Спосіб отримання пептидів, що специфічно розпізнають клітини певного типу та призначені для терапевтичних цілей

Спосіб отримання пептидів, що специфічно розпізнають клітини певного типу та призначені для терапевтичних цілей, при якому конструюють фагову бібліотеку випадкових пептидів на основі олігонуклеотидних фрагментів, які їх кодують, проводять її скринінг та використовують методи для підтвердження специфічності відібраних пептидів, який відрізняється тим, що: - олігонуклеотидні фрагменти, що кодують випадкові пептиди, отримують реакцією оберненої транскрипції з використанням випадкових праймерів та 2 (19) 1 3 Винахід належить до генної інженерії, зокрема до способів отримання пептидів, що здатні специфічно розпізнавати певні типи клітин, в тому числі в патологічних станах, і які можуть бути використані в діагностиці, терапії та фармацевтичних застосуваннях. В наш час, однією з найголовніших проблем є підвищення рівня серцево-судинних, онкологічних та імунних захворювань. У більшості випадків, первинним джерелом таких порушень є швидкоплинна неконтрольована проліферація тканинноклітинних структур, яка утруднює та ускладнює їх діагностику і терапію. Тому, першочерговою умовою стає своєчасне виявлення патологічного стану, розробка та доставка лікарських препаратів, які блокують клітинну активність у вогнищі захворювання. Відомі терапевтичні інгібітори судинних гладком'язових клітин, які використовують для пригнічення клітинної активності та/або знищення клітини шляхом націленої доставки терапевтичних агентів у вогнища активної проліферації (див. пат. США №6515009 від 04.02.2003р., МПК А61К31/40). Для інгібування судинних гладком'язових клітин, згідно даного патенту, використовують терапевтичні кон'югати, які містять у собі лікарській препарат, зчеплений з пептидом чи білком, що специфічним чином зв'язується з клітинною мембраною судинних гладком'язових клітин (наприклад, моноклональні та поліклональні антитіла, фактори росту, поліпептидні гормони, цитокіни та подібні до них молекули) або з елементом внутрішньо- або зовнішньоклітинного матриксу (наприклад, макромолекули, що впізнають рецептори інтегринів та фібронектинів, а також епітопи колагену та позаклітинних протеогліканів) цих же клітин. Один з таких пептидів, наприклад, містить послідовність амінокислот, що специфічно впізнає хондроїтинсульфат протеоглікан, з наближеною молекулярною вагою біля 250 кілодальтон, що експресується на мембранах судинних гладком'язових клітин. Таку ж послідовність амінокислот знаходять у регіонах, що забезпечують компліментарність моноклонального антитіла NR-AN-01 та/або його функціональних еквівалентів. Недоліками даного винаходу є використання пептидів, які впізнають білки з вираженою експресією в ряді інших функціонально вагомих клітин і тканин, це призводить до того, що даний терапевтичний кон'югат може зв'язуватися з іншими типами клітин не гладком'язового походження, як наприклад клітини нейроглії, кісткової тканини та інші, що призводить до небажаної акумуляції лікарського препарату в даних клітинах та побічній цитотоксичній дії (клітинної загибелі). Крім того, при використанні антитіл як ведучої складової кон'югатів, їх розмір, із-за досить високої щільності позаклітинного матриксу, може стати перешкодою при проникненні кон'югату в вогнище проліферації, при цьому, крос-реактивність антитіл до інших молекулярних структур знижує їх специфічність. Відомий також спосіб цілеспрямованої доставки пептидів до рестенозних судинних гладком'язових клітин in vitro та in vivo, з метою доставки лі 93922 4 карських препаратів до рестенозної бляшки за допомогою пептидів, які вбудовані в фагові частинки та зв'язуються з судинними гладком'язовими клітинами, що проліферують. Ці пептиди відбирають з бібліотеки синтетичних 15-ти членних пептидів, сконструйованої випадковим шляхом (див. Статтю Ingrid N. Michon et al. "Targeting of peptides to restenotic vascular smooth muscle cells using phage display in vitro and in vivo" в журналі "Biochimica at Biophysica Acta" вип. №1591, 2002p., стор.87-97). Відібрані пептиди шляхом багаторазового повторення одноступеневого скринінгу далі проходять підтвердження специфічності, виключно методом імуноферментного аналізу та візуалізуються за допомогою імунофлюоресценції, за якими виявляють два пептиду з консервативною амінокислотною послідовністю, такі як 5G6 (N'CNIWGVVLSWIGVFPEC-C') та 5Е5 (N'CESLWGGLMWTIGLSDC-C'). Недоліками даного способу є використання однієї вихідної бібліотеки на основі синтетичних випадково орієнтованих пептидів, які не мають аналогів у природі, що визначає їх первинно низьку специфічність та селективність, а також високу імуногенність. Крім того, багаторазове повторення одноступеневого скринінгу призводить до послаблення специфічних та нарощуванню неспецифічних взаємодій. В основу заявленого винаходу поставлена задача створити спосіб отримання пептидів людського походження здатних розпізнавати з високим ступенем специфічності та селективності вибрані типи клітин. Поставлена задача досягається шляхом здійснення нового способу отримання пептидів, що специфічно розпізнають певні типи клітин та призначені для терапевтичних цілей, при якому конструюють фагову бібліотеку випадкових пептидів, на основі олігонуклеотидних фрагментів, які їх кодують, проводять її скринінг та використовують методи для підтвердження специфічності відібраних пептидів, при цьому, відповідно винаходу: - олігонуклеотидні фрагменти, що кодують випадкові пептиди, отримують реакцією оберненої транскрипції з використанням випадкових праймерів та сумарних РНК певного типу клітин та клітин інших типів, які можуть бути включені в патологічний процес або здатні впливати на його діагностику та терапію, - вказані олігонуклеотидні фрагменти вбудовують в бактеріофагові вектори в правильній орієнтації та використовують для створення фагових бібліотек випадкових пептидів для всіх типів клітин, які використовувались для виділення сумарних РНК, - скринінг отриманих фагових бібліотек випадкових пептидів проводять в два етапи, на першому з яких відбирають пептиди, що здатні зв'язуватись з певним типом клітин, а на другому - з відібраних на першому етапі пептидів відбирають пептиди, що не здатні зв'язуватись з клітинами інших використовуваних типів, 5 - підтверджують специфічність пептидів у складі бактеріофагових частинок до певного типу клітин, використовуючи комбінації різних тестів, - визначають первинні послідовності олігонуклеотидних фрагментів, що кодують пептиди у складі відібраних фагових частинок та транслюють їх у амінокислотні послідовності з подальшим проведенням аналізу отриманих послідовностей, - конструюють матриці з амінокислотних послідовностей пептидів, виходячи з їх фізикохімічних властивостей, що включають лінкер та сигнал розпізнавання, - зчитують послідовності нових пептидів з матриць та синтезують такі пептиди хімічним шляхом, з подальшим підтвердженням специфічності отриманих пептидів до певного типу клітин. При здійсненні даного способу отримують пептиди, що специфічно розпізнають певні типи клітин (в тому числі в патологічних станах), які можуть бути використанні для доставки лікарських препаратів у місце їх безпосередньої дії, з метою профілактики та/або терапії розладів, що пов'язані з порушенням функціонування певних типів клітин, або для безпосереднього використання отриманих пептидів, як лікарської форми в терапевтичних застосуваннях. Крім того, використання таких пептидів та їх фрагментів, або модифікованого вектора з таким пептидом, дозволить діагностувати порушення функціонування певних типів клітин і прогнозувати їх лікування. Спосіб отримання пептидів пояснюється схемами та ілюстраціями, де: Фіг. 1 - показано синтез кДНК і конструювання бібліотек; Фіг. 2 - зображена схема одно - та багатоступеневого скринінгу. Фіг. 3 - зображена схема пептидного конструкту (матриці) Спосіб отримання пептидів здійснюють таким шляхом. Спочатку, проводять відбір, і розподіл клітинних популяцій на типи: клітини, що повинні бути специфічно розпізнані пептидами, та клітини які можуть бути втягнені в патологічний процес або здатні впливати на його діагностику та терапію, розпізнавання яких при цьому є небажаним так як це може привести до перекручування результатів діагностики, ярко вираженої побічної дії та низької ефективності терапії. Потім конструюють серії бібліотек випадкових пептидів з використанням сумарної клітинної РНК у векторі вірусного типу на основі ДНК бактеріофагів. Спочатку виділяють сумарну РНК загальновідомими методами в адаптаційних модифікаціях, з наступною, у випадку необхідності, очисткою її та виділенням фракції матричної РНК. Якість такої РНК аналізують і в подальшому, використовують РНК в реакціях оберненої транскрипції, що спрямовують праймерами, як випадкового походження, так і комплементарними до поли А ділянки матричних РНК. На цьому етапі здійснюють первинний розподіл сумарної клітинної РНК шляхом контрольованого синтезу фрагментів кДНК обмежених в розмі 93922 6 рі та гетерогенності, що досягається використанням різних концентрацій іонів в реакційній суміші, комбінацією праймерів, кількістю вихідного матеріалу та режимів температури. Вторинний розподіл клітинної РНК здійснюють на етапі фракціонування та очистки отриманих молекул кДНК, для чого використовують гельфільтрацію таким чином, що після елюції пул молекул кДНК складається з двох частин: фракції молекул з кількістю пар нуклеотидів менше 500 та фракції, що складається з молекул розміром більше 500 пар нуклеотидів. Такий розподіл дозволяє, в першому випадку, створення бібліотек спрямованих на визначення точних місць взаємодії молекули пептиду з молекулами на поверхні клітин, що розпізнають, а в другому - ідентифікувати фрагмент нуклеїнової кислоти, який відповідає за синтез даного пептиду або білкового фрагмента. Далі, на стадії вбудовування фрагментів кДНК у фаговий вектор в правильній орієнтації, отримані в результаті розподілу та синтезу, молекулі кДНК легують з олігонуклеотидними лінкерами, які хімічно синтезовані та містять місця впізнання для ендонуклеаз рестрикції, які використовують для обробки та підготовки вектора для клонування. Для цього, кінці кДНК спочатку обробляють за допомогою ДНК полімерази і тільки потім, такі фрагменти легують з лінкерами та інкубують з ендонуклеазами рестрикції. Використовуючи данні лінкери, стає можливим отримати фрагменти кДНК, які містять на різних кінцях місця впізнання для ендонуклеаз рестрикції, в такому положенні, що можуть бути безперешкодно клоновані у вектор в певній орієнтації (смислове клонування). Одночасно з цим, фаговий вектор обробляють ендонуклеазами рестрикції, з метою отримання фрагментів придатних для легування з синтезованими фрагментами кДНК. Отримані в результаті легування фрагментів кДНК та молекул вектора, рекомбінантні молекули, упаковують in vitro та ініціюють експресію даного фрагмента шляхом одного циклу реплікації. Потім, визначають кількість рекомбінантів в бібліотеці та абсолютне число частинок. Проводять скринінг (відсів) таких бібліотек, використовуючи комбінації клітин певного типу та клітин інших типів, які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію. При цьому, скринінг здійснюють багаторазовим повторенням раундів інкубації з клітинами, з наступними відмивками фагових частинок, які не зв'язалися з клітинами, розчинами різної іонної сили та розчинами різної здатності руйнувати білок-білкові взаємодії, з наступною елюцією та ампліфікацією шуканих фагових частинок. Причому, у випадку прямого скринінгу, певну кількість фагових частинок у буфері спочатку інкубують з матеріалом, який використовують для культивування клітин, а потім залишкову фракцію (супернатант), що містить вільні фаги, переносять на клітини певного типу. У випадку багатоступеневого скринінгу, а саме використання декількох типів клітин, які можуть бути втягнені в патологічний 7 процес та здатні впливати на його діагностику та терапію, супернатант після інкубації з матеріалом спрямовують на ці клітини, після чого супернатант спрямовують або на клітини певного типу, або на наступний тип клітин, які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію, а потім супернатант інкубують з клітинами, що розпізнають. Аналогічно проводять скринінг, якщо використовують певний тип клітин та інші типи клітин, які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію, в різних структурнофункціональних станах. Таким чином, результатом багатоступеневого скринінгу є група пептидів у складі фагових частинок, яка має виражену специфічність у відношенні до певного типу клітин. Далі з вищевказаних груп виділяють індивідуальні фагові частинки та тестують їх. В першому випадку, фагову частинку, що тестують, напрацьовують (нарощують) в необхідній кількості, очищують та досліджують як перше антитіло в прямому імуноферментному аналізі (ІФА), де антигеном виступають культивовані клітини певних типів в різних функціональних станах. При дослідженні великої кількості фагових частинок, проводять мікроселекцію. Для чого, вихідну групу розсівають до отримання індивідуальних бляшок, елюцію яких проводять буфером для інкубації в ІФА та використовують безпосередньо, як джерело першого антитіла в ІФА, без попереднього нарощування та очистки. У другому випадку, індивідуальний клон аналогічно першому, ампліфікують, очищують і інкубують одночасно з клітинами, що розпізнають та клітинами, які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію. Після чого, клітини відмивають, проводять елюцію зв'язаних частинок та визначають їх титр, потім порівнюють його з титром для іншого типу клітин. У третьому випадку, використовують полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), в аналізі специфічності пептидів в складі фагових часток, при цьому, декілька фагів очищують та змішують в однакових кількостях, потім інкубують з клітинами, що розпізнають, та клітинами, які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію, проводять елюцію та розсівають до окремих бляшок, які відбирають парами, виділяють ДНК і використовують її як матрицю для ПЛР. Так визначають кількісний розподіл і ступінь специфічності пептидів в складі фагових частинок. Також визначають стабільність пептиду та здатність проникати в клітину в складі фагової частинки, які перевіряють, інкубуючи фаг з клітинами певного типу при різних режимах температури та часу, з наступною елюцією життєздатних фагів. Для отримання індивідуальних пептидів, що розпізнають певний тип клітин у складі фагових частинок, ДНК бактеріофага виділяють та за допомогою полімеразою ланцюгової реакції проводять ампліфікацію олігонуклеотидних фрагментів, 93922 8 які кодують пептиди, у складі фагової частинки, що специфічно розпізнають клітини певного типу. Первинні нуклеотидні послідовності таких фрагментів визначають методом секвенування за Сенгером, використовуючи автоматичний секвенатор. Отримані таким чином нуклеотидні послідовності транслюють у рамці зчитування для отримання амінокислотних послідовностей пептидів, що знаходяться в складі фагових частинок. Далі проводять комп'ютерний аналіз отриманих амінокислотних послідовностей, використовуючи загальнодоступні пакети програм для аналізу біологічних макромолекул, при цьому визначають фізикохімічні та структурні характеристики пептидів. На основі даних комп'ютерного аналізу, конструюють матриці з амінокислотних послідовностей пептидів, що специфічно розпізнають клітини певного типу. Для цього, на першому етапі амінокислотні послідовності згруповують в короткі (до 5 залишків) матриці, які на другому етапі об'єднують у довгі матриці (не менш 15 залишків), комбінуючи мінімум по 3 та більше коротких матриць. На завершальному етапі до отриманих матриць з амінокислотних послідовностей додають послідовності лінкера та сигналу розпізнавання. Для отримання пептидів у чистому вигляді, зі сконструйованих матриць зчитують послідовності нових пептидів та синтезують такі пептиди хімічним шляхом. Далі пептиди рафінують, з наступним підтвердженням їх специфічності до клітин певного типу. Приклади конкретного виконання заявленого способу. Приклад 1. Вибір клітинних популяцій. Для отримання високоспецифічних пептидів до судинних гладком'язових клітин (СГМК), їх використовують як клітини, які розпізнають, а клітини, що взаємодіють з ними, як у складі стінки кровоносної судини (ендотеліальні) так і ті, що переносяться потоком крові (фібробласти), використовують як клітини, які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію. Клітини карциноми цервікального каналу - HeLa, та клітини карциноми печінки - Hep-G2, також використовують як клітини які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію. Культуру СГМК ініціюють з магістральних кровоносних судин пацієнтів з патологіями серцевосудинної системи. Цілий ряд клітинних ліній також доступний у вигляді комерційних препаратів. Наприклад, паралельно культурам клітин, отриманим при обробці артерій і вен пацієнтів, використовували СГМК коронарної артерії (Cell Systems GmbH, Lot #17151, Catalog # CC-2583). Препарати вихідної культури СГМК є первинними в своєму походженні та мають обмежену кількість дуплікацій, що лімітує кількість їх наступних пересівів. Тому, в усіх випадках, для подальшого дослідження ініціюють культури, використовуючи зразки клітин, які мають не більш ніж шість поділів. Для культивування використовують пластикові флакони, виробленні виключно для роботи з культурами тканин, загальною площею поверхні для росту від 25 до 182 квадратних сантиметрів (наприклад, 9 флакони типів - Т25, Т75, Т182). Судинні гладком'язові клітини культивують, використовуючи поживне середовище, яке складається на 1/3 з кожного наступного компоненту - Waymouth (GIBCO BRL Cat # 31220-023), F12 (GIBCO BRL Cat. # 31220-024), SMCBM (Promocell Cat. # C-22260). Таке середовище доповнюють, попередньо інактивованою інкубацією протягом 30 хвилин при температурі 56 °С на водяній бані, сироваткою плоду корови (GIBCO BRL Cat. # СС-4102) до кінцевої концентрації - 15 %, а також розчином пеніциліну та стрептоміцину (GIBCO BRL Cat. # 15140-114) до кінцевої концентрації - 1,5 %. Середовище, що містить в своєму складі сироватку плоду корови, називають збагаченим. Судинні гладком'язові клітини, які блоковані на стадії росту, культивують, використовуючи збіднене поживне середовище, тобто без додавання сироватки плоду корови, але з додаванням розчину пеніциліну - стрептоміцину у вищевказаній концентрації. Для блокування судинних гладком'язових клітин на стадії росту, їх спочатку культивують, доки розмір моно шару не досягне 90 % від всієї площі для росту, використовуючи збагачене поживне середовище, і тільки потім, проводять заміну збагаченого поживного середовища на збіднене і продовжують інкубацію протягом 72 годин, здійснюючи заміну застарілого поживного середовища на нове, кожні 24 години. Ендотеліальні клітини культивують, використовуючи поживне середовище -EGM-2 (Clonetics Company, Cat. # СС-3202) доповнене пакетом комплементації, що додається - EGM-2 MV (Clonetics Company, Cat. # СС-4147), який містить фактори росту, гормони та інактивовану сироватку плоду корови, кінцева концентрація якої в середовищі після комплементації складає 10 %. Ендотеліальні клітини ініціюють з препарату (Promocell Cat. # СС-2519). Блокують ендотеліальні клітини на стадії росту аналогічно тому, як це роблять у випадку судинних гладком'язових клітин. Фібробласти культивують, використовуючи поживне середовище, основою якого є стандартне середовище DMEM (GIBCO BRL) доповнене інактивованою сироваткою плоду корови до кінцевої концентрації 10 %, та розчином пеніциліну - стрептоміцину до кінцевої концентрації 1,5 %. Ініціюють культуру фібробластів із препаратів пацієнтів з патологіями серцево-судинної системи та блокують також, як це описано для судинних гладком'язових клітин. Клітини HeLa 3T3 та клітини Hep-G2 являють собою імморталізовані лінії, тому практично любий доступний зразок клітин використовують для ініціації культури, однак, намагаються використовувати клітини, що пройшли не більш 100 поділів. Для культивування цих клітин використовують поживне середовище на основі будь-якої з MEM-композицій (GIBCO BRL), доповнену сироваткою плоду корови в кінцевій концентрації 15-20 % (що залежить від бажаних темпів росту) та розчином пеніциліну стрептоміцину до кінцевої концентрації 1,5 %. Для отримання достовірних результатів скринінгу дані типи клітин також піддають культивуванню з використанням збідненого поживного середовища, імітуючи блокування росту подібне з тим, що спо 93922 10 стерігається для первинних типів клітин (СГМК, ендотеліальні клітини та фібробласти). Приклад 2. Виділення РНК та реакції оберненої транскрипції (див. Фіг. 1) На основі первинного відбору клітинних популяцій виділяють РНК, як з клітин певного, так і з клітин які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію. Клітини всіх типів нарощують протягом 5-7 діб, використовуючи флакони типу Т75 та 18 мл поживного середовища, зміну якого проводять кожні 24 години. Судинні гладком'язові клітини культивують у 40 флаконах, з рахунку 3,5*105 клітин на флакон. Ендотеліальні клітини культивують в 20 флаконах, з розрахунку 3,5* 105 клітин на флакон. Клітини HeLa та Hep-G2 культивують в 20 флаконах, з розрахунку 1,6*105 клітин на флакон. Клітини інтенсивно промивають 2 рази, використовуючи 12 мл буфера HBSS (GIBCO BRL) кожний раз, далі обробляють протягом 3 хвилин, використовуючи 6мл розчину, що містить 0,05 % трипсину та 0,53мМ ЕДТА (етілендіамінтетраацетат), та нейтралізують додаванням 9 мл буферу HBSS. Збирають клітини центрифугуванням протягом 10 хвилин на 3000*g, та промивають 3 рази, використовуючи 20 мл буфера HBSS. Число клітин визначають за допомогою камери для рахунку клітин, для чого змішують 50 мкл суспензії клітин з рівним об'ємом 15 %-ого розчину трипанового блакитного, що є вітальним барвником. Число живих клітин фіксують та розраховують загальне число клітин в суспензії. У випадку використання методів жорсткої екстракції гуанідинізотіоціанатом, як з наступним осадженням солями літію, так і без осадження ними, клітини концентрують центрифугуванням, супернатант видаляють, а осад ресуспендують інтенсивно в буфері для лізису (5,25 М гуанідинізотіоціанату; 50 мМ Трис-С1, рН 6,4; 20 мМ ЕДТА; 1 % Тритон-Х100; 0,1 М 2-меркаптоетанол) з розрахун7 ку 1 мл на 10 клітин. До даного розчину додають 0,1 об'єму 2М р-ну ацетату натрію, 1 об'єм р-ну водного фенолу, 0,3 об'єму суміші хлороформізоаміловий спирт (у співвідношенні 24:1) та інтенсивно перемішують протягом 30-60 секунд. Інкубують отриману суміш 15 хвилин при температурі 0 °С, після чого центрифугують протягом 30 хвилин на 8000* g при температурі 4 °С, з метою розділення водної та органічної фаз. Водну фазу після осадження переносять в нову пробірку та додають до неї 0,6 об'єму ізопропілового спирту, попередньо охолодженого до температури - 20 °С, перемішують та помішують на не менш 60 хвилин у охолоджувач з температурою -70 °С. Після інкубації розчин центрифугують 30 хвилин на 12000* g при температурі 4 °С, супернатант ретельно видаляють, а осад промивають декілька разів центрифугуванням по 5 хвилин у присутності 1 мл 70 % р-ну етилового спирту. Отриманий осад розчиняють в 0,4 мл води обробленої діетилпірокарбонатом (ДЕПК). У випадку застосування методів м'якої екстракції з використанням протеїнази К, клітини концентрують центрифугуванням, супернатант видаляють, а осад ресуспендують інтенсивно в 11 попередньо охолодженому буфері для лізису (0,15М хлориду натрію; 10 мМ Трис - Сl, рН 8,5; 0,05 % NP-40; 0,01 % 3-карбоксиаурінової кислоти; 0,1 М 2-меркаптоетанолу) з розрахунку 1 мл на 7 5*10 клітин. Потім, суміш центрифугують 2 хвилини на 12000* g та температурі 4 °С, супернатант переносять в нову пробірку і додають рівний об'єм буфера для протеїнази К (0,2 М Трис - Ацетат; 0,3М натрію ацетат; 0,05 М ЕДТА, рН 7,5; 2 % (в/о) натрію додецилсульфат), що містить 400 мг/мл протеїнази К, та інкубують 60 хвилин при температурі 37 °С. Далі, додають 1 об'єм суміші фенолхлороформ-ізоаміловий спирт (у співвідношенні 25:24:1) та інтенсивно перемішують 5 хвилин при кімнатній температурі. Після чого, суміш центрифугують 2 хвилини на 12000* g при кімнатній температурі, отриману водну фазу переносять в нову пробірку та повторюють екстракцію сумішшю фенол-хлороформ-ізоаміловий спирт (у співвідношенні 25:24:1) декілька разів. До водної фази, що отримана в результаті екстракції, додають 2,5 об'єму абсолютного етилового спирту, інтенсивно перемішують, і осаджують РНК, розміщуючи зразок на 30 хвилин у охолоджувач з температурою 70 °С. Надалі розчин, що містить РНК, центрифугують 10 хвилин на 12000* g при температурі 4 °С, та отриманий осад промивають 3 рази центрифугуванням 5 хвилин на 12000* g, у присутності 700мкл 70 % розчину етилового спирту. Осад висушують 2,5 хвилини під вакуумом і розчиняють в 0,4 мл води обробленої ДЕПК. Отриманий в результаті первинної екстракції розчин сумарної РНК піддають обробці дезоксирибонуклеазою першого типу, з метою видалення фрагментів ДНК, здатних потрапити у розчин РНК в процесі її екстракції і здатних утрудняти подальше фракціонування такої РНК та її використання в реакціях оберненої транскрипції. Для цього, до 0,4мл розчину, що містить 4 мг/мл РНК, додають 12 мкл (480 одиниць) інгібітору рибонуклеаз (Invitrogen, Cat. # 10777-019), 50 мкл 10-кратного стандартного буфера для дезоксирибонуклеази та 50 мкл (500 одиниць) дезоксирибонуклеази першого типу (GIBCO BRL). Потім, отриману суміш інкубують 2 години при температурі 37 °С, та зупиняють реакцію одночасним додаванням 0,1 об'єму 3М р-ну ацетату натрію (рН 5,2), 1,1 об'єму розчину водного фенолу, 0,3 об'єму суміші хлороформізоаміловий спирт (у співвідношенні 24:1). Розчин інтенсивно перемішують протягом 1 хвилини, інкубують 15 хвилин при температурі 0 °С та центрифугують 10 хвилин на 12000* g при температурі 4°С. Водну фазу переносять в нову пробірку і осаджують РНК за допомогою абсолютного етилового спирту, як описано вище. Для виділення фракції матричної РНК (мРНК), 1-2 мг сумарної РНК розчиняють в 5 мл буфера для нанесення (додається до колонки), і наносять на колонку, що містить Оліго - (дТ) - целюлозу (Sigma, Cat # 03131), попередньо промиту 3 рази 1мл буфера для нейтралізації. Після екстракції колонку промивають 5 разів, використовуючи 1 мл буфера для нейтралізації , та проводять елюцію зв'язаної мРНК 1,5 мл буфера для елюції. Надалі, мРНК, що міститься в отриманому розчині, оса 93922 12 джують додаванням 150 мкл 3М р-ну ацетату натрію (рН 5,2) та 3,75 мл абсолютного етилового спирту. Приклад 3. Синтез кДНК і фрагментація транскриптома. З метою отримання молекул кДНК для клонування, сумарну РНК або/та мРНК використовують в реакціях оберненої транскрипції , що направляються РНК - залежною - ДНК - полімеразою. Для цього, змішують 0,001-5,000 мг сумарної РНК та 1 мкл праймера (500 мкг оліго - (дТ) або 0,050-0,250 мкг праймера, що випадково зв'язується), до яких додають 1 мкл 10 мМ р-ну дезоксирибонуклеотидів (10 мМ кожного у нейтральному розчині) та доводять об'єм суміші до 12 мкл, використовуючи подвійно дистильовану воду оброблену ДЕПК. Отриману суміш інкубують 5 хвилин при температурі 65 °С, швидко охолоджують і додають 4 мкл 5-кратного буферу для синтезу первинного ланцюгу кДНК (250 мМ Трис - Сl, рН 8,3; 375 мМ хлориду калію; 15 мМ хлориду магнію), 2 мкл 0,1 М р-ну дитіотриетолу (ДТТ), 1 мкл (40 одиниць) інгібітору рибонуклеаз. Вміст пробірки інтенсивно перемішують та інкубують 2 хвилини при температурі 42 °С, після чого, додають 1 мкл (200 одиниць) Superscript II РНК - залежної - ДНК - полімерази (GIBCO BRL, Cat. # 18064-014) інтенсивно перемішують та інкубують 60 хвилин при температурі 42°С. Реакцію оберненої транскрипції зупиняють шляхом інактивації ферменту, для чого суміш інкубують 15 хвилин при температурі 70 °С. З метою видалення фрагментів РНК компліментарних новосинтезованим молекулам кДНК та здатним утруднювати наступну ампліфікацію кДНК за допомогою ПЛР, до розчину додають 1 мкл (2 одиниці) рибонуклеази Н та інкубують 20 хвилин при температурі 37 °С. На цьому етапі здійснюють первинний розподіл сумарної РНК шляхом контрольованого синтезу фрагментів кДНК обмежених у розмірі та гетерогенності, що досягається використанням різних концентрацій іонів у реакційній суміші, комбінацій праймеров, кількістю вихідного матеріалу та режимами температури. Синтез 2-ого ланцюгу кДНК здійснюють за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), для чого використовують не більш 10 % кінцевого продукту після обробки рибонуклеазою Н. Збирають суміш послідовним додаванням 5 мкл 10 кратного буферу для ПЛР (200 мМ Трис - Сl, рН 8,4; 500 мМ хлориду калію), 1,5 мкл 50 мМ р-ну хлориду магнію, 1 мкл 10 мМ р-ну дезоксирибонуклеотидів, по 1 мкл (10 мкмоль) кожного з праймерів для ампліфікації, 0,5 мкл (2,5 одиниці) Taq - ДНК полімерази, 2 мкл р-ну кДНК (кінцевий продукт реакції синтезу первинного ланцюгу кДНК), 38,1мкл води обробленої ДЕПК. Розчин інтенсивно перемішують та інкубують протягом 2 хвилин при температурі 94 °С. Потім проводять 15-40 стандартних циклів ампліфікації ПЛР. З метою отримання фрагментів придатних для клонування, кінці молекул кДНК обробляють та легують з синтетичними олігонуклеотидними лінкерами, які містять в своєму складі місце впізнання для ендонуклеази рестрикції - Eco R1 та частково 13 місце впізнання для ендонуклеази рестрикції Hind III. Це дозволяє отримати після обробки таких лінкерів відповідними ендонуклеази рестрикції, молекули кДНК, що здатні ефективно легуватись з 5'-кінця лише з Eco R1 обробленою ДНК, та з 3'кінця лише з Hind III обробленою ДНК. Для цього до 20 мкл (не більш 10 мкг) розчину молекул кДНК додають 3 мкл 10-кратного буферу для Т4 - ДНК полімерази (200 мМ Трис - Сl, рН 8,4; 500 мМ хлорид калію), 1,5 мкл 100 мМ р-ну ДТТ, 3 мкл 1 мМ рну дезоксирибонуклеотидів, та 1 мкл (1,5 одиниць) Т4 - ДНК - полімерази, та доводять кінцевий об'єм розчину до 30 мкл, використовуючи подвійно дистильовану воду. Розчин повільно перемішують та інкубують протягом 20 хвилин при температурі 11°С. Реакцію зупиняють додаванням рівного об'єму суміші фенол-хлороформ-ізоаміловий спирт (у співвідношенні 25:24:1) і потім ДНК, що міститься у водній фазі, осаджують додаванням розчинів ацетату натрію та абсолютного етилового спирту, як описано вище. Отриманий осад, що містить молекули кДНК, розчиняють в 10 мкл подвійно дистильованої води. Олігонуклеотидні лінкери фосфорилюють шляхом інкубації з Т4 - полінкулеотидкіназою, безпосередньо перед використанням в реакціях легування. Для цього, збирають суміш послідовним додаванням до 10 мкл р-ну молекул кДНК (з попереднього етапу), 2 мкл 10-ти кратного буферу для легування (10х=200 мМ Трис - Сl, рН 7,6; 50 мМ хлорид калію), 2 мкл 1 мМ р-ну АТФ, 2 мкл (100 пі-комоль) рну олігонуклеотидних лінкерів, 2 мкл 100 мМ р-ну ДТТ, 2,0 мкл (5 одиниць) Т4-полінуклеотидкінази. Розчин перемішують та інкубують протягом 5 хвилин при температурі 37 °С. Потім додають 6-8 одиниць Т4 - ДНК - лігази та інкубують протягом 620 годин при температурі 16 °С. Далі молекули кДНК розщеплюють за допомогою 2-х ендонуклеаз рестрикції - Hind III та Eco R1. Для цього, до розчину молекул кДНК, додають 10мкл 10-кратного буфера для ендонуклеази рестрикції Hind III, та 10 мкл (100 одиниць) ендонуклеази рестрикції Hind III (Invitrogen), об'єм такої суміші доводять до 100 мкл за допомогою подвійно дистильованої води. Отриману суміш інкубують протягом 2 годин при температурі 37 °С. Потім додають 10 мкл 10-кратного буфера для ендонуклеази рестрикції Eco R1 та 10 мкл (100 одиниць) ендонуклеази рестрикції Eco Rl (Invitrogen), та знов інкубують протягом 4 годин при температурі 37 °С. Реакцію зупиняють додаванням рівного об'єму суміші фенол-хлороформ-ізоаміловий спирт (у співвідношенні 25:24:1) і потім ДНК, що міститься у водній фазі, осаджують додаванням розчинів ацетату натрію та абсолютного етилового спирту, як описано вище. Вторинний розподіл сумарної РНК здійснюють на етапі фракціонування та очистки отриманих молекул кДНК, для чого застосовують гельфільтрацію. Хроматографічну колонку, що містить частинки сефарози певного розміру (Novagen) промивають 5 разів, використовуючи 1 мл буфера для нейтралізації кожний раз. Наносять матеріал, що необхідно розділити, популяцію молекул кДНК, в об'ємі 1 мл та збирають фракції по 25 мкл. 93922 14 Приклад 4. Клонування та створення бібліотек. Створення бібліотек всіх органів проводять за однією схемою, як для клітин певного типу так і для клітин які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію. Для цього використовують наприклад ДНК бактеріофагу Т7 (Novagen, T7 Select 10-3 вектор), оброблену з використанням 2 ендонуклеаз рестрикції - Eco R1 та Hind III, тобто, того ж типу, що використовувались для обробки кінців кДНК. Розчин молекул ДНК вектора та розчин молекул кДНК змішують у співвідношенні 1:3, у перерахунку на моль речовини, додають еквівалентну кількість Т4 - ДНК - лігази (GIB-CO BRL) та інкубують не більш ніж 28 годин при температурі 16 °С. Реакцію зупиняють додаванням рівного об'єму суміші фенол хлороформ - ізоаміловий спирт (у співвідношенні 25:24:1), і потім ДНК, що міститься у водній фазі, осаджують додаванням розчинів ацетату натрію та абсолютного етилового спирту, як описано вище. Отримані рекомбінантні молекули ДНК, в кількості не більш 1 мкг, змішують з 250 мкл р-ну пакувальних білків бактеріофагу та інкубують протягом 5 хвилин при температурі 0 °С. Потім додають поживне середовище та продовжують інкубацію ще 60 хвилин при температурі 37 °С. Приклад 5. Ампліфікація бактеріофагів. Бактеріофаг Т7 культивують, використовуючи штам E.coli BLT 5403 як хазяїна. При цьому, ампліфікацію проводять кількома шляхами. В одному випадку, мікроампліфікація, одиничну бляшку або елюат після скринінгу, або будь-яку іншу малу кількість бактеріофагів, розчиняють в 1мл поживного середовища, виготовленого за методом Лурія - Бертані (ЛБ). Потім додають 1 мл свіжоприготовленої культури штаму-хазяїна з оптичною густиною 0,4-0,6 при довжині хвилі 600 нм (ОГ600=0,4-0,6), яку готують нарощуванням 0,5 мл нічної культури в 50 мл поживного середовища протягом 2-3 годин. Суміш фагів і бактерій загальним об'ємом 2 мл інкубують на шейкері при температурі 37 °С та 200 обертів за хвилину протягом 34 годин, спостерігаючи повний лізис, що виражається просвітленням вмісту пробірки. В другому випадку, макроампліфікацію проводять, використовуючи колби, шляхом інокуляції необхідної кількості фагів в 135 мл свіжоприготовленої денної культури штаму-хазяїна (ОГ600=0,40,6) з наступним ростом протягом 4-5 годин до моменту повного лізису. До лізованих культур додають 0,1 об'єму 5М рну хлориду натрію, інтенсивно перемішують 30 секунд та центрифугують протягом 3 хвилин на 7000* g та при температурі 4 °С. Супернатант переносять в нову пробірку та додають 1/6 об'єму розчину, що містить 20 % поліетиленгліколю та 2,5М хлориду натрію, інтенсивно перемішують, та інкубують не менше 3 годин при температурі 0 °С. Далі, розчин центрифугують 10 хвилин на 8000* g, а осад, що містить фаги, розчиняють в 1 мл стандартного буфера TBS (Трис - Боратний Буфер, GIBCO BRL) та знов осаджують фагові частинки додаванням розчину поліетиленгліколю - хлористого натрію з наступною інкубацією та центрифу 15 гуванням протягом 10 хвилин на 12000* g та температурі 4 °С. Отриманий осад розчиняють в 0,2мл буфера TBS. Приклад 6. Скринінг (див. Фіг. 2) Скринінг бібліотек здійснюють, як багаторазовим повторенням одноступеневої процедури, так і за допомогою багатоступеневої комплексної процедури, що включає селекцію на комбінаціях різних типів клітин, які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію. Для цього ініціюють культуру судинних гладком'язових клітин в чашках Петрі діаметром 60 мм з розрахунку 64000 клітин на чашку та нарощують протягом 48 годин. Одночасно, в аналогічних чашках ініціюють культури ендотеліальних клітин, фібробластів, HeLa, Hep-G2, відповідно в кількостях 48000,24000,16000,16000 клітин на чашку, та нарощують протягом 48 годин. Клітини промивають інтенсивно 5 разів по 5 хвилин, використовуючи 3мл буфера HBSS кожного разу. При використанні одноступеневої процедури, 1010 фагових частинок з будь-якої бібліотеки, розчиняють в 2 мл буфера HBSS та інкубують 20 хвилин з преінкубаційним матеріалом (чашкою Петрі, в якій замість клітин містилось лише середовище, надалі - пластик). Після цього, верхню фазу, що містить не зв'язані з пластиком фаги, переносять на попередньо промиті судинні гладком'язові клітинита інкубують 40 хвилин при температурі 4 °С. Після інкубації, з метою видалення незв'язаного матеріалу, клітини інтенсивно відмивають 5 разів по 5 хвилин, використовуючи кожного разу 3 мл буфера HBSS, з наступною елюцією специфічно зв'язаних фагів за допомогою 1 мл буфера для елюції, який містить в своєму складі не більш ніж 1,0 % додецилсульфат натрію, або за допомогою 1 мл свіжовиготовленої денної культури штаму хазяїна. Титр фагів в елюаті визначають та елюат ампліфікують для отримання як мінімум 1010 фагів, котрі інкубують з новою порцією преінкубаційного матеріалу та новою порцією судинних гладком'язових клітин, повторюючи селекційний цикл 3-5 разів. При використанні багатоступеневої процедури, 1010 фагових частинок з будь-якої бібліотеки, розчиняють в 2 мл буфера HBSS та інкубують 20 хвилин з преінкубаційним матеріалом (пластик). Після цього, верхню фазу, що містить не зв'язані з пластиком фаги, переносять на попередньо промиті ендотеліальні клітини та інкубують протягом 40 хвилин при температурі 4 °С, з наступним переносом верхньої фази на нову порцію ендотеліальних клітин та аналогічною інкубацією, що повторюють 2-3 рази і лише після цього, верхню фазу спрямовують на фібробласти та проводять схожу селекцію 2-3 рази. Або верхню фазу після інкубації на ендотеліальних клітинах, без додаткової селекції на фібробластах, переносять безпосередньо на судинні гладком'язові клітини та інкубують протягом 40 хвилин при температурі 4 °С. Відмивку та елюцію проводять, як описано вище. В іншому випадку, верхню фазу після інкубації з преінкубаційним матеріалом (пластик) переносять на попередньо промиті клітини HeLa та інку 93922 16 бують з ними протягом 40 хвилин при температурі 4 °С, а далі, верхню фазу переносять на клітини Hep-G2 та інкубують з ними протягом 40 хвилин при температурі 4 °С, після чого, верхню фазу переносять на нову порцію клітин HeLa та клітин Hep-G2, повторюючи комбіновану селекцію 2-3 рази. Кінцеву верхню фазу переносять на судинні гладком'язові клітини та інкубують протягом 40 хвилин при температурі 4 °С. В іншому варіанті скринінгу, матеріал після селекції на імморталізованих типах клітин, переносять на ендотеліальні клітини та/або фібробласти, і лише потім на судинні гладком'язові клітини. Приклад 7. Виконання комбінованого тестування пептидів у складі фагових частинок. А. Імуноферментний аналіз. Специфічність індивідуальних пептидів у складі фагових частинок, оцінюють, використовуючи їх, замість першого антитіла в прямому імуноферментному аналізі, де в якості антигену виступають клітини певного типу та клітини інших типів які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію. Для цього, всі типи клітин, що використовуються, культивують в 96-лункових мікропланшетах, ініціюючи культуру з розрахунку 10000 клітин на лунку. Клітини нарощують протягом 48 годин, при цьому, проводять заміну поживного середовища кожні 24 години. Потім, мікропланшети промивають інтенсивно 5 разів по 5 хвилин, використовуючи кожного разу по 200 мкл буфера HBSS. Далі інкубують 106-107 фагових частинок з клітинами протягом 1 години при температурі 4 С, з інтенсивною наступною відмивкою буфером HBSS, та інкубацією з другим антитілом, протягом 1 години при кімнатній температурі. Друге антитіло розпізнає послідовність із 11 амінокислот (N'-MetAla-Ser-Met-Thr-(Gly)2-(Gln)2-Met-Gly-C') з N'- кінця білка №10, що входить до складу капсида бактеріофага Т7, та являє собою кон'югат з пероксидазою хрону. Потім, планшети промивають знов буфером HBSS та проводять детекцію другого антитіла, використовуючи субстрат для пероксидази, розщеплення якого зупиняють додаванням 50 мкл 1М р-ну сірчаної кислоти. Б. Аналіз на зв'язування. Зв'язування індивідуальних пептидів досліджують, використовуючи одноступеневу селекцію, при якій пептид, що аналізується, тестують паралельно, на зв'язування з клітинами, що розпізнають, та клітинами, які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію. Для цього ініціюють культуру судинних гладком'язових клітин в чашках Петрі діаметром 60 мм з розрахунку 64000 клітин на чашку та нарощують протягом 48 годин. Одночасно, в аналогічних чашках ініціюють культури ендотеліальних клітин, фібробластів, HeLa, Hep-G2, відповідно в кількостях 48000, 24000, 16000, 16000 клітин на чашку, та нарощують протягом 48 годин. Використовують 109 фагових частинок індивідуального фагу, які розчиняють в 2 мл буфера HBSS. Такий розчин інкубують спочатку протягом 17 20 хвилин з преінкубаційним матеріалом (пластик) і потім переносять верхню фракцію на досліджувані клітини, попередньо промиті 5 разів буфером HBSS, тривалістю по 5 хвилин кожного разу. При цьому, процедуру паралельно виконують як для судинних гладком'язових клітин (клітини, що розпізнають), так і для ендотеліальних клітин, фібробластів, клітин HeLa та Hep-G2 (клітини які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію), використовуючи для всіх типів клітин 2 режими температури: 4 °С та 37 °С. Після інкубації, не зв'язані частинки, інтенсивно відмивають, використовуючи буфер HBSS, після чого проводять елюцію зв'язаних частинок, використовуючи 1 мл буфера для елюції. Визначають титр фагів в елюаті та порівнюють одержані значення для всіх типів клітин. При цьому, чим більше відношення титру фагів, отриманих після елюції з гладком'язових клітин до титру фагів, отриманих з інших типів клітин, тим пептид в складі фагової частинки більш специфічний до гладком'язових клітин, та менш специфічне до клітин інших типів. В. Використання полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Специфічність індивідуальних пептидів у складі фагових частинок тестують, використовуючи ПЛР для ідентифікації клонів, а також для аналізу їх кількісного розподілу при взаємодії з клітинами, що розпізнають та клітинами інших типів які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію. Для цього, ініціюють культуру судинних гладком'язових клітин в чашках Петрі діаметром 60 мм з розрахунку 64000 клітин на чашку та нарощують протягом 48 годин. Одночасно, в аналогічних чашках ініціюють культури ендотеліальних клітин, фібробластів, HeLa, Hep-G2, відповідно в кількостях 48000, 24000, 16000, 16000 клітин на чашку, та нарощують протягом 48 годин. Фагові частинки 7 змішують в еквівалентних кількостях, звичайно 10 частинок кожного типу, з розрахунку на кінцевий об'єм розчину 2 мл. Отриманий розчин інкубують спочатку 20 хвилин з преінкубаційним матеріалом (пластик) і потім переносять верхню фракцію на досліджувані клітини, попередньо промиті 5 разів буфером HBSS, тривалістю по 5 хвилин кожний раз. При цьому, процедуру одночасно проводять, як для судинних гладко м'язових клітин (клітини, що розпізнають), так і для ендотеліальних клітин, фібробластів, клітин HeLa та Hep-G2 (клітини які можуть бути втягнені в патологічний процес та здатні впливати на його діагностику та терапію), використовуючи для всіх типів клітин 2 режими температури: 4 °С та 37 °С. Після інкубації незв'язані частинки, інтенсивно відмивають, використовуючи буфер HBSS, після чого проводять елюцію зв'язаних фагів, використовуючи 1 мл буфера для елюції. Потім визначають титр фагів в елюаті та розсівають рівні аліквоти елюату до отримання одиничних бляшок. Відбирають з кожної чашки 100 бляшок, розподіляють їх групами по дві і виділяють ДНК шляхом раптового лізису фагових частинок. Для цього інкубують фагові частинки в 10 мМ р -ні ЕДТА протягом 10 хвилин при температурі 93922 18 65°С, с наступним охолодженням і центрифугуванням протягом 3 хвилин на 14000* g. Отриманий розчин, що містить ДНК бактеріофагу використовують в якості матриці для ПЛР за стандартною для даного вектора схемою, спрямованою праймерами до ділянок вектора (Т7 "Forward" праймер: 5' - AACCCCTCAAGACCCGTTTA - 3'; Т7 "Reverse" праймер: 5' -GGAGCTGTCGTATTCCAGTC - 3') або спеціально розробленими праймерами. Після цього визначають абсолютну частоту зустрічальності кожного з фагів в залежності від типу клітин. Г. Тест на стабільність пептиду та здатність проникати в клітину в складі фагової частинки. Стабільність індивідуального пептиду в складі фагової частинки, тобто здатність максимально довго зберігати свою функціональну ефективність в клітині, яку він специфічно розпізнає, а також в самому організмі хазяїна, прямо перетинається зі здатністю ефективно проникати в клітину, та зберігати активність і специфічно бомбардувати внутрішньоклітинні цілі. Для цього, ініціюють культуру судинних гладком'язових клітин в чашках Петрі діаметром 60 мм з розрахунку 64000 клітин на чашку та нарощують протягом 48 годин. 1010 фагових частинок, що несуть пептиди, які розпізнають певний тип клітин та являють собою фракцію, отриману після елюції фагів в результаті 3-х раундів селекції багатоступеневим скринінгом, інкубують з судинними гладком'язовими клітинами при 2 режимах температури: 4 °С та 37 °С, та протягом різних періодів часу. Далі клітини відмивають та проводять їх лізис протягом 10 хвилин, використовуючи 2 мл буфера для лізису (1 мл 2 % р-ну дезоксихолієвої кислоти; 10мМ Трис; 2 мМ ЕД-ТА, рН 8,0). Після нейтралізації, розчин, що містить фаги, розсівають до окремих бляшок, які потім відбирають з метою визначення первинних послідовностей олігонуклеотидних фрагментів, що кодують пептиди у складі фагових частинок, а також для проведення додаткового тестування. Приклад 8. Визначення первинної послідовності олігонуклеотидних фрагментів та амінокислотних послідовностей пептидів, що в них закодовані, та їх комп'ютерний аналіз. Олігонуклеотидні фрагменти ДНК ділянки геному вектора, що представляють собою вставки кДНК, які кодують пептиди специфічні до певного типу клітин, та обмежені праймерами вектора, ампліфікують, використовуючи ПЛР, та визначають їх первинну послідовність, методом секвенування за Сенгером, використовуючи автоматичний секвенатор, наприклад, АВІ Prism 310 (Applied Biosystems Inc.), керуючись рекомендованими виробником протоколами проведення реакцій. Використовуючи специфічні сигнали розпізнавання у векторі, первинні послідовності олігонуклеотидних фрагментів транслюють в рамці зчитування в амінокислотні послідовності пептидів, що специфічно зв'язуються з судинними гладко'мязовими клітинами в різних функціональних станах, і отримані таким чином амінокислотні послідовності розподіляють згідно їх довжини та походження. В першу групу розміщують пептиди з коротким амінокислотним ланцюгом (до 30 ланок), які впізна 19 ють виключно лінійні епітопи (ділянки) рецепторних білків на поверхні гладком'язових клітин. До складу другої групи при цьому відбирають пептиди з довгим амінокислотним ланцюгом та фрагменти білків, які зв'язуються з гладком'язовими клітинами, за рахунок розпізнавання складних вторинних та третинних структур на їх поверхні. Амінокислотні послідовності в кожній з двох груп далі послідовно аналізують згідно наступного алгоритму: 1) проводять пошук гомології з відомими амінокислотними послідовностями, що зареєстровані в міжнародних молекулярно-біологічних базах даних, використовуючи алгоритми суміщення, що розповсюджуються через сервера BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) та ExPaSy (www.expasy.org/tools/); 2) визначають первинну структуру та фізико-хімічні характеристики пептидів, використовуючи при цьому алгоритми NHH, що розповсюджуються через сервер ExPaSy (www.expasy.org/tools/) в комбінації з будь-якими вільно доступними автономними пакетами програм. При цьому визначають такі параметри, як частота зустрічальності різних класів амінокислот (структуроутворюючих, гідрофобних, заряджених позитивно, заряджених негативно, полярних без заряду) по кожній з позицій поліпептиду, починаючи з N-кінця молекули. Додатково, визначають профіль гідрофобності, а також середній заряд та середню гідрофобність в перерахунку на ланку ланцюгу для всієї молекули пептиду; 3) визначають елементи вторинної та третинної структур пептидів порівнюючи послідовності з бази даних по білковим структурам (http://www.wwpdb.org/) з послідовностями пептидів специфічних по відношенню до певного типу клітин, наприклад, використовуючи пакет програм WebLab ViewerPro v4.0 (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA, U.S.A.). Можливі ділянки зв'язування пептидів специфічних по відношенню до гладком'язових клітин з молекулами рецепторних білків на їх поверхні виявляють шляхом порівняння суміщень фрагментів пептидів у багатовимірному просторі, використовуючи дані отримані для першої та другої груп амінокислотних послідовностей одночасно. Приклад 9. Проектування матриць з амінокислотних послідовностей, створення пептидного конструкту та зчитування нових пептидів (див. Фіг.3). Конструювання матриць здійснюють за рахунок уніфікації поліпептидних ланцюгів, що передбачає використання найменшої кількості амінокислотних залишків для отримання пептидів з мінімальною складністю структури (для зменшення витрат та часу на синтез) та максимальною специфічністю зв'язування з клітинами обраного типу (для зменшення кількостей пептидів при застосуванні у діагностиці та терапії). Конструюють матриці з амінокислотних послідовностей в 2 етапи. На першому етапі створюють набір коротких матриць (не більш ніж з 5 залишків амінокислот) шляхом перекривання коротких ділянок, що зустрічаються з найбільшою частотою в амінокислотних послідовностях, що аналізують, використовуючи, наприклад, пакет програм Clаstal W (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). 93922 20 На другому етапі, короткі матриці комбінують в групи по 3 та більше з ділянками перекривання на С'- та N'-кінцях пептидів не більш ніж 2 амінокислоти. Після цього, формують повнорозмірний пептидний конструкт, додаючи з С-кінця до отриманої на другому етапі матриці, послідовності лінкера та сигналурозпізнавання. Отримані пептидні конструкти використовують для зчитування нових пептидів, що специфічно розпізнають клітини певного типу, таким чином, щоб, як мінімум один із зчитаних пептидів, утримував в своєму складі оригінальну послідовність пептиду, який було відібрано на етапі селекції, а інші представляли собою максимально різні комбінації залишків амінокислот. Зчитування нових пептидів проводять блоками, що включають як мінімум 2 триплети (6 пептидів). Приклад 10. Хімічний синтез нових пептидів. Синтез пептидів, що специфічно розпізнають клітини певного типу, здійснюють на твердофазному носії за участю апарату для автоматизованого синтезу пептидів, наприклад, РЕ Biosystems Pioneer® (Foster City, CA, U.S.A.), використовуючи термостатичну колонку, заповнену 2-хлоротритіл хлоридним носієм (заміщення 0,27 ммоль/г носія гліцином), підтримуючи постійну температуру 50°С. Приєднання першої амінокислоти з С-кінця пептиду здійснюють згідно технічної документації до апарату для автоматизованого хімічного синтезу. Приєднання кожної наступної амінокислоти проводять, використовуючи чотириразовий надлишок суміші флуорил-9-ілметоксикарбоніл амінокислоти, ТБТУ (О-(Бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'тетраметилуроніум тетрафлуороборат) та діізопропілетиламін (у співвідношенні 1:1:1,7, за об'ємом) у розчині, що попереджує агрегацію (диметилформамід/N-метилпіролідон (3:1, за об'ємом), 1% Тритон Х-100 та 1М етилен карбонату). Цикл приєднання активованих амінокислот повторюють двічі на тих ділянках пептичної молекули, для яких синтез є ускладненим через комплексність вторинної структури ланцюгу, що заздалегідь виявляють за допомогою комп'ютерного аналізу, використовуючи, наприклад, пакет програм Peptide Companion (CoshiSoft, AZ, U.S.A.). Процес синтезу періодично зупиняють та відбирають пробу для оцінки якості реакції за допомогою мас-спектрометрії з іонізуючим розпиленням, наприклад, (ESI - MS, Perkin Elmer/Sciex API I, PE Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.). Отримані пептиди відщеплюють від носія та деактивують, використовуючи суміш із трифтороцтової кислоти, води, тіоанізолу, фенолу, етандитіолу та 3ізопропілсилану (82,5:5:5:2,5:2,5:2,5, за об'ємом). Неочищені пептиди відновлюють протягом 60 хвилин, при температурі 60 °С, використовуючи десятиразовий надлишок розчину трис-(2карбоксіетил)фосфінгідрохлориду, приготовленому в буферному розчині, який містить 6М гуанідинхлориду та 0,1М цитрату натрію (рН 3,0). Потім пептиди негайно опріснюють шляхом рідинної хроматографії на С18 колонці, наприклад, Waters Delta-Pak® C18 (15 м, 300 Å, 25мм×100мм) в розчинах насичених молекуляр 21 ним азотом, а супроводжуюче очистку окислення пептидних молекул контролюють. Концентрацію пептидів після очистки, попередньо оцінюють за поглинанням молекул триптофану та тирозину на довжині хвилі 280 нм, а точні значення вираховують за допомогою тесту на окислення протеїнів біхінольними сполуками. Приклад 11. Підтвердження специфічності нових пептидів. Підтвердження специфічного розпізнавання гладком'язових клітин новими синтезованими пептидами проводять, наприклад, методом імуноферментного аналізу, описаним у прикладі 7, використовуючи замість першого антитіла не фагову частинку, а синтезований пептид. При цьому 40 мкг пептиду інкубують з клітинами протягом 40 хвилин при температурі 37 °С, після чого клітини фіксують, вміщуючи їх у 100 % розчин метилового спирту на 10 хвилин при температурі - 20 °С. Потім клітини промивають буфером HBSS, що містить 0,1 % сапоніну та 1,0 % сухого молока (за вагою), та інкубують з розчином другого антитіла протягом 10 хвилин. 93922 22 Специфічність розпізнавання гладком'язових клітин новими пептидами виражають у відносних одинцях та порівнюють її зі специфічністю розпізнавання гладком'язових клітин будь-якими фаговими частинками, відібраними випадковим чином з бібліотек, описаних в прикладі 4, до проведення селекції. Таким чином при виконанні заявленого способу отримання пептидів, що специфічно розпізнають клітини певного типу, отримали ряд пептидів, що специфічно розпізнають судинні гладком'язові клітини: 1. N'-Asn-Ser-Trp-Pro-Leu-Ser-Arg-Gln-Arg-LeuLeu-Gln-Leu-His-Pro-Ser-Leu-Leu-C'. 2. N'-His-Ala-Tyr-Lys-Ala-Pro-His-Ser-Pro-Ala-IlePro-Leu-His-Pro-Arg-Pro-Gly-C'. 3. N'-(Arg)2-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg-Pro-Arg-(Leu)2(Pro)2-Arg-Pro-Arg-(Pro)2-C'. 4. N'-His-Ser-Trp-Lys-Leu-Pro-His-Pro-Arg(Leu)2-Ser-Pro-His-Pro-(Ser)2-Pro-Gly-C'. 5. N'-Asn-Ser-Tyr-His-Ile-Ser-His-Ser-Arg-AlaVal-Tyr-Pro-His-Arg-(Leu)2-C'. 23 Комп’ютерна верстка Мацело В. 93922 Підписне 24 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601