулюванню, і його реплікація не може бути легко припинена. [0011] VSV пов'язується із захворюванням із відносно м'яким перебігом і також має добре відому функцію вірусного гена. WO 99/04026 розкриває застосування VSV як вектора у генній терапії для забезпечення широких можливостей лікування різноманітних розладів. Однак VSV страждає на ті самі проблеми, що і реовірус, а саме: він важко піддається генетичному маніпулюванню, і його реплікація не може бути легко припинена. [0012] Іншими онколітичними вірусами"кандидатами", описаними у цій галузі, є вірус коров'ячої віспи та вірус поліомієліту, однак вони пов'язуються із серйозною або потенційно смертельною хворобою. [0013] Патент США № 4,806,347 розкриває застосування гамма-інтерферону і фрагмента IFN (-інтерферон) проти людських ракових клітин. WO 99/18799 розкриває спосіб лікування захворювання у ссавця, при якому хворобливі клітини мають порушення інтерферон-опосередкованої противірусної реакції, що включає введення ссавцю терапевтично ефективної кількості чутливого до інтерферону, реплікаційнокомпетентного клонального 7 вірусу. Тут безпосередньо розкривається, що частинки VSV мають токсичну активність проти ракових клітин, однак послаблення цитотоксичності VSV для нормальних клітин спостерігається у присутності інтерферону. WO 99/18799 також розкриває, що NDV-індукована чутливість спостерігалась у ракових клітин, що були піддані обробці інтерфероном, але додання інтерферону до нормальних клітин робить ці клітини стійкими до NDV. Мета цього способу полягає у тому, щоб зробити клітини чутливими до інтерферону шляхом інфікування їх інтерферон-чутливими вірусами. [0014] Основу цього винаходу становить несподіване відкриття того, що вірус міксоми кроликів, у тому числі новий вірус міксоми, що не експресує функціонально активний білок M135R, може вибірково інфікувати клітини, у тому числі пухлинні клітини людини, що мають недостатню вроджену противірусну реакцію, у тому числі клітини, що не реагують на інтерферон, і де згадана інфекція посилюється обробкою таких клітин лікарським засобом рапаміцином. Термін "вроджена", що вживається у цьому контексті, описує неспецифічну щодо антигену імунну реакцію. Оскільки вірус міксоми не розмножується ефективно у нормальних людських клітинах, згаданий вірус унаслідок цього може застосовуватись як лікарський засіб для різних розладів та станів, які характеризуються наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, у тому числі клітин, що не реагують на інтерферон, наприклад, як онколітичний засіб для лікування раку. Згаданий вірус може також застосовуватись для ідентифікування клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію і для виявлення цих клітин in vivo. [0015] За одним зі своїх аспектів, цей винахід пропонує спосіб пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, що включає введення до згаданої клітини ефективної кількості комбінації вірусу міксоми та рапаміцину. [0016] За одним зі своїх аспектів, цей винахід пропонує спосіб лікування хворобливого стану, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, який включає введення хворому, який цього потребує, ефективної кількості комбінації вірусу міксоми та рапаміцину. [0017] Цей винахід додатково пропонує застосування ефективної кількості комбінації вірусу міксоми та рапаміцину для пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, і для виготовлення лікарського засобу для пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію. [0018] Цей винахід додатково пропонує застосування ефективної кількості комбінації вірусу міксоми та рапаміцину для лікування хворобливого стану у хворого, причому згаданий хворобливий стан характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, і для виготовлення лікарського засобу для лікування такого хворобливого стану у хворого. [0019] За іншим аспектом, цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, що містить вірус 96412 8 міксоми та рапаміцин. Фармацевтична композиція може застосовуватись для пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, або для лікування хворобливого стану, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію. [0020] За іншим аспектом, цей винахід пропонує набір, що включає в себе вірус міксоми, рапаміцин і інструкції для пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, або для лікування хворобливого стану, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію. Згадані хворобливі стани включають рак і хронічну вірусну інфекцію. [0021] Цей винахід додатково пропонує спосіб виявлення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, який включає піддання популяції клітин впливу комбінації вірусу міксоми і рапаміцину; надання згаданому вірусу можливості інфікування клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію і визначення інфікування будь-яких клітин згаданої популяції клітин вірусом міксоми. [0022] Цей винахід також грунтується на несподіваному виявленні того, що білок M135R вірусу міксоми кроликів залучений до викликання імунної реакції у кроликів, і що штам вірусу міксоми, який не експресує функціонально активний M135R, може вбивати клітини in vitro, але не спричинює захворювання тварин міксоматозом. Такий вірусний штам може застосовуватись до клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, у тому числі клітин, що не реагують на інтерферон, у тому числі у комбінації з лікарським засобом рапаміцином, без необхідності у збільшенні кількості вірусу, результатом чого є підвищена безпека. [0023] За одним зі своїх аспектів, цей винахід пропонує спосіб пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, який включає введення до згаданої клітини ефективної кількості вірусу міксоми, що не експресує функціонально активний M135R, факультативно у комбінації з ефективною кількістю рапаміцину. [0024] За одним зі своїх аспектів, цей винахід пропонує спосіб лікування хворобливого стану, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, який включає введення хворому, який цього потребує, ефективної кількості вірусу міксоми, що не експресує функціонально активний M135R, факультативно у комбінації з ефективною кількістю рапаміцину. [0025] Цей винахід додатково пропонує застосування ефективної кількості вірусу міксоми, що не експресує функціонально активний M135R, факультативно у комбінації з ефективною кількістю рапаміцину, для пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, і для виготовлення лікарського засобу для пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію. [0026] Цей винахід додатково пропонує застосування ефективної кількості вірусу міксоми, що не експресує функціонально активний M135R, факу 9 льтативно у комбінації з ефективною кількістю рапаміцину, для лікування хворобливого стану у хворого, причому згаданий хворобливий стан характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, і для виготовлення лікарського засобу для лікування такого хворобливого стану у хворого. [0027] За додатковим аспектом, цей винахід пропонує вірус міксоми, що не експресує функціонально активний M135R. [0028] За іншим аспектом, цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, до складу якої входить вірус міксоми, що не експресує функціонально активний M135R. Згадана фармацевтична композиція може бути придатною для пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, або для лікування хворобливого стану, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію. Згадана фармацевтична композиція може додатково містити рапаміцин. [0029] За іншим аспектом, цей винахід пропонує набір, який включає в себе вірус міксоми, що не експресує функціонально активний M135R, і інструкції для пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, або для лікування хворобливого стану, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію. До складу згаданого набору може додатково входити рапаміцин. Згадані хворобливі стани охоплюють рак і хронічну вірусну інфекцію. [0030] Цей винахід додатково пропонує спосіб виявлення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, який включає піддання популяції клітин впливу вірусу міксоми, що не експресує функціонально активний M135R, факультативно у комбінації з рапаміцином; надання згаданому вірусу можливості інфікування клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, і визначення інфікування будь-яких клітин згаданої популяції клітин вірусом міксоми. [0031] Інші аспекти і особливості цього винаходу стануть очевидними фахівцям у цій галузі після розгляду наведеного нижче опису конкретних варіантів здійснення цього винаходу у поєднанні із фігурами, що додаються. Слід розуміти, однак, що докладний опис і конкретні приклади, які пояснюють варіанти здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, наведені лише з ілюстративними цілями, оскільки фахівцям у цій галузі із цього докладного опису стануть зрозумілими різні зміни та модифікації у межах обсягу та суті цього винаходу. [0032] На фігурах, які ілюструють варіанти здійснення цього винаходу лише як приклад, [0033] Фіг. 1 - принципова схема передавання інтерферонопосередкованого противірусного сигналу, індукованого у разі вірусної інфекції клітини; [0034] Фіг. 2 - фазово-контрастна мікрофотографія непермісивних фібробластів мишачих зародків ("MEF") дикого типу (WT) після піддання дії вірусу міксоми, які показують, що MEF стають пермісивними після пригнічення α/β-інтерферону нейтралізуючими антитілами; 96412 10 [0035] Фіг. 3 - вестерн-блот, який показує стани фосфорилування (активації) STAT1 і STAT2 після інфікування вірусом міксоми з демонструванням того, що непермісивні інфекції клітин MEF пов'язані з активацією STAT1 і STAT2; [0036] Фіг. 4 - вестерн-блот, який показує стани фосфорилування (інактивації) STAT3, STAT4, STAT5 і STAT6 після інфікування вірусом міксоми з демонструванням того, що непермісивні інфекції клітин MEF не активують жоден із цих видів; [0037] Фіг. 5 - фазово-контрастна мікрофотографія IFNα/β R -/- MEF і STAT1 -/- MEF, IFNα/β R /- MEF і STAT1 -/- MEF після інфікування вірусом міксоми, яка показує, що клітини стають пермісивними для інфікування вірусом міксоми унаслідок інактивації передавання сигналу IFN/STAT/JAK; [0038] Фіг. 6 - вестерн-блот, що показує стани фосфорилування PKR у непермісивних MEF дикого типу після інфікування вірусом міксоми з демонструванням того, що PKR не активується інфікуванням вірусом міксоми; [0039] Фіг. 7 - вестерн-блот, що показує стани фосфорилування PKR у MEF дикого типу, псевдоінфікованих або передінфікованих вірусом міксоми, з демонструванням того, що вірус міксоми блокує активацію PKR в клітинах MEF; [0040] Фіг. 8 - вестерн-блот, що показує стани фосфорилування PERK у MEF дикого типу після інфікування вірусом міксоми, з демонструванням того, що вірус міксоми блокує активацію PERK у клітинах MEF; [0041] Фіг. 9 - фазово-контрастна мікрофотографія потрійного блокування PKR -/-, РНKази-L -/- і Мх1 -/- після піддання дії вірусу міксоми, що показує, що противірусний стан клітин MEF опосередковується різними шляхами; [0042] Фіг. 10 - фазово-контрастна мікрофотографія потрійного блокування PKR -/-, РНKази-L -/- і Мх1 -/- після піддання дії вірусу міксоми; [0043] Фіг. 11 - фазово-контрастна мікрофотографія потрійного блокування PKR -/-, РНKази-L -/- і Мх1 -/- після обробки IFNα/β-нейтралізуючими антитілами і після піддання дії вірусу міксоми; [0044] Фіг. 12 - вестерн-блот, що показує рівні фосфорилування eIF-2α і PKR у непермісивних MEF після обробки IFNα/β-нейтралізуючими антитілами і після піддання дії вірусу міксоми з демонструванням того, що фосфорилування eIF2a у непермісивних клітин каталізується PKRнезалежним шляхом; [0045] Фіг. 13 - вестерн-блот, що показує стани фосфорилування STAT1 у разі потрійного блокування PKR-/-, РНKази-L-/- і Мх1-/- після інфікування вірусом міксоми з демонструванням нормальних реакцій передавання IFN-індукованого сигналу; [0046] Фіг. 14 - фазово-контрастна мікрофотографія, що ілюструє субклітинну локалізацію тирозин-фосфорилованого STAT1 у непермісивних PKR-/- + РНKаза-L-/- + Мх1-/- клітин через 12 год після інфікування з демонструванням того, що активований STAT локалізується у ядрі, як прогнозувалось для нормальних реакцій передавання сигналу IFN/STAT; 11 [0047] Фіг. 15 - флуоресцентне зображення головного мозку "голих" мишей з інтракраніальним псевдоінфікуванням гліомою або інфікованих інактивованим або живим вірусом міксоми, що експресує GFP, що демонструє цілеспрямовану доставку вірусу міксоми до клітин гліоми; [0048] Фіг. 16 - флуоресцентне зображення і фотографія тонких зрізів мишачої гліоми, інфікованої вірусом міксоми, що експресує GFP, на яких показано, що реплікація вірусу міксоми відбувається лише у ракових клітинах; [0049] Фіг. 17 - фазово-контрастна мікрофотографія людських ракових клітин НТ29, забарвлених X-Gal або кристалвіолетом, після інфікування вірусом міксоми, на якій показано приклад непермісивної інфекції людських клітин; [0050] Фіг. 18 - фазово-контрастна мікрофотографія людських ракових клітин НОР92, забарвлених X-Gal або кристалвіолетом, після інфікування вірусом міксоми, на якій показано приклад пермісивної інфекції людських клітин; [0051] Фіг. 19 - фазово-контрастна мікрофотографія людських ракових клітин OVCAR4, забарвлених X-Gal або кристалвіолетом, після інфікування вірусом міксоми, на якій показано приклад пермісивної інфекції людських клітин; [0052] Фіг. 20 - фазово-контрастна мікрофотографія людських ракових клітин SK-MEL3, забарвлених X-Gal або кристалвіолетом, після інфікування вірусом міксоми, на якій показано приклад пермісивної інфекції людських клітин; [0053] Фіг. 21 - фазово-контрастна мікрофотографія людських ракових клітин SK-MEL28, забарвлених X-Gal або кристалвіолетом, після інфікування вірусом міксоми, на якій показано приклад напівпермісивної інфекції людських ракових клітин; [0054] Фіг. 22 - фазово-контрастна мікрофотографія клітин BGMK, забарвлених X-Gal або кристалвіолетом, після інфікування вірусом міксоми, на якій показана типова пермісивна контрольна інфекція; [0055] Фіг. 23 - фазово-контрастна мікрофотографія позитивних контрольних клітин BGMK і ліній людських ракових клітин U87, А172 і U373, інфікованих зростаючими концентраціями вірусу міксоми, що експресує білок LacZ, забарвлених X-Gal, на якій показано, що усі ці клітини людської гліоми були пермісивними для реплікації вірусу міксоми; [0056] Фіг. 24 - діаграма, що показує коефіцієнт виживаності клітин BGMK, U87, А172 і U373, інфікованих вірусом міксоми, через 72 год після інфікування зростаючими концентраціями вірусу з демонструванням здатності вірусу міксоми до убивання усіх цих клітин; [0057] Фіг. 25 - фазово-контрастна мікрофотографія і флуоресцентна мікрофотографія клітин астроцитоми SF04 1585, інфікованих MV GFP, що показує інфекцію клітин первинної людської гліоми; [0058] Фіг. 26 - фазово-контрастна мікрофотографія клітин гліоми U373, інфікованих вірусом міксоми, що експресує білок LacZ, забарвлених XGal, що показує інфекцію цих людських ракових клітин; 96412 12 [0059] Фіг. 27 - діаграма, що показує коефіцієнт виживаності клітин SF04 1585, інфікованих MV GFP, через 48 год після інфікування, що показує убивання цих інфікованих людських ракових клітин; [0060] Фіг. 28 - флуоресцентна мікрофотографія ліній клітин Daoy і D384 медулобластоми, інфікованих вірусом міксоми, що експресує GFP, що показує інфекцію цих людських ракових клітин. [0061] Фіг. 29 - графічні зображення швидкості продукування вірусу у різних лініях клітин з попередньою обробкою рапаміцином або без неї; BGMK (контрольна лінія клітин приматів); RK-13 та RL5 (контрольні лінії клітин кролів); 4Т1 та B16F10 (лінії ракових клітин мишей); HOS, РСЗ, 786-0, НСТ116, ACHN, MCF-7, M14 та COLO205 (лінії ракових клітин людини); із застосуванням вірусу дикого типу vMyxLac та вірусу vMyxT5KO із блокованим М-Т5, як зазначено; [0062] Фіг. 30 - фотографії вірусінфікованих ліній клітин, інфікованих vMyxLac або vMyxT5-; [0063] Фіг. 31 - графічні зображення швидкості продукування вірусу у різних лініях клітин (BGMK; A9; MCF-7; MDA-MB-435; M14; та COLO205) з попередньою обробкою рапаміцином або без неї; [0064] Фіг. 32 - (А) схематичне впорядковане розміщення білка M135R вірусу міксоми та білка B18R вірусу коров'ячої віспи; і (В) порівняльний аналіз амінокислотних послідовностей M135R і перших 179 амінокислот B18R; [0065] Фіг. 33 - (А) вестерн-блот M135R, експресованого у клітинах BGMK, інфікованих вірусом міксоми Lausanne (vMyxLau); і (В) вестерн-блот M135R, експресованого у клітинах BGMK, інфікованих vMyxLau і оброблених агаС, тунікаміцином або монензином; [0066] Фіг. 34 - (А) флуоресцентна мікрофотографія клітин BGMK, псевдоінфікованих або інфікованих вірусом міксоми і забарвлених для виявлення M135R; і (В) порівняння вестерн-блоту з імунопреципітатами або клітинними лізатами клітин, інфікованих вірусом міксоми дикого типу (vMyxgfp) або штамом із блокованим M135R (vMyx135KO) із застосуванням aнти-M135R антитіла; [0067] Фіг. 35 - (А) схематичне зображення стратегії клонування з одержанням vMyx135KO, (В) агарозний гель інсерційного продукту ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція); і (С) вестерн-блот клітин, інфікованих вірусом міксоми дикого типу і штамом із блокованим M135R; [0068] Фіг. 36 - крива росту осередків вірусу у клітинах BGMK, інфікованих vMyxgfp або vMyx135KO; [0069] Фіг. 37 - світлові та флуоресцентні мікрофотографії фібробластів кролячих зародків, інфікованих vMyxgfp або vMyx135KO; [0070] Фіг. 38 - світлові та флуоресцентні мікрофотографії кролячих фібробластів HIG82, інфікованих vMyxgfp або vMyx135KO; [0071] Фіг. 39 - світлові та флуоресцентні мікрофотографії людських первинних фібробластів, інфікованих vMyxgfp або vMyx135KO; [0072] Фіг. 40 - графік температури тіла кролів, інфікованих vMyxLau або vMyx135KO; 13 96412 125 [0073] Фіг. 41 - графік емісії І клітин, псевдоінфікованих або інфікованих vMyxgfp або 125 vMyx135KO і оброблених І-міченим кролячим α/β-інтерфероном; [0074] Фіг. 42 - графік осередків, утворених унаслідок інфікування клітин RK13 або BGMK vMyxgfp або vMyx135KO, де клітини не оброблялись або оброблялись кролячим α/β-інтерфероном за 24 год до інфікування; і [0075] Фіг. 43 - мікрофотографії вестерн-блотів із застосуванням клітинних лізатів лінії ракових клітин людини 786-0, які піддавали попередній обробці рапаміцином (R) (20 нМ) або контрольним носієм (D), зондованих антитілами, спрямованими проти вказаних білків. [0076] Раніше винахідники відкрили, що вірус міксоми дикого типу, вірус, який за нормальних умов інфікує кроликів, може вибірково інфікувати і убивати клітини, у тому числі людські клітини, що мають недостатню вроджену противірусну реакцію, наприклад, клітини, що не реагують на інтерферон, як описано у заявці РСТ/СА2004/000341, включеній до цього опису у повному обсязі шляхом посилання. Вірус міксоми у нормальних людських клітинах ефективно не розмножується. Оскільки багато захворювань або станів характеризуються наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, у тому числі клітин, що не реагують на інтерферон, наприклад, рак, вірус міксоми може застосовуватись для лікування таких захворювань і станів, у тому числі раку, з низькою токсичністю для нормальних здорових клітин. Вірус міксоми може також застосовуватись для лікування хронічно інфікованих клітин, наприклад, клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію. Багато вірусів, наприклад, кодують генні продукти, функція яких полягає у пригніченні антивірусної, інтерферонової реакції клітин; вірус міксоми може вибірково інфікувати ці клітини. [0077] Вірус міксоми ("MV") є збудником міксоматозу у кроликів. MV належить до роду Leporipoxvirus сімейства Poxviridae, найбільших ДНК-вмісних вірусів. MV викликає доброякісне захворювання у свого природного хазяїна, американського кролика (Sylvilagus), у Північній та Південній Америці. Це, однак, є вірулентний і хазяїноспецифічний поксвірус, що викликає смертельне захворювання у європейських диких кроликів, яке відрізняється системними ураженнями, зокрема, довкола слизових ділянок. (Камерон К. (Cameron С), Хота-Мітчелл С. (Hota-Mitchell S.), Чен Л. (Chen L.), Барретт Дж. (Barrett J.), Kao Дж.Кс. (Сао J.X.), Маколей К. (Macaulay С), Уіллер Д. (Wilier D.), Еванс Д. (Evans D.), Макфадден Г. (McFadden G.) Virology 1999, 264(2):298-318; Kepp П. (Kerr P.), Макфадден Г. (McFadden G.) Viral Immunology 2002, 15(2):229-246). [0078] MV є великим вірусом із двонитковою геномною ДНК (163 т.п.н.), що реплікується у цитоплазмі інфікованих клітин (Б.Н. Фіддс (B.N. Fields), Д.М. Кнайп (D.M. Knіре), П.М. Хаули (P.M. Howley), Eds., Virology Lippincott Raven Press, New nd York, 2 ed., 1996). Відомо, що MV кодує різноманітні клітино-асоційовані і секретовані білки, що є 14 причетними до регуляції за типом зворотного зв'язку імунних та запальних реакцій хазяїна та пригнічення апоптозу вірусінфікованих клітин. MV може поглинатись усіма людськими соматичними клітинами. Однак, у разі нормальних соматичних кролячих клітин, якщо клітини мають нормальну вроджену противірусну реакцію, вірус виявиться нездатним до продуктивного інфікування клітини, що означає те, що вірус буде нездатним до реплікації та спричинення загибелі клітини. [0079] Інтерферони (IFN) являють собою сімейство цитокінів, що секретуються у відповідь на різноманітні стимули. Інтерферони зв'язуються з мембранними рецепторами клітин з активацією послідовності реакцій передавання сигналу, наслідком чого є численні клітинні реакції, у тому числі противірусна реакція та індукування сигналів пригнічення росту та/або апоптозу. Інтерферони підрозділяються на два типи: тип І або тип II. До інтерферонів (IFN) типу І належать IFN-α, IFN-β, IFN- і IFN-ω, усі з яких є мономерами; лише інтерферон типу II, IFN-, є димером. Дванадцять різних підтипів IFN-α продукуються 14 генами, але усі інші інтерферони контролюються одним геном (Ардіні (Arduini) та інші, 1999). Інтерферони здійснюють безпосередню протипухлинну активність шляхом модулювання експресії онкогену. Наслідком надекспресії онкогенів, що стимулюють ріст або втрати онкогенів-супресорів пухлин може бути злоякісна трансформація. Деякими онкогенами, які, як припускають, є причетними до виникнення раку є р53, Rb, PC, NF1, WT1, DCC. [0080] Вірус міксоми, як і інші онколітичні віруси, наприклад, реовірус і VSV, повинен обходити противірусний захист, який існує у нормальних здорових клітинах, для того, щоб мати змогу до реплікації у межах клітин. MV та інші онколітичні віруси індукують продукування інтерферону і є, як правило, чутливими до противірусного ефекту реакцій продукування інтерферону. До відповідних білків, що індукуються IFN противірусною реакцією і які, головним чином, впливають на розмноження вірусу, належать PKR, OAS-синтетаза і РНKаза-Lнуклеаза. PRK активує eIF2α, наслідком чого є пригнічення трансляції та індукція апоптозу. На Фіг. 1 схематично зображена реакція продукування інтерферону. У нормальних клітинах MV знаходиться під безпосереднім впливом PKR та eIF2α. [0081] У ракових клітин послідовність противірусних реакцій часто є зруйнованою. Наприклад, знижена або недостатня реакція на інтерферон є генетичним дефектом, що часто виникає під час процесу трансформації та розвитку пухлини. Більше 80% ліній ракових клітин не реагують або демонструють ослаблені реакції на інтерферон. (Стойдл (Stojdl) та інші, Cancer Cell (2003) 4:263275 та посилання, що згадуються у цій роботі; Вонг (Wong) та інші J. Вiol. Chem. (1997) 272(45):2877928785; Сан (Sun) та інші Blood. (1998) 91(2):570576; Мейтін (Matin) та інші Cancer Res. (2001) 61(5):2261-2266; Балачандран (Balachandran) та інші Cancer Cell (2004) 5(1):51-65). Як попередньо описано у РСР/СА2004/000341, MV може інфікувати і убивати ракові клітини, у тому числі людські ракові клітини. Не обмежуючись жодною конкрет 15 ною теорією, гадають, що MV може інфікувати ці клітини, оскільки вони мають недостатню вроджену противірусну реакцію. [0082] Дані дозволяють припустити, що пригнічення ранньої вродженої імунної реакції та уповільнення розвитку Тh1-клітинних імунних реакцій є важливим моментом для ефективності онколітичної терапії. Незважаючи на те, що вірус міксоми є вірулентним вірусом, він є хазяїноспецифічним і має дуже обмежений діапазон хазяїв; він не інфікує людей або мишей. Не обмежуючись жодною конкретною теорією, гадають, що, оскільки вірус міксоми не є людським вірусом, у людей він не повинен зустрічатись із передіснуючим імунологічним розпізнаванням. Таким чином, його потенціал як онколітичного вірусу буде погіршеним меншою мірою, і вірус міксоми повинен забезпечити більш активне інфікування пермісивних ракових клітин, аніж нативні людські віруси, унаслідок чого він може забезпечити ефективне онколітичне лікування раку. [0083] Видається, що ген МТ-5 діапазону хазяїв вірусу міксоми відіграє критичну роль під час інфікування вірусом міксоми багатьох ліній пухлинних клітин людини (Сіпула (Sypula) та інші, (2004) Gene Ther. Моl Вiol. 8:103). Ген МТ-5 кодує повторюваний білок анкірину, необхідний для реплікації вірусу міксоми у лімфоцитах кролів, а вірус міксоми з видаленим геном МТ-5 не може спричинювати міксоматоз у сприйнятливих кролів (Моссман (Mossman) та інші, (1996) J. Virol. 70:4394). Доступні факти дозволяють висунути припущення про те, що різниці у внутрішньоклітинному передаванні сигналів у межах інфікованої пухлинної клітини людини є критичними для розрізнення людських пухлинних клітин, що є пермісивними для інфікування вірусом міксоми і продуктивної реплікації (Джонстон (Johnston) та інші, (2003) J. Virol. 77:5877). [0084] На додаток до цього, вірус міксоми має білок, M135R, який демонструє гомологію з амінокінцевою ділянкою рецептора α/β ("IFNα/β-R"). Було висунуто припущення про те, що M135R імітує хазяйський IFNα/β-R для запобігання ініціювання IFNα/β хазяйської противірусної реакції (Барретт (Barrett) та інші, Seminars in Immunology (2001) 13:73-84). Згадане припущення базується на гомології послідовностей з вірусним IFNα/β-R вірусу коров'ячої віспи, B18R, і було продемонстровано, що вірус коров'ячої віспи ("W") застосовує таку стратегію ухиляння від механізмів імунологічного нагляду. Однак, M135R за величиною становить лише половину розміру W B18R та усіх інших IFNα/β-R гомологів секвенованих поксвірусів, і в усіх випадках суміщається лише з амінокінцевою половиною гомолога. [0085] Винахідники відкрили, що, незважаючи навіть на те, що результати імунофлуоресцентних досліджень дозволяють зробити припущення про те, що M135R локалізується на поверхні клітини, спроби продемонструвати здатність M135R до взаємодії з IFNα/β не дали позитивних результатів. Незважаючи на ці результати, винахідники відкрили, що видалення M135R різко зменшує здатність вірусу міксоми до спричинення захворювання у 96412 16 тварин-хазяїв, хоча вірус міксоми з видаленим M135R зберігає однакову ефективність щодо інфікування і вбивання клітин in vitro, порівняно з MV дикого типу. Таким чином, за одним з аспектів, цей винахід має відношення до відкриття того, що вірус міксоми, який не експресує функціонально активний M135R, є придатним для обробки клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, у тому числі для онколітичних досліджень, оскільки такий вірус забезпечує безпечнішу альтернативу для онколітичної вірусної терапії, оскільки зникає потреба у незвичних стратегіях біобезпечності, які були б необхідними для хворих, яких піддають лікуванню. [0086] За іншим аспектом, цей винахід має відношення до відкриття того, що дія протиракового засобу рапаміцину спрямована на підвищення рівнів інфективності вірусу міксоми у пухлинних клітинах людини, що є пермісивними для інфікування вірусом міксоми, і що рапаміцин надає можливість розмноження певних штамів вірусу міксоми у пухлинних клітинах людини, які без рапаміцину є рестриктивними для розмноження згаданих штамів вірусу міксоми. Клітиною, яка є пермісивною для інфікування вірусом міксоми, є клітина, до якої вірус може проникнути і в якій вірус може продуктивно відтворюватись. Пермісивні клітини можуть мати дефекти або мутації одного або декількох шляхів, що залучають білки PTEN, PDK, АКТ, GSK, Raf, mTOR або P70S6K. Рестриктивною клітиною є клітина, що є пермісивною для вірусу міксоми лише за певних умов, але не дозволяє продуктивного інфікування за інших умов. Наприклад, рестриктивна клітина може бути пермісивною для штамів вірусу дикого типу, однак не дозволяє певним мутантним штамам вірусу міксоми, наприклад, штаму, що має заблокований ген МТ-5, продуктивно відтворюватись. За іншим прикладом, клітина, рестриктивна для вірусу міксоми, може не дозволити продуктивного інфікування лише вірусом міксоми, і той самий вірус міксоми виявляється здатним до продуктивного інфікування клітини лише у разі обробки рапаміцином. Абортивні лінії клітин є непермісивними для інфікування вірусом міксоми, що означає, що вірус може бути здатним до проникнення до клітини, однак продуктивно згадану клітину не інфікує. [0087] Таким чином, рапаміцин, у разі застосування у комбінації з вірусом міксоми, підсилює інфективність вірусу міксоми відносно клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію. Цей винахід має відношення до застосування рапаміцину у комбінації з вірусом міксоми для обробки клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію. [0088] Рапаміцин являє собою макроциклічний лактон, який, як було показано, є активною протигрибковою сполукою, очищеною з ґрунтової бактерії Streptomyces hygroscopicus. Термін "рапаміцин", що вживається у цьому описі, означає рапаміцин (який називають також сіролімом (sirolimus)) та його аналоги або похідні, здатні до комплексоутворення з ЕКВР12 та пригнічення mTOR, у тому числі аналоги ССІ-779 (який називають також інгібітором клітинного циклу-779 або рапаміцин 17 42,2,2-біс(гідроксиметил)-пропіоновою кислотою) та RAD001 (який називають також еверолімом (everolimus) або 40-0-(2-гідроксіетил)рапаміцином). Рапаміцин, ССІ-779 та RAD001 є комерційно доступними, а рапаміцин є доступним під назвою рапамун (Rapamune™) від компанії Wyeth-Ayerst. Термін "рапаміцин" додатково означає фармацевтично прийнятні солі і складні ефіри рапаміцину, його гідрати, сольвати, поліморфи, аналоги або похідні, а також проліки або попередники, які метаболізуються або перетворюються на рапаміцин або його аналоги чи похідні у процесі застосування, наприклад, у разі введення хворому. [0089] Рапаміцин як інгібітор передавання клітинних сигналів є високоспецифічним; він проникає до клітини і зв'язується з клітинним білком, відомим як FKBP12. У подальшому, комплекс рапаміцин/РКВР12 зв'язується зі специфічною клітинною мішенню mTOR (мішень рапаміцину у ссавців). Було показано, що раки багатьох видів розвиваються унаслідок надмірної активності молекул, що передають сигнали, наприклад, Р13К, або втрати гена-супресора пухлин PTEN. Ці обидві молекули знаходяться у зворотному напрямку відносно mTOR. Було показано, що mTOR є центральним регулятором проліферації, росту, диференціації, міграції та виживаності клітин, і є, таким чином, ідеальною мішенню для зупинки неконтрольованого росту ракових клітин. Лініями ракових клітин, що є сприйнятливими до рапаміцину, є, як правило, лінії клітин, які одержали унаслідок активації шляху через mTOR. [0090] Рапаміцини застосовують, головним чином, для хворих, які перенесли трансплантацію, як альтернативне або додаткове лікування до лікування циклоспорином. У хворих, які перенесли трансплантацію, лікування рапаміцином, як правило, дає менше побічних ефектів, аніж лікування циклоспорином А або FK506. На додаток до цього, ретроспективні дослідження показали, що у хворих, яких піддають лікуванню рапаміцином, як правило розвивається менша кількість різновидів раку і вони мають нижчий рівень інфікування CMV (цитомегаловірус; вірус герпесу). Унаслідок цього, несподіваним є те, що обробка рапаміцином посилює інфікування ракових клітин вірусом міксоми, зокрема, у світлі досліджень, які грунтуються на припущенні того, що реплікація CMV повинна бути знижена рапаміцином (оглядова стаття Понтічеллі (Ponticelli): "The pleiotropic effects of mTOR inhibitors" у J. Nephrology 2004; 17:762). He обмежуючись конкретною теорією, можливо, що вірус міксоми використовує перевагу аберантного передавання сигналів шляхом mTOR, що може асоціюватись із неопластичним фенотипом цих клітин. Маніпулювання цим шляхом інгібіторами mTOR може, у такому разі, надавати вибіркову перевагу згаданому вірусу. [0091] Таким чином, пропонується спосіб пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, який включає введення до клітини ефективної кількості вірусу міксоми. За додатковим варіантом здійснення, вірус вводять у комбінації з ефективною кількістю рапаміцину. 96412 18 [0092] Вірусом міксоми може бути будь-який реплікаційнокомпетентний вірус, що належить до виду Leporipoxvirus поксвірусів. Вірус міксоми може бути штамом вірусу міксоми дикого типу або це може бути генетично модифікований штам вірусу міксоми, у тому числі штам вірусу міксоми з блокованим МТ-5. Вірусом міксоми може бути штам, що має ослаблений ефект у кролів, зі спричиненням, унаслідок цього, зниженого ризику виникнення захворювання, у тому числі штам, що не експресує функціонально активний білок Μ135, як описано нижче. [0093] За конкретним варіантом здійснення, вірусом міксоми є вірус міксоми, який не експресує функціонально активний M135R. [0094] Вірусом міксоми, який не експресує функціонально активний M135R, є вірус міксоми, у якого частина або уся відкрита рамка зчитування, що кодує M135R, видалена, замінена або перервана таким чином, що не експресується жодний генний продукт, жодний стабільний генний продукт або жодний функціонально активний генний продукт. Таким вірусом є також вірус міксоми, у якого частина або уся регуляторна ділянка гена M135R видалена, замінена або перервана таким чином, що жоден білок не може експресуватись геном, який кодує M135R. Функціонально активним білком M135R є M135R, що транскрибується, транслюється, укладається, піддається посттрансляційній модифікації і локалізується у межах клітини, і який надає можливість вірусу міксоми спричинювати міксоматоз у інфікованого хазяїна. У разі, якщо білок M135R не (або невідповідно чи недостатньо) транскрибується, транслюється, укладається, піддається посттрансляційній модифікації або локалізується у межах клітини, унаслідок чого у інфікованого хазяїна не виникає міксоматозу, у такому разі клітина не експресує функціонально активний білок M135R. [0095] За одним із варіантів здійснення винаходу, згадана клітина не реагує на інтерферон. [0096] За конкретними варіантами здійснення винаходу, згаданою клітиною є ракова клітина ссавця. За одним із варіантів здійснення винаходу, згаданою клітиною є людська ракова клітина, у тому числі клітина людської солідної пухлини. [0097] За іншим варіантом здійснення винаходу, згадана клітина хронічно інфікована вірусом. [0098] "Комбінація" рапаміцину і вірусу міксоми для введення може входити до складу однієї дозованої лікарської форми або окремих дозованих лікарських форм, і окремі дозовані лікарські форми можуть бути такою самою дозованою лікарською формою або різними формами для введення одним і тим самим способом або різними способами введення. На додаток до цього, введення комбінації рапаміцину і вірусу міксоми, у разі, коли вони вводяться не спільно у одній і тій самій дозованій лікарській формі, означає, що рапаміцин і вірус міксоми вводять одночасно ссавцю, якого піддають лікуванню, і можуть бути введені одночасно або послідовно у будь-якому порядку або у різні моменти часу. Так, рапаміцин і вірус міксоми можуть бути введені окремо, але достатньо набли 19 жено за часом, щоб забезпечити бажаний терапевтичний ефект. [0099] Термін "ефективна кількість", який вживають у цьому описі, означає кількість, ефективну у дозах та впродовж періодів часу, необхідних для досягнення бажаного результату. [00100] Термін "клітина, що має недостатню вроджену противірусну реакцію", що вживається у цьому описі, означає клітину, яка у разі піддання дії вірусу або у разі проникнення вірусу, не індукує противірусних захисних механізмів, в тому числі таких, як пригнічення реплікації вірусу, продукування інтерферону, індукування реакції на інтерферон та апоптоз, який може опосередковуватись інтерфероном або може не опосередковуватись інтерфероном, і, таким чином, піддається інфікуванню MV, або самого, або у комбінації з рапаміцином. Згаданий термін охоплює клітину, яка має знижену або ослаблену вроджену противірусну реакцію у разі її піддання дії вірусу або її інфікування вірусом, у порівнянні з нормальною клітиною, наприклад, неінфікованою або не раковою клітиною. Цей термін охоплює клітину, що не реагує на інтерферон, і клітину, яка має знижену або ослаблену апоптозну реакцію або індукцію каскаду апоптозних реакцій. Така недостатність може зумовлюватися різними причинами, у тому числі інфекцією, генетичним дефектом або впливом навколишнього середовища. Слід, однак, розуміти, що у разі, коли недостатність зумовлена передіснуючою інфекцією, суперінфекція MV може бути виключена, і фахівець може легко визначити такі випадки. Фахівець може легко визначити без зайвого експериментування, чи має клітина будьякого даного типу недостатню вроджену противірусну реакцію і, таким чином, може інфікуватись вірусом міксоми, або самого, або у комбінації з рапаміцином. Для визначення противірусної реакції клітини, наприклад, традиційно застосовують VSV. [00101] Для визначення того, чи клітина даного типу, наприклад, ракова клітина даного типу, має недостатню вроджену противірусну реакцію, фахівець може відібрати експлантат, культивувати декілька клітин in vitro і визначити здатність до зараження VSV або, за альтернативним варіантом, вірусом міксоми, в тому числі вірусом міксоми в комбінації з рапаміцином. [00102] Термін "клітина, що не реагує на інтерферон", який вживається у цьому описі, означає клітину, яка не реагує на активність інтерферону, наприклад, противірусну або протипухлинну активність інтерферону, або має атипову реакцію на інтерферон, наприклад, знижену або неефективну реакцію на інтерферон, або атипове передавання сигналу інтерферону, що визначається, наприклад, фосфорилуванням або активацією молекул, які передають сигнал, наприклад, факторів транскрипції, наприклад, STAT1. Наприклад, без обмеження, згадана клітина може не піддаватись пригніченню проліферації або її не можна убити у разі піддання дії рівнів інтерферону, достатніх для індукування такої реакції у клітини, що реагує на інтерферон. Клітина, що не реагує на інтерферон, може мати дефект внутрішньоклітинного шляху 96412 20 або шляхів передавання сигналу, які, за нормальних умов, активуються у реагуючих клітин. Як правило, чутливість до інфікування VSV вказує на відсутність реагування на інтерферон, і фахівець може легко визначити, що конкретна клітина не реагує на інтерферон за її здатністю (або відсутністю такої здатності) пригнічувати інфікування VSV у присутності інтерферона або із застосуванням інших маркерів активності інтерферону, відомих у цій галузі, наприклад, рівня експресії IFNстимульованих генів, наприклад, PKR, STAT, OAS, MX. [00103] Термін "реплікаційнокомпетентний", який вживається у цьому описі, означає вірус, здатний до інфікування і реплікації у межах конкретної клітини-хазяїна. Це може бути вірус, який самостійно не може розмножуватись у конкретній клітині-хазяїні, але у разі обробки клітини-хазяїна рапаміцином згаданий вірус може продуктивно інфікувати згадану клітину. [00104] Термін "клітина", що вживається у цьому описі, означає одну клітину, а також множину або популяцію клітин. Введення засобу до клітини означає введення як in vitro, так і in vivo. [00105] Термін "тварина", що вживається у цьому описі, означає усіх членів царства тварин, особливо ссавців, у тому числі людей. [00106] Термін "пригнічення" клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, означає загибель клітини унаслідок лізису або апоптозу чи інших механізмів загибелі клітини, окрім позбавлення клітини здатності до росту або поділу, чи ослаблення або уповільнення росту або поділу клітин. [00107] Геном вірусу міксоми може бути легко модифікованим для експресії одного або декількох терапевтичних трансгенів із застосуванням стандартних методів молекулярної біології, відомих фахівцю і описаних, наприклад, у довіднику Сембрук (Sambrook) та інші ((2001) Molecular Cloning: a rd Laboratory Manual, 3 ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press). Фахівець може легко визначити, які частини геному вірусу міксоми можуть бути видалені таким чином, щоб вірус все ще залишався здатним до продуктивного інфікування. Наприклад, несуттєві ділянки вірусного геному, які можуть бути видалені, можуть бути визначені шляхом порівняння опублікованої послідовності вірусного геному з геномами інших добре вивчених вірусів (дивись, наприклад, К. Камерон (С. Cameron), С. Хота-Мітчелл (S. Hota-Mitchell), Л. Чен (L. Chen), Дж. Барретт (J. Barrett), Дж.Кс. Као (J.-X. Cao), К. Маколей (С. Macaulay), Д. Уіллер (D. Wilier), Д. Еванс (D. Evans), Г. Макфадцен (G. McFadden), Virology 1999, 264:298-318). [00108] Термін "терапевтичний ген" або "терапевтичні трансгени", який вживається у цьому описі, означає, у широкому значенні, будь-який ген, експресія якого забезпечує одержання бажаного результату, наприклад, протиракового ефекту. Наприклад, вірус може бути модифікований для перенесення гена, що підсилить протираковий ефект лікування вірусом. Таким геном може бути ген, залучений до запуску механізму апоптозу або залучений до цільової доставки до інфікованої 21 клітини для імунного руйнування, наприклад, ген, який відновлює відсутність реакції на інтерферон або який забезпечує експресію мембранного маркера клітини, що стимулює гуморальну імунну відповідь, наприклад, мембранний антиген бактеріальної клітини. Вірус може також бути модифікований для експресії генів, залучених до припинення проліферації та росту неопластичних або ракових клітин, із перешкоджанням, тим самим, поділу клітин. Вірус може також бути модифікований так, щоб включати терапевтичні гени, наприклад, гени, залучені до синтезу хіміотерапевтичних речовин або він може бути модифікований таким чином, щоб мати підвищені рівні реплікації у клітинах конкретних видів, з яких одержують клітини для пригнічення або убивання, наприклад, людських клітинах. Конкретними прикладами генів, які можуть бути введені до вірусу міксоми для підвищення його протиракового ефекту, є людський ген білка TRAK або ген аденовірусу, який кодує поліпептид Е4 orf4, причому обидва згадані білки залучені до убивання людських ракових клітин. [00109] Буде зрозуміло, що терапевтичний ефект вірусу міксоми, у тому числі при його використанні у комбінації з рапаміцином, може досягатись лізисом клітин згаданим вірусом або доставкою терапевтичних продуктів цим вірусом. Включення рапаміцину до комбінації з вірусом міксоми повинно надати можливість посилення ефекту самостійно застосовуваного вірусу міксоми. Це означає, що вірус міксоми у разі введення у комбінації з рапаміцином повинен бути здатним до продуктивного інфікування більшої кількості клітин-мішеней, аніж у разі самостійного застосування вірусу міксоми, або повинен бути здатним до продуктивного інфікування клітин-мішеней, що мають недостатню вроджену противірусну реакцію, які є рестриктивними для продуктивного інфікування вірусом міксоми за відсутності рапаміцину. [00110] Вірус можна одержати за допомогою стандартних методів, відомих у цій галузі. Вірус, наприклад, можна одержати шляхом інфікування культивованих клітин кролика штамом вірусу міксоми, призначеним для застосування, з подальшим забезпеченням можливості прогресування інфекції таким чином, щоб вірус розмножувався у культивованих клітинах і міг бути виділений за допомогою стандартних методів, відомих у цій галузі, шляхом руйнування клітинної мембрани і, тим самим, виділення вірусних частинок для збирання. Після збирання, титр вірусу може визначатись шляхом інфікування конфлюентного газону кролячих клітин і здійснення аналізу бляшкоутворення (див. Моссман (Mossman) та інші (1996) Virology 215:17-30). [00111] Також пропонується спосіб лікування хворобливого стану, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, у хворого, що потребує такого лікування, що включає введення згаданому хворому ефективної кількості вірусу міксоми, факультативно у комбінації з рапаміцином. Згаданим хво 96412 22 рим може бути будь-яка тварина, у тому числі ссавець, у тому числі людина. [00112] Словосполучення "хворобливий стан, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію", яке вживається у цьому описі, означає будь-яке захворювання, розлад або стан, який асоціюється з наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, залежить від наявності таких клітин або характерним для якого є їх наявність, і згадані захворювання, розлад, стан або їхні симптоми можуть лікуватись шляхом убивання цих клітин. Хворобливим станом може бути, наприклад, рак. Хворобливий стан може також включати хронічну вірусну інфекцію. [00113] "Лікування" хворобливого стану означає підхід для одержання сприятливих або бажаних результатів, у тому числі клінічних результатів. Сприятливими або бажаними клінічними результатами можуть бути, але ними не обмежуватись, полегшення або поліпшення одного або декількох симптомів або станів, зменшення поширення захворювання, стабілізація стану захворювання, запобігання розвитку захворювання, запобігання поширенню захворювання, припинення або уповільнення прогресування захворювання, припинення або уповільнення початку захворювання, поліпшення або полегшення хворобливого стану і ремісія (часткова або повна). "Лікування" може також означати продовження виживання хворого за межі періоду часу, очікуваного за відсутності лікування. "Лікування" може також означати пригнічення прогресування захворювання, тимчасове уповільнення прогресування захворювання, хоча за варіантом, якому віддається більша перевага, цей термін включає постійне припинення прогресування захворювання. [00114] За одним із варіантів здійснення винаходу, хворобливим станом є рак. Згаданим раком може бути рак будь-якого типу, де принаймні деякі клітини, хоча не обов'язково усі клітини, мають недостатню вроджену противірусну реакцію. За одним із варіантів здійснення винаходу, згаданим раком може бути рак, де принаймні деякі клітини не реагують на інтерферон. Терміни "пухлина", "пухлинні клітини", "рак" і "ракові клітини" (що вживаються взаємозамінно) означають клітини, які демонструють патологічний ріст, характеризуються значною втратою контролю над проліферацією клітин або клітини, які були іморталізовані. Термін "рак" або "пухлина" охоплює метастатичний, а також неметастатичний рак або пухлини. Термін "неопластичний" або "новоутворення", що вживається у цьому описі, у широкому значенні означає клітину або клітини, які проліферують без нормальних механізмів пригнічення росту і, таким чином, включає доброякісні пухлини, окрім раку, а також диспластичні або гіперпластичні клітини. [00115] Рак може діагностуватись за загальноприйнятими у цій галузі критеріями, у тому числі за наявністю злоякісної пухлини. [00116] До типів раку, які можуть лікуватись за цим винаходом, належать, але ними не обмежуються, раки гемопоетичних клітин, у тому числі лейкемії та лімфоми, рак товстої кишки, рак леге 23 нів, рак нирок, рак підшлункової залози, рак ендометрія, рак щитовидної залози, рак ротової порожнини, рак яєчника, рак гортані, гепатоцелюлярний рак, рак жовчних протоків, плоскоклітинна карцинома, рак передміхурової залози, рак молочної залози, рак шийки матки, рак анастомозу ободової та прямої кишок, меланоми і будь-які інші пухлини. До солідних пухлин, наприклад, сарком і карцином, належать, але ними не обмежуються, фібросаркома, міксосаркома, ліпосаркома, хондросаркома, остеогенна саркома та інші саркоми, синовіома, мезотеліома, омобластома, лейоміосаркома, рабдоміосаркома, рак товстої кишки, лімфолейкоз, рак підшлункової залози, рак молочної залози, рак легенів, рак яєчника, рак передміхурової залози, злоякісна гепатома, плоскоклітинна карцинома, базально-клітинний рак, аденокарцинома, рак потових залоз, рак сальних залоз, папілокарцинома, папілярна аденокарцинома, медулярний рак, бронхогенний рак, рак нирок, гепатома, рак жовчних протоків, хоріокарцинома, пухлина Вільмса, рак шийки матки, тестикулярний рак, карцинома сечового міхура і пухлини центральної нервової системи (наприклад, гліома, астроцитома, медулобластома, краніофарингіома, епендимома, пінеалома, гемангіобластома, акустична неврінома, олігодендрогліома, менангіома, меланома, нейробластома і ретинобластома). [00117] За іншим варіантом здійснення винаходу, хворобливим станом є хронічна вірусна інфекція. [00118] Хронічно інфікуючим вірусом може бути будь-який вірус, що інфікує або розмножується у клітинах тварини персистентним чином впродовж тривалого періоду часу з причинениям патологічного стану. Хронічно інфікуючим вірусом може бути вірус, що асоціюється або пов'язується з розвитком раку. [00119] Хронічна інфекція вірусом може діагностуватись за допомогою стандартних методів, відомих у цій галузі. Наприклад, хронічна вірусна інфекція може бути виявлена за наявністю противірусних антитіл у хворого або позитивним результатом перевірки на наявність вірусної РНК або ДНК у клітинах хворого. [00120] У разі введення хворому, ефективною кількістю вірусу міксоми, а факультативно комбінації вірусу міксоми з рапаміцином, є кількість, необхідна у дозах і впродовж достатнього часового періоду, для полегшення, поліпшення, заспокоєння, пом'якшення, стабілізування, запобігання поширенню, уповільнення або припинення розвитку або лікування захворювання. Наприклад, це може бути кількість, достатня для досягнення ефекту зменшення кількості або знищення ракових клітин або неопластичних клітин, або зменшення кількості чи знищення клітин, хронічно інфікованих вірусом, або пригнічення росту та/або проліферації таких клітин. [00121] Ефективна кількість, призначена для введення хворому, може змінюватись у залежності від багатьох факторів, наприклад, фармакодинамічних властивостей вірусу міксоми, а факультативно вірусу міксоми з рапаміцином, способу введення, віку, стану здоров'я та ваги хворого, 96412 24 природи та поширення хворобливого стану, частоти лікування і типу сумісного лікування, у разі його проведення, вірулентності та титру вірусу. [00122] Фахівець у цій галузі може визначити відповідну кількість вірусу міксоми, виходячи з вищезгаданих факторів. Вірус початково може вводитись у відповідній кількості, що може регулюватись за потребою у залежності від клінічної реакції пацієнта. Ефективна кількість вірусу може бути визначена емпіричним шляхом і залежати від максимальної кількості вірусу, що може вводитись безпечно, а також мінімальної кількості вірусу, що дає бажаний результат. [00123] Вірус міксоми може бути введений хворому за допомогою стандартних способів введення. За одним із варіантів здійснення, вірус вводять системним шляхом. За іншим варіантом здійснення, вірус вводять шляхом ін'єкції на хворобливій ділянці. За специфічним варіантом здійснення, хворобливим станом є солідна пухлина, і вірус вводять шляхом ін'єкції на ділянці локалізації пухлини. За різними варіантами здійснення, вірус може вводитись перорально або парентерально чи за будь-яким стандартним способом, відомим у цій галузі техніки. [00124] Для одержання такого самого клінічного ефекту у разі введення вірусу системним шляхом, як і той, що досягається у разі ін'єкції вірусу у хворобливу ділянку, може знадобитися введення значно більших кількостей вірусу. Однак відповідним рівнем дози повинна бути мінімальна кількість, що забезпечила б досягнення бажаного результату. [00125] Концентрація вірусу, призначеного для введення, буде змінюватись у залежності від вірулентності конкретного штаму вірусу міксоми, що повинен вводитись, а також від природи клітин, до яких він спрямовується. За одним із варіантів здійснення винаходу, хворому-людині вводять дозу 9 меншу за приблизно 10 бляшкотвірних одиниць ("pfu"). За різними варіантами здійснення цього винаходу, одноразовою дозою може вводитись від 2 9 приблизно 10 pfu до приблизно 10 pfu, від приб2 7 лизно 10 pfu до приблизно 10 pfu, від приблизно 3 6 4 10 pfu до приблизно 10 pfu або від приблизно 10 5 pfu до приблизно 10 pfu. [00126] Фахівець у цій галузі може також визначити, застосовуючи вищенаведені фактори, відповідну кількість рапаміцину для введення хворому. Ефективна кількість рапаміцину може бути визначена емпіричним шляхом і буде залежати від кількості і штаму вірусу, який вводять, максимальної кількості рапаміцину, яка може бути безпечно введена, і мінімальної кількості рапаміцину, яка може бути введена для досягнення посилення інфективності вірусу міксоми. [00127] Рапаміцин може бути введений хворому за допомогою стандартних способів введення. За одним із варіантів здійснення, рапаміцин вводять системним шляхом. За іншим варіантом здійснення, рапаміцин вводять шляхом ін'єкції на хворобливій ділянці. За специфічним варіантом здійснення, хворобливим станом є солідна пухлина, і рапаміцин вводять шляхом ін'єкції на ділянці локалізації пухлини. За різними варіантами здійс 25 нення, рапаміцин може бути вводений перорально або парентерально чи за будь-яким стандартним способом, відомим у цій галузі техніки. [00128] Загальна кількість рапаміцину може бути введена однією дозою або численними дозами, розподіленими на одну добу або декілька діб. Частота і тривалість введення доз може бути легко визначена. Схема застосування буде залежати від тривалості періоду часу, впродовж якого повинен вводитись вірус міксоми. Наприклад, рапаміцин може бути введений хворому один раз або може бути введений від 2 разів до 4 разів на добу. [00129] За різними варіантами здійснення, доза рапаміцину може становити від приблизно 0,01 мг/кг маси тіла на добу до приблизно 250 мг/кг маси тіла на добу, від приблизно 0,01 мг/кг маси тіла на добу до приблизно 50 мг/кг маси тіла на добу, від приблизно 0,05 мг/кг маси тіла на добу до 10 мг/кг маси тіла на добу або від приблизно 0,1 мг/кг маси тіла на добу до 7,5 мг/кг маси тіла на добу. [00130] Ефективні кількості комбінації вірусу міксоми та рапаміцину можуть вводитись повторно, у залежності від ефекту початкової схеми лікування. Введення, як правило, здійснюють періодично з моніторингом будь-якої реакції. Фахівцю буде зрозуміло, що відповідно до обраних схем та шляхів, можуть вводитись менші або більші дози, аніж зазначені вище. [00131] Вірус міксоми, факультативно у комбінації з рапаміцином, може вводитись як єдиний лікарський засіб або може вводитись у комбінації з іншими лікарськими засобами, у тому числі хіміотерапією, променевою терапією або іншими противірусними лікарськими засобами. Наприклад, вірус міксоми, факультативно у комбінації з рапаміцином, може вводитись перед або після хірургічного видалення первинної пухлини або перед, одночасно чи після лікування, наприклад, проведення курсу променевої терапії чи застосування традиційних хіміотерапевтичних лікарських засобів. За одним із варіантів здійснення, вірус міксоми, факультативно у комбінації з рапаміцином, може вводитись у комбінації з або послідовно з іншими онколітичними вірусами, які можуть демонструвати специфічність до пухлинних клітин різних типів. [00132] Для полегшення введення вірус міксоми, факультативно у комбінації разом із рапаміцином, може включатись як інгредієнт до фармацевтичної композиції. Таким чином, за додатковим варіантом здійснення винаходу, пропонується фармацевтична композиція, до складу якої входять вірус міксоми і факультативно рапаміцин, і фармацевтично прийнятний розріджувач. Цей винахід, таким чином, за одним зі своїх аспектів, пропонує також такі фармацевтичні композиції для застосування з метою пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, або лікування хворобливого стану, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію. До складу згаданих композицій можуть, як правило, входити сіль, буферні речовини, консерванти і різні сумісні носії у фармацевтично прийнятних концентраціях. Для усіх 96412 26 форм доставки рекомбінантний вірус міксоми може бути вводений до фізіологічного розчину. [00133] Фармацевтичні композиції можуть додатково містити інші терапевтичні засоби, наприклад, протиракові засоби. За одним із варіантів здійснення винаходу, композиції включають хіміотерапевтичний засіб. Хіміотерапевтичним засобом, наприклад, може бути по суті будь-який засіб, що демонструє онколітичний ефект проти ракових клітин або неопластичних клітин хворого і не пригнічує або не зменшує онколітичного ефекту вірусу міксоми. Хіміотерапевтичним засобом може бути, наприклад, без обмеження, антрациклін, алкілувальний агент, алкілсульфонат, азиридин, етиленімін, метилмеламін, азотистий іприт, нітрозосечовина, антибіотик, антиметаболіт, аналог фолієвої кислоти, аналог пурину, аналог піримідину, фермент, подофілотоксин, платиновмісний засіб або цитокін. За варіантом, якому віддають перевагу, хіміотерапевтичним засобом може бути засіб, який, як відомо, є ефективним проти клітини конкретного типу, що є раковою або неопластичною. [00134] Пропорція і природа фармацевтично прийнятного розріджувача визначається обраним шляхом введення, сумісністю із живим вірусом і стандартною фармацевтичною практикою. Взагалі, до складу фармацевтичної композиції будуть входити компоненти, які не погіршуватимуть суттєво біологічних властивостей живого вірусу міксоми, або спричинятимуть розклад чи знижуватимуть стійкість або ефективність рапаміцину, у разі його включення. [00135] Фармацевтична композиція може одержуватись за відомими методами одержання фармацевтично прийнятних композицій, придатних для введення хворим, таким чином, що ефективна кількість активної речовини об'єднується у суміші із фармацевтично прийнятним носієм. Придатні носії описуються, наприклад, у довіднику Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). На цій основі композиції включають, але без обмежень, розчини вірусу у поєднанні з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями або розріджувачами і містяться у буферних розчинах, що мають відповідний рН і є ізоосмотичними із фізіологічними рідинами. [00136] Фармацевтична композиція може бути введена хворому у різноманітних формах у залежності від обраного шляху введення, що буде зрозумілим для фахівців у цій галузі. Композиція за цим винаходом може бути введена пероральним або парентеральним шляхами. Парентеральне введення включає внутрішньовенний, внутрішньоочеревинний, підшкірний, внутрішньом'язовий, черезшкірний, інтраназальний, внутрішньолегеневий, підоболонковий, ректальній і місцевий шляхи введення. Парентеральне введення може здійснюватись шляхом безперервного вливання впродовж обраного періоду часу. [00137] Фармацевтична композиція може бути введена перорально, наприклад, з інертним розріджувачем або із засвоюваним носієм, або вона може бути вміщена у тверді або м'які желатинові 27 капсули, або може пресуватись у таблетки. Для перорального терапевтичного введення, вірус міксоми може об'єднуватись із наповнювачем і застосовуватись у формі таблеток для приймання усередину, защічних таблеток, пастилок, капсул, еліксирів, суспензій, сиропів, облаток тощо. [00138] Розчини вірусу міксоми, факультативно разом із рапаміцином, можуть одержуватись у фізіологічно прийнятному буфері. За звичайних умов зберігання та застосування, ці препарати включають консервант для запобігання росту мікроорганізмів, однак це не буде інактивувати живий вірус. Фахівцю у цій галузі відомо, яким чином одержувати придатні композиції. Традиційні методи і інгредієнти для вибору та одержання відповідних композицій описуються, наприклад у довіднику Remington's Pharmaceutical Sciences та у Фармакопеї США: Книга рецептурних формул, що випускається Американською фармацевтичною асоціацією (USP 24 NF19), опублікованій у 1999 році. [00139] За різними варіантами здійснення винаходу, композиція вводиться шляхом ін'єкції (підшкірно, внутрішньовенно, внутрішньом'язово тощо) безпосередньо до хворобливої ділянки, наприклад, ділянки пухлини, або шляхом перорального введення, за альтернативним варіантом, шляхом черезшкірного введення. [00140] Формами фармацевтичної композиції, придатними для ін'єкції, є стерильні водні розчини або дисперсія і стерильні порошки для одержання стерильних розчинів або дисперсій для ін'єкції, що готуються для негайного застосування, де термін стерильний не розповсюджується на сам живий вірус міксоми, що підлягає введенню. В усіх випадках, лікарська форма повинна бути стерильною і повинна бути рідкою до такої міри, що забезпечувала б легке введення за допомогою шприца. [00141] Доза фармацевтичної композиції, що повинна застосовуватись, залежить від конкретного стану, який піддають лікуванню, тяжкості стану, індивідуальних параметрів хворого, які охоплюють вік, фізичний стан, розміри і масу, тривалість лікування, природу сумісного лікування (у разі проведення), конкретний шлях введення та інші подібні фактори, які знаходяться у межах обсягу знань та досвіду практикуючого лікаря. Ці фактори є відомими фахівцям у цій галузі, і до них можна звертатись з мінімальним звичайним експериментуванням. [00142] Вірус міксоми, факультативно у комбінації з рапаміцином, або фармацевтичні композиції, що містять вірус міксоми та рапаміцин, можуть також пакуватись як набір, що включає інструкції із застосування вірусу міксоми і рапаміцину, у тому числі застосування вірусу міксоми або вірусу міксоми в комбінації з рапаміцином для пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, або застосування вірусу міксоми вірусу міксоми в комбінації з рапаміцином для лікування хворобливого стану, який характеризується наявністю клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію у хворого, який цього потребує. Хворобливим станом може бути рак, або це може бути хронічна вірусна інфекція. 96412 28 [00143] Цим винаходом передбачається також застосування вірусу міксоми, факультативно у комбінації з рапаміцином, для пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію. За одним із варіантів здійснення винаходу, згадана клітина не реагує на інтерферон. Додатково пропонується застосування вірусу міксоми, факультативно у комбінації з рапаміцином, для лікування хворобливого стану, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, у хворого, який цього потребує. За одним із варіантів здійснення винаходу, хворобливим станом є рак. Пропонується також застосування вірусу міксоми, факультативно у комбінації з рапаміцином, для виготовлення лікарського засобу для пригнічення клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, або для лікування хворобливого стану, який характеризується наявністю клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, у хворого, який цього потребує. [00144] MV може вибірково інфікувати клітини у організмі тварин або одержані від тварин, які не є природним хазяїном MV, у популяції клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію. Ця здатність MV надає можливість застосування MV при виявленні клітин у популяції клітин, у культурі або у організмі тварини, що мають недостатню вроджену противірусну реакцію, у тому числі клітин, які не реагують на інтерферон. Такі клітини, у противному разі, не можуть бути легко виявлені, наприклад, певні ракові клітини, які ще не досягли рівня промацуваної пухлини або ще не викликали помітних симптомів у тварини. [00145] Таким чином, за одним із варіантів здійснення винаходу, пропонується спосіб виявлення у хворого клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, який включає введення хворому вірусу міксоми, модифікованого таким чином, що він експресує виявний маркер; надання можливості вірусу інфікувати у хворого клітину, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію; і виявлення у хворого клітини, яка експресує виявний маркер. [00146] Інфіковані клітини можуть виявлятись за допомогою будь-якого традиційного методу візуалізації діагностичних зображень. Метод виявлення буде залежати від конкретного застосованого маркера, що піддається виявленню. Наприклад, клітини, інфіковані вірусом міксоми, генетично модифікованим для експресії флуоресцентного білка, можуть виявлятись за допомогою флуоресцентної мікроскопії із цифровим зображенням. Іншими методами є комп'ютерна томографія (СТ), повне сканування тіла, наприклад, позитронна емісійна томографія (PET), ЯМР-томографія (MRI) і ультразвукова ехографія. Фахівці зможуть визначити відповідний метод для виявлення конкретного маркера, що піддається виявленню. [00147] Виявним маркером є (але ним не обмежується) будь-який маркер, гени для експресії або синтезу якого можуть вводитись у геном вірусу міксоми таким чином, щоб забезпечувалась експресія або синтез згаданого маркера у межах клітин, інфікованих модифікованим вірусом. Напри 29 клад, за одним із варіантів здійснення винаходу, виявним маркером може бути флуоресцентний білок. Інфіковані клітини можуть виявлятись через відповідний проміжок часу після введення хворому модифікованого вірусу для того, щоб надати вірусу можливість інфікувати будь-які клітини, що мають недостатню вроджену противірусну реакцію, та експресувати виявний маркер, в таких клітинах на рівнях, які б надавали можливість виявлення. Виявлення, наприклад, може відбуватись у межах приблизно 2-20 днів після введення хворому вірусу, генетично модифікованого для експресії флуоресцентного білка. [00148] Метод виявлення може повторно бути застосований до хворого через проміжки часу для моніторингу у цього хворого наявності клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію. Наприклад, метод виявлення таких клітин із використанням вірусу міксоми може бути застосований до хворого з проміжками у 6 місяців, 1 рік або 2 роки, за потребою, у залежності від природи клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, і природи будь-якого хворобливого стану, що є наслідком наявності таких клітин у хворого. Повторне застосування згаданого методу через певний період часу надає можливість моніторингу розвитку або ремісії хворобливого стану або поширення хвороби у межах організму хворого. [00149] Вірус міксоми здатний до вибіркового інфікування клітин, які мають недостатню вроджену противірусну реакцію, і може застосовуватись як індикатор такої недостатності у клітин. Так, клітини, видалені у пацієнта, можуть перевірятись на недостатню вроджену противірусну реакцію із застосуванням методів за цим винаходом. Таке визначення може вказати, у разі поєднання з іншими індикаторами, що хворий може страждати на конкретний хворобливий стан, наприклад, рак. [00150] Таким чином, за одним із варіантів здійснення винаходу, пропонується спосіб виявлення у зразку клітини, яка має недостатню вроджену противірусну реакцію, який включає культивування клітин, піддання культивованих клітин дії вірусу міксоми, факультативно у комбінації з рапаміцином, і визначення інфективності клітин вірусом міксоми. [00151] Клітини можуть видалятись з суб'єкта, у тому числі людини, за допомогою відомих методів біопсії. Метод біопсії буде залежати від знаходження та типу клітини, яка повинна піддаватись випробуванню. [00152] Клітини культивуються за відомими методами культивування і піддаються дії MV і факультативно рапаміцину, шляхом додання живого вірусу міксоми і факультативно рапаміцину, до культурального середовища. Якщо вірус міксоми додається у комбінації з рапаміцином, вірус та рапаміцин можуть додаватись як одночасно, так і послідовно. Множинність зараження ("МОІ"), включаючи наявність рапаміцину, може змінюватись для визначення оптимальної МОl для клітин даного типу, густини та методу культивування із застосуванням позитивної контрольної культури клітин, яка, як відомо, інфікується у разі піддання дії MV. 96412 30 [00153] Кількість рапаміцину і час додання рапаміцину і вірусу міксоми до культивованих клітин можуть змінюватись у залежності від типу клітин, способу культивування і штаму вірусу. Такі параметри можуть легко перевірятись і коригуватись з мінімальним експериментуванням за допомогою традиційних способів. [00154] Інфективність культивованих клітин MV, включаючи наявність рапаміцину, може визначатись різними методами, відомими фахівцю, у тому числі за здатністю MV викликати некроз клітин. Сюди може долучатись також додання реактивів до культури клітин для завершення ферментативної або хімічної реакції з продуктом вірусної експресії. Продукт вірусної експресії може експресуватись репортерним геном, який був введений до геному MV. [00155] За одним із варіантів здійснення винаходу, MV може модифікуватись для підвищення легкості виявлення стану інфікованості. Наприклад, MV може генетично модифікуватись для експресії маркера, який може легко виявлятись фазово-контрастною мікроскопією, флуоресцентною мікроскопією або сцинтиграфією. Згаданим маркером може бути експресований флуоресцентний білок або експресований фермент, який може бути залучений до колориметричної реакції або реакції з радіоізотопною міткою. За іншим варіантом здійснення винаходу, згаданим маркером може бути генний продукт, який руйнує або пригнічує конкретну функцію клітин, що піддаються випробуванню. [00156] Винахід додатково ілюструється наведеними нижче необмежувальними прикладами. Приклади Приклад 1: Інфікування мишачих та людських ліній клітин вірусом міксоми Вірусні штами [00157] Були використані такі вірусні штами: штам MV дикого типу, MV, модифікований для експресії білка із флуоресценцією зеленого кольору ("GFP") або β-галактозидази ("LacZ") і убитий ("інактивований") MV. Вірус одержували і титрували із застосуванням стандартних методів. Клітинні штами [00158] Експерименти на мишах здійснювали із застосуванням фібробластів мишачих зародків ("MEF"), які одержали від мишей лінії дикого типу, а також наведених нижче мишачих препаратів, одержаних шляхом блокування: гомозиготне блокування рецепторів IFNα/β; гомозиготне блокування STAT1; гетерозиготне блокування PKR; гетерозиготне блокування РНKази-L; гетерозиготне блокування Мх1; потрійне гомозиготне блокування РKR/РНKази-L/Мх1. [00159] Експерименти з людськими препаратами здійснювали на контрольній лінії клітин BGMK та лініях людських ракових клітин НТ29, НОР92, OVCAR4, OVCAR5, SK-MEL3, SK-MEL28, М14, SKOV3, РСЗ, DU145, САКІ-1, 786-0, T47D, MDAMB 435, SF04, U87, А172, U373, Daoy та D384, як описано у Стойдл (Stojdl) та інші, Cancer Cell (2003) 4:263-275. 31 Методи [00160] Взагалі, аналізи та експерименти здійснювали, як описано у Лалані (Lalani) та інші, Virology (1999) 256:233-245; Джонстон (Johnston) та інші, J. Virology (2003) 77(13):7682-7688; та Сіпула (Sypula) та інші, Gen. Ther. Моl. Biol. (2004)8:103. [00161] Для проведення досліджень на мишах in vivo, "голим" мишам інтракраніально імплантували людські гліоми U87. Через 15 днів після імплантування мишам внутрішньопухлинно вводили 6 GFP живого або інактивованого MV (титр 5×10 ) або здійснювали псевдоінфікування. Через 72 год після інфікування тварин умертвляли, видаляли головний мозок, заливали ОСТ (сполука для одержання зрізів при оптимальній температурі) і заморожені зрізи використовували для одержання гістологічних препаратів. GFP вірусу міксоми візуалізовали на гістологічних зрізах головного мозку засобами флуоресцентної мікроскопії. Для візуалізації пухлини зрізи фіксували і забарвлювали Н&Е (гематоксилін/еозин). [00162] Для дослідження людських ракових пухлин, пухлини піддавали трипсинізації, висівали негайно після хірургічного видалення і наступного дня інфікували з МОl 0,1, 1,0 або 10. Через 24 год і 48 год після інфікування збирали дані щодо цитотоксичності та вірусної експресії, використовуючи фазово-контрастну та флуоресцентну мікроскопію. Через 48 год, 72 год або 96 год після інфікування здійснювали аналіз із застосуванням жовтої солі тетразолію МТТ для кількісного визначення відсотка виживаності клітин (як відсоток клітин, що вижили після псевдоінфікування). [00163] Лінії клітин дитячої медулобластоми, Daoy і D384, інфікували GFP вірусу міксоми з МОI 10. Через 72 год після інфікування життєздатність клітин визначали із застосуванням МТТ. Результати: Інфікування ліній мишачих клітин [00164] Попереднє дослідження показало, що деякі клони мишачих клітин 3Т3, трансфіковані хемокінними рецепторами, інфікувались вірусом міксоми, у той час як з іншими клонами подібного не відбувалось. Для дослідження того, чи залежить тропізм вірусу міксоми у інших мишачих клітин від будь-яких конкретних рецепторів, ми піддали дослідженням первинні фібробласти мишачих зародків (MEF) від мишей дикого типу (WT) з блокуванням різних генів. [00165] Оскільки фібробласти мишачих зародків (IFN) відіграють ключову роль у підтримці противірусних реакцій, ми висунули гіпотезу про те, що рестриктивний фенотип пов'язувався з "противірусним станом", опосередкованим інтерфероном (IFN). Руйнування ланцюга IFN реакцій системи, нейтралізація циркулюючих IFN антитілами або одержання мишей, позбавлених рецепторів IFN чи мишей з видаленими генами на внутрішньоклітинному шляху передавання сигналу, тяжко пошкоджує стійкість хазяїна до вірусу міксоми, який, як правило, не інфікує нормальні мишачі клітини. [00166] Для перевірки цієї гіпотези нам було необхідно продемонструвати, що неінфективність вірусу міксоми для непермісивних клітин обумовлювалась противірусною дією інтерферонів. Клі 96412 32 тини MEF різного типу з блокуванням одного або декількох білків, залучених до внутрішньоклітинної реакції з передавання сигналу IFN, перевіряли на ефект інфекції MV на шляху IFN. [00167] Експерименти, здійснені з первинними MEF, показали, що MEF дикого типу ("WT") не інфікуються вірусом міксоми. MEF повністю інфікуються вірусом міксоми у тому разі, коли шлях IFN блокується нейтралізацією антитіл до IFNα/β (Фіг. 2). Однак MEF, піддані дії антитіл, що нейтралізують IFN, залишались непермісивними. Це висвітлило важливість IFNα/β, але не IFN, для створення пермісивного середовища для інфікування MEF вірусом міксоми in vitro. В літературних джерелах визначені різні внутрішньоклітинні шляхи передавання сигналу IFNα/β та IFN. Ймовірно, однак, що як IFNα/β, так і IFN відіграють важливу роль у інфікованих хазяїв, на відміну від культивованих фібробластів. Ми передбачаємо, що людські пухлини, дефіцитні за шляхом IFNα/β та/або IFN, будуть сприйнятливими до інфікування вірусом міксоми in vivo. [00168] Ми досліджували активність STAT1 і STAT2 у непермісивних WT MEF, інфікованих MV. Результати, наведені на Фіг. 3, свідчать про активацію STAT1 і STAT2. Додаткове дослідження показало, що STAT3, STAT4 і STAT5 не активуються (Фіг. 4). [00169] Для підтвердження важливості внутрішньоклітинного шляху IFNα/β для підтримки непермісивного стану MEF були здійснені дослідження з генетичної делеції для введення пошкоджень до рецепторів IFNα/β та до внутрішньоклітинного каскаду реакцій. Була здійснена генетична делеція рецепторів IFN, JAK1 або STAT1. MV застосовували для інфікування WT MEF, IFNα/β R-/- MEF і STAT1 -/- MEF. IFNα/β R-/- MEF і STAT1 -/- MEF були пермісивними до MV, що було свідченням того, що каскади реакцій передачі сигналів IFNα/β та STAT1 є критичними для інфікування MV (Фіг. 5). [00170] Протеїнкіназа R (PKR) є ферментом, що індукується IFNα/β у найрізноманітніших клітинах. Ця кіназа, у присутності дволанцюгової РНК, піддається автофосфорилуванню, після чого фосфорилує декілька клітинних білків, у тому числі фактор ініціації синтезу еукаріотного білка (eIF-2α), фосфорилування якого може індукувати пригнічення трансляції білків та апоптоз. PKR також приймає участь у активації РНKази-L. Ми дослідили активацію PKR у непермісивних MEF після інфікування MV. PKR не фосфорилується у непермісивних MEF, противірусний стан яких є добре визначеним (Фіг. 6). Більше того, інфікування MV пригнічує фосфорилування PKR (Фіг. 7). На додаток до цього, PERK (PKR-подібна ER-кіназа) не фосфорилується у первинних WT MEF після інфікування вірусом міксоми (Фіг. 8). [00171] MV застосовували для інфікування MEF з блокуванням одиночних генів PKR, РНKазиL або Мх1 (Фіг. 9). Було встановлено, що PKR, РНKаза-L і Мх1 є несуттєвими для підтримки непермісивності для інфікування вірусом міксоми. Для додаткового підтвердження несуттєвої ролі PKR, РНKази-L та Мх1, було здійснене потрійне 33 96412 блокування PKR-/-, РНKази-L-/- та Мх1-/- у MEF. Потрійне блокування PKR-/-, РНKази-L-/- і Мх1-/не підтримує інфікування вірусом міксоми (Фіг. 10), хоча MEF із потрійним блокуванням PKR, РНKазиL і Мх1, оброблені антитілом, що нейтралізує IFNα/β, стають пермісивними до інфікування вірусом міксоми (порівняй Фіг. 10 і Фіг. 11). Ці експерименти показують, що PKR, РНKаза-L і Мх1 не відіграють суттєвої ролі при опосередковуванні непермісивності MEF для MV. [00172] Були здійснені додаткові дослідження для перевірки активації elF-2α і PKR у непермісивних MEF дикого типу і пермісивних IFNα/β R-/- MEF та STAT1-/- MEF після інфікування MV. Після інфікування MV, eIF-2α фосфорилується у непермісивних і пермісивних MEF, у той час як PKR у жодному разі не фосфорилується (Фіг. 12). Це демонструє, що без залучення PKR і PERK, противірусний стан опосередковується іншим шляхом, який спричинює фосфорилування eIF-2α. [00173] STAT1 у непермісивних MEF, які були піддані потрійному блокуванню PKR, РНKази-L і Мх1, після інфікування вірусом міксоми піддається фосфорилуванню як серину, так і тирозину (Фіг. 13). Показана також субклітинна локалізація тирозин-фосфорилованого STAT1 у непермісивних PKR-/-+PHKa3a-L-/-+Mx1-/- MEF після інфікування вірусом міксоми (Фіг. 14). [00174] Підсумовуючи, ці результати показують, що критичним для поксвірусного тропізму є паралельний PKR/PERK-незалежний противірусний шлях, що залучає IFN/STAT1. Більше того, 34 фосфорилування eIF-2α є найкращим маркером противірусної дії IFN. Результати: Дослідження людських пухлин [00175] Ми досліджували здатність MV до інфікування людських ракових клітин у системі in vivo. "Голим" мишам ін'єкційним шляхом вводили клітини людської гліоми з подальшим розвитком інтракраніальних гліом. Живий вірус був здатним інфікувати ці людські ракові клітини, але не інфікував навколишні клітини (Фіг. 15). Локалізація флуоресцентного сигналу GFP у пухлині зображена на Фіг. 16. [00176] Приймаючи до уваги, що багато людських пухлин не реагують на інтерферон, і що ракові клітини не мають нормальних послідовностей реакцій з передавання сигналу IFN, порівняно з тими, що знаходяться у нормальних людських клітин, були проведені дослідження з вивчення впливу вірусу міксоми на людські пухлини. Результати узагальнені нижче. [00177] Початково, для дослідження інфективності та цитолітичної дії на різні контрольні та людські лінії ракових пухлин (BGMK, HT29, НОР92, OVCAR4, SK-MEL3 і SK-MEL28) застосовували вірус міксоми. MV демонстрував різні ступені інфективності та цитолітичні результати: НТ29 (Фіг. 17), НОР92 (Фіг. 18), OVCAR4 (Фіг. 19), SK-MEL3 (Фіг. 20), SK-MEL28 (Фіг. 21) і BGMK (Фіг. 22). [00178] Випробуванням були піддані додаткові ракові клітини, і у наведеній нижче Таблиці 1 класифіковані пухлини різних типів, що випробовувались як пермісивні або непермісивні. Таблиця 1 Тропізм вірусу міксоми до людських пухлинних клітин Лінія клітин BGMK RK-13 RL5 HOS РС3 Саkі-1 НСТ116 786-0 SK-OV-3 ACHN НОР92 SK-MEL3 SK-MEL28 OVCAR4 OVCAR5 DU145 А498 T47D Соlо205 НТ29 MDAMB435 М14 MCF7 SK-MEL5 Походження клітин Нирки Нирки Т-лімфоцити Остеосаркома Рак передміхурової залози Рак нирок Рак товстої кишки Рак нирок Рак яєчника Рак нирок Рак легенів Меланома Меланома Рак яєчника Рак яєчника Рак передміхурової залози Рак нирок Рак молочної залози Рак товстої кишки Рак товстої кишки Рак молочної залози Меланома Рак молочної залози Меланома Вид Мавпа Кріль Кріль Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Людина Пермісивна X X X X X X X X X X X X X X X X X X Непермісивна X X X X X X 35 [00179] Різні лінії людських ракових клітин продемонстрували різну реактивність до інфікування зі зростаючими концентраціями MV-LacZ. Наприклад, клітини U373 потребували вищих титрів вірусу для досягнення рівнів убивання клітини, які у разі клітин U87 досягались із нижчими титрами вірусу (Фіг. 23 і Фіг. 24). Вірус міксоми ефективно інфікував клітини астроцитоми (Фіг. 25) і клітини гліоми (Фіг. 26). Вірус міксоми продемонстрував ефективність щодо убивання клітин людської астроцитоми і дитячої медулобластоми через 48 год після інфікування (Фіг. 27 і Фіг. 28). Приклад 2: Вплив рапаміцину на кінетику реплікації вірусу міксоми у рестриктивних лініях клітин Вірусні штами [00180] До застосованих вірусних штамів належать штам MV дикого типу ("vMyxLac") і штам MV, модифікований таким чином, що має блокований ген МТ-5 ("vMyxT5-"). Віруси були підготовані і титровані за стандартними методиками. Клітинні лінії [00181] Експерименти з людськими клітинами здійснювали на контрольній лінії клітин приматів BGMK, контрольній лінії клітин кролів RK-13 і лінії нормальних людських фібробластів А9, відповідних лініях людських пухлинних клітин 786-0 (нирки), ACHN (нирки), НСТ116 (товста кишка), MCF-7 (молочна залоза), MDA-MB-435 (молочна залоза), М14 (меланома) і COLO205 (товста кишка). Методики [00182] Взагалі, аналізи і експерименти здійснювали як описано у Лалані (Lalani) та інші, Virology (1999) 256:233-245; Джонстон (Johnston) та інші, J. Virology (2003) 77(13):7682-7688; Сіпула (Sypula) та інші, Gen. Ther. Моl. Вiol. (2004) 8:103. [00183] Для одержання кривих росту вірусу, клітини культивували in vitro у моношарі і перед інфікуванням вірусом піддавали попередній обробці 20 нМ розчином рапаміцину або контрольним розчином (DMSO (диметилсульфоксид), розведення 1:5000). [00184] Зразки вказаних ліній клітин, інфіковані вказаним вірусним штамом, збирали через 72 год після інфікування і піддавали лізису. Вірус, що знаходився у клітинних лізатах, титрували і застосовували для інфікування моношарів BGMK. Через 48 год після інфікування клітини фіксували і забарвлювали за допомогою X-Gal. Результати [00185] Раніше винахідниками було продемонстровано, що вірус міксоми є здатним до інфікування і реплікації у людських пухлинних клітинах багатьох типів (Сіпула (Sypula) та інші, (2004) Gene Ther. Моl. Biol. 8:103). Цей вірус, специфічний для кролів, може вибірково інфікувати більшість (приблизно 70%) людських ракових ліній клітин з еталонної колекції NCI (Національний раковий інститут). На додаток до цього було встановлено, що ген МТ-5 діапазону хазяїв відіграє критичну роль під час інфікування вірусом міксоми багатьох із цих ліній клітин. [00186] У представленому дослідженні потенційних внутрішньоклітинних молекул, які можуть впливати на здатність вірусу міксоми до вибірково 96412 36 го розмноження у людських пухлинних клітинах, випробували вплив рапаміцину. [00187] Як показано на Фіг. 29, здатність вірусу міксоми до розмноження і розповсюдження після низької множинності інфікування (МОl) досліджували за допомогою кривої багатостадійного росту із застосуванням BGMK (контрольна лінія клітин приматів); RK-13 та RL5 (контрольні лінії клітин кролів); 4Т1 та B16F10 (лінії ракових клітин мишей); HOS та РС3 (лінії пермісивних людських ракових клітин); 786-0, НСТП6 та ACHN (лінії рестриктивних людських ракових клітин); MCF-7, Μ14 та COLO205 (лінії абортивних людських ракових клітин). Як vMyxLac дикого типу, так і вірус vMyxT5KO з блокованим МТ-5 випробували для дослідження здатності обох вірусів до інфікування і розповсюдження у моношарі з попередньою обробкою рапаміцином та без такої обробки. Титр вірусу визначали за утворенням осередків на клітинах BGMK. Клітини піддавали попередній обробці 20 нМ розчином рапаміцину або відповідним контрольним носієм (розчин DMSO, розведення 1:5000) за 6 год до інфікування. [00188] Як показано, рапаміцин не впливає ні на випробувані контрольні клітини BGMK, ні на лінії клітин кролів, у тому числі клітини RL-5, які є непермісивними для вірусу з блокованим МТ-5. Однак рапаміцин посилює реплікацію вірусу міксоми у лініях пухлинних клітин мишей і, мінімально, у пермісивних (Тип І) клітинних лініях, наприклад, РС-3. Рапаміцин менше впливає на високопермісивні клітини, наприклад, клітини HOS, ймовірно унаслідок того, що такі клітинні лінії вже є максимально пермісивними для вірусу міксоми. Найбільший вплив рапаміцину спостерігався у рестриктивних (Тип II) клітинних лініях (786-0, НСТ116 та ACHN), які є пермісивними для вірусу дикого типу, однак непермісивними для штаму vMyxT5KO. Деякий вплив спостерігався навіть у абортивних (Тип III) клітинних ліній MCF-7 та COLO205, хоча був відсутнім у абортивної клітинної лінії Μ14. [00189] Після цього зразки інфікованих клітин ліній BGMK та 786-0 збирали і піддавали лізису, а виділений вірус застосовували для інфікування моношарів клітин BGMK (Фіг. 30). Вірусінфіковані клітини візуалізували шляхом забарвлювання XGal. [00190] Наслідком попередньої обробки пухлинних клітин, що є "рестриктивними" для інфікування вірусом міксоми, тобто тих клітин, які дозволяють розмноження вірусу міксоми дикого типу, але не вірусу з блокованим МТ-5, рапаміцином є відновлення здатності вірусу міксоми до розмноження у цих лініях ракових клітин, до яких належать лінії ракових клітин нирок, товстої кишки і яєчника (Фіг. 29 і Фіг. 30). [00191] На додаток до цього, обробка рапаміцином стимулювала здатність вірусу дикого типу до розмноження у цих самих клітинах, але не у контрольних клітинах кролів або приматів. Ці результати вказують на те, що дія рапаміцину спрямована на стимулювання інфективності вірусу міксоми. На додаток до цього видається, що рапаміцин впливає на здатність ракових клітин, які 37 96412 слабо інфікуються цим вірусом, до надання можливості для реплікації вірусу. [00192] У подальших експериментах досліджували вплив обробки рапаміцином на людські пухлинні клітини, які не підтримували інфікування вірусом міксоми дикого типу (Фіг. 31). Попередня обробка мала незначний вплив на контрольні клітини приматів або нормальні людські фібробласти, однак стимулювала інфективність вірусу у декількох клітинних ліній, у тому числі лінії ракових клітин молочної залози MCF-7. Оскільки декілька ліній людських пухлинних клітин, а також контрольні лінії клітин, залишились стійкими до обробки рапаміцином, навряд чи обробка рапаміцином змогла б надати вірусу міксоми можливість до продуктивного інфікування нетрансформованої тканини. Приклад 3: Варіант вірусу міксоми Μ135KО як поліпшений онколітичний вірус-"кандидат" M135R експресується вірусом міксоми як ранній ген [00193] Вірус міксоми кодує білок (M135R), ідентифікований при секвенуванні геному MV (Камерон (Cameron) та інші, Virology (1999) 264:298318), який, як припускають, імітує рецептор IFNα/β хазяїна і запобігає ініціюванню IFNα/β противірус 38 ної реакції хазяїна (Барретт (Barrett) та інші, Seminars in Immunology (2001) 13:73-84). Згадане припущення базується на гомології послідовностей з гомологом вірусного IFNα/β рецептора вірусу коров'ячої віспи (B18R), і було продемонстровано, що згаданий вірус застосовує таку стратегію ухиляння від механізмів імунологічного нагляду (Симонс (Symons) та інші, Cell (1995) 81:551-560). Однак, M135R за величиною становить лише половину розміру W B18R та усіх інших гомологів IFNα/β-R секвенованих поксвірусів і в усіх випадках суміщається лише з амінокінцевою половиною гомолога поксвірусних гомологів IFNα/β-R. На Фіг. 32 показана ймовірна подібність структури і послідовності між M135R W та B18R W. На порівняльному аналізі послідовностей показано лише перші 179 залишків амінокислот B18R. У Таблиці 2 вказується відсоток ідентичності між M135R і вказаними поксвірусними гомологами IFNα/β-R. Число над діагоналлю означає відсоток ідентичності, а число під діагоналлю означає відсоток подібності між будь-якими двома видами. Число у дужках у верхній частині означає кількість амінокислот гіпотетичних білків. Порівнювали лише передбачену повномірну копію M135R (178 амінокислот) і перші 178 залишків кожного гомолога. Таблиця 2 Порівняння M135R з іншими поксвірусними гомологами відсоток ідентичності Вид Міксома Коров'яча віспа Природна віспа Мавпяча віспа Коров'яча віспа Ектромелія Віспа верблюдів YLDV Віспа свиней LSDV Міксома (178) ----- Коров'яча Природна Мавпяча Коров'яча Віспа веВіспа Ектромелія YLDV LSDV віспа віспа віспа віспа рблюдів свиней (358) (351) (360) (351) (354) (352) (351) (355) (344) 24 21 24 23 21 22 20 18 17 39 ----- 80 93 90 84 79 20 23 25 36 88 ----- 79 87 88 79 19 24 24 38 95 87 ----- 86 83 78 20 20 26 38 93 93 91 ------ 92 88 21 23 25 35 89 93 87 94 ----- 87 17 21 25 34 86 94 85 92 93 ----- 17 23 24 38 37 37 37 38 34 34 ----- 23 28 32 39 39 36 39 35 37 38 ----- 25 32 39 39 41 38 39 36 43 38 ----- YLDV - Вірус, подібний до вірусу хвороби Яба LSDV - Вірус нодулярного дерматозу [00194] Пептиди проти передбачених імуногенних ділянок M135R були синтезовані і застосовані для одержання поліклональних антитіл у кролів, які були застосовані у вестерн-блотингу, імунопреципітації та імунофлуоресценції. Імуноблотинг підтвердив, що M135R синтезується як ранній ген, експресія якого може виявлятись вже через три години після інфікування (Фіг. 33А: смуга 1: псевдоінфіковані клітини BGMK; смуги 2-6: клітини BGMK, інфіковані vMyxLau, через 0 год, 3 год, 6 год, 18 год і 36 год після інфікування, відповідно). Обробка інфікованих клітин АгаС вказує на те, що синтез M135R не змінювався пригніченням експресії пізнього білка і він, таким чином, є раннім геном (Фіг. 33В). Однак обробка тунікаміцином вказує на те, що M135R є N-зв'язаним глікозилованим, ймовірно, на одній ділянці, передбаченій зі згаданої послідовності (Фіг. 33В). Обробка монензином дозволяє припустити відсутність Озв'язаного глікозилування. Результати, наведені 39 на Фіг. 33, одержали шляхом інфікування BGMK вірусом міксоми з МОI 10. Клітини у зазначений час обробляли АrаС з концентрацією 40 мкг/мл, тунікаміцином із концентрацією 1 мкг/мл і монензином із концентрацією 1 мкг/мл або не обробляли. M135R виявляли за допомогою пептидного антитіла. M135R кодує сигнальну послідовність, але не секретується [00195] Аналіз послідовності M135R вказує на наявність передбаченої сигнальної послідовності (Фіг. 32В). На карбоксикінці, однак, також існує передбачений трансмембранний домен (Фіг. 32В). Імуноблоти супернатантів інфікованих клітин BGMK вказують на те, що M135R не секретується. Однак M135R легко виявляється у цільноклітинних лізатах (Фіг. 33). Для перевірки, чи функціонує сигнальна послідовність для спонукання M135R до переміщення на поверхню клітин, ми видалили трансмембранний домен і клонували мутант у бакуловірусній експресійній системі. Порівняння супернатантів інфікованих AcM135R і Ас135ΔТМ показало наявність повномірного M135R у клітинному лізаті, однак ознаки секреції були відсутніми. У протилежність до цього, Ас135ДТМ секретується і підтверджує те, що сигнальна послідовність функціонує для спонукання M135R до переміщення до позаклітинного середовища (дані не представлені). Білок M135R локалізується на поверхні інфікованих клітин [00196] Спостереження того, що M135R має функціонально активну сигнальну послідовність, а також трансмембранний домен, підказало нам здійснити перевірку локалізації M135R. Два експериментальні факти вказують на те, що M135R локалізується на поверхні клітини. По-перше, коли BGMK висівали на покривне скло і інфікували vMyxLau (МОl 10) впродовж 24 год, M135R виявляли шляхом імунозабарвлювання за допомогою aнти-M135R, очищеного афінним методом, із подальшим застосуванням міченого флуоресцином "другого" антитіла (Фіг. 34А). Картина забарвлювання M135R свідчить про його локалізацію на поверхні інфікованих клітин. vMyxLau є справжнім штамом вірусу міксоми дикого типу, який не піддавали зміні шляхом введення гена β-gal або EGFP. [00197] Другий експериментальний факт на користь локалізації M135R на поверхні клітин одержали шляхом біотинілування поверхневоклітинних білків клітин GHOST, інфікованих vMyxgfp або vMyx135KO. Через 24 год після інфікування одержали клітинні лізати. Стрептавідин-агарозні гранули змішували з 500 мкг загального клітинного білка з клітинних лізатів впродовж 45 хв. Гранули промивали і відділяли шляхом електрофорезу на 15% поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (PAGE-SDS) із подальшим зондуванням за допомогою aнти-M135R. 50 мкг загального білка з інфікованих клітинних лізатів застосовували як контролі. Імунопреципітація біотинілованих поверхневих білків вказує на те, що M135R знаходиться на поверхні інфікованих клітин (Фіг. 34В). 96412 40 M135R не є обов'язковим для реплікації вірусу міксоми in vitro [00198] Для перевірки дії M135R як фактора вірулентності ми сконструювали рекомбінантний вірус з видаленим M135R, який було замінено на касету, що кодує EGFP та gpt з W раннім/пізнім промоторами (було видалено 460 нуклеотидів або 86% відкритої рамки зчитування). Стратегія клонування і касета представлені на Фіг. 35А. Рекомбінант очищали від бляшок шляхом відбирання вірусних клонів, що експресують EGFP. Чистоту рекомбінанта було підтверджено засобами PCR (полімеразна ланцюгова реакція) (Фіг. 35В; Смуга 1-1 т.п.н. плюс леддер послідовності ДНК, Смуги 2 і 3 - продукти полімеразної ланцюгової реакції двох очищених клонів vMyx135KO. Продукт полімеразної ланцюгової реакції представляє ділянку, на якій було видалено кодувальну ділянку M135R і введено EGFP/gpt маркер. Смуга 2 - бляшка 1, Смуга 3 - бляшка 2. Смуга 4 представляє ту саму ділянку і охоплює нативний непереривчастий локус M135R). Результати імуноблотингу клітин BGMK, інфікованих vMyxLau або vMyx135KO, підтвердили, що vMyx135KO втратив експресію M135R (Фіг. 35С; часовий перебіг експресії M135R; Смуга 1 - неінфіковані клітини BGMK. Смуги 2-6 - інфіковані vMyxLau клітини BGMK через 0 год (смуга 2), 3 год (смуга 3), 6 год (смуга 4), 18 год (смута 5) і 36 год (смуга 6) після інфікування. Смуги 7 і 8 - інфіковані vMyx135KO клітини BGMK через 6 год (смуга 7) та 18 год (смуга 8) після інфікування. Смуга 9 - позитивний контроль з M135R, експресованим у AcNPV). [00199] Криві одностадійного росту застосовували для перевірки здатності vMyx135KO до розмноження у клітинах BGMK. Клітини BGMK інфікували vMyxgfp або vMyx135KO з МОI 5, і клітини збирали у вказаний час. Титри вірусу визначали на клітинах BGMK. Характер розмноження vMyxgfp і vMyx135KO не відрізнявся (Фіг. 36). Ці результати вказують, що M135R не є необхідним для реплікації in vitro. [00200] Під час наших досліджень здатності іншого гена вірусу міксоми впливати на розмноження вірусу міксоми у первинних зародкових фібробластах кролів (REF), ми застосовували vMyx135KO як блокований контроль і спостерігали цікаве явище. Наслідком інфікування REF vMyxgfp було утворення нормальних інфекційних осередків, однак vMyx135KO спричинював утворення бляшкоподібної зони інфекції (Фіг. 37). Під час випробування інших клітин для підтвердження цього фенотипу ми змогли відтворити утворення бляшок на іншій лінії кролячих фібробластів (HIG-82, Фіг. 38) і лінії людських первинних фібробластів (ccd922-sk, Фіг. 39). M135R є критичним фактором вірулентності для патогенезу у кролів [00201] На наступному етапі ми випробували здатність vMyx135KO до спричинення міксоматозу у лабораторних кролів. У протилежність до тварин, яким ін'єкційним шляхом вводили vMyxLau або vMyxgfp, у яких розвинувся нормальний міксоматоз і яких були вимушені умертвити між 9 і 10 днями після ін'єкції, кролі, яким ін'єкційним шляхом 41 96412 вводили vMyx135KO, повністю видужали (Таблиця 3). Для підтвердження того, що втрата M135R спричинювала ослаблення вірулентності vMyx135KO, ми одержали вірус-ревертант, у якого був відновлений M135R, і ми перевірили здатність цього ревертанту (vMyx135REV) до відновлення здатності до спричинення міксоматозу. Усі чотири експериментальні групи кролів реагували подібним чином впродовж перших шести днів після ін'єкції відповідних вірусів (Таблиця 3). На 4 день після інфікування ми спостерігали велике червоне 42 опукле ураження на місці ін'єкції в усіх експериментальних групах. Однак, розпочинаючи з 6 дня і впродовж наступних 3-4 днів, різниці між різними вірусами стали очевидними. Тварини, яким вводили вірус дикого типу або вірус-ревертант, мали численні вторинні ураження на ділянці вух, очей і носу, які не спостерігались у тварин, яким вводили vMyx135KO (Таблиця 3). Ми дійшли висновку, що втрата M135R різко ослаблювала вірулентність MV на тваринних моделях, і це свідчить про те, що M135R є критичним фактором вірулентності. Таблиця 3 Патогенез vMyx135KO порівняно з контролями дикого типу Клінічні ознаки Місце інокуляції Супровідні утвори Запалення кон'юнктиви Аногенітальний набряк Вторинні ураження Утруднення дихання Зворотний розвиток уражень Спостереження і час початку (число+дні вказує першу появу у днях після ін'єкції) Lausanne vMyx135KO vMyx135REV (4 тварини) (6 тварин) (3 тварини) - 2 доби: червоне, видиме, - 4 доби: 11-16 мм, червоне, - 3 доби: невелика, дещо злегка опукле опукле, центральна частина опукла припухлість червоного - 4 доби: червоне, централь- темного кольору кольору на частина темного кольору - 4 доби - 6 діб: тільки починають - 6 діб: 5-10 видимих супровіз'являтись, впродовж перебі- дних утворів, видима кільгу інфікування спостерігалась кість яких на 8 добу збільшудуже незначна кількість ється до 30-40 - Не спостерігалось - 9 діб: виділення з ока у од- - Не спостерігалось ного кроля - 7 діб: припухлість - 7 діб: почервоніння, припухлість - 6-7 діб: спочатку довкола - 7 діб: декілька невеликих - 6 діб: спочатку спостерігаочей, потім на вухах червоних плям, ще не ура- лись як червоні ділянки на ження, вуха, очі повіках, на 7 добу чітко виражені ураження - Незначні або жодних - Незначні або жодних - Незначні або жодних - 11 діб: 25 мм, чорні, вкриті струпом - супровідні утвори втрачають забарвлення і вкриваються струпом - 13 діб: струп починає відділятись від здорової тканини - 2 тварини були умертвлені - усі тварини одужали - 3 тварини були умертвлені на 9 добу на 10 добу - 2 тварини були умертвлені на 10 добу [00202] Температуру кролів визначали щоденно впродовж трьох днів, що передували дослідженню. Ця температура вважалась вихідною температурою тіла тварин. Ми продовжували здійснювати щоденне визначення температури кожної тварини на протязі усього дослідження. Однак різниць у температурі тіла між експериментальними групами виявлено не було (Фіг. 40). Це дозволяє зробити припущення про те, що M135R не відіграє ролі у гарячковій реакції інфікованих тварин. M135R не зв'язує і не пригнічує IFNα/β кролів [00203] Послідовність M135R є подібною до послідовності B18R вірусу коров'ячої віспи, що імітує рецептор IFNα/β. Ми перевірили здатність M135R до зв'язування IFN типу 1 кролів. Спочатку ми мітили йодом кролячий IFN (5 мкг, за допомогою йодогранул) і перевіряли здатність клітин, ін125 фікованих vMyx135KO, до зв'язування міченого І кролячого IFN у порівнянні з клітинами, інфікованими vMyxgfp (МОI 10). Клітини збирали, промивали і підраховували за допомогою гаммалічильника. Видалення M135R не впливало на зв'язування IFNα/β з інфікованими клітинами, і ми не спостерігали жодних різниць у кількості IFN, зв'язаної з поверхнею клітин RK13 або BGMK (Фіг. 41). Окрім того, обробка клітин RK13 або BGMK екзогенним кролячим IFN типу 1 не впливала на інфікування клітин vMyx135KO (Фіг. 42; клітини висівали на 12-лункові планшети і інфікували вка 43 заним вірусом із МОI 0,01; флуоресцентні осередки підраховували через 72-96 год після інфікування; 200 одиниць кролячого IFNα/β або додавали за 24 год до інфікування, або клітини залишались необробленими). Такий самий результат спостерігався, коли клітини піддавали попередній обробці за 24 год до інфікування для індукування противірусного стану у клітини. Ми не помітили жодної значущої різниці у осередках, які утворились після інфікування у клітин RK13 або BGMK (дані не показані). Подібне явище спостерігалось і у разі обробки клітин людським IFNA/D (дані не показані). Окрім того, ми не спостерігали жодного зв'язування, коли впливу супернатантів Ас135АТМ піддавали кролячий IFNα/β, що прикріпився до чипу автоматизованої біосенсорної системи ВІАсоге (дані не показані). Приклад 3: Молекулярні наслідки пригнічення mTOR у контексті інфікування вірусом міксоми [00204] Здійснили вестерн-блотинг (Фіг. 43) із застосуванням клітинних лізатів клітин лінії 786-0, лінії ракових клітин типу II, у яких рапаміцин стимулював інфікування вірусом міксоми. Лізати збирали через 16 год після інфікування vMyxLac або vMyxT5KO з МОI 3 або без інфікування вірусом. Вказані смуги містять білок клітин, які піддавали попередній обробці 20 нМ розчином рапаміцину (позначено R) або відповідним контрольним носієм (DMSO, розведення 1:5000, позначено D) за 6 год до інфікування. Блоти зондували "першими" антитілами, спрямованими проти вказаних білків. [00205] Як було показано, інфікування вірусом міксоми чинить негативний вплив на багато шляхів передачі сигналів, які сходяться до mTOR, фізіологічної мішені рапаміцину. У контексті інфікування вірусом дикого типу (vMyxLac) або МТ-5 96412 44 дефіцитним (vMyxT5KO) вірусом, де рапаміцин чинить благотворний вплив на реплікацію вірусу, у багатьох зі згаданих сигнальних молекул спостерігаються глобальні ефекти, які не могли б бути передбаченими, виходячи з обробки лише рапаміцином (дивись смуги псевдоінфікування). Ці впливи включають підвищення активності кіназ АКТ-1, Raf1, GSK-3β і самої mTOR, а також зниження активності кіназ PTEN та p70S6K. Ці дані вказують на те, що ці шляхи, ймовірно, відіграють роль у пермісивності ліній людських ракових клітин для вірусу міксоми. [00206] Фахівцю у цій галузі є зрозумілою можливість багатьох модифікацій варіантів здійснення, опис яких наведено. Цей винахід, деякою мірою, має за мету включення усіх таких модифікацій до свого обсягу, як визначено формулою винаходу. [00207] Незважаючи на те, що у цьому описі розкривають різні варіанти здійснення винаходу, багато адаптацій і модифікацій може бути зроблено у межах обсягу винаходу, відповідно до традиційного загального знання фахівців у цій галузі техніки. Такі модифікації включають підстановку відомих еквівалентів за будь-яким з аспектів винаходу для одержання такого самого результату, по суті таким самим шляхом. Усі технічні і наукові терміни, вжиті у описі, мають таке саме значення, яке традиційно розуміється пересічним фахівцем у галузі, до якої належить винахід, якщо не визначено інше. [00208] Усі посилання, що згадуються у цьому описі, включені до опису цього винаходу у повному обсязі шляхом посилання. % 45 96412 46 47 96412 48 49 96412 50 51 96412 52 53 96412 54 55 96412 56 57 96412 58 59 96412 60