Антитіло-антагоніст, специфічне для гетеродимеру альфа-4-бета-7

Реферат: Описані антиген-зв'язувальні білки, специфічні для гeтеродимеру альфа-4-бeта-7, нуклеїнові кислоти, що кодують їх, і способи їх одержання і використання. UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Посиляння на споріднені заявки Для даної заявки заявляється пріоритет згідно з 35 U.S.C. 119(е) за заявкою на патент США номер 61/162154, поданою 20 березня 2009 року, і за заявкою на патент США номер 61/306829, поданою 22 лютого 2010 року, які включені у даний опис за допомогою посилань. Галузь техніки, якої стосується винахід Дана заявка представляє композиції і способи, що стосуються антиген-зв'язувальних білків, специфічних для гетеродимеру альфа-4-бета-7. Передумови створення винаходу Інтегрини являють собою гетеродимерні трансмембранні білки типу 1, утворені з двох субодиниць (однієї альфа-субодиниці і однієї бета-субодиниці), які залучаються до множини різних взаємодій за типом клітина-клітина і клітина-позаклітинний матрикс. Функціонально, як було показано, інтегрини залучаються до різних біологічних процесів, що включають міграцію лейкоцитів, рециркуляцію та імунну відповідь. У ссавців відомо 18 альфа-субодиниць і 8 бетасубодиниць, які об'єднуються з утворенням 24 різних інтегринів. Специфічність для ліганду визначається в основному конкретними поєднаннями альфа- і бета-субодиниць, що експресуються, тоді як афінність для ліганду модулюється конформаційними змінами інтегринів і залежить від двовалентних катіонів. Ліганди для інтегринів формують структурно різнорідні групи, які включають білки позаклітинного матриксу, такі як колагени, фібронектин, вітронектин і ламініни; контррецептори, такі як молекули клітинної адгезії (наприклад, молекула адгезії клітин судинного ендотелію, або VCAM) і плазматичні білки. Різні патогенні мікроорганізми також використовують інтегрини для запуску інфекції або як сайти для зв'язування токсинів. Ліганди, що структурно відрізняються, які містять однакові виступаючі залишки глутамінової або аспарагінової кислот, звичайно представлені у вигляді розширеної гнучкої петлі, які важливі для розпізнавання інтегринами. Інтегрини альфа-4 (альфа-4 інтегрини, що функціонують у тандемі з бета-1 або бета-7 субодиницею) грають важливу роль в імунній системі. Альфа-4-бета-1 експресуються на лімфоцитах і мієлоїдних клітинах; очевидно, вони є основною зв'язувальною ланкою для молекули адгезії судинного ендотелію (VCAM). VCAM широко експресується у судинному ендотелії і піддається позитивній регуляції у процесі запалення, зв'язуючись з альфа-4-бета-7, а також з альфа-4-бета-1 (хоча і слабше, ніж з альфа-4-бета-7). Альфа-4-бета-7, виявлені також у периферичних Т-клітинах, В-клітинах, NK-клітинах і еозинофілах, експресуються на максимальному рівні у субпопуляції CD4+CD45RA Т-клітин пам'яті, які, як було показано, знаходяться переважно у кишці. Основним лігандом для гетеродимеру альфа-4-бета-7 є молекула адгезії клітин слизового адресину-1 (MAdCAM-1 або MAdCAM), що експресується в ендотелії кишки. Бета-7 субодиниця, крім зв'язування з альфа-4 ланцюгом, виконує також функцію партнера для альфа-Е з утворенням у цьому випадку альфа-Е-бета-7, що переважно експресується на внутрішньоепітеліальних лімфоцитах (IEL) у кишечнику, легенях і сечостатевому тракті. АльфаЕ-бета-7 також експресується на дендритних клітинах у кишці. Гетеродимер альфа-Е-бета-7 зв'язується з Е-кадгерином і експресується на епітеліальних клітинах. Вважається, що IELклітини функціонують у межах механізму імунологічного нагляду в епітеліальному компартменті. Антитіла, які зв'язуються з альфа-4 та інгібують зв'язування альфа-4-бета-1 з VCAM-1 і фібронектином, були картовані на ділянці з 52 амінокислот в альфа-4, між залишками 152 і 203 (Schiffer et al., J. Biol. Chem. 270:14270; 1995). Tidswell et al. (J. Immunol. 159:1497; 1997) ідентифікували домени бета-7, важливі для зв'язування з MAdCAM-1, з використанням у своїх дослідженнях панелі антитіл, які зв'язуються з бета-7, у межах стратегії, що базується на використанні химерних мишачих/людських субодиниць бета-7. Вказані автори виявили, що шість з семи антитіл, які інгібували зв'язування з MAdCAM-1 і Е-кадгерином, картуються на ділянці, що включає амінокислоти 176-250, які, очевидно, мають гомологію з сайтом адгезії, залежним від іона металу (MIDAS), з інших субодиниць інтегрину. Одним з антитіл, використаних Tidswell et al., було специфічне для гетеродимеру альфа-4-бета-7 антитіло, позначене як ACT-1. Антитіло ACT-1 було спочатку описане Lazarovitz et al. (J. Immunol. 133:1857; 1984) як антитіло, що утворюється у імунізованих мишей при введенні ним Т-лімфоцитарної лінії з МКПК (PBMC), специфічної для токсоїду правця людини.Пізніше було показано, що ACT-1 специфічно зв'язується з гетеродимером альфа-4-бета-7 (Schwcighoffcr et al., J. Immunol. 151:717, 1993). Незважаючи на те, що ACT-1 не зв'язується з мишачим альфа-4-бета-7, це антитіло зв'язується з альфа-4-бета-7 щонайменше з деяких видів приматів, відмінних від людини, і, як було показано, атенуює спонтанний коліт у чубатих тамаринів у неволі (Hesterberg et al., Gastroenterology 111:1373; 1996). 1 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Антитіло ACT-1 піддали процедурі гуманізації і потім оцінили його властивості як терапевтичного засобу для лікування виразкового коліту у людини (Feagan et al., N Engl J Med. 352:2499; 2005), а нещодавно і для лікування хвороби Крона (Feagan et al., Clinical Gastroenterology і Hepatology, 6:1370, 2008). Гуманізоване антитіло ACT-1, також відоме як ведолізумаб, описане у WO 98/06248, а також у патенті США No. 714785 та у WO 07/061679 і US 2007-0122404. Інше гуманізоване антитіло, наталізумаб (Tysabri®), використовували для лікування хвороби Крона. Наталізумаб являє собою гуманізовану версію мишачого антитіла, специфічного для альфа-4. Ведолізумаб, як було показано, приводить до нейтралізації реакції проти гуманізованого антитіла у частини пацієнтів, а наталізумаб асоційований з прогресуючою багатоосередковою лейкоенцефалопатією (PML), що являє собою неврологічне захворювання, пов'язане з реактивацією попередньої інфекції вірусом JC у індивідуумів зі зниженим імунітетом. Відповідно, є потреба у терапевтичному засобі, який би ослаблював ці прояви за допомогою впливу на метаболічний шлях, що стосується альфа-4-бета-7/MAdCAM-1. Суть винаходу В одному аспекті даний винахід стосується виділеного антиген-зв'язувального білка, який специфічно зв'язується з альфа-4-бета-7 (тобто, з антиген-зв'язувальним білком, специфічним для гетеродимеру альфа-4-бета-7). В іншому аспекті здійснення даного винаходу антигензв'язувальний білок специфічно зв'язується з альфа-4-бета-7 з примату, відмінного від людини, яванського макака, шимпанзе, ссавця, відмінного від приматів, гризунів, миші, щура, хом'яка, морської свинки, кота або собаки. В іншому аспекті здійснення даного винаходу виділений антиген-зв'язувальний білок включає людське антитіло, химерне антитіло, моноклональне антитіло, рекомбінантне антитіло, антиген-зв'язувальний фрагмент антитіла, одноланцюжкове антитіло, діатіло, триатіло, тетратіло, Fab-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, домен-специфічне антитіло, IgD-антитіло, IgE-антитіло, IgM-антитіло, IgG1-антитіло, IgG2-антитіло, IgG3-антитіло, IgG4-антитіло або IgG4-антитіло, що містить щонайменше одну мутацію у шарнірній ділянці, яка ослаблює тенденцію до утворення всередині-Н-ланцюжкового дисульфідного зв'язку. В іншому аспекті виділений антиген-зв'язувальний білок включає константну область важкого ланцюга одного з вказаних антитіл; в іншому аспекті константна область являє собою поліпептид, що включає SEQ ID NO: 72; поліпептид, що має щонайменше 90 % ідентичність з SEQ ID NO: 72; поліпептид з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NО:72, з якої були видалені одна, дві, три, чотири або п'ять N-кінцевих і/або С-кінцевих амінокислот; або один з вказаних вище поліпептидів, який включає одну або декілька пост-трансляційних модифікацій. В одному варіанті виділений антиген-зв'язувальний білок включає константну область легкого каппаланцюга, в іншому варіанті він включає область легкого ламбда-ланцюга. В одному варіанті константна область легкого ланцюга являє собою поліпептид, що включає SEQ ID NО:70; поліпептид, що характеризується щонайменше 90 % ідентичністю з SEQ ID NO:70; поліпептид з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NО:70, з якої були видалені одна, дві, три, чотири або п'ять N-кінцевих і/або С-кінцевих амінокислот; або один з вказаних вище поліпептидів, який включає одну або декілька пост-трансляційних модифікацій. Один варіант здійснення даного винаходу стосується антиген-зв'язувального білка, специфічного для гетеродимеру альфа-4-бета-7, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, кожний з яких включає одну або декілька областей, що визначають комплементарність, або CDR. В іншому аспекті здійснення даного винаходу, варіабельна область важкого ланцюга включає CDR1, CDR2 і CDR3, і варіабельна область легкого ланцюга включає CDR1, CDR2 і CDR3, де кожна відповідна CDR вибрана з групи, що складається з CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO:55, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO:58; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO:56, CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NO:59; а також CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO:57, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NО:60. В іншому аспекті здійснення даного винаходу варіабельна область важкого ланцюга також включає чотири рамкових ділянки (FR), позначених як FR1, FR2, FR3 і FR4, і варіабельна область легкого ланцюга також включає чотири рамкових ділянки (FR), позначених як FR1, FR2, FR3 і FR4. В одному аспекті FR вибирають з тих самих SEQ ID NO, що і CDR; в іншому аспекті FR вибирають з інших SEQ ID NO. В іншому варіанті даний винахід стосується антигензв'язувального білка, специфічного для гетеродимеру альфа-4-бета-7, де вказана варіабельна область легкого ланцюга включає SEQ ID NО:55, і варіабельна область важкого ланцюга включає SEQ ID NО:58; варіабельна область легкого ланцюга включає SEQ ID NO:56, і варіабельна область важкого ланцюга включає SEQ ID NO:59; або варіабельна область легкого 2 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ланцюга включає SEQ ID NO:57, і варіабельна область важкого ланцюга включає SEQ ID NО:60. Даний винахід, в іншому аспекті свого здійснення, стосується виділеного антигензв'язувального білка, специфічного для гетеродимеру альфа-4-бета-7, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, кожний з яких включає одну або декілька ділянок, що визначають комплементарність, або CDR. В іншому аспекті здійснення даного винаходу варіабельна область важкого ланцюга включає CDR1, CDR2 і CDR3, і варіабельна область легкого ланцюга включає CDR1, CDR2 і CDR3. В одному варіанті CDR легкого ланцюга вибирають з групи, що складається з CDR1, CDR2 і CDR3, які характеризуються щонайменше 90 % ідентичністю з CDR1, CDR2 і CDR3, відповідно, з SEQ ID NO: 3; CDR1, CDR2 і CDR3, що характеризуються 90 % ідентичністю з CDR1, CDR2 і CDR3, відповідно, з SEQ ID NO: 5; CDR1, CDR2 і CDR3, що характеризуються щонайменше 90 % ідентичністю з CDR1, CDR2 і CDR3, відповідно, з SEQ ID NO: 7; CDR1, CDR2 і CDR3, що характеризуються щонайменше 90 % ідентичністю з CDR1, CDR2 і CDR3, відповідно, з SEQ ID NO: 22; і CDR1, CDR2 і CDR3, що характеризуються щонайменше 90 % ідентичністю з CDR1, CDR2 і CDR3, відповідно, з SEQ ID NO: 24; і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NO:58. В іншому аспекті здійснення даного винаходу варіабельна область важкого ланцюга також включає чотири рамкових ділянки (FR), позначених як FR1, FR2, FR3 і FR4, і варіабельна область легкого ланцюга також включає чотири рамкових ділянки (FR), позначених як FR1, FR2, FR3 і FR4. В одному аспекті FR вибирають з тих же SEQ ID NO, як і CDR; в іншому аспекті FR вибирають з інших SEQ ID NO. Даний винахід, в іншому варіанті свого здійснення, стосується антиген-зв'язувального білка, специфічного для гетеродимеру альфа-4-бета-7, де варіабельна область легкого ланцюга вибрана з групи, що складається з варіабельної області легкого ланцюга, що характеризується щонайменше 90 % ідентичністю з SEQ ID NО: 3; варіабельної області легкого ланцюга, що характеризується щонайменше 90 % ідентичністю з SEQ ID NО: 5; варіабельної області легкого ланцюга, що характеризується щонайменше 90 % ідентичністю з SEQ ID NO: 7; варіабельної області легкого ланцюга, що характеризується щонайменше 90 % ідентичністю з SEQ ID NO: 22, і варіабельної області легкого ланцюга, що характеризується щонайменше 90 % ідентичністю з SEQ ID NO: 24; і де варіабельна область важкого ланцюга включає SEQ ID NO: 58. Інший аспект здійснення даного винаходу стосується виділеного антиген-зв'язувального білка, специфічного для гетеродимеру альфа-4-бета-7, що містить варіабельну область важкого ланцюга, яка включає CDR1, CDR2 і CDR3, і варіабельну область легкого ланцюга, яка включає CDR1, CDR2 і CDR3, де CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга вибрані з групи, що складається з CDR1, CDR2 і CDR3, що характеризуються щонайменше 90 % ідентичністю з CDR1, CDR2 і CDR3, відповідно, з SEQ ID NO: 12; CDR1, CDR2 і CDR3, що характеризуються щонайменше 90 % ідентичністю з CDR1, CDR2 і CDR3, відповідно, з SEQ ID NO: 25; і CDR1, CDR2 і CDR3, що характеризуються щонайменше 90 % ідентичністю з CDR1, CDR2 і CDR3, відповідно, з SEQ ID NО: 26, і де CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга вибрані з групи, що складається з CDR1, CDR2 і CDR3, що характеризуються щонайменше 90 % ідентичністю з CDR1, CDR2 і CDR3, відповідно, з SEQ ID NO: 41; і CDR1, CDR2 і CDR3, що характеризуються щонайменше 90 % ідентичністю з CDR1, CDR2 і CDR3, відповідно, з SEQ ID NO: 54. В одному варіанті варіабельну область легкого ланцюга вибирають з групи, що складається з варіабельних областей, які щонайменше на 90 % ідентичні будь-якій з послідовностей SEQ ID NO: 12, 25 і 26; і варіабельну область важкого ланцюга вибирають з групи, що складається з варіабельних областей, які щонайменше на 90 % ідентичні будь-якій з послідовностей SEQ ID NO:41 і 54. В іншому аспекті здійснення даного винаходу варіабельна область важкого ланцюга також включає чотири рамкових ділянки (FR), позначених як FR1, FR2, FR3 і FR4, і варіабельна область легкого ланцюга також включає чотири рамкових ділянки (FR), позначених як FR1, FR2, FR3 і FR4. В одному аспекті FR вибирають з тих же SEQ ID NO, що і CDR; в іншому аспекті FR вибирають з інших SEQ ID NO. В іншому варіанті даний винахід стосується виділеного антиген-зв'язувального білка, специфічного для гетеродимеру альфа-4-бета-7, що містить варіабельну область важкого ланцюга, яка включає CDR1, CDR2 і CDR3, і варіабельну область легкого ланцюга, яка включає CDR1, CDR2 і CDR3, де кожна відповідна CDR щонайменше на 90 % ідентична CDR, вибраній з групи, що складається з CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NO:10, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 38; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 2, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NO: 30; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NO: 20; і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NO: 51; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 11, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 39; 3 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 13, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 42; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 17, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 46; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 8, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 36; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 19, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 49; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 18, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 47; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 21, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 52; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 3, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 31; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 7, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 35; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 6, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 34; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 1, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 29; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 22, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 50; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 24, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 40; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 9, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 37; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 4, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 32; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 28, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 53; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 16, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 45; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 15, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 44; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 14, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 43; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 27, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 43; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 5, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 33; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 12, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 41; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 23, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 48; CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 25, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 54; і CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга з SEQ ID NО: 26, і CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга з SEQ ID NО: 54. В іншому аспекті CDR важкого ланцюга і CDR легкого ланцюга ідентичні відповідним CDR вказаних SEQ ID NО. В одному варіанті здійснення даного винаходу варіабельна область важкого ланцюга також включає чотири рамкових ділянки (FR), позначених як FR1, FR2, FR3 і FR4, і варіабельна область легкого ланцюга також включає чотири рамкових ділянки (FR), позначених як FR1, FR2, FR3 і FR4. В одному аспекті FR вибирають з тих же SEQ ID NO, що і CDR; в іншому аспекті FR вибирають з інших SEQ ID NO. В іншому варіанті здійснення даного винаходу антиген-зв'язувальний білок, специфічний для гетеродимеру альфа-4-бета-7, включає варіабельну область легкого ланцюга і варіабельну область важкого ланцюга, де вказана варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 10, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 38; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 2, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 30; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 20, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 51; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 11, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 39; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 13, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 42; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 17, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 46; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 8, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 36; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 19, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 49; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 18, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на90 % ідентична SEQ ID NO: 47; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 21, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 52; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 3, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 31; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 7, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 35; 4 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 6, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 34; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 1, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 29; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 22, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 50; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 24, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 40; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 9, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 37; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 4, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 32; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 28, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 53; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 16, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 45; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 15, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 44; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 14, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 43; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 27, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 43; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 5, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 33; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 12, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 41; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 23, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 48; варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 25, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 54; або варіабельна область легкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 26, і варіабельна область важкого ланцюга щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO: 54. В іншому аспекті варіабельні області важкого ланцюга і легкого ланцюга ідентичні відповідним варіабельним областям з вказаних SEQ ID NO. Один аспект даного винаходу стосується виділеного антиген-зв'язувального білка, специфічного для гетеродимеру альфа-4-бета-7, що характеризується показником EC50 менше ніж 35 нг/мл у тесті на зв'язування CD4+ Т-клітин пам'яті; інший аспект стосується виділеного антиген-зв'язувального білка, специфічного для гетеродимеру альфа-4-бета-7, що характеризується показником EC50 менше ніж 10 нг/мл у тесті на зв'язування CD4+ Т-клітин пам'яті. В іншому варіанті даний винахід стосується виділеного антиген-зв'язувального білка, специфічного для гетеродимеру альфа-4-бета-7, який характеризується показником IC50 у конкурентному тесті з MAdCAM менше ніж 30 нг/мл; в іншому варіанті даний винахід стосується виділеного антиген-зв'язувального білка, специфічного для гетеродимеру альфа-4-бета-7, який має показник IC50 менше ніж 10 нг/мл у конкурентному тесті з MAdCAM. Один аспект даного винаходу стосується виділеного антиген-зв'язувального білка, специфічного для гетеродимеру альфа-4-бета-7, який зв'язується з S250N мутантом альфа-4-бета-7. Даний винахід в одному варіанті свого здійснення стосується нуклеїнових кислот, що кодують вказані вище поліпептиди. В іншому варіанті здійснення даного винаходу вказана нуклеїнова кислота являє собою вектор. В іншому варіанті здійснення даного винаходу даний винахід стосується клітин-хазяїнів, трансформованих або трансфікованих нуклеїновими кислотами за даним винаходом. В іншому аспекті даний винахід стосується способу одержання поліпептиду, що включає інкубування клітин-хазяїнів в умовах, що сприяють експресії поліпептидів, і збір одержаних поліпептидів. В іншому аспекті даний винахід стосується виділеної клітини, яка секретує антигензв'язувальний білок, який зв'язується з альфа-4-бета-7. В іншому варіанті вказана клітина являє собою гібридому. В іншому варіанті даний винахід стосується способу одержання антигензв'язувального білка, який специфічно зв'язується з альфа-4-бета-7 (тобто, з людським альфа4-бета-7), що включає інкубування вказаної виділеної клітини в умовах, які дозволяють експресувати вказаний антиген-зв'язувальний білок. 5 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному аспекті даний винахід стосується виділеного антиген-зв'язувального білка, який специфічно зв'язується з гетеродимером альфа-4-бета-7. В іншому варіанті виділений антигензв'язувальний білок, при його зв'язуванні з людським альфа-4-бета-7, інгібує зв'язування альфа4-бета-7 з MAdCAM-1. Відповідно, один варіант здійснення даного винаходу стосується способу інгібування щонайменше однієї активності альфа-4-бета-7, який включає контактування клітини, що експресує альфа-4-бета-7, з антиген-зв'язувальним білком, специфічним для гетеродимеру альфа-4-бета-7, так, що вказана активність частково або повністю інгібується. В одному аспекті такий спосіб виконується in vivo. В одному аспекті здійснення даного винаходу вказаний виділений антиген-зв'язувальний білок інгібує адгезію клітин, що експресують альфа-4-бета-7, з клітинами, що експресують MAdCAM-1. У ще одному аспекті здійснення даного винаходу вказаний виділений антиген-зв'язувальний білок інгібує транспорт клітин, що експресують альфа-4-бета-7, в області тканин, зайнятих клітинами, що експресують MAdCAM-1; в одному прикладі здійснення такого варіанту виділений антиген-зв'язувальний білок інгібує транспорт лімфоцитів у кишку. В іншому аспекті даний винахід стосується фармацевтичної композиції, що включає антигензв'язувальний білок. В одному варіанті даний винахід стосується способу лікування стану у суб'єкта, що включає введення фармацевтичної композиції вказаному суб'єкту, де вказаний стан підлягає лікуванню за допомогою зниження активності (частково або повністю) альфа-4бета-7 у суб'єкта. В іншому варіанті вказаний суб'єкт являє собою людину. В іншому варіанті вказаний стан являє собою запальний стан шлунково-кишкового тракту. Таким чином, пропонується спосіб лікування індивідуума, який має стан, що характеризується невідповідним транспортом клітин, що експресують альфа-4-бета-7, у тканини, що включають клітини, які експресують MAdCAM, де вказаний спосіб включає введенні індивідууму антиген-зв'язувального білка, специфічного для гетеродимеру альфа-4-бета-7, у кількості, достатній для інгібування (часткового або повністю) транспорту клітин, що експресують альфа-4-бета-7, у тканини, що включають клітини, що експресують MAdCAM. В одному варіанті вказаний стан являє собою запальну хворобу кишечнику, наприклад, виразковий коліт, хворобу Крона, хворобу глютенової недостатності (нетропічна спру), ентеропатію, асоційовану з серонегативними артропатіями, мікроскопічний або колагеновий коліт, еозинофільний гастроентерит або синдром запалення резервуара, що виник після проктоколоектомії, та ілеоанальний анастомоз. В іншому варіанті вказаний стан являє собою панкреатит, інсулін-залежний цукровий діабет, мастит, холецистит, холангіт, перихолангіт, хронічний бронхіт, хронічний синусит, астму або хворобу "трансплантат проти хазяїна". В іншому варіанті даний винахід також стосується способу, який включає проведення вказаному суб'єкту другого курсу лікування. В іншому варіанті другий курс лікування проводиться суб'єкту до і/або одночасно з введенням, і/або після введення вказаної фармацевтичної композиції вказаному суб'єкту. В іншому варіанті вказаний другий курс лікування включає введення протизапального засобу. В іншому варіанті друга фармацевтична композиція включає засіб, що вибирають з групи, яка складається з нестероїдних протизапальних засобів, стероїдів та імуномодулюючих засобів. В іншому варіанті вказаний спосіб включає проведення суб'єкту третього курсу лікування. В іншому аспекті даний винахід стосується способу підвищення життєздатності у суб'єкта, що включає введення вказаному суб'єкту фармацевтичної композиції. В іншому аспекті даний винахід стосується способу зниження активності альфа-4-бета-7 у суб'єкта, за наявності такої необхідності, що включає введення вказаному суб'єкту фармацевтичної композиції. В іншому аспекті даний винахід стосується способу зниження альфа-4-бета-7-опосередкованого транспорту (наприклад, альфа-4-бета-7-опосередкований-хомінг у кишці) у суб'єкта, за наявності такої необхідності, що включає введення вказаному суб'єкту фармацевтичної композиції. Докладний опис винаходу Даний винахід стосується композицій, наборів і способів, що стосуються молекул, які зв'язуються з інтегрином альфа-4-бета-7 ("альфа-4-бета-7"), що включають молекули, які є агоністами або антагоністами альфа-4-бета-7, такі як анти-анти-альфа-4-бета-7 антитіла, фрагменти антитіл і похідні антитіл, наприклад, антагоністичні анти-альфа-4-бета-7 антитіла, фрагменти антитіл або похідні антитіл. Даний винахід також стосується нуклеїнових кислот і їх похідних і фрагментів, що включають нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, повністю або його частину, де вказаний поліпептид зв'язується з альфа-4-бета-7, наприклад, даний винахід стосується нуклеїнової кислоти, що кодує анти-альфа-4-бета-7 антитіло, повністю або його частину, фрагмент антитіла або похідне антитіла, а також плазмід і векторів, що включають такі нуклеїнові кислоти, і клітин або клітинних ліній, що включають такі нуклеїнові кислоти і/або 6 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вектори і плазміди. Даний винахід також стосується способів, що включають, наприклад, способи одержання, ідентифікації або виділення молекул, які зв'язуються з альфа-4-бета-7, таких як анти-альфа-4-бета-7 антитіла, способів визначення, чи зв'язується молекула з альфа4-бета-7, способів визначення, чи є молекула, що розглядається, агоністом або антагоністом для альфа-4-бета-7, способів створення композицій, таких як фармацевтичні композиції, що включають молекулу, яка зв'язується з альфа-4-бета-7, і способів введення молекули, яка зв'язується з альфа-4-бета-7, суб'єкту, наприклад, способів лікування станів, опосередкованих альфа-4-бета-7, і досягнення агоністичного або антагоністичного впливу на біологічну активність альфа-4-бета-7 in vivo або in vitro. Полінуклеотидні і поліпептидні послідовності наведені у даному описі з використанням стандартних однобуквених або трибуквених скорочених позначень. Якщо не вказано інше, кожна поліпептидна послідовність має аміно-кінець з лівого боку і карбокси-кінець з правого боку; кожна одноланцюжкова послідовність нуклеїнової кислоти і верхній ланцюг кожної дволанцюжкової послідовності нуклеїнової кислоти має 5'-кінець зліва і 3'-кінець справа. Конкретна поліпептидна або полінуклеотидна послідовність може бути також описана шляхом пояснення, як вона відрізняється від стандартної послідовності. Якщо не вказано інше, наукові і технічні терміни, використані у тексті даного опису, мають загальноприйняті значення, відомі фахівцям у даній галузі. Крім того, якщо з контексту не випливає інше, наведені в однині терміни включають також їх множину, а наведені у множині терміни будуть також включати однину. В основному, номенклатура, що використовується в описі, а також наведені у даному тексті методи, що стосуються культивування клітин і тканин, галузі молекулярної біології, імунології, мікробіології, генетики, а також білкової хімії і хімії нуклеїнових кислот, включаючи процедури гібридизації, відомі фахівцям у даній галузі і широко ними використовуються. Методи і процедури за даним винаходом в основному здійснюються згідно зі стандартними способами, відомими у даній галузі і описаними у різних керівництвах і конкретних статтях, які наведені і обговорюються у межах даного опису, якщо не вказано інше. nd Див., наприклад, Sambrook et al. Molecular Cloning: А Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane Antibodies: А Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), де вказані керівництва включені у даний опис як посилання. Ферментативні реакції і методи очищення проводяться за інструкціями виробників, як це прийнято у даній галузі, або відповідно до наведеного у даному описі матеріалу. Термінологія, використана у даному описі, а також наведені у даному тексті способи здійснення лабораторних процедур і методів аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії і медичної і фармацевтичної хімії добре відомі фахівцям у даній галузі і широко ними використовуються. З метою проведення хімічного синтезу, хімічних аналізів, розробки фармацевтичних препаратів, їх виготовлення, доставки і для лікування пацієнтів можуть використовуватися стандартні методики. Якщо не вказано інше, наведені нижче терміни повинні мати наступні значення: Термін "виділена молекула" (де вказана молекула являє собою, наприклад, поліпептид, полінуклеотид або антитіло) стосується молекули, яка, згідно з її походженням або джерелом її одержання, (1) не асоційована з множиною природних компонентів, які зустрічаються разом з нею в її нативному стані, (2) по суті не містить інших молекул з того ж виду, (3) експресується клітиною іншого виду або (4) не існує у природі без впливу людини. Таким чином, молекула, яка була хімічно синтезована або синтезована у клітинній системі, відмінній від клітини, з якої вона була одержана, де вона існувала у природному стані, буде вважатися "виділеною" з асоційованих з нею у природному оточенні компонентів. Молекула може бути також одержана у вигляді, по суті вільному від асоційованих з нею у природному оточенні компонентів, шляхом виділення, з використанням методів очищення, відомих у даній галузі. Чистота або гомогенність молекули може бути оцінена з використанням множини способів, відомих у даній галузі. Наприклад, чистота поліпептидного зразка може бути оцінена шляхом електрофорезу у поліакриламідному гелі і потім забарвлювання гелю для візуалізації поліпептиду, за допомогою методик, відомих у даній галузі. Для досягнення конкретних цілей може проводитися розділення з більш високою розрізнювальною здатністю у межах процедур ВЕРХ або інших способів очищення, відомих фахівцям у даній галузі. Терміни "інгібітор альфа-4-бета-7" і "антагоніст альфа-4-бета-7" використовуються взаємозамінно. Кожний з них означає молекулу, яка в явній мірі інгібує щонайменше одну функцію альфа-4-бета-7. І навпаки, термін "агоніст альфа-4-бета-7" означає молекулу, яка явно посилює щонайменше одну функцію альфа-4-бета-7. Інгібування, викликане інгібітором альфа4-бета-7, необов'язково повинно бути повним, головне, щоб воно виявлялося, наприклад, у 7 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 межах деякого використовуваного для цього тесту. Може бути використаний будь-який тест на функцію альфа-4-бета-7, приклади таких тестів наведені у даному описі. Прикладами функцій альфа-4-бета-7, які можуть інгібуватися інгібітором альфа-4-бета-7 (або посилюватися під дією агоніста альфа-4-бета-7), включають зв'язування з лігандом (тобто, зв'язування з MAdCAM-1), адгезію з клітинами, що експресують ліганд, транспорт у конкретний компартмент, такий як кишка, вивільнення цитокінів, хемокінів та інших медіаторів, підвищення або посилення запальної відповіді і ушкодження тканини, і т.п. Відповідні приклади типів інгібіторів альфа-4бета-7 і агоністів альфа-4-бета-7 включають, без обмеження, альфа-4-бета-7-зв'язувальні поліпептиди, такі як антиген-зв'язувальні білки (наприклад, білки, що зв'язують антиген альфа-4бета-7), антитіла, фрагменти антитіл і похідні антитіл. Терміни "пептид", "поліпептид" і "білок", кожний, стосуються молекули, що включає два або більше амінокислотних залишків, з'єднаних один з одним пептидними зв'язками. Вказані терміни охоплюють, наприклад, нативні і штучні білки, білкові фрагменти, поліпептидні аналоги (такі як мутеїни, варіанти і білки злиття), білкові послідовності, а також пост-трансляційні або іншим чином, ковалентно або нековалентно, модифіковані білки. Пептид, поліпептид або білок можуть бути мономерними або полімерними. Термін "поліпептидний фрагмент" у контексті даного опису стосується поліпептиду, який має аміно-кінцеву і/або карбокси-кінцеву делецію, у порівнянні з відповідним повнорозмірним білком. Фрагменти можуть складати, наприклад, щонайменше 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 або 200 амінокислот у довжину. Фрагменти можуть також досягати, наприклад, максимум 1000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11 або 10 амінокислот у довжину. Вказані фрагменти можуть бути також одержані внаслідок протеолітичного (або іншого) процесингу, який, наприклад, приводить до варіацій в аміно- і /або карбокси-кінцевих частинах, що включають від однієї до п'яти передбачуваних амінокислот. Фрагмент також може включати на одному або на обох своїх кінцях одну або декілька додаткових амінокислот, наприклад, амінокислотну послідовність з іншого природного білка (наприклад, Fc або лейциновий зипер-домен) або штучну амінокислотну послідовність (наприклад, штучну лінкерну послідовність або білкову мітку). Поліпептиди за даним винаходом включають поліпептиди, які були модифіковані будь-яким способом і на будь-якій основі, такі, наприклад, які: (1) знижують чутливість до протеолізу, (2) знижують чутливість до окиснення, (3) змінюють зв'язувальну афінність при формуванні білкових комплексів, (4) змінюють зв'язувальні афінності; і (5) додають інших фізико-хімічних або функціональних властивостей або модифікують їх. Аналоги включають мутеїни поліпептиду. Наприклад, у природній послідовності можуть бути здійснені одиничні або множинні заміщення амінокислот (наприклад, консервативні заміщення амінокислот) (наприклад, у частині поліпептиду, за межами одного або декількох доменів, що формують міжмолекулярні контакти). Можуть бути також використані консенсусні послідовності для вибору придатних для заміщення амінокислотних залишків; фахівці розуміють, що додаткові амінокислотні залишки також можуть бути заміщені. "Консервативне заміщення амінокислот" являє собою таке заміщення, яке по суті не змінює структурні характеристики початкової послідовності (зокрема, амінокислотне заміщення, що проводиться, не повинно порушувати спіральну структуру, що є у початковій послідовності, або порушувати інші типи вторинної структури, які характеризують початкову послідовність або є важливими для її функціональної активності). Приклади відомих у даній галузі вторинних і третинних структур поліпептидів описані у відповідних керівництвах: Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (С. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, ; and Thornton et at. Nature 354:105 (1991), які включені у даний опис як посилання. Даний винахід також стосується непептидних аналогів поліпептидів, що зв'язуються з альфа-4-бета-7. Непептидні аналоги в основному використовуються у фармацевтичній промисловості як лікарські засоби з властивостями, аналогічними властивостям матричного пептиду. Вказані типи непептидної сполуки позначаються як "пептидні міметики" або "пептидоміметики"; див., наприклад, Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), де вказані роботи включені у даний опис як посилання. Пептидні міметики, які структурно близькі до терапевтичних пептидів, можуть використовуватися для досягнення еквівалентного терапевтичного або профілактичного ефекту. В основному, пептидоміметики структурно близькі до початкового поліпептиду (тобто, до поліпептиду, який має бажану біохімічну властивість або бажану фармакологічну активність), такого як людське антитіло, але де один або декілька пептидних зв'язків необов'язково заміщується зв'язком, вибраним з групи, що складається з - 8 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CH2NH-, --CH2S--, --CH2--CH2-, -CH=CH- (цис- і транс-форми), --COCH2-, -CH(OH)CH2-- і --CH2SO-, і вказане заміщення здійснюється відповідно до методів, відомих у даній галузі. Може також практикуватися системне заміщення однієї або декількох амінокислот консенсусною послідовністю з D-амінокислотою того ж типу (наприклад, D-лізином замість L-лізину) з метою створення більш стабільних пептидів. Крім того, пептиди з напруженою структурою, що включають консенсусну послідовність або по суті ідентичну консенсусну послідовність з деякими варіаціями, можуть бути одержані за методами, відомими у даній галузі (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), де вказана робота включена у даний опис як посилання), наприклад, шляхом використання внутрішніх цистеїнових залишків, здатних до формування внутрішньомолекулярних дисульфідних містків, які приводять до циклізації пептиду. "Варіант" поліпептиду (наприклад, антитіла) включає амінокислотну послідовність, де один або декілька амінокислотних залишків вбудовані, делетовані або заміщені в амінокислотній послідовності у порівнянні з іншою поліпептидною послідовністю. Варіанти за даним винаходом включають білки злиття. "Похідне" поліпептиду являє собою поліпептид (наприклад, антитіло), який був хімічно модифікований, наприклад, за допомогою кон'югування з іншим хімічним фрагментом (таким як, наприклад, поліетиленгліколь або альбумін, наприклад, людський сироватковий альбумін), шляхом фосфорилування і/або глікозилування. Якщо не вказано інше, термін "антитіло" включає, на додаток до антитіл, що включають два повнорозмірних важких ланцюга і два повнорозмірних легких ланцюга, їх похідні, варіанти, фрагменти і мутеїни, приклади яких наведені нижче. "Антиген-зв'язувальний білок" являє собою білок, що включає частину, яка зв'язується з антигеном, і необов'язково у поєднанні з його каркасною або рамковою частиною, яка дозволяє антиген-зв'язувальній частині приймати конформацію, що сприяє зв'язуванню антигензв'язувального білка з антигеном. Приклади антиген-зв'язувальних білків включають антитіла, фрагменти антитіл (наприклад, антиген-зв'язувальну частину антитіла), похідні антитіла і аналоги антитіла. Антиген-зв'язувальний білок може включати, наприклад, альтернативний каркасний білок або штучний каркасний білок з прищепленими CDR або CDR похідними. Такі каркасні форми включають, без обмеження, одержані з антитіла каркасні структури, що включають мутації, введені, наприклад, з метою стабілізації тривимірної структури антигензв'язувального білка, а також повністю синтетичні каркаси, що включають, наприклад, біосумісні полімери. Див., наприклад, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. Крім того, можуть використовуватися пептидні міметики антитіл ("PAM"), а також каркасні структури, що базуються на міметиках антитіл, де роль каркасної структури виконують фібронектинові компоненти. Антиген-зв'язувальний білок може мати, наприклад, структуру природного імуноглобуліну. У контексті даного опису термін "імуноглобулін" означає тетрамерну молекулу. У випадку природного імуноглобуліну кожний тетрамер складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, де кожна пара має один "легкий" ланцюг (приблизно розміром 25 кДа) і один "важкий" ланцюг (приблизно розміром 50-70 кДа). Аміно-кінцева частина кожного ланцюга включає варіабельну область розміром від приблизно 100 до приблизно 110 або більше амінокислот, в основному відповідальних за розпізнавання антигену. Карбокси-кінцева частина кожного ланцюга визначає константну область, в основному відповідальну за ефекторну функцію. Легкі ланцюги людської молекули поділяються на легкі каппа- або лямбда-ланцюги. Важкі ланцюги класифікуються на мю, дельта, гамма, альфа або епсилон ланцюги і визначають ізотип антитіла, такий як IgM, IgD, IgG, IgA і IgE, відповідно. У складі легких і важких ланцюгів варіабельна і константна області з'єднуються "J" ділянкою розміром приблизно 12 або більше амінокислот, при цьому важкий ланцюг включає "D" ділянку розміром приблизно 10 або більше амінокислот. Див., в основному, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (де вказане керівництво включене повністю для всіх цілей). Варіабельні області кожної з легких/важких пар ланцюгів формують сайт зв'язування антитіла так, що інтактний імуноглобулін має два зв'язувальних сайти. Варіабельні області природних імуноглобулінових ланцюгів демонструють таку ж основну структуру, яка властива відносно консервативним рамковим ділянкам (FR), з'єднаним трьома гіперваріабельними ділянками, які також називають ділянками, що визначають комплементарність, CDR. У напрямі від N-кінця до С-кінця легкі і важкі ланцюги включають домени FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. Віднесення амінокислот до кожного з доменів проводять відповідно до визначення Кабата (Kabat et al. in Sequences of Proteins of th Immunological Interest, 5 ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication 9 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 no. 91-3242, 1991). Інші системи нумерації амінокислот в імуноглобулінових ланцюгах включають системи IMGT® (Міжнародна інформаційна система ImMunoGeneTics; Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 29:185-203; 2005) і AHo (Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657670; 2001). Антитіла можуть бути одержані з ряду джерел, таких як сироватка або плазма, які містять імуноглобуліни, що мають різну антигенну специфічність. При проведенні афінного очищення такі антитіла можуть бути збагачені визначеною антигенною специфічністю. При цьому кожний збагачений препарат антитіл звичайно містить менше ніж приблизно 10 % антитіла зі специфічною зв'язувальною активністю для конкретного антигену. Проведення на основі таких препаратів декількох раундів афінного очищення може привести до підвищення частки антитіла з конкретною зв'язувальною активністю для даного антигену. Антитіла, одержані таким чином, відомі як "моноспецифічні". Моноспецифічні антитільні препарати можуть бути одержані з наявністю до приблизно 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % або 99,9 % антитіла, що має конкретну зв'язувальну активність для визначеного антигену. Термін "антитіло" стосується інтактного імуноглобуліну або його антиген-зв'язувальної частини, яка конкурує з інтактним антитілом за специфічне зв'язування, якщо особливо не вказано інше. Антиген-зв'язувальні білки можуть бути одержані за методами рекомбінантних ДНК або шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл. Антигензв'язувальні частини включають, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, домен-специфічні антитіла (dAb) і фрагменти ділянки, що визначає комплементарність (CDR), фрагменти варіабельної області, одноланцюжкові антитіла (scFv), химерні антитіла, діатіла, триатіла, тетратіла і поліпептиди, які містять щонайменше частину імуноглобуліну, достатню для підтримки специфічної антиген-зв'язувальної здатності з поліпептидом. Fab-фрагмент являє собою одновалентний фрагмент, що містить VL, VH, CL і CH1 домени; F(ab')2-фрагмент являє собою двовалентний фрагмент, що містить два Fab-фрагменти, які з'єднані дисульфідним зв'язком по шарнірній ділянці; Fd-фрагмент, що містить VH і CH1 домени; Fv-фрагмент, що містить VL і VH домени одного плеча антитіла; і dAb-фрагмент містить VH домен, VL домен або антиген-зв'язувальний фрагмент VH або VL домену (патент США No. 6846634, 6696245, публікації за заявками на патенти США No. 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward et al., Nature 341:544-546, 1989). Одноланцюжкове антитіло (scFv) являє собою антитіло, в якому VL і VH ділянки з'єднані через лінкер (наприклад, синтетичну послідовність амінокислотних залишків) з утворенням безперервного білкового ланцюга, де лінкер повинен бути досить довгим, з тим, щоб білковий ланцюг міг складатися сам з собою і утворювати одновалентний антиген-зв'язувальний сайт (див., наприклад, Bird el al., 1988, Science 242:423-26 and Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83). Діатіла і бівалентні антитіла включають два поліпептидних ланцюги, де кожний поліпептидний ланцюг включає VH і VL домени, з'єднані лінкером, який повинен бути досить коротким, з тим, щоб дозволити спарювання кожного домену з комплементарним доменом на іншому поліпептидному ланцюгу (див., наприклад, Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, and Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-23). Якщо два поліпептидних ланцюги діатіла ідентичні, то діатіло, яке одержують у результаті спарювання, буде містити два ідентичних антиген-зв'язувальних сайти. Поліпептидні ланцюги з різними послідовностями можуть використовуватися для одержання діатіла з двома різними антиген-зв'язувальними сайтами. Аналогічно, триатіла і тетратіла являють собою антитіла, що включають три або чотири поліпептидних ланцюги, відповідно, і утворюють три або чотири антиген-зв'язувальних сайти, відповідно, які можуть бути однаковими або різними. Ділянки, що визначають комплементарність (CDR), і рамкові ділянки (FR) даного антитіла можуть бути ідентифіковані з використанням системи, описаної Kabat et al. supra; Lefranc et al., supra і/або Honegger and Pluckthun, supra. Одна або декілька CDR можуть бути включені у молекулу, ковалентно або нековалентно, з утворенням антиген-зв'язувального білка. Антигензв'язувальний білок може включати одну або декілька CDR як частину більш великого поліпептидного ланцюга, може ковалентно з'єднувати одну або декілька CDR з іншим поліпептидним ланцюгом або може включати одну або декілька нековалентно приєднаних CDR. Вказані CDR дозволяють антиген-зв'язувальному білку специфічно зв'язуватися з конкретним цікавлячим антигеном. Антиген-зв'язувальний білок може містити один або декілька зв'язувальних сайтів. Якщо є більше одного зв'язувального сайту, то такі зв'язувальні сайти можуть бути ідентичні один одному або можуть бути різними. Наприклад, природний людський імуноглобулін у типовому 10 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 випадку містить два ідентичних зв'язувальних сайти, тоді як "біспецифічне" або "біфункціональне" антитіло має два різних зв'язувальних сайти. Термін "людське антитіло" включає всі антитіла, які містять одну або декілька варіабельних і константних областей, одержаних з послідовностей людського імуноглобуліну. В одному варіанті всі варіабельні і константні домени одержані з послідовностей людського імуноглобуліну (повністю людське антитіло). Такі антитіла можуть бути одержані різними способами, приклади яких будуть описані нижче, включаючи одержання шляхом імунізації миші визначеним антигеном миші, в умовах генетичної модифікації, з експресією антитіл, одержаних з генів, що кодують важкий і/або легкий ланцюг. Гуманізоване антитіло має послідовність, яка відрізняється від послідовності антитіла, одержаного з виду, відмінного від людини, за заміщенням, делецією і/або доданням однієї або декількох амінокислот так, що гуманізоване антитіло, коли його вводять людині, менш ймовірно буде індукувати імунну відповідь і/або воно буде індукувати менш виражену імунну відповідь, у порівнянні з антитілом з виду, відмінного від людини. В одному варіанті деякі амінокислоти у рамковій області і у константних доменах важкого і/або легкого ланцюгів антитіла з виду, відмінного від людини, піддають мутації з одержанням гуманізованого антитіла. В іншому варіанті один або декілька константних доменів з людського антитіла піддають злиттю з одним або декількома варіабельними доменами молекули з виду, відмінного від людини. В іншому варіанті один або декілька амінокислотних залишків в одній або декількох CDR послідовностях антитіла з виду, відмінного від людини, змінюють для зниження можливої імуногенності антитіла з виду, відмінного від людини, коли його вводять людині, де вказані змінені амінокислотні залишки або не є важливими для імуноспецифічного зв'язування антитіла зі своїм антигеном, або ці зміни в амінокислотній послідовності такі, що вони виконані як консервативні зміни, таким чином зв'язування гуманізованого антитіла з антигеном істотно не погіршує зв'язування антитіла з виду, відмінного від людини, з антигеном. Приклади того, як можуть бути одержані гуманізовані антитіла, описані у патентах США No. 6054297, 5886152 і 5877293. Термін "химерне антитіло" стосується антитіла, яке містить одну або декілька ділянок з одного антитіла і одну або декілька ділянок з одного або декількох інших антитіл. В одному варіанті одну або декілька CDR одержують з людського анти-альфа-4-бета-7 антитіла. В іншому варіанті всі CDR одержують з людського анти-альфа-4-бета-7 антитіла. В іншому варіанті CDR з більш ніж одного людського анти-альфа-4-бета-7 антитіла змішують і картують у химерному антитілі. Наприклад, химерне антитіло може містити CDR1 з легкого ланцюга першого людського анти-альфа-4-бета-7 антитіла, CDR2 і CDR3 з легкого ланцюга другого людського анти-альфа-4-бета-7 антитіла і CDR з важкого ланцюга третього анти-альфа-4-бета-7 антитіла. Інші поєднання можливі і також включаються у галузь даного винаходу. Крім того, рамкові ділянки можуть бути одержані з одних і тих же анти-альфа-4-бета-7 антитіл, з одного або з декількох інших антитіл, таких як людське антитіло, або з гуманізованого антитіла. В одному прикладі химерне антитіло, частина важкого і/або легкого ланцюга ідентичні, гомологічні антитілу з конкретного виду або з антитіла, що належить до конкретного класу антитіл або підкласу антитіл, або одержані з такого антитіла, тоді як один або декілька ланцюгів, що залишилися, ідентичні, гомологічні антитілу або одержані з одного або декількох антитіл з іншого виду або антитіла, що належить до іншого класу або підкласу антитіл. У галузь даного винаходу також включаються фрагменти таких антитіл, які демонструють бажану біологічну активність (тобто здатність специфічно зв'язуватися з альфа-4-бета-7). Див., наприклад, патент США No. 4816567 і Morrison, 1985, Science 229:1202-07. Термін "нейтралізуюче антитіло" або "інгібуюче антитіло" означає антитіло, яке інгібує взаємодію альфа-4-бета-7 з MAdCAM-1, коли надлишок анти-альфа-4-бета-7 антитіла знижує рівень взаємодії щонайменше приблизно на 20 %, за даними тесту, такого, як наведений у прикладах даного опису. У різних варіантах антиген-зв'язувальний білок знижує рівень взаємодії альфа-4-бета-7 з MAdCAM-1 щонайменше на 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % і 99,9 %. Фрагменти або аналоги антитіл можуть бути одержані будь-яким фахівцем у даній галузі відповідно до опису, наведеного у даній заявці, і за методами, відомими у даній галузі. Аміно- і карбокси-кінцеві кінці фрагментів або аналогів знаходяться поблизу меж функціональних доменів. Структурні і функціональні домени можуть бути ідентифіковані при порівнянні нуклеотидної і/або амінокислотної послідовності з відповідними даними, наведеними у базах даних стосовно таких послідовностей. Комп'ютерні методи порівняння можуть використовуватися для ідентифікації мотивів послідовності або для прогнозування конформації доменів, які є в інших білках з відомою структурою і/або функцією. Методи ідентифікації 11 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білкових послідовностей, які складаються з утворенням відомої тривимірної структури, відомі у даній галузі. Див., наприклад, Bowie et al., 1991, Science 253:164. "CDR-прищеплене антитіло" являє собою антитіло, що включає одну або декілька СDR, одержаних з антитіла конкретного виду або ізотипу і рамкової області іншого антитіла, того ж або іншого виду або ізотипу. "Поліспецифічне антитіло" являє собою антитіло, яке розпізнає більш ніж один епітоп в одному або декількох антигенах. Підклас цього типу антитіл являє собою "біспецифічне антитіло", яке розпізнає два різних епітопи на одному і тому ж або на різних антигенах. Вважається, що антиген-зв'язувальний білок "специфічно зв'язується" з антигеном (наприклад, з людським альфа-4-бета-7), якщо він зв'язується з антигеном і має константу дисоціації 1 наномоль або менше. У контексті даного опису, антиген-зв'язувальний білок є "специфічним для гетеродимеру", якщо він зв'язується з першим гетеродимерним інтегрином, але не зв'язується з іншими інтегринами, які мають один ланцюг, що співпадає з першим інтегрином. Наприклад, антитіло, яке є специфічним для гетеродимеру альфа-4-бета-7, буде зв'язуватися з альфа-4-бета-7 і не зв'язуватися з альфа-4-бета-1 або альфа-Е-бета-7. Відомо, що інтегрини утворюють різні конформації, в залежності від стану активації однієї або декількох клітин, що експресують їх, і від наявності або відсутності деяких іонів металів. Інтегрин в "активній" конформації зв'язується зі своїм партнерським лігандом з більшою активністю, ніж той самий інтегрин у "неактивній" конформації. Антиген-зв'язувальний білок може зв'язуватися з інтегрином тільки у своїй активній конформації, тільки у неактивній конформації або в обох, або в якій-небудь з цих конформацій. Наприклад, антигензв'язувальний білок, специфічний для гетеродимеру альфа-4-бета-7, може зв'язуватися з 2+ альфа-4-бета-7 у присутності або за відсутності двовалентного катіону марганцю (Mn ), вказуючи на те, що антиген-зв'язувальний білок зв'язується і з активним, і з неактивним альфа4-бета-7. "Антиген-зв'язувальний домен", "антиген-зв'язувальна область" або "антиген-зв'язувальний сайт" являють собою частину антиген-зв'язувального білка, яка містить амінокислотні залишки (або інші фрагменти), які взаємодіють з антигеном і визначають специфічність і афінність антиген-зв'язувального білка для даного антигену. У випадку антитіла, яке специфічно зв'язується зі своїм антигеном, він буде включати щонайменше частину щонайменше з одного свого CDR домену. "Епітоп" являє собою частину молекули, яка зв'язується з антиген-зв'язувальним білком (наприклад, антитілом). Епітоп може включати не безперервні частини молекули (наприклад, у поліпептиді це амінокислотні залишки, які не є безперервними у первинній послідовності поліпептиду, але які у контексті третинної і четвертинної структури поліпептиду практично можуть зв'язуватися з антиген-зв'язувальним білком). "Процент ідентичності" двох полінуклеотидних або двох поліпептидних послідовностей визначається у порівнянні послідовностей з використанням комп'ютерної програми GAP (частина пакету прикладних програм GCG Wisconsin Package, версія 10.3 (Accelrys, San Diego, CA)) при введенні заданих параметрів. Терміни "полінуклеотид", "олігонуклеотид" і "нуклеїнова кислота" використовуються взаємозамінно у ході всього опису і включають молекули ДНК (наприклад, кДНК або геномну ДНК), молекули РНК (наприклад, мРНК), аналоги ДНК або РНК, одержані з використанням нуклеотидних аналогів (наприклад, пептидних нуклеїнових кислот і неприродних нуклеотидних аналогів), а також їх гібриди. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюжковою або дволанцюжковою. В одному варіанті молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом включають безперервну відкриту рамку зчитування, що кодує антитіло або його фрагмент, похідне, мутеїн або варіант за даним винаходом. Дволанцюжкові полінуклеотиди розглядаються як "комплемент" один для одного, якщо їх послідовності можуть бути вирівняні в антипаралельній орієнтації так, щоб кожний нуклеотид в одному полінуклеотиді знаходився навпроти свого комплементарного нуклеотиду в іншому полінуклеотиді без введення гепів, і без порушення нуклеотидів, що є на 5'- або 3'-кінцях будьякої послідовності. Полінуклеотид вважається "комплементарним" іншому полінуклеотиду, якщо два полінуклеотиди можуть гібридизуватися один з одним в умовах помірної жорсткості. Таким чином, полінуклеотид може бути комплементарним іншому полінуклеотиду і не бути його комплементом. "Вектор" являє собою нуклеїнову кислоту, яка може використовуватися для введення у клітину іншої зв'язаної з нею нуклеїнової кислоти. Одним типом вектора є "плазміда", яка являє собою лінійну або кільцеву дволанцюжкову молекулу ДНК, всередині якої можуть бути ліговані додаткові сегменти нуклеїнової кислоти. Інший тип вектора являє собою вірусний вектор 12 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (наприклад, дефектні за реплікацією ретровіруси, аденовіруси і аденоасоційовані віруси), де додаткові сегменти ДНК можуть бути введені у вірусний геном. Деякі вектори здатні до автономної реплікації у клітині-хазяїні, всередину якої вони були введені (наприклад, бактеріальні вектори, що включають бактеріальні оріджини реплікації і епісомальні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомальні вектори ссавців) інтегруються і геном клітинихазяїна при введенні у клітину-хазяїна, і, відповідно, реплікуються разом з геномом хазяїна. "Вектор експресії" являє собою такий тип вектора, який може направляти експресію вибраного полінуклеотиду. Нуклеотидна послідовність вважається "оперативно зв'язаною" з регуляторною послідовністю, якщо регуляторна послідовність впливає на експресію (наприклад, на рівень, час або локалізацію експресії) нуклеотидної послідовності. "Регуляторна послідовність" являє собою нуклеїнову кислоту, яка впливає на експресію (наприклад, на рівень, час або локалізацію експресії) нуклеїнової кислоти, з якою вона оперативно зв'язана. Регуляторна послідовність може, наприклад, проявляти свій ефект безпосередньо на регульовану нуклеїнову кислоту через вплив на одну або декілька інших молекул (наприклад, поліпептиди, які зв'язуються з регуляторною послідовністю і/або з нуклеїновою кислотою). Приклади регуляторних послідовностей включають: промотори, енхансери та інші контрольні елементи експресії (наприклад, сигнали поліаденілювання). Інші приклади регуляторних послідовностей описані, наприклад, у роботі Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA and Baron el al, 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605 06. "Клітина-хазяїн" являє собою клітину, яка може використовуватися для експресії нуклеїнової кислоти, наприклад, нуклеїнової кислоти за даним винаходом. Клітина-хазяїн може бути прокаріотичною, наприклад, клітиною Е. coli, або це може бути еукаріотична клітина, наприклад, одноклітинного еукаріота (наприклад, дріжджів або інших грибів), вказана клітина може також бути рослинною клітиною (наприклад, клітиною рослин тютюну або томатів), клітиною тварини (наприклад, клітиною людини, клітиною мавпи, клітиною хом'яка, клітиною щура, клітиною миші або клітиною комах) або може являти собою гібридому. Приклади клітин-хазяїнів включають клітини нирки мавпи (COS-7) (ATCC CRL 1651) (див. Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), L-клітини, C127-клітини, 3T3-клітини (ATCC CCL 163), клітини яєчника хом'яка (CHO) або їх похідні, такі як Veggie CHO і споріднені клітинні лінії, які ростуть на безсироваткових середовищах (див. Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31) або CHO, штам DX-B11, дефектний за DHFR (див. Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20), HeLa-клітини, клітинні лінії BHK (ATCC CRL 10), клітинну лінію CV1/EBNA, одержану з клітинної лінії нирки зеленої африканської мавпи CV1 (ATCC CCL 70) (див. McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821), клітини ембріональної нирки людини, такі як 293, 293 EBNA або MSR 293, людські епідермальні клітини A431, людські клітини Colo205, трансформовані клітинні лінії інших приматів, нормальні диплоїдні клітини, клітинні штами, одержані з in vitro культури первинної тканини, первинних експлантів, клітини HL-60, U937, HaK або Jurkat. У типовому випадку клітина-хазяїн являє собою клітину, що культивується, яка може бути трансформована або трансфікована нуклеїновою кислотою, що кодує поліпептид, який може бути потім експресований у клітині-хазяїні. Фраза "рекомбінантна клітина-хазяїн" може використовуватися для позначення клітини-хазяїна, яка була трансформована або трансфікована нуклеїновою кислотою, що експресується. Клітина-хазяїн може також являти собою клітину, яка включає нуклеїнову кислоту, але не експресує її на бажаному рівні, якщо регуляторна послідовність не введена у клітину-хазяїна так, що вона стає оперативно зв'язаною з нуклеїновою кислотою. Потрібно розуміти, що термін "клітина-хазяїн" стосується не тільки клітини конкретного суб'єкта, але також потомства або потенційного потомства такої клітини. Оскільки деякі модифікації можуть здійснюватися у наступних поколіннях у зв'язку, наприклад, з мутацією або впливом навколишнього середовища, таке потомство фактично може бути не ідентичним вихідній клітині, проте включається у перелік термінів, що використовуються у даному описі. Антиген-зв'язувальні білки В одному аспекті даний винахід стосується антиген-зв'язувальних білків (наприклад, антитіл, фрагментів антитіл, похідних антитіл, мутеїнів антитіл і варіантів антитіл), які зв'язуються з альфа-4-бета-7, наприклад, з людським альфа-4-бета-7. Антиген-зв'язувальні білки за даним винаходом включають антиген-зв'язувальні білки, які інгібують біологічну активність альфа-4-бета-7. Приклади таких видів біологічної активності включають зв'язування альфа-4-бета-7 з MAdCAM-1 і адгезію між клітинами, що експресують альфа-4-бета-7, і клітинами, що експресують MAdCAM-1. Інші види біологічної активності включають активність in vivo, опосередковану альфа-4-бета-7, таку як транспортування і хоумінг; зокрема, альфа-4-бета-7 залучається до транспортування лімфоцитів у кишечник. 13 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Підвищена експресія MAdCAM-1 у запаленій кишці посилює рекрутмент лімфоцитів, що експресують альфа-4-бета-7, у кишку, де аберантна активація лімфоцитів посилює запальну відповідь і ушкодження тканини. Різні антиген-зв'язувальні білки можуть зв'язуватися з різними доменами або епітопами альфа-4-бета-7 або діяти у межах інших механізмів. Відповідні приклади включають, без обмеження, антиген-зв'язувальні білки, які перешкоджають здатності альфа-4-бета-7 зв'язуватися з MAdCAM-1, або які інгібують клітинні взаємодії, такі як адгезія між клітинами, що експресують альфа-4-бета-7, і клітинами, що експресують MAdCAM-1. Сайт дії може бути, наприклад, внутрішньоклітинним (наприклад, за рахунок створення перешкоди для проходження внутрішньоклітинного сигнального каскаду) або позаклітинним. Антигензв'язувальний білок необов'язково повністю інгібує альфа-4-бета-7-індуковану активність з метою його використання відповідно до даного винаходу; оскільки антиген-зв'язувальні білки, які знижують визначену активність альфа-4-бета-7, також розглядаються як придатні у цьому контексті. (Обговорення конкретних механізмів дії антиген-зв'язувальних білків, що зв'язують альфа-4-бета-7, при лікуванні визначених захворювань, є лише ілюстративним, і методи, представлені у даному описі, не є обмежувальними). Інші похідні анти-альфа-4-бета-7 антитіл за даним винаходом включають ковалентні або агреговані кон'югати анти-альфа-4-бета-7 антитіл або їх фрагментів з іншими білками або поліпептидами, такими як рекомбінантні білки злиття, що утворюються при експресії, які включають гетерологічні поліпептиди, злиті з N-кінцем або С-кінцем анти-альфа-4-бета-7 антитільного поліпептиду. Наприклад, кон'югований пептид може являти собою гетерологічний сигнальний (або лідерний) поліпептид, наприклад, лідерний поліпептид альфа-фактора дріжджів або пептид, такий як епітопна мітка. Білки злиття, що містять антиген-зв'язувальний білок, можуть включати пептиди, додані для полегшення очищення або ідентифікації антигензв'язувального білка (наприклад, полі-His). Антиген-зв'язувальний білок може бути також приєднаний до FLAG® пептиду Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:62), як описано у Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988, і патенті США No. 5011912. FLAG® пептид характеризується високою антигенністю і являє собою епітоп, що оборотно зв'язується специфічним моноклональним антитілом (мАт), що дозволяє проводити швидке тестування і полегшує очищення експресованого рекомбінантного білка. Реагенти, що використовуються для одержання білків злиття, які застосовні для об'єднання FLAG® пептиду з даним поліпептидом, комерційно доступні (Sigma-Aldrich, St. Louis MO). Олігомери, які містять один або декілька антиген-зв'язувальних білків, можуть використовуватися як антагоністи альфа-4-бета-7. Олігомери можуть бути представлені у формі ковалентно зв'язаних або нековалентно зв'язаних димерів, тримерів або олігомерів більш високого порядку. Олігомери, що включають два або більше антиген-зв'язувальних білків, розглядаються у контексті даного опису як придатні для використання, де один з прикладів включає гомодимер. Інші олігомери включають гетеродимери, гомотримери, гетеротримери, гомотетрамери, гетеротетрамери і т.п. Один з варіантів здійснення даного винаходу стосується олігомерів, що включають множину антиген-зв'язувальних білків, з'єднаних за допомогою ковалентної або нековалентної взаємодії між пептидними фрагментами, що об'єднуються з антиген-зв'язувальними білками. Такі пептиди можуть представляти пептидні лінкери (спейсери) або пептиди, які сприяють олігомеризації. У числі пептидів, які можуть сприяти олігомеризації приєднаних до них антиген-зв'язувальних білків, можуть використовуватися лейцинові зипери і деякі поліпептиди, одержані з антитіл, як це буде більш детально описано нижче. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу вказані олігомери включають від двох до чотирьох антиген-зв'язувальних білків. Вказані антиген-зв'язувальні білки олігомеру можуть бути представлені у будь-якій формі, такій як будь-яка з форм, описаних вище, наприклад, у вигляді варіантів і фрагментів. Переважно, олігомери включають антиген-зв'язувальні білки, які мають альфа-4-бета-7-зв'язувальну активність. В одному варіанті олігомер одержують з використанням поліпептидів, виділених з імуноглобулінів. Одержання білків злиття, що включають деякі гетерологічні поліпептиди, злиті з різними частинами поліпептидів, одержаних з антитіл (включаючи Fc домен), описане у літературі, наприклад, у роботах Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Bym et al., 1990, Nature 344:677; і Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11. Один варіант здійснення даного винаходу стосується димеру, що включає два білки злиття, утворених за рахунок злиття альфа-4-бета-7-зв'язувального фрагмента анти-альфа-4-бета-7 антитіла з Fc ділянкою антитіла. Вказаний димер може бути одержаний, наприклад, за рахунок 14 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вбудовування гена злиття, що кодує білок злиття у відповідний вектор експресії, що експресує білок злиття у клітинах-хазяїнах, трансформованих рекомбінантним вектором експресії, що дозволяє проводити експресію білка злиття з подальшим збиранням молекули антитіла з високим ступенем подібності, при цьому утворюються міжланцюжкові дисульфідні зв'язки між Fc фрагментами з утворенням димеру. Термін "Fc поліпептид" у контексті даного опису включає нативні і мутеїнові форми поліпептидів, одержаних з Fc ділянки антитіла. Усічені форми таких поліпептидів, що містять шарнірну ділянку, яка сприяє димеризації, також входять у галузь даного винаходу. Білки злиття, що включають Fc фрагменти (і одержані з них олігомери), характеризуються тією перевагою, що вони полегшують очищення методами афінної хроматографії на колонках з білком А або білком G. Один з придатних Fc поліпептидів, описаний у PCT заявці WO 93/10151 (яка включена у даний опис як посилання), являє собою одноланцюжковий поліпептид, що охоплює область від N-кінцевої шарнірної ділянки до нативного С-кінця Fc ділянки людського антитіла IgG1. Інший придатний для використання Fc поліпептид являє собою Fc мутеїн, описаний у патенті США No. 5457035 та у роботі Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001. Амінокислотна послідовність цього мутеїну ідентична амінокислотній послідовності нативної Fc ділянки, описаної у WO 93/10151, за винятком того, що амінокислота 19 змінена від Leu до Ala, амінокислота 20 змінена від Leu до Glu, і амінокислота 22 змінена від Gly до Ala. Вказаний мутеїн демонструє знижену афінність до Fc рецепторів. В інших варіантах здійснення даного винаходу варіабельна ділянка важкого і/або легкого ланцюгів анти-альфа-4-бета-7 антитіла може заміщати варіабельну ділянку важкого і/або легкого ланцюгів антитіла. Альтернативно, олігомер являє собою білок злиття, що включає множину антигензв'язувальних білків, які містять або не містять пептидні лінкери (спейсерні пептиди). До числа придатних пептидних лінкерів належать відповідні пептидні лінкери, описані у патентах США No. 4751180 і 4935233. Інший спосіб одержання олігомерних антиген-зв'язувальних білків включає використання лейцинового зипера. Домени лейцинового зипера являють собою пептиди, які сприяють олігомеризації білків, в яких вони містяться. Лейцинові зипери спочатку були ідентифіковані у деяких ДНК-зв'язувальних білках (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759) і з цього моменту були виявлені у множині різних білків. У число відомих лейцинових зиперів входять природні пептиди і їх похідні, які димеризуються або тримеризуються. Приклади доменів лейцинових зиперів, придатних для одержання розчинних олігомерних пептидів, описані у PCT заявці WO 94/10308, а також включають лейциновий зипер, одержаний з легеневого сурфактанту білка D (SPD), описаний у роботі Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191, яка включена у даний опис як посилання. Використання модифікованого лейциного зипера, що дозволяє досягти стабільної тримеризації гетерологічного білка, злитого з ним, описана у роботі Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. У межах однієї стратегії, рекомбінантні білки злиття, що включають фрагмент анти-альфа-4-бета-7 антитіла або його похідне, злиті/е з пептидом лейцинового зипера, експресують у придатних клітинах-хазяїнах і утворювані при цьому розчинні олігомерні фрагменти або похідні анти-альфа-4-бета-7 антитіла виділяють з культурального супернатанту. В одному аспекті даний винахід стосується антиген-зв'язувальних білків, які перешкоджають зв'язуванню альфа-4-бета-7 з MAdCAM-1. Такі антиген-зв'язувальні білки можуть бути одержані проти альфа-4-бета-7 або його фрагмента, варіанта або похідного і скриновані у межах стандартних тестів для оцінки їх здатності перешкоджати зв'язуванню альфа-4-бета-7 з MAdCAM-1. Приклади придатних тестів включають тести, які визначають здатність антигензв'язувальних білків інгібувати зв'язування MAdCAM-1 (тобто, розчинного MAdCAM-1) з клітинами, що експресують альфа-4-бета-7, або які визначають здатність антиген-зв'язувальних білків знижувати біологічну або клітинну відповідь, що виникає у результаті взаємодії MAdCAM1 і альфа-4-бета-7 (тобто, адгезію клітин, що експресують альфа-4-бета-7, з MAdCAM-1 або MAdCAM-1-експресуючими клітинами). Додаткові тести, які оцінюють антиген-зв'язувальні білки, включають такі тести, які, у кількісному або якісному варіанті, порівнюють рівень зв'язування антиген-зв'язувального білка з альфа-4-бета-7 поліпептидом, відносно рівня зв'язування відомого антиген-зв'язувального білка з альфа-4-бета-7 поліпептидом, декілька прикладів яких описано нижче. В іншому аспекті даний винахід стосується антиген-зв'язувального білка, який демонструє видову селективність. В одному варіанті вказаний антиген-зв'язувальний білок зв'язується з одним або декількома альфа-4-бета-7 ссавця, наприклад, з людським альфа-4-бета-7, і одним або декількома альфа-4-бета-7 миші, щура, морської свинки, хом'яка, піщанки, кота, кролика, 15 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 собаки, кози, вівці, корови, коня, верблюда і примату, відмінного від людини. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок зв'язується з одним або декількома альфа-4-бета-7 приматів, наприклад з людським альфа-4-бета-7 і одним або декількома з альфа-4-бета-7 яванського макака, ігрунки, макака-резус, тамарину і шимпанзе звичайного. В іншому варіанті антигензв'язувальний білок зв'язується специфічно з альфа-4-бета-7 людини, яванського макака, ігрунки, макака-резус, тамарину або шимпанзе. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок не зв'язується з одним або декількома альфа-4-бета-7 миші, щура, морської свинки, хом'яка, піщанки, кота, кролика, собаки, кози, вівці, корови, коня, верблюда і примату, відмінного від людини. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок не зв'язується з альфа-4-бета-7 мавп Нового Світу такого виду як ігрунка. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок не демонструє специфічного зв'язування з яким-небудь природним білком, відмінним від альфа-4-бета-7. В іншому варіанті антигензв'язувальний білок не демонструє специфічного зв'язування з будь-яким природним білком, відмінним від альфа-4-бета-7 ссавців. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок не демонструє специфічного зв'язування з будь-яким природним білком, відмінним від альфа-4бета-7 приматів. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок не демонструє специфічного зв'язування з будь-яким природним білком, відмінним від людського альфа-4-бета-7. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок специфічно зв'язується з альфа-4-бета-7 щонайменше одного виду примату, відмінного від людини, альфа-4-бета-7 яванського макака і альфа-4-бета7 людини. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок специфічно зв'язується з альфа-4бета-7 примату, відмінного від людини, наприклад, яванського макака, і з людським альфа-4бета-7 з близькою афінністю за зв'язуванням. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок блокує активність альфа-4-бета-7 примату, відмінного від людини, такого як яванський макак, і людського альфа-4-бета-7. В іншому варіанті вказаний антиген-зв'язувальний білок має близькі показники IC50 або EC50 застосовно до альфа-4-бета-7 з приматів, відмінних від людини, наприклад, яванського макака, і альфа-4-бета-7 людини, за результатами описаного тесту. Кожний фахівець у даній галузі може визначити селективність антиген-зв'язувального білка для альфа-4-бета-7 з використанням відомих методів і відповідно до наведених у даному описі процедур. Наприклад, можна визначити селективність з використанням методів вестернблотингу, процедур FACS, ELISA або RIA. В іншому аспекті даний винахід стосується зв'язування антиген-зв'язувального білка з альфа-4-бета-7 (наприклад, з анти-альфа-4-бета-7 антитілом), яке характеризується однією або декількома з вказаних вище характеристик: зв'язування відбувається і з людським альфа-4бета-7, і з альфа-4-бета-7 з приматів, відмінних від людини, відбувається інгібування зв'язування MAdCAM-1 з альфа-4-бета-7, інгібування адгезії клітин, що експресують альфа-4бета-7, з MAdCAM-1, інгібування адгезії клітин, що експресують альфа-4-бета-7, з клітинами, що експресують MAdCAM-1, інгібування міграції клітин, що експресують альфа-4-бета-7, до тканин, що включають клітини, що експресують MAdCAM-1, зв'язування як з активною, так і з неактивною формою альфа-4-бета-7, і викликає відносно невелику негативну регуляцію альфа4-бета-7, що експресується на клітинній поверхні. Антиген-зв'язувальні фрагменти антиген-зв'язувальних білків за даним винаходом можуть бути одержані з використанням традиційних методик. Приклади таких фрагментів включають, без обмеження, Fab- і F(ab')2-фрагменти. Фрагменти і похідні антитіл, які одержують методами генної інженерії, розглядаються у даному винаході. Додаткові варіанти включають химерні антитіла, наприклад, гуманізовані версії моноклональних антитіл з видів, відмінних від людини (наприклад, мишачі). Такі гуманізовані антитіла можуть бути одержані у межах відомих методик, і вони мають перевагу, що визначається зниженою імуногенністю при введенні антитіл людині. В одному варіанті гуманізоване моноклональне антитіло включає варіабельний домен з мишачого антитіла (або повністю, або частину його антиген-зв'язувального сайту) і константний домен, одержаний з людського антитіла. Альтернативно, варіант гуманізованого антитіла може включати антигензв'язувальний сайт мишачого моноклонального антитіла і фрагмент варіабельного домену (що не містить антиген-зв'язувальний сайт), одержаний з людського антитіла. Процедури одержання химерних моноклональних антитіл та інших моноклональних антитіл у межах генно-інженерної стратегії включають, зокрема, методи, описані у наведених нижче роботах: Riechmann et al., 1988, Nature 332:323, Liu et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439, Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7:934, і Winter el. аl., 1993, TIPS 14:139. В одному варіанті химерне антитіло являє собою антитіло з приєднаною CDR. Процедури гуманізації антитіл описані у науковій і патентній літературі, див., наприклад, заявку на патент США No. 10/194975 (опубліковану 27 16 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лютого 2003 року), патенти США No. 5869619, 5225539, 5821337, 5859205, Padlan et al., 1995, FASEB J. 9:133-39 і Tamura et al., 2000, J. Immunol. 164:1432-41. Були описані процедури одержання людських або частково людських антитіл з використанням тварин, відмінних від людини. Наприклад, були одержані миші, у яких за допомогою різних методів була досягнута інактивація одного або декількох ендогенних генів імуноглобуліну. Далі, людські гени імуноглобулінів вбудовували у мишей для заміщення інактивованих мишачих генів. При цьому антитіла, що утворюються у тварин, включали поліпептидні ланцюги людського імуноглобуліну, що кодуються генетичним матеріалом людини, який був введений в організм тварини. В одному варіанті тварину, відмінну від людини, таку як трансгенна миша, імунізували поліпептидом альфа-4-бета-7, таким чином в організмі тварини створювалися антитіла проти альфа-4-бета-7 поліпептиду. Одним прикладом придатного імуногену є розчинний людський альфа-4-бета-7, такий як поліпептид, що включає частину альфа-4-бета-7, або інший імуногенний фрагмент альфа-4-бета-7. Інший приклад придатного імуногену включає клітини, що експресують високі рівні альфа-4-бета-7, або одержані з них препарати клітинних мембран. Приклади методик, придатних для одержання і використання трансгенних тварин для продукування людських або частково людських антитіл, описані у патентах США No. 5814318, 5569825 і 5545806 та у роботах Davis et al., 2003, Production of human antibodies from transgenic mice in Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ: 191-200, Kellermann et al., 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97, Russel et al., 2000, Infect Immun. 68:182026, Gallo et al., 2000, Eur J Immun. 30:534-40, Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25, Green, 1999, J. Immunol Methods. 231:11-23, Jakobovits, 1998, Adv Drug Deliv Rev 31:33-42, Green et al., 1998, J Exp Med. 188:483-95, Jakobovits А, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14, Tsuda et al., 1997, Genomics 42:413-21, Mendez et al., 1997, Nat Genet. 15:146-56, Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63, Arbones et al., 1994, Immunity. 1:247-60, Green et al., 1994, Nat Genet. 7:13-21, Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-58, Jakobovits et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA. 90:255155. Chen, J. et al., 1993, lnt Immunol 5: 647-656, Choi et al., 1993, Nature Genetics 4: 117-23, Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol 14: 845-51, Harding et al., 1995, Ann NY Acad Sci, Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59, Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg et al., 1995, lnt Rev Immunol 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nat Biotechnol 14: 826, Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20: 6287-95, Taylor et al., 1994, lnt Immunol 6: 579-91, Tomizuka el al, 1997, Nat Gen 16: 133-43, Tomizuka et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA. 97: 722-27, Tuaillon et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA. 90: 3720-24, і Tuaillon et al., 1994, J Immunol 152: 2912-20. Ці та інші приклади обговорюються у публікації за заявкою на патент США 2007-0098715, опублікованою 3 травня 2007 року. В іншому аспекті даний винахід стосується моноклональних антитіл, які зв'язуються з альфа-4-бета-7. Моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням будь-якої методики, відомої у даній галузі, наприклад, шляхом імморталізації клітин селезінки, взятих від трансгенної тварини після проведення процедури імунізації. Клітини селезінки можуть бути імморталізовані з використанням відомої методики, наприклад шляхом злиття їх з мієломними клітинами з одержанням гібридом. Мієломні клітини, що використовуються у процедурах злиття, які проводяться з метою одержання гібридом, переважно являють собою клітини, що не продукують антитіла, мають високу ефективність зі злиття, а також характеризуються ферментативною недостатністю, що надає їм нездатність рости на визначених селективних середовищах, які підтримують зростання тільки визначених злитих клітин (гібридом). Приклади придатних клітинних ліній для проведення процедур злиття з використанням мишачих клітин включають: Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 і S194/5XX0 Bul; приклади клітинних ліній, що використовуються у процедурах злиття з використанням клітин щурів, включають: R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F і 4B210. Інші клітинні лінії, що використовуються для злиття клітин, включають U-266, GM1500GRG2, LICR-LON-HMy2 і UC729-6. В одному варіанті гібридомну клітинну лінію одержують шляхом імунізації тварини (наприклад, трансгенної тварини, яка включає послідовність людського імуноглобуліну) альфа4-бета-7 імуногеном; відбір клітин селезінки з імунізованої тварини; злиття зібраних клітин селезінки з мієломною клітинною лінією, що приводить до одержання гібридомних клітин; встановлення гібридомних клітинних ліній з гібридомних клітин та ідентифікація гібридомної клітинної лінії, яка продукує антитіло, що зв'язується з поліпептидом альфа-4-бета-7. Такі гібридомні клітинні лінії і анти-альфа-4-бета-7 моноклональні антитіла, що одержують з їх використанням, входять у галузь даного винаходу. 17 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Моноклональні антитіла, що секретуються гібридомною клітинною лінією, можуть бути очищені з використанням будь-якої відомої у даній галузі методики. Гібридоми або моноклональні антитіла можуть бути далі скриновані для ідентифікації мАт, що мають конкретні властивості, такі як здатність блокувати активність, індуковану альфа-4-бета-7. Приклади таких скринінгів наведені у вказаних нижче прикладах. Моноклональні антитіла можуть бути також одержані з використанням процесу, відомого як генетична імунізація. Наприклад, нуклеїнова кислота, що кодує цікавлячий антиген, може бути включена у вірусний вектор (такий як аденовірусний вектор). Одержаний вектор далі використовують для вироблення імунної відповіді проти антигену, що представляє інтерес, в організмі придатної тварини-хазяїна (наприклад, у діабетичних мишей без супутнього ожиріння або NOD). Цей метод описаний в основних рисах у роботі Ritter et al., Biodrugs 16(1): 3-10 (2002), яка включена у даний опис як посилання. Для виділення антитіл з підвищеною афінністю також враховувалася молекулярна еволюція ділянок, що визначають комплементарність (CDR), у центрі сайту зв'язування антитіл, наприклад, антитіл, що мають підвищену афінність до c-erbB-2, як описано Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551. Відповідно, такі методики застосовні для одержання антитіл проти альфа-4бета-7. Антиген-зв'язувальні білки проти альфа-4-бета-7 можуть використовуватися, наприклад, у тестах, що проводяться з метою детектування альфа-4-бета-7 поліпептидів або клітин, що експресують альфа-4-бета-7, як в умовах in vitro, так і in vivo. Антиген-зв'язувальні білки можуть також використовуватися при очищенні альфа-4-бета-7 білків методами імунологічної афінної хроматографії. Такі антиген-зв'язувальні білки, які додатково здатні блокувати взаємодію МAdCAM-1 і альфа-4-бета-7, можуть використовуватися для інгібування біологічної активності, що виникає внаслідок такого роду взаємодії. Блокування антиген-зв'язувальних білків може використовуватися у методах за даним винаходом. Такі антиген-зв'язувальні білки, які функціонують як антагоністи альфа-4-бета-7, можуть використовуватися при лікуванні будьякого індукованого альфа-4-бета-7 стану, що включає, без обмеження, запальні стани. В одному варіанті людське альфа-4-бета-7 моноклональне антитіло, яке одержують за процедурами, що включають імунізацію трансгенних мишей, використовується при лікуванні таких станів. Антиген-зв'язувальні білки можуть використовуватися у процедурі in vitro або можуть вводитися in vivo для інгібування біологічної активності, індукованої альфа-4-бета-7. Таким чином, вказане лікування може проводитися застосовно до розладів, що викликаються або загострюються (безпосередньо або опосередковано) альфа-4-бета-7 і його взаємодією з MAdCAM-1, приклади яких наведені у даному описі. В одному варіанті даний винахід стосується способу лікування, що включає введення in vivo ссавцю, за наявності необхідності, альфа-4бета-7-блокуючого антиген-зв'язувального білка у кількості, ефективній для зниження біологічної активності, індукованої альфа-4-бета-7. Антиген-зв'язувальні білки за даним винаходом включають частково людські і повністю людські моноклональні антитіла, які інгібують біологічну активність альфа-4-бета-7. Один варіант здійснення даного винаходу стосується людського моноклонального антитіла, яке, щонайменше частково, блокує взаємодію людського альфа-4-бета-7 з MAdCAM-1. В одному варіанті здійснення даного винаходу вказані антитіла одержують шляхом імунізації трансгенної миші альфа-4-бета-7 імуногеном. В іншому варіанті вказаний імуноген являє собою людський альфа-4-бета-7 поліпептид (наприклад, клітину, трансформовану або трансфіковану для експресії альфа-4-бета-7, або клітину, яка у природному стані експресує альфа-4-бета-7). Гібридомні клітинні лінії, одержані з таких імунізованих мишей, де гібридома секретує моноклональне антитіло, яке зв'язується з альфа-4-бета-7, також можуть використовуватися у даному винаході. Незважаючи на те, що людські, частково людські або гуманізовані антитіла є цілком придатними для багатьох варіантів застосування, особливо тих, які залучають введення антитіла людині, інші типи антиген-зв'язувальних білків також можуть бути придатні для деяких варіантів застосування. Антитіла за даним винаходом, відмінні від людських, можуть являти собою, наприклад, антитіла, одержані з антитіло-продукуючої тварини, будь-якої, такої як миша, щур, кролик, коза, осел або примат, відмінний від людини (такої, як мавпа (наприклад, яванський макак або макак-резус), або мавпа іншого виду (наприклад, шимпанзе)). Антитіла за даним винаходом, одержані з видів, відмінних від людини, можуть використовуватися, наприклад, in vitro і у форматі клітинних культур або в інших методах застосування, де імунна відповідь на антитіло за даним винаходом не відбувається, є незначною, або може бути попереджена, або не викликає заклопотаності, або має місце будь-який інший бажаний варіант. 18 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В одному варіанті антитіло за даним винаходом одержане з виду, відмінного від людини, вводять суб'єкту, відмінному від людини. В іншому варіанті антитіло з виду, відмінного від людини, не викликає імунної відповіді у суб'єкта, відмінного від людини. В іншому варіанті антитіло, відмінне від людського, взяте з того ж виду, що і суб'єкт, відмінний від людини, наприклад, мишаче антитіло за даним винаходом, вводять миші. Антитіло з тварини визначеного виду може бути одержане, наприклад, шляхом імунізації тварини вказаного виду бажаним імуногеном (наприклад, клітинами, що експресують альфа-4-бета-7, або розчинним альфа-4-бета-7 поліпептидом) або з використанням штучної системи утворення антитіл вказаного виду (наприклад, у бактеріальній системі або у системі на основі фагового дисплею для одержання антитіл конкретного виду), або шляхом перетворення антитіла з одного виду в антитіло іншого виду шляхом заміщення, наприклад, контактної області даного антитіла константною областю, взятою з іншого виду, або шляхом заміщення одного або декількох амінокислотних залишків антитіла так, щоб одержана послідовність більше відповідала послідовності антитіла з іншого виду. В одному варіанті вказане антитіло являє собою химерне антитіло, що включає амінокислотні послідовності, одержані з антитіл з двох або більше різних видів. Антиген-зв'язувальні білки можуть бути одержані з використанням будь-якої з множини відомих стандартних методик. Наприклад, вони можуть бути виділені і очищені з клітин, які у природному стані експресують їх (наприклад, антитіло може бути виділене і очищене з гібридоми, яка продукує його), або вказані антиген-зв'язувальні білки можуть бути одержані у системах рекомбінантної експресії з використанням будь-якої відомої у даній галузі методики. Див., наприклад, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: А New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); і Antibodies: А Laboratory Manual, Harlow and Land (cds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Для одержання рекомбінантних поліпептидів за даним винаходом може використовуватися будь-яка система експресії, відома у даній галузі. В основному клітини-хазяїни піддають трансформації рекомбінантним вектором експресії, який включає ДНК, що кодує бажаний поліпептид. У число клітин-хазяїнів, які можуть при цьому використовуватися, входять прокаріоти, дріжджі або вищі еукаріотичні клітини. Прокаріоти включають грам-негативні або грам-позитивні організми, наприклад, Е. coli або бацили. Вищі еукаріотичні клітини включають клітини комах і встановлені клітинні лінії ссавців. Приклади придатних клітинних ліній ссавців включають лінії клітини нирки мавпи COS-7 (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), клітинні лінії на основі таких клітин як L-клітини, 293-клітини, С127-клітини, 3T3-клітини (ATCC CCL 163), клітини яєчника китайського хом'яка (CHO), HeLa-клітини, BHK (ATCC CRL 10) і клітинну лінію CVI/EBNA, одержану з клітинної лінії нирки африканської зеленої мавпи CVI (ATCC CCL 70), як описано McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821. Придатні вектори клонування і експресії, що використовуються у поєднанні з бактеріальними, грибними, дріжджовими клітинами-хазяїнами і клітинами-хазяїнами ссавців, описані у роботі Pouwels et al. (Cloning Vectors: А Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985). Трансформовані клітини можуть культивуватися в умовах, які сприяють експресії поліпептиду. Поліпептид відновлюють з використанням стандартних процедур очищення білка. Одна така процедура очищення включає проведення афінної хроматографії, наприклад, з використанням матриці, що містить приєднаний до неї альфа-4-бета-7, повністю або частину (наприклад, позаклітинний домен). Поліпептиди, які можуть використовуватися у даному варіанті здійснення даного винаходу, включають практично гомогенні рекомбінантні поліпептиди альфа-4-бета-7 антитіла ссавців, які по суті не містять контамінуючого ендогенного матеріалу. Амінокислотна послідовність одержаних поліпептидів може бути підтверджена з використанням відомих у даній галузі процедур і може бути ідентична послідовностям, описаним у списку послідовностей, доданому до даного опису, або може відрізнятися від цих послідовностей за одним або декількома амінокислотними залишками, у результаті процесингу. Наприклад, у вказаних по суті гомогенних поліпептидах, повнорозмірних або на їх частині, Скінцева амінокислота з легкого або важкого ланцюга (або відповідної одноланцюжкової молекули) може бути видалена за допомогою протеолітичного розщеплення або іншої обробки, що проводиться у процесі культивування, наприклад, шляхом процесингу С-кінцевих Lys залишків. Альтернативно, видаляють більш ніж один С-кінцевий амінокислотний залишок, наприклад, дві С-кінцевих амінокислоти, або три, або чотири, або п'ять С-кінцевих амінокислот. Зокрема, було описане усікання С-кінця до утворення амідованого проліну у важкому ланцюгу антитіла, що розглядається. Аналогічно, N-кінцеві амінокислоти можуть бути відсутніми, наприклад, можуть бути відсутніми одна, дві, три, чотири або п'ять N-кінцевих амінокислот. 19 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Альтернативно або додатково амінокислотні залишки можуть піддаватися посттрансляційним модифікаціям, наприклад, без обмеження, глутамін (зокрема, глутамін на N-кінці) може бути циклізований або перетворений у піроглутамінову кислоту; додатково або альтернативно, амінокислоти можуть піддаватися дезамідуванню, ізомеризації, глікуванню і/або окисненню. Поліпептиди за даним винаходом можуть піддаватися додатковим посттрансляційним модифікаціям, включаючи глікозилування, наприклад, N-зв'язане або О-зв'язане глікозилування, по сайтах, відомих у даній галузі. Як було описано раніше, вказані перетворення можуть бути введені в амінокислотну послідовність поліпептиду для попередження або мінімізації таких змін, або для полегшення їх у тих випадках, коли такий процесинг є сприятливим. Препарати по суті гомогенних поліпептидів можуть включати приблизно 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або 99 % поліпептиду, який має, у результаті проведеного процесингу, визначену форму (або декілька форм). Препарати по суті гомогенних поліпептидів можуть включати декілька (менше або дорівнює 50 %), багато (більш ніж 50 %, але менш ніж 90 %) або по суті максимальну кількість (більш ніж 90 %) однієї або декількох конкретних форм процесованого поліпептиду. Крім того, такі препарати можуть включати поліпептиди, які характеризуються варіюючими рівнями наявності іншого, більш ніж одного типу модифікацій, пов'язаних з процесингом, наприклад, поліпептид може характеризуватися наявністю декількох, переважно або по суті повністю видалених С-кінцевих лізинів (наприклад, С-кінцевого лізину у SEQ ID NO: 72) і перетворенням декількох, переважно або по суті всіх N-кінцевих амінокислот у піроглутамінову кислоту (наприклад, будь-який поліпептид, наведений у таблиці 1 і/або 2, або у списку консенсусних послідовностей). Антиген-зв'язувальні білки можуть бути одержані і скриновані на наявність бажаних властивостей, за будь-якою з множини відомих методик. Деякі такі методики включають виділення нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептидний ланцюг (або його частину) в антигензв'язувальному білку, що представляє інтерес (наприклад, в анти-альфа-4-бета-7 антитілі), і маніпулювання нуклеїновою кислотою у межах технології рекомбінантних ДНК. Нуклеїнова кислота може бути злита з іншою нуклеїновою кислотою, що представляє інтерес, або може бути змінена (наприклад, шляхом мутагенезу або інших традиційних процедур) з метою, наприклад, додання, делеції або заміщення одного або декількох амінокислотних залишків. В іншому аспекті даний винахід стосується антиген-зв'язувальних фрагментів анти-альфа-4бета-7 антитіла за даним винаходом. Такі фрагменти можуть складатися повністю з послідовностей, одержаних з антитіла, або можуть включати додаткові послідовності. Приклади антиген-зв'язувальних фрагментів включають Fab, F(ab')2, одноланцюжкові антитіла, діатіла, триатіла, тетратіла і домени антитіл. Інші приклади описані у роботі Lunde et al., 2002, Hiochem. Soc. Trans. 30:500-06. Одноланцюжкові антитіла можуть бути одержані при з'єднанні фрагментів варіабельного домену важкого і легкого ланцюгів (Fv ділянка) через амінокислотний місток (короткий пептидний лінкер) з утворенням одноланцюжкового поліпептидного ланцюга. Такі одноланцюжкові Fv (scFv) були одержані при злитті ДНК, що кодує пептидний лінкер, з використанням ділянок між ДНК, що кодують два поліпептиди варіабельних доменів (V L і VH). Одержані поліпептиди можуть знову формувати складчасту структуру один з одним з утворенням антиген-зв'язувальних мономерів або при цьому можуть створюватися мультимери (наприклад, димери, тримери або тетрамери), в залежності від довжини гнучкого лінкера між двома варіабельними доменами (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). При об'єднанні різних поліпептидів, що містять VL і VH, можна створити мультимерні scFv, які зв'язуються з різними епітопами (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Способи одержання одноланцюжкових антитіл включають такі методи, які описані у патенті США No. 4946778; та у роботах Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87. Антиген-зв'язувальні білки (наприклад, антитіла, фрагменти антитіл і похідні антитіл) за даним винаходом можуть включати будь-яку константну область, відому у даній галузі. Константна область легкого ланцюга може являти собою, наприклад, константну область легкого ланцюга каппа- або лямбда-типу, наприклад, константну область каппа- або лямбдатипу легкого ланцюга людини. Константна область важкого ланцюга може являти собою, наприклад, константні області важкого ланцюга альфа-, дельта-, епсилон-, гамма- або мю-типу, наприклад, константні області альфа-, дельта-, епсилон-, гамма- або мю-типу важкого ланцюга 20 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекули людини. В одному варіанті константна область легкого або важкого ланцюга являє собою фрагмент, похідне, варіант або мутеїн природної константної області. Відомі методики одержання антитіла визначеного підкласу або ізотипу на основі антитіла, що представляє інтерес, тобто способи переключення підкласу. Так, IgG антитіла можуть бути одержані, наприклад, з IgM антитіла і навпаки. Такі методики дозволяють одержувати нові антитіла, які мають антиген-зв'язувальні властивості для даного антитіла (початкового антитіла), але які також демонструють біологічні властивості, асоційовані з антитілом іншого ізотипу або підкласу, відмінного від батьківського антитіла. Можуть також використовуватися технології рекомбінантних ДНК. У таких процедурах може використовуватися клонована ДНК, що кодує визначені поліпептиди антитіл, наприклад, ДНК, що кодує константний домен антитіла бажаного ізотипу. Див. також, Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol.178:303-16. Крім того, якщо бажано одержати IgG4, може бути зручно ввести точкову мутацію (CPSCP → CPPCP) у шарнірну ділянку (як описано у роботі Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407, яка включена у даний опис як посилання), для зниження тенденції до утворення всередині-Н-ланцюжкових дисульфідних містків, які можуть здійснювати внесок у гетерогенність утворюваних IgG4антитіл. Крім того, відомі також методики одержання антиген-зв'язувальних білків з різними властивостями (тобто, з варіюючою афінністю для антигену, з яким вони зв'язуються). Одна така методика, відома як перебудова ланцюга, включає проявлення генних репертуарів для варіабельного домену імуноглобуліну на поверхні ниткоподібного бактеріофагу, що часто називають фаговим дисплеєм. Перебудова ланцюга використовувалася для одержання високоафінних антитіл для гаптен-2-фенілоксазол-5-ону, як описано у роботі Marks et al., 1992, BioTechnology, 10:779. В іншому варіанті даний винахід стосується антиген-зв'язувального білка, який характеризується низькою константою дисоціації з альфа-4-бета-7. В одному варіанті вказаний антиген-зв'язувальний білок має значення Kd, що дорівнює 100 пМ або менше. В іншому варіанті значення Kd становить 10 пМ або менше; в іншому варіанті воно становить 5 пМ або менше, або воно становить 1 пМ або менше. В іншому варіанті значення Kd по суті таке ж, як і у антитіла, описаного у наведених прикладах. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок зв'язується з альфа-4-бета-7 по суті з тим же значенням Kd, що і антитіло, наведене у прикладах. В іншому аспекті даний винахід стосується антиген-зв'язувального білка, який інгібує активність альфа-4-бета-7, наприклад, зв'язування (або адгезію) з MAdCAM-1, зв'язування зклітинами, що експресують MAdCAM-1, або адгезію між клітинами, що експресують альфа-4бета-7, і клітинами, що експресують MAdCAM-1. В одному варіанті антиген-зв'язувальний білок має значення IC50, що дорівнює 100 пМ або менше. В іншому варіанті значення IC 50 становить 500 пМ або менше. В іншому варіанті значення IC50 становить 100 пМ або менше; в іншому варіанті значення IC50 по суті таке ж, як і у антитіла, наведеного у прикладах. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок інгібує активність альфа-4-бета-7 по суті з тим самим значенням IC50, що і антитіло, описане у наведених у даному тексті прикладах. В одному варіанті антиген-зв'язувальні білки за даним винаходом мають уявну афінність для альфа-4-бета-7 (або клітин, що експресують альфа-4-бета-7) на рівні 1000 пМ або нижче. В іншому варіанті антиген-зв'язувальні білки демонструють уявну афінність, що дорівнює 500 пМ або менше, 200 пМ або менше, 100 пМ або менше, 80 пМ або менше, 40 пМ або менше, або 15 пМ або менше. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок демонструє уявну афінність, яка по суті дорівнює такій для антитіла, наведеного у прикладах. В іншому варіанті антигензв'язувальний білок демонструє уявну афінність, яка по суті дорівнює такій для антитіла, наведеного у прикладах. В іншому аспекті даний винахід стосується антиген-зв'язувального білка, який зв'язується і з активною, і з неактивною формами альфа-4-бета-7. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок зв'язується тільки з однією формою або переважно зв'язується тільки з однією формою альфа-4-бета-7. Наприклад, антиген-зв'язувальний білок може зв'язуватися з альфа-4-бета-7 у 2+ присутності або за відсутності Mn (тобто, він зв'язується і з активною, і з неактивною формами). Альтернативно, антиген-зв'язувальний білок може зв'язуватися з альфа-4-бета-7 2+ 2+ тільки у присутності Mn , або тільки за відсутності Mn , або він може зв'язуватися з більш високою афінністю в одному з таких варіантів, ніж в іншому, вказуючи на переважне зв'язування з конкретною формою альфа-4-бета-7. В іншому варіанті даний винахід стосується антиген-зв'язувального білка, який конкурує за зв'язування альфа-4-бета-7 з антитілом за даним винаходом. Така конкурентна здатність може визначатися за відомими у даній галузі методами, наприклад, при оцінці конкурентного 21 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язування з альфа-4-бета-7-експресуючими клітинами, за результатами FACS-аналізу, сортування активованих флуоресценцією клітин, або з використанням інших аналогічних методів конкурентного аналізу, таких як тест на адгезію (тобто, адгезію між клітинами, що експресують альфа-4-бета-7, і клітинами, що експресують MAdCAM-1), або за результатами іншого конкурентного тесту, описаного у даній заявці. В іншому аспекті антиген-зв'язувальний білок, який конкурує за зв'язування альфа-4-бета-7 з антитілом за даним описом, зв'язується з тим самим епітопом або відбувається перекриття епітопів (або вони розташовані поряд), відносно епітопів у даному антитілі. В іншому аспекті антиген-зв'язувальний білок, який конкурує за зв'язування альфа-4-бета-7 з антитілом за даним винаходом, інгібує активність альфа-4бета-7. В іншому аспекті даний винахід стосується антиген-зв'язувального білка, який зв'язується з людським альфа-4-бета-7, експресованим на поверхні клітини, і який при зв'язуванні інгібує взаємодію альфа-4-бета-7 з MAdCAM-1, не знижуючи у значній мірі кількості альфа-4-бета-7 на поверхні клітини. Для цього може використовуватися будь-який спосіб визначення або оцінки кількості альфа-4-бета-7 на поверхні і/або всередині клітини. В одному варіанті даний винахід стосується антиген-зв'язувального білка, який зв'язується з альфа-4-бета-7, експресованим на поверхні клітини, і який при зв'язуванні інгібує взаємодію альфа-4-бета-7 з MAdCAM-1, не викликаючи значного підвищення рівня інтерналізації альфа-4-бета-7 з поверхні клітини. В інших варіантах зв'язування антиген-зв'язувального білка з клітинами, що експресують альфа-4бета-7, викликає менш ніж 75 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 1 % або 0,1 % інтерналізацію альфа-4-бета-7 з клітинної поверхні. В іншому аспекті даний винахід стосується антиген-зв'язувального білка, що характеризується періодом напіввиведення, що дорівнює щонайменше одному дню in vitro або in vivo (наприклад, при введенні людині). В одному варіанті антиген-зв'язувальний білок характеризується періодом напіввиведення, що дорівнює щонайменше трьом дням. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок характеризується періодом напіввиведення, що дорівнює чотирьом дням або більше. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок характеризується періодом напіввиведення, що дорівнює восьми дням або більше. В іншому варіанті антигензв'язувальний білок піддають дериватизації або модифікації, таким чином він має більш тривалий період напіввиведення, у порівнянні з недериватизованим або немодифікованим антиген-зв'язувальним білком. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок містить одну або декілька точкових мутацій для підвищення періоду напіввиведення з сироватки крові, як описано у WO 00/09560, опублікованому 24 лютого 2000 року, який включений у даний опис як посилання. Даний винахід також стосується поліспецифічних антиген-зв'язувальних білків, наприклад, біспецифічного антиген-зв'язувального білка, наприклад, антиген-зв'язувального білка, який зв'язується з двома різними епітопами альфа-4-бета-7 або з епітопом альфа-4-бета-7 і епітопом іншої молекули, через два різних антиген-зв'язувальних сайти або ділянки. Крім того, специфічний антиген-зв'язувальний білок за даним описом може включати сайт зв'язування з альфа-4-бета-7 з одного з описаних у даній роботі антитіл і другу ділянку зв'язування з альфа-4бета-7 з інших описаних антитіл, включаючи ті, які були описані з посиланням на інші публікації. Альтернативно, біспецифічний антиген-зв'язувальний білок може включати антигензв'язувальний сайт з одного з описаних тут антитіл, другий антиген-зв'язувальний сайт - з іншого альфа-4-бета-7 антитіла, відомого у даній галузі, або з антитіла, яке було одержане за відомими методами або відповідно до наведених у даному описі методів. Різні способи одержання біспецифічних антитіл відомі у даній галузі і обговорюються у заявці на патент США 09/839632, зареєстрованій 20 квітня 2001 року (включена у даний опис як посилання). Такі методи включають використання гібридом, описаних Milstein et al., 1983, Nature 305:537, та інших (у патенті США 4474893, у патенті США 6106833), а також хімічне зв'язування фрагментів антитіл (Brennan et al., 1985, Science 229:81; Glennie et al., 1987, J. Immunol. 139:2367; патент США 6010902). Крім того, біспецифічні антитіла можуть бути одержані у межах рекомбінантної стратегії, наприклад, при використанні фрагментів лейцинового зипера (тобто, з Fos і Jun білків, які переважно формують гетеродимери; Kostelny et al., 1992, J. Immnol. 148:1547) або інших lock і key інтерактивних доменних структур, описаних у патенті США 5582996. Додаткові, застосовувані для досягнення вказаної мети підходи включають методи, описані Kortt et al., 1997, supra; у патентах США No. 5959083 і 5807706. В іншому аспекті антиген-зв'язувальний білок за даним винаходом включає похідне антитіла. Дериватизоване антитіло може включати будь-яку молекулу або речовину, яка надає бажані властивості антитілу, що розглядається, такі як підвищений період напіввиведення у конкретному варіанті використання. Дериватизоване антитіло може включати, наприклад, такий, 22 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що детектується (або використовується як мітка) фрагмент (наприклад, радіоактивну, колориметричну, антигенну або ензиматичну молекулу), кульку, що детектується (таку як магнітна або електронно-щільна (наприклад, золота) кулька), або молекулу, яка зв'язується з іншою молекулою (наприклад, біотин або стрептавідин), терапевтичні або діагностичні фрагменти (наприклад, радіоактивний, цитотоксичний або фармацевтично активний фрагмент), або молекули, які підвищують придатність антитіла для конкретного варіанту використання (наприклад, для введення суб'єкту, такому як людина, або іншому суб'єкту у варіантах використання in vivo або in vitro). Приклади молекул, які можуть використовуватися для дериватизації антитіла, включають альбумін (наприклад, людський сироватковий альбумін) і поліетиленгліколь (ПЕГ). Зв'язані з альбуміном і ПЕГільовані похідні можуть бути одержані з використанням методики, відомої у даній галузі. В одному варіанті вказане антитіло кон'югують або іншим чином зв'язують з транстиретином (TTR) або з варіантом TTR. TTR або варіант TTR може бути хімічно модифікований, наприклад, хімічною речовиною, вибраною з групи, що складається з декстрану, полі(н-вінілпіролідону), поліетиленгліколів, пропіленгліколевих гомополімерів, співполімерів поліпропіленоксиду/етиленоксиду, поліоксіетилованих поліолів і полівінілових спиртів. Див. заявку на патент США No 20030195154. В іншому аспекті даний винахід стосується способів скринінгу молекули, яка зв'язується з альфа-4-бета-7, з використанням антиген-зв'язувальних білків за даним винаходом. У зв'язку з цим може використовуватися будь-яка придатна методика скринінгу. В одному варіанті молекулу альфа-4-бета-7 або її фрагмент, з яким зв'язується антиген-зв'язувальний білок за даним винаходом, приводять у контакт з антиген-зв'язувальним білком за даним винаходом та іншою молекулою, де інша молекула зв'язується з альфа-4-бета-7, якщо вона знижує зв'язування антиген-зв'язувального білка з альфа-4-бета-7. Зв'язування антиген-зв'язувального білка може бути виявлене з використанням будь-якого придатного методу, наприклад ELISA. Детектування зв'язування антиген-зв'язувального білка з альфа-4-бета-7 може бути спрощене при введенні мітки, що детектується, в антиген-зв'язувальний білок, як було описано вище. В іншому варіанті альфа-4-бета-7-зв'язувальну молекулу далі аналізували для визначення, чи інгібує вона активацію і/або сигнальну функцію альфа-4-бета-7. Нуклеїнові кислоти В одному аспекті даний винахід стосується виділеної молекули нуклеїнової кислоти. Нуклеїнові кислоти включають, наприклад, полінуклеотиди, які кодують повнорозмірний антиген-зв'язувальний білок або його частину, наприклад, одного або обох ланцюгів антитіла за даним винаходом або їх фрагмент, похідне, мутеїн або варіант, полінуклеотиди, достатні для використання як зонди для гібридизації, ПЛР-праймерів або праймерів для секвенування з метою ідентифікації, аналізу, мутування або ампліфікації полінуклеотиду, що кодує поліпептид, антисмислові нуклеїнові кислоти для інгібування експресії полінуклеотиду і комплементарні послідовності вказаних вище форм. Нуклеїнові кислоти можуть мати будь-яку довжину. Вони можуть включати, наприклад, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1500, 3000, 5000 або більше нуклеотидів у довжину і/або можуть включати одну або декілька додаткових послідовностей, наприклад, регуляторних послідовностей, і/або можуть являти собою частину більш великої нуклеїнової кислоти, наприклад, вектора. Нуклеїнові кислоти можуть бути одноланцюжковими і дволанцюжковими і можуть включати нуклеотиди РНК і/або ДНК і їх штучні варіанти (наприклад, пептидні нуклеїнові кислоти). Нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди антитіл (наприклад, важкий або легкий ланцюг, тільки варіабельний домен або молекулу повнорозмірної довжини), можуть бути виділені з Вклітин мишей, які були імунізовані альфа-4-бета-7. Нуклеїнова кислота може бути виділена при використанні традиційних методик, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Даний винахід також стосується нуклеїнових кислот, які гібридизуються з іншими нуклеїновими кислотами у конкретних умовах гібридизації. Способи гібридизації нуклеїнових кислот добре відомі у даній галузі. Див., наприклад, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Як тут описано, умови гібридизації у варіанті помірної жорсткості включають використання розчину для попереднього промивання, що містить 5X хлорид натрію/цитрат натрію (SSC), 0,5 % ДСН, 1,0 мМ ЕДТА (pH 8,0), буфер для гібридизації, що включає приблизно 50 % формаміду, 6X SSC, і температура гібридизації становить 55 °C (або використовуються інші придатні розчини для гібридизації, такі як розчини, що містять приблизно 50 % формаміду, при температурі гібридизації 42 °C), з використанням умов промивання, що включають температуру 60 °C, в 0,5 X SSC, 0,1 % ДСН. Умови жорсткої гібридизації включають проведення гібридизації в 6X SSC при температурі 45 °C, з проведенням згодом одного або декількох промивань в 0,1X SSC, 0,2 % ДСН при температурі 23 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 68 °C. Крім того, будь-який фахівець у даній галузі може маніпулювати умовами гібридизації і/або промивання для підвищення або для зниження жорсткості умов гібридизації так, щоб нуклеїнові кислоти, що включають нуклеотидні послідовності, які щонайменше на 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 або 99 % ідентичні кожній іншій послідовності, звичайно, у типовому випадку гібридизувалися одна з одною. Основні параметри, що впливають на вибір умови гібридизації, і рекомендації стосовно вибору придатних умов, описані, наприклад, у керівництві Sambrook, Fritsch, and Maniatis (1989, Molecular Cloning: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11; і Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4), і можуть бути легко визначені фахівцями у даній галузі на основі, наприклад, довжини і/або складу основ ДНК. Зміни у нуклеїнову кислоту можуть бути введені за допомогою мутації, що приводить до змін в амінокислотній послідовності поліпептиду (наприклад, в антиген-зв'язувальному білку), який вона кодує. Мутації можуть бути введені з використанням будь-якої відомої у даній галузі процедури. В одному варіанті один або декілька конкретних амінокислотних залишків змінюють з використанням, наприклад, протоколу сайт-направленого мутагенезу. В іншому варіанті один або декілька випадково вибраних залишків змінюють з використанням, наприклад, протоколу випадкового мутагенезу. І як тільки вказана процедура буде завершена, досягається експресія мутантного поліпептиду і проводиться його скринінг на бажані властивості (наприклад, на зв'язування з альфа-4-бета-7 або на блокування зв'язування альфа-4-бета-7 з адресином, таким як MAdCAM). Мутації можуть бути введені у нуклеїнову кислоту без істотної зміни біологічної активності поліпептиду, який вона кодує. Наприклад, можуть бути здійснені нуклеотидні заміщення, які приводять до заміщень у складі амінокислот по неістотних амінокислотних залишках. В одному варіанті нуклеотидну послідовність або її бажаний фрагмент, варіант або похідне мутують таким чином, щоб вона кодувала амінокислотну послідовність, що включає одну або декілька делецій, або одне або декілька заміщень амінокислотних залишків. В іншому варіанті мутагенез приводить до вбудовування амінокислот поряд з одним або декількома амінокислотними залишками. Альтернативно, у нуклеїнову кислоту можуть бути введені одна або декілька мутацій, що приводить до селективної зміни біологічної активності (наприклад, зв'язування з альфа-4-бета-7, інгібування зв'язування альфа-4-бета-7 з адресином, таким як MAdCAM, і т.п.) поліпептиду, який вона кодує. Наприклад, мутація може, у кількісному або якісному варіанті, змінювати біологічну активність. Приклади кількісних змін включають підвищення, зниження або усунення активності. Приклади якісних змін включають зміну антигенної специфічності антигензв'язувального білка. В іншому аспекті даний винахід стосується молекул нуклеїнової кислоти, які придатні для використання як праймери або зонди для гібридизації з метою детектування послідовностей нуклеїнових кислот за даним винаходом. Молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом може включати тільки частину послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує повнорозмірний поліпептид за даним винаходом, наприклад, фрагмент, який може використовуватися як зонд або праймер, або фрагмент, що кодує активну частину (наприклад, альфа-4-бета-7зв'язувальну частину) поліпептиду за даним винаходом. Зонди, що базуються на послідовності нуклеїнової кислоти за даним винаходом, можуть використовуватися для детектування нуклеїнової кислоти або споріднених форм нуклеїнових кислот, наприклад, транскриптів, що кодують поліпептид за даним винаходом. Вказані зонди можуть включати мічену групу, наприклад, радіоактивний ізотоп, флуоресцентну сполуку, фермент або кофактор ферменту. Такі зонди можуть використовуватися для ідентифікації клітини, яка експресує поліпептид. В іншому аспекті даний винахід стосується векторів, що включають нуклеїнову кислоту, яка кодує поліпептид за даним винаходом або його частину. Приклади векторів включають, без обмеження, плазміди, вірусні вектори, неепісомальні вектори ссавців і вектори експресії, наприклад, рекомбінантні вектори експресії. Рекомбінантні вектори експресії за даним винаходом можуть включати нуклеїнову кислоту за даним винаходом у формі, придатній для експресії нуклеїнової кислоти у клітині-хазяїні. Рекомбінантні вектори експресії включають одну або декілька регуляторних послідовностей, вибраних з врахуванням клітин-хазяїнів, що використовуються для експресії, які оперативно зв'язані з послідовністю, що експресується, нуклеїнової кислоти. Регуляторні послідовності включають такі послідовності, які направляють конститутивну експресію нуклеотидної послідовності у клітинах-хазяїнах багатьох типів (наприклад, енхансер раннього гена SV40, промотор вірусу саркоми Рауса і промотор цитомегаловірусу), а також такі послідовності, які направляють експресію нуклеотидної послідовності тільки у визначених клітинах-хазяїнах 24 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (наприклад, тканиноспецифічні регуляторні послідовності, див. Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237, де вказані роботи включені у даний опис повністю як посилання), і послідовності, які направляють індуцибельну експресію нуклеотидної послідовності у відповідь на визначене лікування або стан (наприклад, промотор металотіонеїну у клітинах ссавців і tet-чутливий і/або стрептоміцин-чутливий промотор у системах прокаріотів і еукаріотів (див. id.)). Для фахівців у даній галузі очевидно, що розробка вектора експресії залежить від таких факторів як вибір клітини-хазяїна, яка підлягає трансформації, рівень експресії бажаного білка і т.п. Вектори експресії за даним винаходом можуть вводитися у клітини-хазяїни для створення білків або пептидів, включаючи білки або пептиди злиття, що кодуються нуклеїновими кислотами, наведеними у даному описі. В іншому аспекті даний винахід стосується клітин-хазяїнів, в які був введений рекомбінантний вектор експресії за даним винаходом. Клітина-хазяїн може являти собою будьяку прокаріотичну клітину (наприклад, Е. coli) або еукаріотичну клітину (наприклад, клітини дріжджів, комах або ссавців (наприклад, СНО-клітини)). Векторна ДНК може бути введена у прокаріотичні або еукаріотичні клітини з використанням стандартних методів трансформації або трансфекції. Застосовно до стабільної трансфекції клітин ссавців відомо, що, в залежності від використовуваного вектора експресії і використовуваного методу трансфекції, лише невелика частина клітин може інтегрувати чужорідну ДНК у свій геном. Для ідентифікації і вибору таких інтегрованих варіантів, в основному, у клітини-хазяїни разом з цікавлячим геном вводиться ген, який кодує маркер, що селектується (наприклад, резистентність до антибіотика). Переважні маркери, що селектуються, включають такі маркери, які надають стійкість до лікарських засобів, таких як G418, гігроміцин і метотрексат. Клітини, стабільно трансфіковані введеною нуклеїновою кислотою, можуть бути ідентифіковані при проведенні селекції на лікарському засобі (наприклад, клітини, які включили маркерний ген, що селектується, будуть виживати, тоді як інші клітини загинуть), в числі інших використовуваних методів. Показання В одному аспекті даний винахід стосується способів лікування суб'єкта. Вказаний спосіб може, наприклад, здійснювати загалом цілющий ефект на суб'єкта, наприклад, він може приводити до підвищення очікуваної тривалості життя у суб'єкта. Альтернативно, даний спосіб може являти собою, наприклад, лікування, профілактику, виліковування, полегшення або ослаблення ("лікування") захворювання, розладу, стану або хвороб ("стану"). Серед станів, що підлягають лікуванню за даним винаходом, розглядаються стани, що характеризуються невідповідною експресією або активністю альфа-4-бета-7. Такі стани включають стани, які асоційовані з невідповідною міграцією клітин, наприклад, міграцією лейкоцитів (таких як лімфоцити або моноцити) у шлунково-кишковий тракт або інші тканини, що включають клітини, які експресують MAdCAM-1 (у результаті зв'язування лейкоцитів з клітинами, які експресують MAdCAM-1). Захворювання, які у цьому випадку можуть лікуватися, включають запальні хвороби кишечнику, такі як виразковий коліт, хвороба Крона, хвороба глютенової недостатності (нетропічна спру), ентеропатію, асоційовану з серонегативною артропатією, мікроскопічний і колагенозний коліт, еозинофільний гастроентерит або синдром запалення резервуара, що виникає у результаті проктоколоектомії та ілеоанального анастомозу. Додаткові стани, які можуть піддаватися лікуванню відповідно до даного винаходу, включають панкреатит, інсулінзалежний цукровий діабет, мастит, холецистит, холангіт, перихолангіт, хронічний бронхіт, хронічний синусит, астму і хворобу "трансплантат проти хазяїна". Способи лікування і введення антиген-зв'язувальних білків Деякі способи, наведені у даному описі, включають введення суб'єкту антигензв'язувального білка, специфічного для гетеродимеру альфа-4-бета-7, що приводить до зниження альфа-4-бета-7-індукованої біологічної відповіді, яка грає визначену роль у розвитку конкретного стану. У деяких варіантах способи за даним винаходом включають контактування ендогенного альфа-4-бета-7 з антиген-зв'язувальним білком, що взаємодіє з альфа-4-бета-7, наприклад, шляхом його введення суб'єкту або при здійсненні процедури ex vivo. Термін "лікування" означає ослаблення або попередження щонайменше одного симптому або іншого аспекту розладу або зниження тяжкості захворювання і т.п. Антиген-зв'язувальний білок необов'язково повинен здійснювати повне виліковування або усунення будь-якого симптому або прояву захворювання для того, щоб він розглядався як життєздатний терапевтичний агент. Як відомо у даній галузі, препарати, що використовуються як терапевтичні засоби, можуть знижувати тяжкість стану при даному захворюванні, але необов'язково повинні усувати будь-який прояв захворювання, щоб їх розглядали як корисні терапевтичні засоби. Аналогічно, лікування, що проводиться у профілактичному режимі, необов'язково повністю буде ефективне у плані профілактики виникнення стану, щоб його можна було вважати життєздатним 25 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 профілактичним агентом. Просто ослаблення прояву захворювання (наприклад, за рахунок зниження кількості симптомів або їх тяжкості, або шляхом підвищення ефективності іншого лікування, або шляхом створення іншого сприятливого ефекту) або зниження ймовірності того, що захворювання виникне або погіршиться стан суб'єкта, будуть достатніми основами. Один варіант здійснення даного винаходу стосується способу, що включає введення пацієнту антагоніста альфа-4-бета-7 у кількості і протягом періоду часу, які будуть достатніми для індукції тривалого поліпшення стану за вибраним індикатором, який характеризує тяжкість конкретного розладу, відносно його базового рівня. Відповідно до відомого у даній галузі підходу, фармацевтичні композиції, що включають молекули за даним винаходом, можуть вводитися суб'єкту у режимі, придатному для даного показання. Фармацевтичні композиції можуть вводитися у придатному режимі, що включає, без обмеження, парентеральне введення, місцеве введення або введення шляхом інгаляції. У випадку ін'єкції фармацевтичні композиції можуть вводитися, наприклад, внутрішньосуглобовим, внутрішньовенним, внутрішньом'язовим способом, всередину ураження, внутрішньочеревинно або підшкірно, шляхом ін'єкції болюсом або шляхом безперервної інфузії. Локалізоване введення, наприклад, в уражений захворюванням сайт або в ушкоджену зону, також розглядається у даному винаході, як і трансдермальна доставка, і тривале вивільнення з імплантату. Доставка шляхом інгаляції включає назальну або пероральну інгаляцію, використання небулайзера, інгаляцію антагоністом в аерозольній формі і т.п. Інші альтернативи включають очні краплі, пероральні препарати, що включають пілюлі, сиропи, льодяники або жувальні таблетки, і препарати для місцевого введення, такі як лосьйони, гелі, спреї і мазі. У даному винаході розглядаються також процедури застосування антиген-зв'язувальних білків ex vivo. Наприклад, кров або інша рідина з організму пацієнта може бути приведена у контакт ex vivo з антиген-зв'язувальним білком, який зв'язується з альфа-4-бета-7. Антигензв'язувальний білок може бути зв'язаний з придатною нерозчинною матрицею або твердим матеріалом основи. В одному з придатних варіантів антиген-зв'язувальні білки вводяться у формі композиції, яка включає один або декілька додаткових компонентів, таких як фізіологічно прийнятний носій, ексципієнт або розріджувач. Необов'язково, вказана композиція додатково включає один або декілька фізіологічно активних засобів, наприклад, другу речовину, що інгібує запалення або імунітет, анти-ангіогенну речовину, анальгетик і т.п., необмежувальні приклади яких наведені у даному описі. У різних конкретних варіантах здійснення даного винаходу вказана композиція включає один, два, три, чотири, п'ять або шість фізіологічно активних засобів, на додаток до альфа-4-бета-7-зв'язувального антиген-зв'язувального білка. В одному варіанті вказана фармацевтична композиція включає антиген-зв'язувальний білок за даним винаходом у поєднанні з однією або декількома речовинами, вибраними з групи, що складається з буфера, антиоксиданту, такого як аскорбінова кислота, низькомолекулярного поліпептиду (наприклад такого, що містить менше 10 амінокислот), білка, амінокислоти, вуглеводу, такого як глюкоза, сахароза або декстрини, хелатуючого агента, такого як ЕДТА, глутатіон, стабілізатора і ексципієнта. Нейтральний сольовий буфер або сольовий розчин, змішаний з неспецифічним сироватковим альбуміном, являють собою приклади придатних розріджувачів. Відповідно до прийнятних стандартів виробництва, можуть бути також додані консерванти, такі як бензиловий спирт. Композиція може бути виготовлена у вигляді ліофілізату з використанням розчинів придатних ексципієнтів (наприклад, сахарози) як розріджувача. Придатні компоненти не токсичні для реципієнтів у використаному дозуванні і концентраціях. Інші приклади компонентів, які можуть використовуватися при виготовленні фармацевтичних th композицій, описані у керівництві Ремінгтона (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 Ed. th (1980) і 20 Ed. (2000), Mack Publishing Company, Easton, PA). У даній заявці описані набори для використання у медичній практиці, які включають альфа4-бета-7-інгібуючу речовину за даним винаходом і етикетку або інші інформативні матеріали, що містять інструкції із застосування при лікуванні будь-якого зі станів, наведених у даному описі. В одному варіанті вказаний набір включає стерильний препарат одного або декількох альфа-4-бета-7-зв'язувальних антиген-зв'язувальних білків, які можуть бути у формі композиції, описаної вище, і можуть бути введені в один або декілька флаконів. Дозування і частота введення можуть варіювати в залежності від таких факторів як спосіб введення, конкретно використовуваний антиген-зв'язувальний білок, природа і тяжкість захворювання, що підлягає лікуванню, яким є даний стан, гострим або хронічним, від розмірів і загального стану здоров'я суб'єкта. Придатні дозування можуть бути визначені за процедурою, відомою у даній галузі, наприклад, використовуваною при проведенні клінічних випробувань, де вказані процедури можуть включати дослідження зі зростаючою дозою. 26 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Альфа-4-бета-7-інгібуюча речовина за даним винаходом може вводитися, наприклад, однократно або більше, ніж один раз, наприклад, з регулярними інтервалами протягом визначеного періоду часу. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу антигензв'язувальний білок вводять протягом періоду часу, що складає щонайменше один місяць або більше, наприклад, протягом одного, двох або трьох місяців, або навіть невизначено довго. Для лікування хронічних станів найбільш ефективним в основному є тривале лікування. Однак, для лікування гострих станів може бути досить введення протягом більш коротких періодів часу, наприклад, від одного до шести тижнів. В основному антиген-зв'язувальний білок вводять до появи у пацієнта медично значущого ступеню поліпшення, за одним або декількома вибраними індикаторами, відносно базового рівня. Конкретні варіанти здійснення даного винаходу включають введення антиген-зв'язувального білка у дозі, що складає від приблизно 1 нг антиген-зв'язувального білка на кілограм ваги суб'єкта на день ("1 нг/кг/день") до приблизно 10 мг/кг/день, більш переважно, від приблизно 500 нг/кг/день до приблизно 5 мг/кг/день, і найбільш переважно, від приблизно 5 мкг/кг/день до приблизно 2 мг/кг/день. У додаткових варіантах антиген-зв'язувальний білок вводять дорослим пацієнтам один раз на тиждень, два рази на тиждень або три, або більше разів на тиждень, при лікуванні опосередкованого альфа-4-бета-7 захворювання, стану або розладу, наприклад, медичного розладу за даним описом. У випадку ін'єкції ефективна кількість антиген2 зв'язувального білка у дозі для дорослого пацієнта може варіювати у діапазоні від 1 до 20 мг/м і переважно становить приблизно 5-12 мг/мл. Альтернативно, може вводитися рівна доза і кількість може варіювати у діапазоні 5-100 мг/дозу. Один діапазон для рівної дози становить приблизно 20-30 мг на дозу. В одному варіанті здійснення даного винаходу рівна доза 25 мг/дозу повторно вводиться шляхом ін'єкції. Якщо спосіб введення відрізняється від ін'єкції, то використовувану дозу відповідним чином коректують, згідно зі стандартними медичними підходами. Один з прикладів придатного терапевтичного режиму включає ін'єкцію дози, що включає приблизно 20-30 мг антиген-зв'язувального білка, один-три рази на тиждень протягом періоду часу, що становить щонайменше три тижні, хоча може бути необхідне більш тривале лікування для індукції бажаного ступеню поліпшення. У випадку лікування дітей (вік 4-17 років), один з репрезентативних придатних режимів включає підшкірну ін'єкцію дози від 0,4 мг/кг до максимальної дози, що становить 25 мг антиген-зв'язувального білка, що вводиться два або три рази на тиждень. Конкретні варіанти здійснення способів за даним винаходом включають підшкірну ін'єкцію від 0,5 мг до 10 мг переважно, від 3 до 5 мг антиген-зв'язувального білка один або два рази на тиждень. Інший варіант стосується легеневого введення (наприклад, з використанням небулайзера) 3 або більше мг антиген-зв'язувального білка один раз на тиждень. Приклади придатних терапевтичних режимів за даним описом включають підшкірну ін'єкцію антиген-зв'язувального білка один раз на тиждень у дозі 1,5-3 мг для лікування стану, при якому важлива роль альфа-4-бета-7. Приклади таких станів наведені у даному описі і включають, наприклад, ревматичні стани, вказані вище, а також інші стани, при яких грає істотну роль надмірна кількість або невідповідна міграція клітин, що експресують альфа-4-бета-7 (наприклад, як було описано раніше, запальне захворювання кишечнику, панкреатит і т.п.). Щотижневе введення антиген-зв'язувального білка продовжують до досягнення бажаного результату, наприклад, видалення симптомів у суб'єкта. Лікування може продовжуватися, в залежності від необхідності, або, альтернативно, можуть застосовуватися підтримуючі дози. Інші приклади терапевтичних режимів за даним описом включають підшкірне або внутрішньовенне введення дози у 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 або 20 міліграмів інгібітору альфа-4-бета-7 за даним винаходом на кілограм маси тіла суб'єкта (мг/кг). Вказана доза може вводитися суб'єкту однократно або більше, ніж один раз, з визначеними інтервалами, наприклад, один раз на день, три рази на тиждень, два рази на тиждень, один раз на тиждень, три рази на місяць, два рази на місяць, один раз на місяць, один раз кожні два місяці, один раз кожні три місяці, один раз кожні шість місяців або один раз на рік. Тривалість лікування і зміна дози/частоти лікування можуть змінюватися або варіювати у ході лікування з тим, щоб відповідати конкретним потребам даного суб'єкта. В іншому варіанті антиген-зв'язувальний білок вводять суб'єкту у кількості і протягом періоду часу, які є достатніми для індукції поліпшення, переважно, для тривалого поліпшення, щонайменше за одним індикатором, який відображає тяжкість розладу, що підлягає лікуванню. Можуть оцінюватися різні індикатори, які відображають вираженість хвороби, захворювання або стану у суб'єкта, для визначення, чи є вибрані кількість і час лікування достатніми. Такі індикатори включають, наприклад, клінічно значущі індикатори тяжкості захворювання, симптомів або проявів того або іншого розладу, що розглядається. В одному варіанті здійснення 27 UA 104311 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 даного винаходу вказане поліпшення розглядається як тривале, якщо у суб'єкта виявляються поліпшення щонайменше у двох часових точках, що оцінюються, взятих з інтервалом від двох до чотирьох тижнів. Ступінь поліпшення звичайно визначається лікуючим лікарем, який може зробити висновок на основі ознак, симптомів, результатів оцінки біопсійних зразків і даних інших тестів, і, крім того, лікуючий лікар може провести анкетування суб'єкта, наприклад, з використанням розробленої для конкретного захворювання анкети, що включає питання стосовно оцінки якості життя. Зміни в експресії альфа-4-бета-7 і/або активації альфа-4-бета-7, і/або в його зв'язуванні з партнером MAdCAM-1 асоційовані з розвитком великого числа розладів, що включають, наприклад, запальні стани шлунково-кишкового тракту. Суб'єкти з даним розладом можуть бути скриновані з метою ідентифікації тих індивідуумів, у яких є змінена експресія і/або активація альфа-4-бета-7, або MAdCAM-1, що дозволяє виявити тих суб'єктів, які могли б одержати сприятливий результат лікування з використанням альфа-4-бета-7-зв'язувального антигензв'язувального білка. Таким чином, способи лікування за даним винаходом необов'язково включають першу стадію виявлення у суб'єкта активації альфа-4-бета-7 або MAdCAM-1, або оцінки рівнів експресії. Антиген-зв'язувальний білок може вводитися суб'єкту, у якого експресія і/або активація альфа-4-бета-7, і/або MAdCAM-1 підвищена понад нормальні значення. Рівні активності альфа-4-бета-7 або MAdCAM-1 у суб'єкта можуть відстежуватися до, під час і/або після лікування з використанням антиген-зв'язувального білка для виявлення змін, якщо вони є, в активності альфа-4-бета-7 або MAdCAM-1. У випадку деяких розладів наявність підвищеної активності альфа-4-бета-7 і/або MAdCAM-1 може варіювати в залежності від таких факторів як стадія захворювання або конкретна форма захворювання. Можуть використовуватися відомі методики для визначення такої активності, наприклад, у зразках крові або у тканині суб'єкта. Активність альфа-4-бета-7 або MAdCAM-1 може бути виміряна з використанням будь-якої придатної методики. Конкретні варіанти здійснення способів і створення композицій за даним винаходом включають використання антиген-зв'язувального білка і одного або декількох додаткових антагоністів альфа-4-бета-7, наприклад, двох або більше антиген-зв'язувальних білків за даним винаходом, або антиген-зв'язувального білка за даним винаходом і одного або декількох інших антагоністів альфа-4-бета-7. В інших варіантах антиген-зв'язувальний білок вводять один або у поєднанні з іншими засобами, що використовуються для лікування стану, який є у даного пацієнта. Приклади таких засобів включають лікарські препарати як білкової, так і не білкової природи. Коли вводиться множина терапевтичних засобів у курсі їх спільного застосування, дозування може бути відкоректоване відповідним чином, згідно з прийнятими у даній галузі підходами. "Спільне введення" і комбінована терапія не обмежені варіантом одночасного введення, а також включають такі режими лікування, в яких антиген-зв'язувальний білок вводять щонайменше один раз у ході всього курсу лікування, який включає введення пацієнту щонайменше одного іншого терапевтичного засобу. Приклади інших засобів, які можуть вводитися в об'єднаному режимі разом з антигензв'язувальним білком, включають інші антиген-зв'язувальні білки або терапевтичні поліпептиди, які вибирають з врахуванням конкретного стану, що підлягає лікуванню. Альтернативно, не білкові лікарські засоби, які використовуються для лікування одного з вказаних вище конкретних станів, можуть вводитися у поєднанні з антагоністом альфа-4-бета-7. Об'єднана терапія В іншому аспекті даний винахід стосується способу лікування суб'єкта з використанням антиген-зв'язувального білка, що інгібує альфа-4-бета-7, у поєднанні з одним або декількома іншими видами терапії. В одному варіанті така об'єднана терапія приводить до досягнення синергічного, або додаткового, ефекту, що створюється, наприклад, при впливі на множинні сайти або молекулярні мішені у пухлині. Види об'єднаної терапії, які можуть використовуватися відповідно до даного винаходу, включають інгібування або активацію (в залежності від того, що прийнятно у конкретному випадку) множини вузлів на одному шляху, що стосується конкретного захворювання, множини шляхів у цільовій клітині і множини клітинних типів у цільовій тканині. В іншому варіанті спосіб об'єднаної терапії включає введення суб'єкту двох, трьох, чотирьох, п'яти або більше агоністів або антагоністів альфа-4-бета-7 за даним описом. В іншому варіанті вказаний спосіб включає проведення суб'єкту двох або більше варіантів лікування, які у спільному режимі інгібують або активують (безпосередньо або опосередковано) сигнальну трансдукцію, пов'язану з участю альфа-4-бета-7. Приклади таких способів включають використання поєднання двох або більше антиген-зв'язувальних білків, що інгібують альфа-4бета-7, антиген-зв'язувального білка, що інгібує альфа-4-бета-7, і одного або декількох інших терапевтичних агентів, що мають протизапальні властивості (наприклад, нестероїдних 28