Lactobacillus johnsonii la1 ncc533 (cncm i-1225) і імунні розлади

Реферат: Винахід стосується галузі профілактики і/або лікування запальних та інфекційних захворювань, зокрема, шляхом збільшення ендогенного антимікробного використання L. johnsonii La1 NCC533 (депозит № CNCM I-1225), що не реплікується, для застосування у лікуванні або профілактиці хвороб, пов'язаних із імунною системою, включаючи інфекції. Композиція, що містить L. johnsonii La1 NCC533 (депозит № CNCM I-1225), де принаймні 95% о о або 100% бактерій є нереплікативними внаслідок обробки при 110 -140 протягом 5-30 секунд. UA 107573 C2 (12) UA 107573 C2 UA 107573 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід в цілому відноситься до галузі запобігання та/або лікування запальних та інфекційних захворювань, зокрема, шляхом збільшення ендогенного антимікробного захисту. Одним з варіантів втілення даного винаходу є використання L. johnsonii La1 NCC533 (депозит № CNCM l-1225), що не реплікується, для застосування у лікуванні або профілактиці захворювань, пов'язаних із імунною системою, в тому числі інфекцій. Середовище, що нас оточує, забруднене багатоманіттям потенційно патогенних мікроорганізмів. Як шкірні кератиноцити, так і епітеліальні клітини, що вистилають шлунковокишечний тракт, респіраторний тракт, урогенітальний тракт, утворюють фізичний бар'єр, що захищає від мікробного вторгнення в організм. Крім того, епітелій допомагає захисту людини шляхом виробництва і виділення антимікробних засобів для обмеження доступу бактерій та інших мікроорганізмів., Такі антимікробні молекули становлять ключові компоненти основного захисту вродженого імунітету. Одним з найважливіших класів антимікробних пептидів людини є дефензини. Дефензини виробляють епітеліальні клітини легенів, шкіри, порожнини рота, урогенітального, респіраторного і шлунково-кишечного трактів. Серед іншого, існує родина β-дефензинів, до яких відносяться дефензини 1 (hBD1) i 2(hBD2). HBD1 виділяється у різноманітних слизових поверхнях, наприклад, слизовій рота, слинних залоз, шлунку, тонкого кишечника, кишечника, печінки і підшлункової залози. HBD2 також наявний у епітеліальних клітинах багатьох слизових поверхонь, зокрема, у шлунковокишечному тракті. Крім того, обидва дефензини також наявні у слині та рідини'з дихальних шляхів (Cunliffe.R.N. and Mahida.Y.R. 2004, J Leukoc.Biol. 75:49-58). HBD1 виділяється конституітивно і ніколи не демонстрував послідовної активації бактеріями або запаленнями (Ou.G., et al., 2009, Scand.J Immunol 69:150-161). Пробіотики добре відомі як такі, що можуть зміцнювати різноманітні лінії кишкового захисту: імунне виключення, імунне видалення та імунне регулювання. Пробіотики також відомі як стимулятори неспецифічного опору істоти-носія мікробним патогенам і, відтак, направлені на їх ерадикацію. Однак, незважаючи на це, експресія конституітивного hBD1 відзначена як така, на яку не впливають бактерії-пробіотики (O'Neil.D.A. et al., J Immunol 163:6718-6724) і яка дуже слабко активується умовно-патогенними (Escherichia coli) і патогенними (Salmonella typhimurium) штамами (Ou, G., et al., 2009, Scand.J Immunol 69:150-161). Застосування пробіотиків наразі полягає у зменшенні ризинку захворювань, пов'язаних із дисфункцією кишкового бар'єру (Е. Isolauri, et al, 2002, Gut 2002;50:iii 54-iii 59). Вважають, що пробіотики ефективні завдяки виживанню у кишечнику, стабільності до кислоти та жовчі, темпоральній колонізації слизових поверхонь кишкового тракту. Таким чином, велика кількість опублікованих джерел пов'язана із живими пробіотиками. Однак, деякі дослідження вивчали переваги для здоров'я, які забезпечують бактерії, що не реплікується, і більшість з них показало, що інактивація пробіотиків, наприклад, за допомогою теплової обробки, веде до втрати їх очікуваних корисних ефектів для здоров'я (Rachmilewitz, D., et al., 2004, Gastroenterology 126:520-528; Castagliuolo, et al., 2005, FEMS Immunol.Med.Microbiol. 43:197-204; Gill, H. S. and K. J. Rutherfurd, 2001,Br.J.Nutr. 86:285-289; Kaila, M., et al., 1995, Arch.Dis.Child 72:51-53.). Робота із живими бактеріями у харчових продуктах наразі має декілька недоліків. Живі бактерії зазвичай не є стійкими до навантажень, тому з ними важко працювати у промислових масштабах, підтримуючи життєздатність. Крім того, для деяких категорії продуктів може бути не зовсім оптимальним додавати живі мікроорганізм до композиції, зважаючи на проблеми безпечності. Таким чином, існує потреба у біоактивних нежиттєздатних мікроорганізмах. Переважно, якщо будуть запропоновані пробіотичні мікроорганізми, які не реплікуються, це дозволить відновлення в умовах високої температури, наприклад, порошкових харчових композицій, із збереженням корисних ефектів для здоров'я споживача. Виходячи з цього, бажано працювати із бактеріями, що не реплікуються, замість їх живих аналогів, однак, наявні в цьому відношенні дослідження поки не є обнадійливими. Застосування живих пробіотиків як стратегія для лікування або запобігання запальним кишковим хворобам було відзначено у літературі, нещодавно був підготовлений огляд Dotan et al. (Dotan, I. and D. Rachmilewitz. 2005; Curr.Opin.Gastroenterol. 21:426-430). Наприклад, висококонцентрована суміш із восьми живих бактерій-пробіотиків (VSL#3) продемонструвала ефективність у профілактиці (Gionchetti, P., et al., 2003, Gastroenterology 124:1202-1209) та лікуванні рецидивних або таких, що не піддаються лікуванню паучитів у людей (Gionchetti, P., et al., 2000, Gastroenterology 119:305-309; Mimura, Т., et al., 2004, Gut 53:108-114). Дуже цікавим є результати проведеного із застосуванням моделі DSS-мишей дослідження колітів Rachmilewitz 1 UA 107573 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 et al. (Rachmilewitz, D., et al., 2004, Gastroenterology 126:520-528), яке свідчить про те, що лікування живими і γ-опроміненими, однак, не знищеними тепловою обробкою VSL#3, захищає від колітів. Аналогічним чином, вбиті тепловою обробкою L crispatus не показані ефективності у захисті від DSS-стимульованих колітів, хоча живі бактерії очевидно знижували втрату ваги тіла і активність МПО в кишечнику (Castagliuolo, et al., 2005, FEMS Immunol.Med.Microbiol. 43:197-204). Такі дослідження дозволяють припустити, що живі пробіотики в контексті запалень кишечника є більш ефективними, аніж ті, що не реплікуються. Було встановлено, що інактивовані L reuteri (вбиті тепловою обробкою і γ -опромінені) не можуть зменшити TNF-стимульоване продукування IL-8 Т84-клітинами, хоча живі бактерії показували значний корисний ефект (Ма, D., et al., 2004, Infect.lmmun. 72:5308-5314). Відтак, існує потреба запропонувати натуральні композиції, із якими легко працювати в промислових умовах, які є безпечними і нескладними у введенні і які дозволяють запобігати і/або лікувати запальні і інфекційні захворювання, зокрема, шляхом збільшення ендогенного антимікробного захисту. В ідеалі натуральні композиції слід одержувати з пробіотичних культур, зокрема, з пробіотичних мікроорганізмів, що на сьогодні добре сприймаються і визнаються споживачами за корисний для здоров'я ефект. Переважно, композиція має містити бактерії, що не реплікуються, які мають бути більш ефективними, ніж живі. Автори даного винаходу вирішити цю проблему. Відтак, метою даного винаходу є покращення рівня техніки, забезпечення натуральної композиції, яка уможливлює профілактику і/або лікування запальних та інфекційних захворювань, зокрема, шляхом збільшення ендогенного антимікробного захисту та виконання вищеописаних вимог. Автори несподівано з'ясували, що дану задачу можна вирішити за допомогою об'єкту у незалежних пунктах формули винаходу. Залежні пункти додатково визначають переважні варіанти втілення даного винаходу. Об'єкт даного винаходу посилює ендогенний антимікробний захист ссавців шляхом введення продукту із вмістом мікроорганізмів, таких, як мікроорганізми, що не реплікуються, наприклад, підданих тепловій обробці. Автори описують, що L. johnsonii (La1, NCC 533, депозит № CNCM l-1225), зокрема, L johnsonii (La1, NCC 533, депозит № CNCM l-1225), що не реплікується, наприклад, підданий нагріванню L. johnsonii (La1, NCC 533, депозит № CNCM I-1225), має вищий ефект на стимулювання експресії антимікробних пептидів, ніж попередньо описані і ідентифіковані в літературі штами. Було встановлено, наприклад, що: - L johnsonii (La1, NCC 533, депозит № CNCM l-1225) значно стимулює конституітивну експресію hBD1, і що - підданий тепловій обробці L. johnsonii (La1, NCC 533, депозит № CNCM I-1225) активує hBD1 значніше, ніж живий. HBD1 проявляє антибактеріальну активність до широкого спектру бактерій, включаючи Е. соlі і Pseudomonas aeruginosa, H. pylori (Nuding.S., et al., 2009,Microbes.Infect. 11:384-393), і також проти грибків, наприклад, Candida albicans (O'Neil, D.A. 2003, Моl.Immunol 40:445-450) і вірусів (вірус імунодефіциту людини) (Kota,S. Et al., 2008, J. Biol. Chem 283:22417-22429). Тобто, такі антимікробні пептиди можуть зміцнювати мукозальний бар'єр і відповідно обмежувати бактеріальне приєднання і інвазію. Все більше і більше доказів вказують на те, що рівні дефензинів зменшуються у певних патофізіологічних умовах, і що це є фактором ризику для патогенезису і ускладнень таких інфекційних і запальних хвороб, як (Doss, M.et al., 2010, J Leukoc.Biol. 87: 79-92); Rivas-Santiago, B.et al., 2009, Infect.lmmun. 77:4690-4695): - у респіраторному тракті: - муковісцидоз, реактивні захворювання дихальних шляхів, легеневі інфекції і тютюнопаління, астма, пневмонія, риніт, отит, синусит, туберкульоз; - у шлунково-кишечному тракті: Хвороба Крона (у товстому кишечнику та клубовій кишці), виразковий коліт, гастрит і виразка шлунку, викликані інфекцією Helicobacter pylori, інфекційна діарея, некротичний ентероколіт, викликана антибіотиками діарея, целіакія, кишкова незрілість; - в урогенітальному тракті: Бактеріальний вагіноз, ВІЛ, вірус простого герпесу (Herpes simplex), урінальні інфекції; - на шкірі: Атопічний дерматит, хронічні виразки, карцинома, атопічна екзема, опіки; 2 UA 107573 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - в порожнині рота: Пацієнти із ВІЛ, тонзиліт, гінгівіт, карієс зубів; - кератити очей. Презентовані результати показують, що L. johnsonii La1 (NCC 533, депозит № CNCM l-1225) має більшу потужність для збільшення ендогенного антимікробного захисту, ніж раніше ідентифіковані бактерії-пробіотики, і, відтак, може бути більш ефективним для профілактики та лікування надмірного бактеріального зросту в тонкому кишечнику, запальних та інфекційних захворювань. Крім того, дані авторів винаходу показують, на відміну від даних, очікуваних із літератури, що теплова обробка не зменшує, а збільшує сильний антимікробний ефект L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225). Одним з варіантів даного винаходу є композиція, що містить L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM l-1225), для застосування у лікуванні або профілактиці захворювань, пов'язаних із імунною системою, наприклад, інфекцій. Відповідно до даного винаходу захворювання, пов'язані із імунною системою, можна лікувати або запобігати ним за допомогою збільшення експресії ендогенного hBD1. Даний винахід також стосується композиції, що містить L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM l-1225) для застосування у лікуванні або профілактиці хвороб, пов'язаних із зменшеною експресією hBD1, наприклад, мікробних інфекцій. Даний винахід також стосується застосування L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM l1225) у приготуванні композиції для лікування або профілактики захворювань, пов'язаних із імунною системою. L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM l-1225), що не реплікується, може застосуватися принаймні частково. L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225), що не реплікується, зокрема, підданий тепловій обробці, демонструє перевагу - більшу ефективність, ніж у живих бактерій. Застосування мікроорганізмів, що не реплікуються, наприклад, підданого тепловій обробці L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225), замість живих мікроорганізмів, забезпечує такі додаткові переваги: - зменшується потенційний ризик пов'язаного із живими пробіотиками сепсису у чутливих групах населення, - є безпечною альтернативою для пацієнтів із імунними розладами, і - нижчими є труднощі в переробці, їх можна вводити у рідкі продукти тривалого зберігання. Тобто, в одному з варіантів втілення даного винаходу принаймні 90 %, наприклад, принаймні 95 %, переважно принаймні 98 %, переважніше принаймні 99 %, в ідеалі принаймні 99.9 %, або повністю L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225) є такими, що не реплікуються. Даний винахід також стосується композиції, що містить L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225), яка відрізняється тим, що принаймні 95 %, переважно принаймні 98 %, переважніше принаймні 99 %, в ідеалі принаймні 99.9 %, або 100 % L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225) є такими, що не реплікуються. Таким чином, даний винахід також стосується біоактивних L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM l-1225), що не реплікуються, наприклад, підданих тепловій обробці. "Такі, що не реплікуються" L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM l-1225) включають L. johnsonii La1, піддані тепловій обробці. Це включає L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225), що є інактивованими, мертвими, нежиттєздатними і/або наявні в якості фрагментів, наприклад, ДНК, метаболітів, цитоплазмідні сполуки, і/або матеріали клітинних стінок. "Такі, що не реплікуються", означає, що класичними способами культивування не можливо визначити життєздатні клітини і/або колонієутворюючі одиниці. Такі класичні способи культивування описані у книзі із мікробіології: James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology. 7th edition, Springer Science, New York, N.Y. 790 p. Як правило, відсутність життєздатних клітин демонструють наступним способом: відсутні видимі колонії на чашках з агаровим середовищем або відсутнє збільшення мутності у рідкому середовищі зросту після інокуляції різними концентраціями бактеріальних препаратів (зразки, "що не відтворюються") та інкубації в відповідних умовах (аеробне і /або анаеробне середовище протягом принаймні 24год). L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225) можна зробити такими, що не реплікуються, за допомогою теплової інактивації. Теплова інактивація може проходити при принаймні 70° С 3 UA 107573 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Може застосовуватися будь-яка теплова обробка для інактивації пробіотиків, оскільки вона здійснюється достатньо довго для забезпечення інактивації. Наприклад, така теплова обробка може здійснюватися протягом принаймні 10 секунд. Як правило, висока температура зумовлює короткий час нагрівання, а нижча температура вимагає довшого нагрівання. Наприклад, L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM l-1225) можна зробити такими, що не відтворюються, при 110° - 140° протягом 1-30 секунд, наприклад, 10-20 секунд. Такий заданий час стосується часу, протягом якого L. johnsonii La1 піддають заданій температурі. Слід відзначити, що в залежності від природи та кількості композиції, в якій наявні L. johnsonii La1, і в залежності від будови застосовуваного нагрівального апарату час теплової обробки може змінюватися. Температурна обробка може застосовуватися при нормальному атмосферному тиску, але й може при підвищеному. Як правило, діапазон тиску становить від 1 до 50 бар, переважно від 1-10 бар, навіть переважніше від 2 до 5 бар. Ідеальний тиск залежить від природи композиції, в якій наявні мікроорганізми, і від застосовуваної температури. Якщо композиції, в яких наявні La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225), піддані певній тепловій обробці, наприклад, до пакування і реалізації, може бути переважним застосування такої теплової обробки для інактивації La1 NCC533. Як правило, композиції, що містять Lа1 (NCC 533, депозит № CNCM I-1225) можуть оброблятися високотемпературною короткотривалою обробкою (HTST), миттєвою пастеризацією або надвисокою температурою (UHT). UHT-обробка - це надвисокотемпературна обробка або переробка, що передбачає принаймні часткову стерилізацію композиції шляхом нагрівання її протягом короткого часу, приблизно 1-10 секунд, при температурі вище 135 °C (275 °F), що є температурою, необхідною для знищення бактеріальних спор у молоці. Наприклад, така обробка молока із застосуванням температур вище 135° С уможливлює зменшення бактеріального навантаження при належному часті витримування (протягом 2-5 сек), що уможливлює безперервне виробництво. Існує два основних типи UHT-систем: прямі і непрямі системи. При прямих системах продукти обробляють шляхом інжекції пари або нагнітання пари, а в непрямих системах продукти піддають тепловій обробці у пластинчатому теплообміннику, трубчастому теплообміннику або скребковому теплообміннику. Комбінації UHT-систем можуть застосовуватись на будь-якій або на декількох стадіях в процесі приготування продукту. Високотемпературна короткотривала обробка - це спосіб пастеризації, призначений для досягнення 5-кратного зменшення, знищення 99,9999 % кількості життєздатних мікроорганізмів у молоці. Це вважається адекватним для знищення майже усіх грибків, пліснявих грибків та загально-забруднюючих бактерій, а також для забезпечення адекватного знищення звичайних патогенних теплостійких організмів. При високотемпературній короткочасній обробці молоко нагрівають до 71.7 °C (161 °F) протягом 15-20 секунд. Миттєва пастеризація - це спосіб теплової пастеризації швидкопсувних напоїв, наприклад, фруктових та овочевих соків, пива та молочних продуктів. її здійснюють до наповнення ємностей для знищення забруднюючих мікроорганізмів, забезпечення безпеки та тривалішого строку зберігання продуктів. Рідина пересувається контрольованим безперервним потоком при підданні температурі 71.5 °C (160 °F) - 74 °C (165 °F) протягом приблизно 15-30 секунд. Для цілей даного винаходу термін "короткотривала високотемпературна обробка" включає, наприклад, високотемпературну короткочасну (HTST) обробку, UHT-обробку і миттєву пастеризацію. Композиції згідно даного винаходу можуть включати La1 у кількості, достатній для принаймні часткової обробки інфекцій та розладів, пов'язаних із імунною системою та /або їх ускладненнями. Кількість, достатню для досягнення цієї мети, позначають як "терапевтично ефективну дозу". Ефективні для цієї мети кількості залежать від багатьох відомих фахівцям з рівня техніки факторів, наприклад, від тяжкості захворювання, ваги, загального стану здоров'я споживача, його харчової матриці. Для профілактичного застосування композиції згідно винаходу вводять споживачеві, що вразливий до або несе інший ризик захворювань, пов'язаних із імунною системою, в кількості, що є достатньою для принаймні часткового зниження ризику таких захворювань. Таку кількість визначають як "профілактично ефективну дозу". Знов, точні кількості залежать від багатьох специфічних для пацієнта факторів, наприклад, стану здоров'я пацієнта, ваги, ефекта на харчову матрицю. Фахівці з рівня техніки зможуть регулювати терапевтично ефективну дозу і/або у профілактично ефективну дозу відповідно. 4 UA 107573 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як правило, композиція згідно даного винаходу містить La1 (NCC533, депозит № CNCM l1225) у терапевтично ефективній дозі і/або у профілактично ефективній дозі. Як правило, терапевтично ефективна доза і/або профілактично ефективна доза становить в діапазоні від приблизно 0,005 мг - 1000 мг La1 на добову дозу. В кількісних значеннях La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225) може бути наявний в 4 12 композиції в кількості, що відповідає між 10 і 10 еквіваленту КУО/г композиції в сухій вазі. Очевидно, мікроорганізми, що не реплікуються, не утворюють колоній, відповідно, цей термін 4 12 слід розуміти як кількість мікроорганізмів, що не реплікуються, одержану з 10 -10 КУО/г бактерій, що реплікуються. Це включає мікроорганізми, які не активовані, не життєздатні або мертві або наявні в якості фрагментів ДНК або клітинних стінок або цитоплазмідних сполук. Інакше кажучи, кількість мікроорганізмів, яку містить композиція, виражається у колонієутворюючій здатності (КУО) такої кількості мікроорганізмів, якби всі мікроорганізми були живими, незважаючи на те, чи є вони насправді такими, що не реплікуються, наприклад, інактивованими або мертвими, фрагментованими або комбінацією з будь-яких або всіх зазначених станів. Наприклад, композиція згідно даного винаходу може містити кількість L. johnsonii La1 4 12 (NCC533, депозит № CNCM l-1225), що відповідає приблизно 10 0 10 КУО на добову дозу. Композиція згідно даного винаходу може містити приблизно 0,005 мг -1000 мг L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225) на добову дозу. Композиція згідно даного винаходу може бути композицією будь-якого виду. Композицію можна вводити орально, ентерально, парентерально (черезшкірно або внутрішньом'язово), локально або наочно, або шляхом інгаляції, інтраректально або інтравагінально, наприклад. Тобто, композиція згідно даного винаходу може бути обрана з групи, до якої належать харчові композиції, харчові продукти, включаючи корми для тварин, напої, суміші для повноцінного харчування, харчові добавки, нутрацевтики, поживні добавки, фармацевтичні композиції, косметичні композиції, медикаменти та композиції для місцевого застосування. Можуть бути додані пребіотики. Пребіотики можуть сприяти зросту пробіотиків до того, як вони стають такими, що не реплікуються. Пребіотики також можуть діяти синергетично із життєздатними пробіотичними бактеріями, які наявні в композиції та/або можуть бути додані до неї. Хвороби, пов'язані із імунною системою, можуть бути обрані із групи інфекцій, наприклад, бактеріальних, вірусних, грибкових та/або паразитарних інфекцій; запалень, фагоцитних недостач, дефектів епітеліального бар'єру, незрілості імунної системи, надлишкового бактеріального зросту в тонкому кишечнику та їх комбінацій. В одному з варіантів втілення даного винаходу композиція, що включає L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225), може застосовуватись для лікування або профілактики мікробних інфекцій, наприклад, вірусних, грибкових та/або паразитарних інфекцій. Хвороби, пов'язані із імунною системою, можуть бути обрані із групи хвороб, пов'язаних із низьким рівнем дефензинів, зокрема, hBD1. Такі хвороби можуть бути обрані з групи, до якої належать муковісцидоз, реактивні захворювання дихальних шляхів, легеневі інфекції внаслідок тютюнопаління, астма, пневмонія, риніт, отит, синусит, туберкульоз, хвороба Крона (у товстій кишці та клубовій кишці), виразковий коліт, целіакія, кишечна незрілість, гастрит, виразка шлунку, спричинена інфекцією Helicobacter pylori, інфекційна діарея, некротичний ентероколіт, пов'язана із антибіотиками діарея, бактеріальний вагіноз, ВІЛ, вірус Herpes simplex, урінальні інфекції, атопічний дерматит, хронічна виразка, карцинома, атопічна екзема, опіки, тонзиліт, гінгівіт, карієс зубів, кератит очей, їх комбінації. Композиція згідно даного винаходу може застосовуватися для збільшення ендогенного антимікробного захисту. Цього можна досягти, наприклад, шляхом збільшення експресії ендогенного hBD1. Автори даного винаходу встановили, що L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM l-1225) значно стимулює експресію конститутивного hBD1, і що L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM l-1225), що не реплікується, наприклад, підданий тепловій обробці, активує експресію hBD1 навіть більше, ніж живий мікроорганізм. Відповідно, предмет даного винаходу також включає спосіб збільшення ефективності L. johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225) у лікуванні або профілактиці хвороб, пов'язаних із імунною системою, що передбачає стадію обробки L johnsonii La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225) таким чином, що він не реплікується, наприклад, шляхом теплової обробки. Хвороби, пов'язані із імунною системою, можуть бути одними з, наприклад, вищеперелічених хвороб. 5 UA 107573 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному з варіантів втілення даного винаходу спосіб передбачає стадію теплової обробки при принаймні приблизно 70 °C протягом принаймні приблизно 10 секунд. Фахівці з рівня техніки зрозуміють, що вони можуть легко поєднувати всі ознаки даного винаходу, описані вище, без виходу за об'єм розкритого винаходу. Зокрема, ознаки, які описані для композицій, можуть застосовуватись до застосування і/або способу згідно даного винаходу і навпаки. Додаткові переваги і ознаки даного винаходу є очевидними з наступних прикладів та фігур. Фігура 1 зображує, що La1 (NCC533, депозит № CNCM l-1225), підданий тепловій обробці при 120 °C- 15 секунд значно стимулює hBD1 мРНК в епітеліальних клітинах кишечника in vitro у порівнянні із іншими підданими тепловій обробці штамами. Клітини Т84 інкубували протягом 4 годин із штамами, підданими тепловій обробці. Генна експресія hBD1 була проаналізована за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу. Стовпчики відтворюють значення ± стандартна похибка середньої величини (sem), нормалізовані до базальної експресії нестимульованих клітин. Фігура 2 зображує, що високотемпературна короткотривала обробка La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225) призводить до стимулювання hBD1 мРНК. Клітини Т84 стимулюють протягом 4 годин із живими та підданими тепловій обробці La1 (NCC533, депозит № CNCM l-1225) при 120 °C - 15 секунд або 85 °C - 20 хвилин. Генна експресія hBD1 була проаналізована за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу. Стовпчики відтворюють значення ± стандартна похибка середньої величини (sem), нормалізовані до базальної експресії нестимульованих клітин. Приклади: Експериментальний протокол Клітини Т84 застосовувалися від проходу 30-40 і були культивовані в модифікованому ессенціальному середовищі Дульбеко /F-12 (Sigma D 6421), що містить 5 % плодної сироватки теляти (FCS) (Amined BioConcept) і 2 ммоль глютаміну. Клітини висівалися при концентрації 2  6 10 клітин/лунка у 6-лункових пластинах для культур та вирощуватися як моношари при 37 °C у 5 % СО2-95 % повітряна атмосфера. Клітини вирощувалися протягом 1 тижня після злиття були інкубовані із сироваткою і вільним від антибіотиків середовищем протягом принаймні 12 годин. Дана стадія була необхідною для виключення стимульованою сироваткою експресії дефензинів та запобігання будь-якому впливу антибіотиків на пробіотики та на клітинну імунну відповідь. Клітини були додатково інкубовані із пробіотиками або підданими тепловій обробці штамами протягом 4 годин. Наприкінці періоду інкубації клітини були промиті із фосфатно-сольовим буфером і одержали ізоляційним реагентом TriPure™ відповідно до протоколу постачальника. Експресія генів людини hBD1 ihBD2 у таким чином оброблених клітинах оцінили кількісною ПЛР. Застосовуваними в даному експерименті бактеріальними штамами були В. longum (NCC 2705, депозит № CNCM 1-2618), В. lactis (NCC 2818, депозит № CNCM І-3446), L. johnsonii (La1, NCC 533, депозит № CNCM l-1225), L paracasei (ST11, NCC 2461, депозит № CNCM l-2116). Дані штами тестували живими або підданими тепловій обробці або при 120 °C - 15 секунда або 85 °C - 20 хвилин. Результати: Підданий тепловій обробці La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225) при 120 °C, 15 секунд, стимулював значну експресію hBD1 мРНК через 4 години інкубації (Фігура 1), на відміну від інших протестованих підданих тепловій обробці штамів. Ці дані є унікальними, оскільки експресію HBD1, що виділяється конституітивно, наукове співтовариство наразі вважало віртуально не змінним мікробами, мікробними продуктами або запаленнями. Як живі, так і піддані тепловій обробці La1 (NCC533, депозит № CNCM I-1225) значно стимулювали експресію hBD1 мРНК, однак найвище стимулювання hBD1 було досягнуто підданим тепловій обробці Lа1 (високотемпературна короткотривала обробка) (Фігура 2). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Композиція, що містить L. johnsonii La1 NCC533, депозит № CNCM I-1225, для застосування у лікуванні або профілактиці захворювань, пов'язаних із імунною системою, яка відрізняється тим, що принаймні 90 %, переважно, 95 % або 100 % L. johnsonii La1 NCC533, депозит № CNCM I-1225 є нереплікативними внаслідок обробки при 110-140° Цельсія протягом 5-30 секунд, а пов'язане з імунною системою захворювання відноситься до групи, куди входять інфекції, зокрема, бактеріальні, вірусні, грибкові і/або паразитарні інфекції; запалення; фагоцитна недостатність; дефекти епітеліального бар'єру; незрілість імунної системи; надмірний ріст бактерій у тонкому кишечнику; їх комбінації, а також розлади, пов’язані із зниженим рівнем hBD1, є захворюванням з групи, до якої входять муковісцидоз, реактивні захворювання 6 UA 107573 C2 5 10 15 20 дихальних шляхів, легеневі інфекції внаслідок тютюнопаління, астма, пневмонія, риніт, отит, синусит, туберкульоз, хвороба Крона, виразкові коліти, целіакія, незрілість кишечнику, гастрити і виразка шлунка, викликана інфекцією Helicobacter pylori, інфекційна діарея, некротизуючий ентероколіт, пов'язана із антибіотиками діарея, бактеріальний вагіноз, ВІЛ, вірус Herpes simplex, уринальна інфекція, атопічний дерматит, хронічна виразка, карцинома, атопічна екзема, опіки, тонзиліт, гінгівіт, карієс зубів, кератит очей. 2. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що композиція містить 4 12 кількість L. johnsonii La1 NCC533, депозит № CNCM I-1225, що відповідає приблизно 10 -10 КУО на добову дозу. 3. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що композиція містить приблизно 0,005-1000 мг L. johnsonii La1 NCC533, депозит № CNCM I-1225 на добову дозу. 4. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що композицію вибирають з групи, яка складається із харчових композицій, харчових продуктів, включаючи корми для тварин, напої, суміші для повноцінного харчування, харчові добавки, нутрацевтики, харчові добавки, фармацевтичні композиції, косметичні композиції, композиції для місцевого застосування та медикаменти. 5. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, яка застосовується для збільшення ендогенного антимікробного захисту, і/або експресії ендогенного hBD1. 6. Спосіб збільшення ефективності L. johnsonii La1 NCC533, депозит № CNCM I-1225 у лікуванні або профілактиці інфекцій та хвороб, пов'язаних із імунною системою, який передбачає стадію обробки L. johnsonii La1, внаслідок якої вони стають такими, що не реплікуються, за допомогою стадії теплової обробки при 110-140° Цельсія протягом 5-30 секунд. 7 UA 107573 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8