Протипухлинні комбінації, які містять антитіла, що специфічно розпізнають cd38, і циклофосфамід

Реферат: Винахід стосується фармацевтичної комбінації, що містить антитіло, яке специфічно розпізнає CD38, і циклофосфамід. UA 104161 C2 (12) UA 104161 C2 UA 104161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід належить до комбінацій моноклональних антитіл, спрямованим проти CD38 і циклофосфаміду, відомих під товарною назвою цитоксан (cytoxan) (або неозар (neosar)), які є терапевтично застосовними для лікування пухлинних захворювань. CD38 є трансмембранним глікопротеїном типу II масою 45 кДа з довгим C-кінцевим позаклітинної доменом і коротким N-кінцевим цитоплазматичним доменом. Білок CD38 є + біфункціональним екзоферментом, який може каталізувати перетворення НАД у циклічну АДФрибозу (cADPR), а також гідролізує cADPR до АДФ-рибози. CD38 є позитивно регульованим і втягнений у багато які гемопоетичні злоякісні пухлини. Моноклональні антитіла 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31 і 38SB39, які специфічно розпізнають CD38, описують у заявці PCT WO2008/047242. Вказані антитіла проти CD38 здатні + убивати CD38 клітини за допомогою трьох різних цитотоксичних механізмів, індукції апоптозу, антитілозалежної клітинної цитотоксичності (ADCC) і комплементзалежної цитотоксичності + (CDC). Крім того, дані антитіла здатні прямо індукувати апоптоз CD38 клітин навіть під час відсутності стромальних клітин або стромальних цитокінів. Циклофосфамід є алкілуючим засобом, який застосовується у хіміотерапії. В даний час існує потреба у нових й ефективних лікарських засобах, які можна застосовувати в терапії злоякісних пухлин. До даного часу виявлено, у тому числі для даного винаходу, що ефективність гуманізованих антитіл проти CD38 можна значно поліпшувати, коли їх вводять у поєднанні з щонайменше однією речовиною, яка терапевтично застосовна в лікуванні злоякісних пухлин і має механізм, який ідентичний або відрізняється від такого в гуманізованих антитіл проти CD38, і яку обмежують у даному винаході циклофосфамідом. Термін "антитіло" застосовують у даному документі в найширшому змісті, і він зокрема охоплює моноклональні антитіла (включаючи повнорозмірні моноклональні антитіла) будь-якого ізотипу, такого як IgG, IgM, IgA, IgD і IgE, поліклональні антитіла, поліспецифічні антитіла, химерні антитіла і фрагменти антитіл. Типове IgG антитіло містить два ідентичні важкі ланцюги і два ідентичні легкі ланцюги, з'єднані дисульфідними зв'язками. Кожен важкий і легкий ланцюг містить константну область і варіабельну область. Кожна варіабельна область містить три сегменти, які називаються "визначаючими комплементарність областями" ("CDR") або "гіперваріабельними областями", що переважно відповідають за зв'язування епітопу антигену. Як правило, їх позначають як CDR1, CDR2 і CDR3, нумеруючи послідовно від N-кінця. Більш високо консервативні частини варіабельних областей поза CDR називають "каркасні області". Як застосовують у даному документі, "VH" або "VH" належить до варіабельної області імуноглобулінового важкого ланцюга антитіла, включаючи важкий ланцюг Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' або F(ab')2 фрагменти. Указівка на "VL" або "VL" належить до варіабельної області імуноглобулінового легкого ланцюга антитіла, включаючи легкий ланцюг Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' або F(ab')2 фрагменти. Антитіло 38SB13 містить щонайменше один важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, яка складається з SEQ ID NO: 50, і щонайменше один легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, яка складається з SEQ ID NO: 38, вказаний важкий ланцюг, що містить три послідовних CDR, які мають амінокислотні послідовності, що складаються з SEQ ID NOS: 1, 2 і 3, і вказаний легкий ланцюг, що містить три послідовних CDR, які мають амінокислотні послідовності, що складаються з SEQ ID NOS: 4, 5 і 6. Антитіло 38SB18 містить щонайменше один важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, що складається з SEQ ID NO: 52, і щонайменше один легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, що складається з SEQ ID NO: 40, вказаний важкий ланцюг, що містить три послідовних CDR, які мають амінокислотні послідовності, що складаються з SEQ ID NOS: 7, 8 і 9, і вказаний легкий ланцюг, що містить три послідовних CDR, які мають амінокислотні послідовності, що складаються з SEQ ID NOS: 10, 11 і 12. Антитіло 38SB19 містить щонайменше один важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, що складається з SEQ ID NO: 54, і щонайменше один легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, що складається з SEQ ID NO: 42, вказаний важкий ланцюг, що містить три послідовних CDR, які мають амінокислотні послідовності, що складаються з SEQ ID NOS: 13, 81 і 15, і вказаний легкий ланцюг, що містить три послідовних CDR, які мають амінокислотні послідовності, що складаються з SEQ ID NOS: 16, 17і 18. Антитіло 38SB30 містить щонайменше один важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, що складається з SEQ ID NO: 56, і щонайменше один легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, що складається з SEQ ID NO: 44, вказаний важкий ланцюг, що містить три послідовних CDR, які мають амінокислотні послідовності, що складаються з SEQ ID NOS: 19, 20 і 21, і вказаний легкий ланцюг, що містить три послідовних CDR, які мають амінокислотні послідовності, що складаються з SEQ ID NOS: 22, 23 і 24. 1 UA 104161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіло 38SB31 містить щонайменше один важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, що складається з SEQ ID NO: 58, і щонайменше один легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, що складається з SEQ ID NO: 46, вказаний важкий ланцюг, що містить три послідовних CDR, які мають амінокислотні послідовності, що складаються з ID NOS: 25, 26 і 27, і вказаний легкий ланцюг, що містить три послідовних CDR, які мають амінокислотні послідовності, що складаються з SEQ ID NOS: 28, 29 і 30. Антитіло 38SB39 містить щонайменше один важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, що складається з SEQ ID NO: 60, і щонайменше один легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, що складається з SEQ ID NO: 48, вказаний важкий ланцюг, що містить три послідовних CDR, які мають амінокислотні послідовності, що складаються з SEQ ID NOS: 31, 32 і 33, і вказаний легкий ланцюг, що містить три послідовних CDR, які мають амінокислотні послідовності, що складаються з SEQ ID NOS: 34, 35 і 36. Гібридомні клітинні лінії, які продукують антитіла миші проти CD38 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31 і 38SB39 зберігають у American Type Culture Collection (10801 University Bid, Manassas, VA, 20110-2209, USA) на 21 червня 2006 року під номерами PTA-7667, PTA-7669, PTA-7670, PTA-7666, PTA-7668 і PTA-7671, відповідно (як описано в WO2008/047242). Як застосовують у даному документі, термін "гуманізоване антитіло" належить до химерного антитіла, що містить мінімальну послідовність, виділену з імуноглобуліну, який не належить людині. Метою гуманізації є зниження імуногенності гетерологічного антитіла, такого як антитіло миші, для введення людині одночасно з підтримкою повної афінності і специфічності зв'язування антигену антитілом. Гуманізовані антитіла або адаптовані для невідторгнення іншими ссавцями антитіла можна одержувати з застосуванням декількох технологій, таких як ремоделювання поверхні і пересадження CDR. Як застосовують у даному документі, у технології ремоделювання поверхні застосовують комбінацію молекулярного моделювання, статистичного аналізу і мутагенезу для зміни поверхні не-CDR варіабельних областей антитіла для того, щоб робити їх схожими з поверхнями відомих антитіл хазяїна-мішені. Технологія пересадження CDR включає заміни визначаючих комплементарність областей, наприклад, антитіла миші, на каркас домену людини, наприклад, дивися WO 92/22653. Гуманізовані химерні антитіла переважно мають константні області і варіабельні області, інші, ніж визначаючі комплементарність області (CDR), виділені по суті або винятково з відповідних регіонів антитіла людини, і CDR, виділені по суті або винятково із ссавця, іншого, ніж людина. Стратегії і способи ремоделювання поверхні антитіл і інші способи зниження імуногенності антитіл усередині різних хазяїнів описують у патенті США 5639641, що у даному документі включений у повному обсязі як посилання. Антитіла можна гуманізувати із застосуванням множини інших технік, включаючи пересадження CDR (EP 0239400; WO 91/09967; патенти США №№ 5530101 і 5585089), ремоделювання поверхні ("veneering") або ремоделювання поверхні ("resurfacing") (EP 0592106; EP 0519596; Padlan Ε.Α., 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489498; Studnicka G. M. Et al., 1994, Protein Engineering, 7(6): 805-814; Roguska Μ.A. et al., 1994, PNAS, 91: 969-973), перестановку ланцюгів (патент США № 5565332) і ідентифікацію вільних залишків (PCT/US2008/074381). Антитіла людини можна одержувати за допомогою множини відомих у даній галузі способів, включаючи фаговий дисплей. Також див. патенти США №№ 4444887, 4716111, 5545806 і 5814318; і публікації міжнародних патентних заявок під номерами WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 і WO 91/10741 (вказані посилання включені в повному обсязі як посилання). Антитіла проти CD38 у фармацевтичній комбінації за даним винаходом є гуманізованими + антитілами, що розпізнають CD38, і убивають CD38 клітини за допомогою апоптозу, ADCC і CDC. У додатковому варіанті здійснення гуманізовані антитіла за винаходом здатні убивати + вказані CD38 клітини за допомогою апоптозу навіть під час відсутності стромальних клітин або стромальних цитокінів. Переважним варіантом здійснення такого гуманізованого антитіла є гуманізоване антитіло 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31 або 38SB39, або його епітопзв’язувальний фрагмент. CDR антитіл 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31 і 38SB39 ідентифікують за допомогою моделювання і передбачають їхні молекулярні структури. Таким чином, в одному з варіантів здійснення даний винахід належить до гуманізованих антитіл або їх епітопзв’язувального фрагменту, який містить один або декілька CDR, які мають амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NOS: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 і 81. У переважному варіанті здійснення надають гуманізовану версію 38SB13, що містить щонайменше один важкий ланцюг і щонайменше один легкий ланцюг, де вказаний важкий ланцюг містить три послідовні визначаючі комплементарність області, які мають амінокислотні 2 UA 104161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, представлені SEQ ID NOS: 1, 2 і 3, і де вказаний легкий ланцюг містить три послідовні визначаючі комплементарність області, які мають амінокислотні послідовності, представлені SEQ ID NOS: 4, 5 і 6. В іншому переважному варіанті здійснення надають гуманізовану версію 38SB18, що містить щонайменше один важкий ланцюг і щонайменше один легкий ланцюг, де вказаний важкий ланцюг містить три послідовні визначаючі комплементарність області, які мають амінокислотні послідовності, представлені SEQ ID NOS: 7, 8 і 9, і де вказаний легкий ланцюг містить три послідовні визначаючі комплементарність області, які мають амінокислотні послідовності, представлені SEQ ID NOS: 10, 11 і 12. В іншому переважному варіанті здійснення надають гуманізовану версію 38SB19, що містить щонайменше один важкий ланцюг і щонайменше один легкий ланцюг, де вказаний важкий ланцюг містить три послідовні визначаючі комплементарність області, які мають амінокислотні послідовності, представлені SEQ ID NOS: 13, 81 і 15, і де вказаний легкий ланцюг містить три послідовні визначаючі комплементарність області, які мають амінокислотні послідовності, представлені SEQ ID NOS: 16, 17 і 18. В іншому переважному варіанті здійснення надають гуманізовану версію 38SB30, що містить щонайменше один важкий ланцюг і щонайменше один легкий ланцюг, де вказаний важкий ланцюг містить три послідовні визначаючі комплементарність області, які мають амінокислотні послідовності, представлені SEQ ID NOS: 19, 20 і 21, і де вказаний легкий ланцюг містить три послідовні визначаючі комплементарність області, які мають амінокислотні послідовності, представлені SEQ ID NOS: 22, 23 і 24. В іншому переважному варіанті здійснення надають гуманізовану версію 38SB31, що містить щонайменше один важкий ланцюг і щонайменше один легкий ланцюг, де вказаний важкий ланцюг містить три послідовні визначаючі комплементарність області, які мають амінокислотні послідовності, представлені SEQ ID NOS: 25, 26 і 27, і де вказаний легкий ланцюг містить три послідовні визначаючі комплементарність області, які мають амінокислотні послідовності, представлені SEQ ID NOS: 28, 29 і 30. В іншому переважному варіанті здійснення надають гуманізовану версію 38SB39, що містить щонайменше один важкий ланцюг і щонайменше один легкий ланцюг, де вказаний важкий ланцюг містить три послідовні визначаючі комплементарність області, які мають амінокислотні послідовності, представлені SEQ ID NOS: 31, 32, і 33, і де вказаний легкий ланцюг містить три послідовні визначаючі комплементарність області, які мають амінокислотні послідовності, представлені SEQ ID NOS: 34, 35, і 36. В одному з варіантів здійснення даний винахід належить до гуманізованих антитіл або їх фрагментів, що містять VH, який має амінокислотну послідовність, вибрану з групи SEQ ID NOS: 66 і 72. У переважному варіанті здійснення надають гуманізоване антитіло 38SB19, що містить VH, який має амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 66. В іншому переважному варіанті здійснення надають гуманізоване антитіло 38SB31, що містить VH, який має амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 72. В іншому варіанті здійснення даний винахід належить до гуманізованих антитіл або їх фрагментів, що містять VL, який має амінокислотну послідовність, вибрану з групи SEQ ID NOS: 62, 64, 68 і 70. У переважному варіанті здійснення надають гуманізоване антитіло 38SB19, що містить VL, який має амінокислотну послідовність, вибрану з групи SEQ ID NOS: 62 і 64. В іншому переважному варіанті здійснення надають гуманізоване антитіло 38SB31, що містить V L, який має амінокислотну послідовність, вибрану з групи SEQ ID NOS: 68 і 70. Показано, що кожна з гуманізованих версій антитіл 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31 і 38SB39 є особливо прийнятною як протираковий засіб. Їхнє одержання, фізичні властивості і вигідні фармакологічні властивості описують у WO 2008/047242, що у повному обсязі включений у даний документ як посилання. Як правило, застосовувані для лікування людини дози, що залежать від характерних для підданого лікуванню індивідуума факторів, складають від 1 до 150 мг/кг, що вводяться перорально, або від 1 до 150 мг/кг, які уводяться внутрішньовенно. Циклофосфамід (Cytoxan®) є алкілуючим засобом із групи азотистих іпритів, які застосовуються для лікування різних злоякісних пухлин. Він є проліками, які у печінці перетворюються в активну форму, яка має хіміотерапевтичну активність. Циклофосфамід як алкілуючий засіб запобігає діленню клітин переважно за допомогою утворення поперечних зшивок ланцюгів ДНК, в остаточному підсумку клітин, що приводять до загибелі. Циклофосфамід доступний у пероральних і парентеральних складах. Одним аспектом винаходу є фармацевтична композиція, яка містить антитіла проти CD38 у поєднанні з щонайменше циклофосфамідом. Оскільки активність продукту залежить від застосовуваних доз, то можна застосовувати більш низькі дози і підвищувати активність, у той же час знижуючи явище токсичності. Поліпшену ефективність комбінації за винаходом можна демонструвати за допомогою визначення терапевтичного синергізму. Комбінація проявляє 3 UA 104161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 терапевтичний синергізм, якщо вона терапевтично краща кращого засобу в дослідженні, що застосовується окремо у своїй максимально переносимій дозі або у своєї найбільш високій тестованій дозі, коли не можна досягти токсичності у видах тварин. Дану ефективність можна кількісно визначати, наприклад, за допомогою log 10 загибелі клітин, що визначають по наступній формулі: log10 загибелі клітин = T-C (доба)/3,32×Td, у якій T-C представляє затримку росту пухлини, яка є середньою величиною часу в добі для пухлин у групі підданих лікуванню (T) і пухлин з контрольної групи (C) для досягнення заздалегідь визначеної величини (наприклад, 1 г), і Td представляє час у добі, необхідний для подвоєння об’єму пухлини в контрольних тварин [T.H. Corbett et al., Cancer, 40: 2660-2680 (1977); F.M. Schabel et al., Cancer Drug Development, Part B, Methods in Cancer Research, 17: 351, New York, Academic Press Inc. (1979)]. Продукт вважають активним, якщо log10 загибелі клітин більша або дорівнює 0,7. Продукт вважають дуже активним, якщо log10 загибелі клітин більша або дорівнює 2,8. У деяких випадках, коли тривалість лікування складає більше 10 днів і відрізняється між 2 сполуками, які оцінюються в комбінації, обчислюють логарифм сумарної загибелі клітин: log10 сумарної загибелі клітин = (T-C) - тривалість лікування/3,32×Td. Активність визнають, коли логарифм сумарної загибелі клітин більший або дорівнює 0. Комбінація виявляє терапевтичний синергізм, коли log10 загибелі клітин більше, ніж значення log10 кращого компонента окремо при його максимальній переносимій дозі або найбільш високій тестованій дозі. Ефективність комбінації відносно солідних пухлин можна визначати експериментально наступним чином: тваринам, які піддаються експерименту, як правило, мишам, підшкірно білатерально пересаджували від 30 до 60 мг фрагмента пухлини в день 0. Тварин, які мають пухлини, рандомізували, ґрунтуючись на розмірі їхньої пухлини до піддавання різним обробкам і перевіркам. Коли пухлини досягали заздалегідь визначеного в залежності від типу пухлини розміру після пересадження, починали хіміотерапію, і щодня обстежували тварин. Різні групи тварин зважували щодня протягом лікування до досягнення максимальної втрати ваги і наступного повного відновлення ваги. Потім групи зважували один або два рази на тиждень до закінчення дослідження. Пухлини вимірюють від 1 до 5 разів на тиждень у залежності від часу подвоєння пухлини, поки пухлина не досягне приблизно 2 г або поки тварина не помре (якщо це відбудеться до того, як пухлина досягне 2 г). Тварин піддавали розтину безпосередньо після умертвіння або смерті. Протипухлинну активність визначали по різних враховуваних параметрах. Результати, отримані з комбінацією hu38SB19 і застосованого у своїй оптимальній дозі циклофосфаміду вказані в даному документі як приклади. Таким чином, даний винахід також належить до фармацевтичних композицій, що містять комбінації за винаходом. Компоненти, з яких складається комбінація, можна вводити одночасно, майже одночасно, окремо або розподіляючи протягом періоду часу таким чином, щоб досягати максимальної ефективності комбінації; для кожного введення можна варіювати його тривалість від швидкого введення до тривалої перфузії. У результаті, для цілей даного винаходу, комбінації не обмежують винятково тими, які одержують за допомогою фізичного об'єднання компонентів, а також тими, які допускають окреме введення, що може бути одночасним або розподіленим протягом періоду часу. Композиції за винаходом переважно є композиціями, які можна вводити парентерально. Однак дані композиції можна вводити перорально, підшкірно або інтраперитонеально у випадку локальних місцевих способів терапії. Композиції для парентерального введення, як правило, є фармацевтично прийнятними стерильними розчинами або суспензіями, які необов'язково можна одержувати в міру необхідності під час застосування. Для одержання неводних розчинів або суспензій можна застосовувати природні рослинні олії, такі як маслинова олія, сезамова олія, або рідкий петролейний або ін’єктовані органічні складні ефіри, такі як етилолеат. Стерильні водні розчини можуть складатися з розчину продукту у воді. Водні розчини є прийнятними для внутрішньовенного введення в тому випадку, якщо pН є відповідним чином відрегульованим, і отриманий розчин є ізотонічним, наприклад, з істотною кількістю хлориду натрію або глюкози. Стерилізацію можна проводити за допомогою термообробки або будь-яким іншим способом, що 4 UA 104161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 не впливає на композицію несприятливо. Комбінації також можуть мати форму ліпосом або форму сполуки з носіями, такими як циклодекстрини або поліетиленгліколі. Композиції для перорального, підшкірного або інтраперитонеального введення переважно є водними суспензіями або розчинами. У комбінаціях за винаходом, застосування компонентів якого може бути одночасним, окремим або розподіленим протягом періоду часу, особливо сприятливим є те, що кількість гуманізованого антитіла проти CD38 представляє від 10 до 90% по масі комбінації, даний вміст можна варіювати відповідно до природи об'єднаної речовини, бажаної ефективності і природи підданої лікуванню злоякісної пухлини. Комбінації за винаходом є особливо застосовними в лікуванні декількох типів злоякісних пухлин, включаючи (але не обмежуючи цим) наступні: карциноми й аденокарциноми, включаючи такі сечового міхура, молочної залози, товстого кишечнику, голови і шиї, передміхурової залози, нирок, печінки, легені, яєчника, підшлункової залози, шлунка, шейки матки, щитовидної залози і шкіри, і включаючи плоскоклітинну карциному; гемопоетичні пухлини лімфоїдного походження, включаючи множинну мієлому, лейкоз, гострий і хронічний лімфоцитарний (або лімфоїдний) лейкоз, гострий і хронічний лімфобластний лейкоз, B-клітинну лімфому, T-клітинну лімфому, неходжкінську лімфому (наприклад, лімфому Беркітта); гемопоетичні пухлини мієлоїдного походження, включаючи гострі і хронічні мієлогенні (мієлоїдні або мієлоцитарні) лейкози і промієлоцитарний лейкоз; пухлини мезенхімального походження, включаючи фібросаркому, остеосаркому і рабдоміосаркому; пухлини центральної і периферичної нервової системи, включаючи астроцитому, нейробластому, гліому і шваноми; і інші пухлини, включаючи меланому, тератокарциному, пігментну ксеродерму, кератоакантому і семіному, і інші ще не визначені злоякісні пухлини, у яких експресується CD38. В основному вони є застосовними для лікування лейкозу, лімфоми і злоякісних пухлин, стійких до загальновикористовуваних протиракових засобів, тому що антитіла проти CD38 за винаходом мають унікальний механізм дії. Таким чином, винахід також належить до застосування вказаних вище комбінацій для виробництва лікарського засобу для лікування злоякісної пухлини. Приклад У даному прикладі in vivo демонстрували ефективність комбінації антитіла проти CD38/циклофосфамід за винаходом для інгібування росту пухлини. Вибрана модель пухлини була трансплантованою клітинною лінією лімфоми Беркітта, модель Namalwa, імплантованої миші з SCID. Hu38SB19 складали в 5% розчині глюкози у воді. Hu38SB19 як окремий засіб уводили внутрішньовенно два рази на тиждень між 11 і 18 днем після трансплантації пухлини. У випадку комбінації, лікування hu38SB19 продовжували до 35 дня (крім найбільш високої дози комбінації, для якої лікування зупиняли при досягненні токсичності на 18 день). Циклофосфамід складали в 5% розчині глюкози у воді. Циклофосфамід уводили внутрішньовенно один раз на добу на 11 і 15 день після імплантації пухлини. Результати експерименту представлені в таблиці 1. Час подвоєння пухлини = 1,9 днів. Застосовували наступні кінцеві точки: - Токсичність визнавали при дозуваннях, які індукують втрату ≥20% маси тіла або ≥10% смертей, пов'язаних з лікарським засобом. - Протипухлинну ефективність визначали за допомогою обчислення log 10 сумарної загибелі клітин = (T-C)/[3,32×(час подвоєння пухлини в добі)]. (T означає середній час, за який піддані лікуванню миші досягнуть 1000 мг, і C означає середній час (15,7 днів), за який миші з контрольної групи досягнуть того ж розміру; які вижили без пухлин виключають з даних обчислень і вміщують у таблиці окремо). Протипухлинну активність не визнавали для логарифму сумарної загибелі клітин 2,8. - Які вижили без пухлин (TFS): відповідають повній регресії нижче межі пальпації (63 мг) для повної тривалості дослідження (>100 днів після останнього лікування). - Терапевтичний синергізм: комбінація має терапевтичний синергізм, якщо вона більш активна, ніж кращий окремий засіб у дослідженні (щонайменше на 1 логарифм загибелі клітин). Токсичність циклофосфаміду окремо спостерігали при дозі 286,1 мг/кг/ін'єкцію з 3 смертельними кінцями з 5 мишей (60%). Таким чином, найбільш висока нетоксична доза (HNTD) циклофосфаміду складала 177,4 мг/кг/ін'єкцію (загальна ін’єктована доза = 354,8 мг/кг). Виявляли, що доза 177,4 мг/кг/ін'єкцію є високо активною з логарифмом сумарної загибелі клітин 4,8. 5 UA 104161 C2 5 10 15 Розглядаючи hu38SB19, продукт є добре переносимими при дозі 40 мг/кг/ін'єкцію (загальна доза 120,0 мг/кг). Не спостерігали токсичність, що можна пояснювати недоліком перехресної відповіді на антитіло з CD38 миші. Логарифм загибелі клітин складав 0,4, що свідчить про те, що hu38DB19 був неактивним у даних умовах. Комбінація циклофосфаміду при 286,1 мг/кг/ін'єкцію і hu38SB19 при 40 мг/кг/ін'єкцію була токсичною з 3 смертельними кінцями, пов'язаними з лікарським засобом, з 6 тварин (50%), тобто дуже схоже з тим, що спостерігали з циклофосфамідом окремо при тій же дозі. Дозу 177,4 мг/кг/ін'єкцію циклофосфаміду з 40 мг/кг/ін'єкцію hu38SB19 розглядали як HNTD. Дана доза демонструє логарифм загибелі клітин 20,0 і 1/6 TFS (день 196), і її, таким чином, вважали високо активною. Навіть більш низькі дози 110,0 мг/кг/ін'єкцію і 68,2 мг/кг/ін'єкцію циклофосфаміду з 40 мг/кг/ін'єкцію hu38SB19 були більш активними з логарифмами сумарної загибелі клітин 15,7 і 6,9, відповідно. Цікаво, що протипухлинна активність комбінації при всіх трьох оцінюваних рівнях дози складала більше, ніж на один логарифм загибелі клітин більше, ніж такий, що спостерігається для кращого засобу, циклофосфаміду (логарифм загибелі клітин складав 4,8 при HNTD). Ми дійшли висновку, що дана комбінація демонструє терапевтичний синергізм. Даний терапевтичний синергізм також чітко встановлений із застосуванням величини логарифма сумарної загибелі клітин, що враховує тривалість лікування (логарифм сумарної загибелі клітин для комбінації складав 16 проти логарифма сумарної загибелі клітин для циклофосфаміду окремо, який складав 4). 20 Таблиця 1 Комбінація hu38SB19 і циклофосфаміду (CPA) проти розвиненої лімфоми Беркітта Namalwa, імплантованої мишам жіночої статі з SCID log10 % BWC при Засіб, режим і доза в T-C у дні сумарної найменшому мг/кг/ін'єкцію (загальна доза) (1000 мг) загибелі рівні (день) клітин hu38SB19, IV CPA, IV День 11-35, два рази на День 11, 15 тиждень 40,0 (120,0)* +5,4 (19) 2,5 0,4/-0,9 286,1 (572,2) -21,2 920) 177,4 (354,8) -11,1 (19) 30,1 4,8/4,0 110,0 (220,0) -5,2 (17) 19,8 3,1/2,3 68,2 (136,4) -3,8 (18) 9,8 1,6/0,8 40,0 (120,0)* 285,1 (572,2) -21,7 (21) 40,0 (320,0) 177,4 (354,8) -8,0 (16) 126,1 20,0/16,0 40,0 (320,0) 110,0 (220,0) -4,2 (17) 99,3 15,7/11,8 40,0 (320,0) 68,2 (136,4) -4,6 (29) 43,7 6,9/3,0 Примітки HDT - неактивний Смерть від токсичності 3/5 HNTD високо активний високо активний активний Смерть від токсичності 3/6 HNTD, високо активний 1/6 TFS високо активний високо активний Час подвоєння пухлини = 1,9 днів. Середній розмір пухлини на початку терапії = 142-149 мг. Час досягнення середньої пухлини 1000 мг = 15,7 днів. Склади: hu38SB19 і CPA = 5% розчин глюкози у воді. BWC = зміна маси тіла, T-C = затримка росту пухлини, HNTD = найбільш висока нетоксична доза, HDT = найбільш висока тестована доза, CPA = циклофосфамід, TFS = які вижили без пухлин, IV = внутрішньовенно.* Лікування зупиняли на 18 день. 6 UA 104161 C2 7 UA 104161 C2 8 UA 104161 C2 9 UA 104161 C2 10 UA 104161 C2 11 UA 104161 C2 12 UA 104161 C2 13 UA 104161 C2 14 UA 104161 C2 15 UA 104161 C2 16 UA 104161 C2 17 UA 104161 C2 18 UA 104161 C2 19 UA 104161 C2 20 UA 104161 C2 21 UA 104161 C2 22 UA 104161 C2 23 UA 104161 C2 24 UA 104161 C2 25 UA 104161 C2 26 UA 104161 C2 27 UA 104161 C2 28