Трансгенна рослина, яка містить днк, що кодує і експресує інсектицидний білок cry1da, і днк, що кодує і експресує інсектицидний білок cry1fa, для боротьби з совкою трав’яною

Реферат: Даний винахід стосується трансгенних рослин, які містять ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Cry1Da, і ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Cry1Fa. Вказані білки не конкурують один з одним за зв’язування з кишковими рецепторами совки трав’яної (FAW). Даний винахід також описує способи боротьби з лускокрилим шкідником Spodoptera frugiperda. Вказані способи дозволяють сповільнювати або попереджати вироблення резистентності у вказаної комахи до цих білків. UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Попередній рівень техніки Людина вирощує кукурудзу для вживання в їжу і для енергетичних цілей. Людина також вирощує множину інших культур, включаючи сою і бавовну. Комахи поїдають і пошкоджують рослини, і тим самим наносять збиток діяльності людини. Для боротьби з комахами-шкідниками щорічно витрачаються мільярди доларів, і ще мільярди йдуть на відшкодування збитку, що наноситься цими шкідниками. Інсектициди, синтезовані методами органічної хімії, є головним інструментом, що використовується для боротьби з комахами-шкідниками, але в деяких регіонах, в боротьбі з комахами-шкідниками важливу роль грають біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, що відбуваються від Bacillus thuringiensis (Bt). Можливість культивувати резистентні до комах рослини за допомогою трансформації цих рослин генами інсектицидних білків Bt була революцією в сучасному сільському господарстві і довела важливість і цінність інсектицидних білків і їх генів. Деякі білки Bt були використані для створення резистентних до комах трансгенних рослин, які успішно пройшли випробування, і в цей час їх виготовляють в промисловому масштабі. Такими білками є Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F і Cry3Bb, що вводяться в кукурудзу, Cry1Ac і Cry2Ab, що вводяться в бавовник, і Cry3A, що вводиться в картоплю. Комерційно доступні продукти, експресуючі ці білки, експресують тільки один з цих білків, за винятком випадків, коли бажано отримати комбінований інсектицидний спектр з 2 білків (наприклад, в кукурудзі, Cry1Ab і Cry3Bb об'єднані для вироблення резистентності до лускокрилих шкідників і кореневих личинок, відповідно), або випадків, коли незалежна дія цих білків робить їх цінним інструментом для сповільнення розвитку резистентності до інсектицидів у сприйнятливих популяцій комах (наприклад, Cry1Ac і Cry2Ab в бавовнику об'єднують з метою вироблення у рослин резистентності до тютюнової листовійки). Тобто, деякі сорти резистентних до комах трансгенних рослин, які швидко і повсюдно пристосовуються до цієї технології, також мають той недолік, що популяції шкідників виробляють резистентність до інсектицидних білків, що продукується цими рослинами. Було запропоновано декілька стратегій для збереження цінних ознак резистентності до Bt-комах, де вказані стратегії включають використання високих доз білків в комбінації із збереженням площ "сховищ" нетрансгенних рослин, і чергування або спільного використання різних токсинів (McGaughey et al.(1998), "Bt-Resistance Management" Nature Biotechnol. 16: 144-146). Необхідно, щоб білки, відібрані для використання в IRM-кластерах, мали незалежну інсектицидну дію, при якій резистентність, що виробляється до одного білка, не розповсюджувалася на інший білок (тобто, не спостерігалася перехресна резистентність до білків). Так, наприклад, якщо популяція комах, вибраних на резистентність до "білка А", є сприйнятливою до "білка В", то можна зробити висновок, що в цьому випадку перехресна резистентність відсутня, і комбінація "білок А і білок В" буде ефективною для сповільнення вироблення резистентності до одного білка А. У випадку за відсутності популяції резистентних комах, оцінка може бути зроблена виходячи з інших характеристик, які, як передбачається, стосуються механізму дії і можливої перехресної резистентності. Було висловлене припущення, що застосування опосередкованого рецептором зв'язування при ідентифікації інсектицидних білків, очевидно, не буде приводити до вироблення перехресної резистентності. (van Mellaert et al. 1999). Ключовим прогностичним фактором відсутності перехресної резистентності, що з'являється при такому підході, є те, що інсектицидні білки не конкурують за зв'язування з рецепторами у сприйнятливих видів комах. У випадку, коли два токсини Bt конкурують за зв'язування з одним і тим же рецептором, і якщо цей рецептор мутує у комахи так, що один з токсинів більше не зв'язується з цим рецептором, а тому не має інсектицидної дії проти комахи, то така комаха може набувати резистентності до другого токсину (який конкурентно зв'язується з тим же рецептором). Тобто, можна сказати, що така комаха буде мати перехресну резистентність до обох токсинів Bt. Однак, якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, то це означає, що така комаха не має одночасної резистентності до цих двох токсинів. Cry1Fa може бути використаний для боротьби з лускокрилими шкідниками багатьох видів, включаючи Європейського кукурудзяного трача (ECB; Ostrinia nubilalis (Hubner)) і совку трав'яну (FAW; Spodoptera frugiperda), і має активність проти бурякового трача (SCB; Diatraea saccharalis). Білок Cry1Fa, що продукується в рослинах кукурудзи, які містять модифікацію TC1507, відповідальний за вироблення ознаки резистентності до комах, і цей білок застосовується у провідних галузях промисловості для боротьби з совкою трав'яною (FAW). Cry1Fa також використовується в продуктах Herculex®, SmartStax™ і WideStrike™. Можливість провести дослідження на зв'язування з рецептором (конкурентне або гомологічне) з використанням білка Cry1Fa має певні обмеження, оскільки при застосуванні 1 UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 більшості методів мічення білків для детектування в аналізах на зв'язування з рецептором відбувається інактивація інсектицидної активності білка Cry1Fa. Додаткові токсини Cry перераховані На web-сайті офісу Комітету по номенклатурі B.t. (Crickmore et al; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Див. Додаток А в даній заявці. У цей час відомо приблизно 60 основних груп токсинів "Cry" (Cry1-Cry59), і крім того, існують інші токсини, такі як токсини Cyt і токсини VIP і т. п. Багато токсинів з кожної пронумерованої групи мають підгрупи, позначені великими буквами, а підгрупи, позначені великими буквами, в свою чергу, поділяються на підгрупи (суб-підгрупи), позначені малими буквами (наприклад, Cry1 має підгрупу A-L, а Cry1A має підгрупу a-i). Короткий опис суті винаходу Даний винахід частково оснований на несподіваному виявленні того факту, що популяція трав'яної совки (Spodoptera frugiperda; FAW), відібрана на резистентність до інсектицидної активності білка Cry1Fa, не є резистентною до інсектицидної активності білка Cry1Ca. Для фахівця в даній галузі очевидно, що перевага такого відкриття полягає в тому, що рослини, експресуючі ці два інсектицидні білки або їх інсектицидні частини, можуть бути використані для сповільнення або попередження розвитку резистентності до будь-якого з цих окремо взятих інсектицидних білків. Даний винахід також підтверджений виявленням того факту, що Cry1Fa і Cry1Da не конкурують один з одним за зв'язування з кишковими рецепторами совки трав'яної (FAW). Даний винахід також стосується, зокрема, трикомпонентних кластерів або "пірамід" з трьох (або більше) токсинів, де токсини Cry1Fa і Cry1Da являють собою базову пару. Одна з переважних пірамід включає щонайменше два білки, що не мають перехресну резистентність до двох шкідників - до FAW і до ECB (Європейського кукурудзяного трача; Ostrinia nubilalis); Cry1Fa плюс Cry1Da плюс один або декілька анти-ЕСВ токсинів, таких як Cry1Ab. У деяких переважних варіантах піраміди, вибрані токсини мають три різні механізми дії проти FAW. Цими переважними пірамідними комбінаціями з "трьома механізмами дії" є Cry1Fa плюс Cry1D плюс інший токсин/ген, вибраний з групи, яка складається з Vip3Ab, Cry1С, Cry1Be і Cry1E. Рослини (і посівні площі, засіяні такими рослинами), які продукують ці три токсини, входять в об'єм даного винаходу. Можуть бути також додані додаткові токсини/ген, але ці конкретні трикомпонентні кластери, відповідно до даного винаходу, будуть, як несподівано було виявлено, переважно діяти проти FAW по трьох механізмах. Це допоможе знизити або взагалі уникнути потреби в площах-"сховищах" нетрансгенних культур. У загальних рисах, даний винахід також стосується застосування трьох інсектицидних білків (в деяких переважних варіантах, білків Cry), які не конкурують один з одним проти одного шкідника-мішені. Таким чином, Cry1Da може бути використаний у вигляді комбінації з 3 генів для кукурудзи і інших рослин (наприклад, бавовнику і сої). Ген Cry1Da може бути введений, наприклад, в продукт Cry1Fa, такий як Herculex®, Smarts tax™ і Wides Strike™. Відповідно до цього, використання Cry1Da може мати важливе значення для зниження тиску відбору на інші промислові білки. Короткий опис графічного матеріалу Фігура 1: Пошкодження (середній % пошкодження листя + сер. кв. пом.) сегментів листя кукурудзи, уражених FAW (сині стовпці) або rFAW (пурпурові стовпці). Всі оброблювані зразки, перед яким стоять числа "5163", являють собою сегменти від рослин, трансформованих конструкцією, що містить Cry1Da. Рослини, в яких не була детектована експресія Cry1Da, були розділені на групи, вказані в лівій крайній частині графіка. Рослини, в яких детектувалась експресія Cry1Da, були розділені на групи, вказані в центральній частині графіка. Нетрансгенний (тобто, негативний) контроль вказаний в крайній правій частині графіка і позначений "B104", "Hill" і "Isoline". Комерційно доступна інбредна лінія, що містить Cry1Fa, представлена першим обробленим зразком, вказаним праворуч (позначений "Herculex I") і є тим же самим генетичним фоном, як і нетрансгенний контроль, позначений "Isoline". Фігура 2: Конкурування за зв'язування BBMV Spodoptera frugiperda з білком, що містить 125 коровий токсин Cry1Fa, коровий токсин Cry1Da і I-мічений коровий токсин Cry1Da. Докладний опис винаходу Як повідомляється в даний заявці, токсин Cry1Da, що продукується в трансгенній кукурудзі (і в інших рослинах наприклад, в бавовнику і сої), виявляє високу ефективність в боротьбі проти совки трав'яної (FAW; Spodoptera frugiperda), у якої виробляється резистентність до активності Cry1Fa. Таким чином, даний винахід частково оснований на несподіваному виявленні того факту, що совка трав'яна, резистентна до дії Cry1Fa, є сприйнятливою (тобто, не має перехресної резистентності) до дії Cry1Da. 2 UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід також частково оснований на несподіваному виявленні того факту, що токсин Cry1Da є ефективним для захисту рослин (таких як рослини кукурудзи) від ураження Cry1Faрезистентної совки трав'яної. Обговорення цього шкідника приводиться, наприклад, в публікації Tabashnik, PNAS (2008), vol. 105 no. 49, 19029-19030. Даний винахід включає застосування токсину Cry1Da для захисту кукурудзи і інших економічно цінних видів рослин від ураження шкідниками і зниження врожайності, що викликається поїданням цих рослин совкою трав'яною або популяціями совки трав'яної, у яких виробляється резистентність до Cry1Fa. Даний винахід також стосується кластера IRM, що використовується для попередження або сповільнення розвитку резистентності совки трав'яної до Cry1Fa і/або Cry1Da. Даний винахід також стосується композицій, що використовуються для боротьби з лускокрилими шкідниками, в клітинах яких продукується білок, що містить коровий токсин Cry1Fa, і білок, що містить коровий токсин Cry1Da. Даний винахід також стосується хазяїна, трансформованого так, щоб він продукував білок, що містить коровий токсин Cry1Fa, і білок, що містить коровий токсин Cry1Da, де вказаним хазяїном є клітина мікроорганізму або рослини. Полінуклеотид Cry1Fa, що розглядається, і полінуклеотид Cry1Da, що розглядається, переважно присутні в генетичній конструкції під контролем промотору, що не є промотором Bacillus thuringiensis (функціонально приєднані до цьому промотору/містять цей промотор). Полінуклеотиди, що розглядаються, можуть містити звичайно кодони, що зустрічаються в цій рослині, що сприяють підвищенню рівня експресії в рослині. Даний винахід також стосується способу боротьби з лускокрилими шкідниками, що включає контактування вказаних шкідників або середовища їх проживання з ефективною кількістю композиції, що містить білок, який включає коровий токсин Cry1Fa, а також білок, що включає коровий токсин Cry1Da. У одному з своїх варіантів, даний винахід стосується рослини кукурудзи, що включає експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Cry1Da, і експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Cry1Fa, і насіння такої рослини. У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується рослини кукурудзи, де експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Cry1Da, і експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Cry1Fa, були введені у вказані рослини кукурудзи і в насіння таких рослин шляхом інтрогресії. Рецептори комах. Як описано в прикладах, дослідження на конкурентне зв'язування з рецептором, що проводиться з використанням радіоактивно міченого білка корового токсину Cry1Da, показало, що цей білок корового токсину Cry1Fa не конкурує за високоафінне зв'язування з сайтом, присутнім в тканинах комахи FAW, з яким зв'язується Cry1Da. Ці результати показали, що комбінація білків Cry1Fa і Cry1Da являє собою ефективний засіб для послаблення вироблення резистентності у популяції FAW до Cry1Fa (і аналогічно, для послаблення вироблення резистентності до Cry1Da), а також для підвищення рівня резистентності рослин кукурудзи, експресуючих обидва ці білки, до вказаного шкідника. Таким чином, частково на основі даних, описаних вище, і даних, представлених в літературі, можна зробити висновок, що спільне продукування (у вигляді кластера) білків Cry1Da і Cry1Fa може бути застосоване для отримання високої дози IRM-кластера, що використовується для боротьби з FAW. У цю комбінацію можуть бути додані і інші білки для розширення спектра комах-шкідників, що знищуються. Так, наприклад, для кукурудзи, додавання Cry1Ab дозволить створити IRM-піраміду, що використовується для боротьби з європейським кукурудзяним трачем. У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується застосування одного або двох білків Cry1Fa і Cry1Da в комбінації з іншим третім токсином/геном, і застосування цього трикомпонентного кластера для послаблення вироблення резистентності у FAW до будь-якого з цих токсинів. Таким чином, в іншому своєму варіанті, даний винахід стосується застосування одного, двох або трьох (або більше) з цих білків в сільськогосподарських регіонах, де FAW може розвиватися в резистентні популяції. Відповідно до цього, даний винахід також частково стосується "трикомпонентних кластерів" або "пірамід" з трьох (або більше) токсинів, де токсини Cry1Fa і Cry1Da являють собою базову пару. Одна з переважних пірамід включає щонайменше два білки, що не мають перехресну резистентність до двох шкідників до FAW і до ECB (Європейського кукурудзяного трача; Ostrinia nubilalis); Cry1Fa плюс Cry1Da плюс один або декілька анти-ЕСВ токсинів, таких як Cry1Ab (див. заявку США 20080311096), оскільки Cry1F має активність проти обох комах. Іншими токсинами проти ECB є Cry1Be (див. заявку США 3 UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 реєстр. № 61/284290, подану 16 грудня, 2009), Cry1I (див. заявку США реєстр. № 61/284278, подану 16 грудня, 2009), Cry2Aa (див. заявку США реєстр. № 61/284278, подану 16 грудня 2009) і DIG-3 (див. заявку США 201000269223). У деяких переважних варіантах "піраміди", вибрані токсини мають три різні механізми дії проти FAW. Такими переважними пірамідними комбінаціями з "трьома механізмами дії" є Cry1Fa плюс Cry1D плюс інший токсин/ген, вибраний з групи, яка складається з Vip3Ab, Cry1С (див. заявку США реєстр. № 61/284252, подану 16 грудня, 2009), Cry1Be і Cry1E (див. заявку США реєстр. № 61/284278, подану 16 грудня 2009). Рослини (і посівні площі, засіяні такими рослинами), які продукують ці три токсини, входять в об'єм даного винаходу. Можуть бути також додані додаткові токсини/ген, і ці конкретні трикомпонентні кластери, відповідно до даного винаходу, будуть, як несподівано було виявлено, переважно діяти проти FAW по трьох механізмах. Це допоможе знизити або уникнути потреби в площах-"сховищах" нетрансгенних культур. Таким чином, в даному винаході розглядається поле, засіяне культурами на площі понад 10 акрів. Таким чином, Cry1Da може бути використаний у вигляді комбінації з 3 генів для кукурудзи, яка в цей час знаходиться на стадії Дослідження I процесу вироблення нових ознак. Cry1Fa присутній в продуктах Herculex®, SmartStax™ і WidesStrike™. Відповідно до цього, використання Cry1Da може мати важливе значення для зниження тиску відбору на інші промислові білки. Інші токсини, наприклад, Vip3, перераховані в Додатку А. Ці номери GENBANK можуть бути також використані для ідентифікації послідовностей будь-яких описаних і згаданих тут генів і білків. У патенті США № 5188960 і в патенті США № 5827514 описані білки, які містять коровий токсин Cry1Fa, і які можуть бути використані для здійснення даного винаходу. У патенті США № 6218188 описані оптимізовані для рослини послідовності ДНК, що кодують білки, які містять коровий токсин Cry1Fa, і які можуть бути використані в даному винаході. Комбінації токсинів, описаних в даному винаході, можуть бути використані для боротьби з лускокрилими шкідниками. Дорослі лускокрилі, наприклад, метелики і молі, харчуються, головним чином, нектаром і грають значну роль в запиленні. Майже всі личинки лускокрилих, тобто, гусениці, поїдають рослини, і багато з них є небезпечними шкідниками. Гусениці живуть на листі або поїдають внутрішню частину листя, або вони пошкоджують коріння або стебла рослини, що приводить до виснаження поживних речовин у рослини, і в більшості випадків, до руйнування основної фізичної структури рослини. Крім того, гусениці пошкоджують плоди, тканини і зерно, що зберігається, і борошно, в результаті чого продукти або взагалі стають непридатними для продажу, або їх комерційна цінність значно знижується. Використовуваний тут термін "лускокрилі шкідники" також стосується різних стадій життєвого циклу шкідника, включаючи стадії розвитку личинок. Деякі химерні токсини згідно з винаходом містять повнорозмірну частину N-кінцевого корового токсину Bt, і в певному положенні, розташованому за частиною корового токсину, цей білок переходить в гетерологічну послідовність протоксину. N-кінцева, інсектицидно активна частина токсину Bt називається "коровим токсином". Перехід від корового сегмента токсину в гетерологічний сегмент протоксину може відбуватися приблизно в області стику токсин/протоксин, або альтернативно, частина нативного протоксину (що простягається за межі корової частини токсину) може зберігатися, причому, перехід в гетерологічну частину протоксину може відбуватися нижче. Одним з прикладів може служити один химерний токсин згідно з винаходом, який являє собою повнорозмірну частину корового токсину Cry1Fa (амінокислоти 1-601) і гетерологічний протоксин (амінокислоти від положення 602 до С-кінця). У одному переважному варіанті винаходу, частина химерного токсину, що містить протоксин, походить від токсину білка Cry1Ab. Другим прикладом може служити другий химерний токсин згідно з винаходом, який являє собою частину повнорозмірного корового токсину Cry1Da (амінокислоти 1-619) і гетерологічний протоксин (амінокислоти від положення 620 до С-кінця). У переважному варіанті винаходу, частина химерного токсину, що містить протоксин, походить від токсину білка Cry1Ab. Для фахівців в даній галузі очевидно, що токсини Bt, навіть токсини, що належать до певного класу, такого як Cry1F, можуть до деякої міри варіюватися по своїй довжині і точній локалізації переходу від частини корового токсину в частину протоксину. Звичайно, токсини Cry1Da і Cry1Fa мають довжину приблизно від 1150 до 1200 амінокислот. Перехід від частини корового токсину в частину протоксину звичайно відбувається на ділянці між частинами, що складають приблизно від 50 % і приблизно до 60 % від всієї довжини токсину. Химерний токсин згідно з винаходом включає повнорозмірну область цієї N-кінцевої частини корового токсину. Таким чином, химерний токсин містить щонайменше приблизно 50 % повнорозмірного білка Cry1Fa токсину Bt або щонайменше приблизно 50 % повнорозмірного білка токсину Bt Cry1Da. 4 UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей білок має довжину, що звичайно складає щонайменше приблизно 590 амінокислот. Що стосується частини протоксину, то повнорозмірна область частини протоксину Cry1Ab простягається від кінця частини корового токсину до С-кінця молекули. Гени і токсини. Гени і токсини, що використовуються в даному винаході, включають не тільки описані тут повнорозмірні послідовності, але також і фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутанти і гібридні білки, які зберігають характерну пестицидну активність токсинів, конкретно описаних в даній заявці. Використовувані тут терміни "варіанти" або "модифікації" генів означають нуклеотидні послідовності, які кодують ті ж самі токсини або токсини, еквівалентні токсинам, що мають пестицидну активність. Використовуваний тут термін "еквівалентні токсини" означає токсини, що мають таку ж або, по суті, такою ж біологічну активність проти шкідниківмішеней, як і заявлені токсини. Межі ідентичності, що використовуються тут, становлять приблизно 95 % (Cry1Fa і Cry1Da), 78 % (Cry1F і Cry1D) і 45 % (Cry1) відповідно до "змін номенклатури для пестицидних кристалічних білків Bacillus thuringiensis" ("Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813). Такі межі можуть бути також застосовані тільки для корових токсинів (для токсинів Cry1F і Cry1D). Для фахівців в даній галузі очевидно, що гени, які кодують активні токсини, можуть бути ідентифіковані і отримані декількома способами. Специфічні гени або частини генів, описані в даний заявці, можуть бути отримані з ізолятів, депонованих в депозитаріях культур. Ці гени або їх частини або варіанти можуть бути також сконструйовані шляхом синтезу, наприклад, на синтезаторі генів. Варіанти генів можуть бути легко сконструйовані стандартними методами отримання точкових мутацій. Крім того, фрагменти цих генів можуть бути отримані з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз відповідно до стандартних процедур. Так, наприклад, для систематичного відщеплення нуклеотидів від кінців цих генів можуть бути використані ферменти, такі як Bal31, або може бути застосований сайтнаправлений мутагенез. Гени, що кодують активні фрагменти, можуть бути також отримані з використанням різних рестриктуючих ферментів. Для безпосереднього отримання активних фрагментів цих білків-токсинів можуть бути використані протеази. Фрагменти і еквіваленти, які зберігають пестицидну активність описаних тут токсинів, входять в об'єм даного винаходу. Крім того, внаслідок надлишковості генетичного коду, ряд різних послідовностей ДНК може кодувати описані тут амінокислотні послідовності. Фахівець в даній галузі може легко отримати такі альтернативні послідовності ДНК, що кодують ті ж самі або, по суті, ті ж самі токсини. Такі варіанти послідовностей ДНК входять в об'єм даного винаходу. Використовуваний тут термін "по суті, ті ж самі" послідовності означає послідовності, які мають амінокислотні заміни, делеції, додавання або інсерції, які фактично не чинять впливу на пестицидну активність. У це визначення також входять фрагменти генів, що кодують білки, які зберігають пестицидну активність. Іншим методом ідентифікації генів, що кодують токсини і частини генів, що використовуються в даному винаході, є застосування олігонуклеотидних зондів. Такими зондами є нуклеотидні послідовності, що детектуються. Такі послідовності можуть бути детектовані за допомогою відповідної мітки, або вони можуть бути спочатку зроблені флуоресцентними, як описано в Міжнародній заявці № WO93/16094. Як добре відомо фахівцям, якщо молекула-зонд і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються за допомогою утворення міцного зв'язку між двома молекулами, то розумно передбачити, що такий зонд і зразок будуть мати значну гомологію. Гібридизацію, переважно, проводять в жорстких умовах із застосуванням методів, добре відомих фахівцям, наприклад, описаних Keller, G. Н., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Нижче приводяться деякі приклади комбінацій концентрацій солі і температур (в порядку зростання жорсткості): 2 х SSPE або SSC при кімнатній температурі; 1 х SSPE або SSC при 42 °C; 0,1 х SSPE або SSC при 42 °C; 0,1 х SSPE або SSC при 65 °C. Детектування зонда являє собою відомий метод, що застосовується для того, щоб визначити, відбувається гібридизація чи ні. Такий аналіз з використанням зонда являє собою швидкий метод ідентифікації токсин-кодуючих генів згідно з винаходом. Нуклеотидні сегменти, що використовуються як зонди згідно з винаходом, можуть бути синтезовані на синтезаторі ДНК відповідно до стандартних процедур. Ці нуклеотидні послідовності можуть бути також використані як ПЛР-праймери для ампліфікації генів згідно з винаходом. Варіанти токсинів. Деякі токсини згідно з винаходом конкретно описані в даний заявці. Оскільки ці токсини приводяться тут просто як приклади токсинів згідно з винаходом, то 5 UA 113273 C2 5 10 15 потрібно зазначити, що даний винахід включає варіанти токсинів або еквівалентні токсини (і нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), що мають таку ж пестицидну активність, як і представлений тут токсин, або аналогічну активність. Еквівалентні токсини мають амінокислотну послідовність, гомологічну амінокислотній послідовності представленого тут токсину. Така гомологія амінокислотних послідовностей звичайно складає більше ніж 75 %, переважно, більше ніж 90 %, а найбільш переважно, більше ніж 95 %. Гомологія амінокислотних послідовностей є найвищою в критичних областях токсину, що відповідають за біологічну активність або визначають тривимірну конфігурацію, яка, зрештою, відповідальна за біологічну активність. Відповідно до цього, деякі амінокислотні заміни є допустимими і можуть бути присутнім в тих областях, які не грають важливої ролі в повідомленні активності, або є консервативними амінокислотними замінами, які не впливають на тривимірну конфігурацію молекули. Так, наприклад, амінокислоти можуть бути поділені на наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислотні. Таким чином, при консервативних замінах, амінокислоту одного класу замінюють іншою амінокислотою того ж типу, і така заміна входить в об'єм даного винаходу, за умови, що вона, фактично, не буде впливати на біологічну активність сполуки. Нижче представлений список прикладів амінокислот, що належать до кожного класу. Таблиця Клас амінокислот Неполярні Незаряджені полярні Кислотні Основні 20 25 30 35 40 45 50 Приклади амінокислот Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trр Gly, Ser, Thr, Сys, Tyr, Asn, Gln Asр, Glu Lys, Arg, His У деяких випадках можуть бути також зроблені неконсервативні заміни. Важливим фактором є те, що такі заміни не повинні значно знижувати біологічну активність токсину. Рекомбінантні хазяїни. Гени, що кодують токсини згідно з винаходом, можуть бути введені мікробним або рослинним хазяїнам широкого ряду. Експресія гена токсину приводить, прямо або опосередковано, до продукування пестициду всередині клітин і його збереження в цих клітинах. Для отримання штаму Bt, що експресує обидва токсини згідно з винаходом, може бути застосоване кон'югативне і рекомбінантне перенесення. Інші організми-хазяїни можуть бути також трансформовані одним або обома генами токсинів, що використовуються для досягнення синергічного ефекту. З використанням прийнятних мікробів-хазяїнів, наприклад, Pseudomonas, ці мікроби можуть бути внесені в місця проживання шкідників, де вони можуть розмножуватися і поїдати ці мікроби. Це буде приводити до знищення шкідників. Альтернативно, мікроб, що містить ген токсину, може бути оброблений в умовах, сприяючих пролонгуванню активності токсину і стабілізації клітини. Оброблена клітина, яка зберігає токсичну активність, може бути потім внесена в середовище проживання шкідників-мішеней. Якщо ген токсину Bt вводять мікробу-хазяїну за допомогою прийнятного вектора, і якщо вказаний хазяїн вносять в середовище проживання в живому вигляді, то важливо, щоб були використані певні мікроби-хазяїни. При цьому, вибирають такі мікроорганізми-хазяїни, які, як відомо, займають певну "фітосферу" (філоплан, філосферу, ризосферу і/або ризоплан) однієї або декількох культур, які представляють інтерес. Ці мікроорганізми вибирають так, щоб вони мали здатність успішно конкурувати в конкретних умовах (в культурі і в іншому середовищі проживання комах) з мікроорганізмами дикого типу, забезпечували стабільне збереження і експресію генів, що кодують поліпептид-пестицид, і бажано, забезпечували кращий захист пестициду від руйнування і інактивації в умовах навколишнього середовища. Відомо, що велике число мікроорганізмів проживає на філоплані (на поверхні листя рослин) і/або на ризосфері (в ґрунті, що оточує коріння рослин) цінних сільськогосподарських культур широкого ряду. Такими мікроорганізмами є бактерії, водорості і гриби. Особливий інтерес представляють такі мікроорганізми, як бактерії, наприклад, бактерії роду Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc і Alcaligenes; гриби, а зокрема, дріжджі, наприклад, дріжджі роду Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula і Aureobasidium. Особливий інтерес представляють такі види бактерій фітосфер, як Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus і Azotobacter vinlandii; і дріжджів-фітосфер, таких як Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus 6 UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 albidus, С. diffluens, С. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae і Aureobasidium pollulans. Особливий інтерес представляють пігментовані мікроорганізми. Для введення гена Bt, що кодує токсин, мікроорганізму-хазяїну в умовах, що забезпечують стабільне збереження гена і стабільну експресію гена, можуть бути застосовані методи широкого ряду. Такі методи добре відомі фахівцям в даній галузі і описані, наприклад, в патенті США № 5135867, який вводиться в даний опис за допомогою посилання. Обробка клітин. Bacillus thuringiensis або рекомбінантні клітини, експресуючі токсини Bt, можуть бути оброблені з метою пролонгування активності токсину і стабілізації клітин. Пестицидна мікрокапсула, що утворюється, містить токсин або токсини Bt в клітинній структурі, яка стабілізує і захищає токсин у випадку, коли цю мікрокапсулу вносять в середовище проживання шкідника-мішені. Прийнятними клітинами-хазяїнами можуть бути прокаріоти або еукаріоти, і такими клітинами звичайно є, але не обмежуються ними, клітини, які не продукують речовини, що є токсичними для вищих організмів, таких як ссавці. Однак, можуть бути також використані і мікроорганізми, які продукують речовини, токсичні для вищих організмів, але, при цьому, ці токсичні речовини є нестабільними, або рівень їх введення є досить низьким, що виключає можливість якого-небудь токсичного впливу на ссавця-хазяїна. Як хазяїни, особливий інтерес представляють прокаріоти і нижчі еукаріоти, такі як гриби. Клітини, що обробляються, звичайно є інтактними і, по суті, знаходяться в проліферативній формі, а не в формі спор, хоча, в деяких випадках можуть використовуватися і спори. Обробка мікробних клітин, наприклад, мікробів, що містять ген або гени токсину Bt, може бути здійснена хімічними і/або фізичними методами, або комбінацією хімічних і фізичних методів, за умови, що такий метод не буде чинити негативного впливу на властивості токсину і не буде приводити до зниження здатності клітин захищати токсин. Прикладами хімічних реагентів є галогенуючі агенти, а зокрема, галогени з атомними номерами 17-80. Більш конкретно, може бути використаний йод в м'яких реакційних умовах протягом певного періоду часу, достатнього для досягнення бажаних результатів. Іншими прийнятними методами є обробка альдегідами, такими як глутаральдегід; протиінфекційними агентами, такими як хлорид зефірану і хлорид цетилпіридинію; спиртами, такими як ізопропіловий спирт і етанол; різними гістологічними фіксаторами, такими як йод Люголя, фіксатор Боуїна; різні кислоти і фіксатор Хеллі (см: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); або комбінацією фізичного методу (нагрівання) і хімічних агентів, які зберігають і пролонгують активність токсину, що продукується в клітинах, введених в середовище проживання хазяїна. Прикладами фізичних методів є короткохвильове випромінювання, таке як гаммавипромінювання і рентгенівське випромінювання, заморожування, УФ-опромінення, ліофілізація і т. п. Методи обробки мікробних клітин описані в патентах США №№ 4695455 і 4695462, які вводяться в даний опис за допомогою посилання. Ці клітини звичайно мають підвищену структурну стабільність, що приводить до збільшення резистентності до умов навколишнього середовища. Якщо пестицид присутній в формі попередника, то спосіб обробки клітин повинен бути вибраний так, щоб він не приводив до інгібування процесингу попередника з утворенням зрілої форми пестициду під дією патогена шкідника-мішені. Так, наприклад, формальдегід буде забезпечувати перехресне зшивання з білками, і тим самим інгібувати процесинг попередника поліпептидного пестициду. Спосіб обробки повинен зберігати щонайменше значну міру біологічної доступності або біологічної активності токсину. Властивостями, що представляють особливий інтерес для продукування при виборі клітинихазяїна, є простота введення гена або генів Bt хазяїну, доступність експресійних систем, ефективність експресії, стабільність пестициду в хазяїні і наявність додаткових генетичних ознак. Технологічними властивостями пестицидних мікрокапсул, які представляють інтерес, є їх захисна здатність відносно пестициду, наприклад, товщина клітинних стінок, пігментація і внутрішньоклітинна упаковка або здатність утворювати тільця включення; виживаність у водному середовищі; відсутність токсичності для ссавців; привабливість з точки зору поїдання шкідниками; простота утилізації; фіксація без пошкодження токсину і т. п. Іншими властивостями, що розглядаються, є простота приготування препарату і його транспортування, матеріальні витрати, стабільність при зберіганні і т. п. Культивування клітин. Клітина-хазяїни, що містять інсектицидний ген або гени B.t., можуть бути вирощені в будь-якому прийнятному поживному середовищі, в якому ДНК-конструкція буде забезпечувати селективну перевагу, тобто, забезпечувати селективне середовище, в якій всі або майже всі клітини будуть зберігати ген B.t. Потім ці клітини можуть бути зібрані звичайними способами. Альтернативно, ці клітини можуть бути оброблені до їх збирання. 7 UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Клітини B.t., що продукують токсини згідно з винаходом, можуть бути культивовані з використанням стандартних середовищ і методом ферментації. Після завершення циклу ферментації, бактерії можуть бути зібрані спочатку шляхом відділення спор і кристалів B.t. від зброджуваного бульйону стандартними методами. Виділені спори і кристали B.t. можуть бути приготовані у вигляді змочуваного порошку; рідкого концентрату; гранул або інших препаратів, отриманих шляхом додавання поверхнево-активних речовин, диспергуючих речовин, інертних носіїв і інших компонентів, що полегшує транспортування, і обробку ними конкретних шкідниківмішеней. Такі процедури приготування і застосування добре відомі фахівцям. Препарати. Приготовані гранули-приманки, що містять атрактант і спори, кристали і токсини ізолятів B.t., або рекомбінантні мікроби, що містять гени, отримані з описаних тут ізолятів B.t., можуть бути внесені в ґрунт. Приготований продукт може бути застосований у вигляді покриття, що наноситься на насіння, або препарату для обробки коріння або всієї рослини на останніх стадіях циклу вирощування сільськогосподарської культури. Для обробки рослин і ґрунту, клітини B.t. можуть бути приготовані у вигляді змочуваних порошків, гранул або дустів, шляхом змішування з різними інертними матеріалами, такими як неорганічні мінеральні речовини (філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати і т. п.) або рослинні матеріали (подрібнені в порошок качани кукурудзи, рисове лушпиння, шкаралупа волоського горіха і т. п.). Такі препарати можуть включати ад'юванти типу "розпилювачів-зв'язувальних речовин", стабілізуючі агенти, інші пестицидні добавки або поверхнево-активні речовини. Рідкі препарати можуть бути водними або безводними, і можуть бути використані у вигляді пін, гелів, суспензій, емульгованих концентратів або т. п. Інгредієнтами можуть бути реологічні агенти, поверхневоактивні речовини, емульгатори, диспергуючі речовини або полімери. Як відомо фахівцям в даній галузі, концентрація пестициду може значно варіюватися залежно від природи конкретного препарату, а зокрема, залежно від того, чи використовується він у вигляді концентрату або в чистому вигляді. Пестицид складає щонайменше 1 % по масі, а може становити 100 % по масі. Сухі препарати можуть становити приблизно 1-95 % по масі пестициду, а рідкі препарати звичайно становлять приблизно 1-60 % по масі твердих речовин в 2 4 рідкій фазі. Ці препарати звичайно містять приблизно від 10 до 10 клітин/мг. Ці препарати можуть бути введені в кількості приблизно від 50 мг (в рідкому або в сухому вигляді) до 1 кг або більше на гектар. Препарати можуть бути внесені в середовище проживання лускокрилих шкідників, наприклад, нанесені на листя або ґрунт шляхом розпилення, опилювання, зрошування або т. п. Трансформація рослин. Переважними рекомбінантними хазяїнами, які можуть бути використані для продукування інсектицидних білків згідно з винаходом, є трансформовані рослини. Гени, що кодують описані тут білки токсинів Bt, можуть бути введені в рослинні клітини із застосуванням різних методів, добре відомих фахівцям. Так, наприклад, існує велике число клонуючих векторів, що містять систему реплікації в Escherichia coli, і маркер, що дозволяє провести відбір трансформованих клітин, і ці вектори можуть бути використані з метою отримання препарату для інсерції чужорідних генів у вищі рослини. Вектори містять, наприклад, inter alia pBR322, серії pUC, серії M13mp, pACYC184. Відповідно до цього, ДНК-фрагмент, що має послідовність, яка кодує білок токсину Bt, може бути вбудований у вектор у прийнятний рестрикційний сайт. Отриману плазміду використовують для трансформації Е. coli. Клітини E. coli культивують у прийнятному поживному середовищі, а потім збирають і піддають лізису. Потім цю плазміду виділяють. Методами аналізу звичайно є аналіз послідовності, рестрикційний аналіз, електрофорез і інші методи, що застосовуються в біохімії і молекулярній біології. Після кожної маніпуляції використовувана послідовність ДНК може бути розщепленням і приєднана до наступної послідовності ДНК. Кожна послідовність плазміди може бути клонована в одній і тій же або в інших плазмідах. Залежно від методу вбудовування потрібних генів в рослину, можуть виявитися необхідними і інші послідовності ДНК. Так, наприклад, якщо плазміду Ti або Ri використовують для трансформації клітин рослини, то щонайменше правий кордон, а в більшості випадків, правий і лівий кордони Т-ДНК-плазміди Ti або Ri приєднують як фланкуючу область генів, що вбудовуються. Використання Т-ДНК для трансформації клітин рослин було ретельно досліджене і детально описане в EP 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986), і An et al., (1985), і добре відомо фахівцям. Після інтеграції вбудованої ДНК в геном рослини, така ДНК стає відносно стабільною. Трансформуючий вектор звичайно містить селективний маркер, який повідомляє трансформованим клітинам рослини резистентність до біоциду або антибіотику, таких як біалафос, канаміцин, G418, блеоміцин або гігроміцин, inter alia. З використанням окремо взятого маркера можна, відповідно, здійснювати відбір трансформованих клітин, а не клітин, які не містять вбудовану ДНК. 8 UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Існує багато методів, прийнятних для вбудувування ДНК в клітини рослин-хазяїнів. Такими методами є трансформація молекулою Т-ДНК з використанням Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як трансформуючі агенти, злиття, інжекція, біобалістичні методи (бомбардування мікрочастинками) або електропорація, а також інші можливі методи. Якщо для трансформації використовуються агробактерії, то ДНК, що вбудовується, клонують в конкретні плазміди, а саме, в проміжний вектор або в бінарний вектор. Проміжні вектори можуть бути інтегровані в плазміду Ti або Ri за допомогою гомологічної рекомбінації з використанням послідовностей, гомологічних послідовностям, присутнім в Т-ДНК. Плазміда Ti або Ri також містить область vir, необхідну для перенесення Т-ДНК. Проміжні вектори не можуть самі реплікуватися в агробактеріях. Проміжний вектор може бути перенесений в Agrobacterium tumefaciens за допомогою хелперної плазміди (кон'югування). Бінарні вектори можуть самі реплікуватися як в Е. coli, так і в агробактеріях. Вони містять селективний маркерний ген і лінкер або полілінкер, які замикають праву і ліву приграничні області Т-ДНК. Вони можуть бути трансформовані безпосередньо в агробактерії (Holsters et al., 1978). Агробактерія, що використовується як клітина-хазяїн, містить плазміду, що несе область vir. Область vir необхідна для перенесення Т-ДНК в клітину рослини. Може також бути присутньою і додаткова Т-ДНК. Трансформованим таким чином бактерію використовують для трансформації клітин рослин. Рослинні експлантати можуть бути переважно культивовані з Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes для перенесення ДНК в клітину рослини. Потім цілі рослини можуть бути вирощені з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, з шматочків листя, сегментів стебел, коріння, а також протопластів або клітин, культивованих суспензійним методом) у прийнятному середовищі, яке може містити антибіотики або біоциди для відбору. Потім вирощеним таким чином рослини можуть бути протестовані на присутність вбудованої ДНК. У випадку інжекції і електропорації, яких-небудь спеціальних вимог до отримання плазмід не пред'являється. При цьому, можуть бути використані стандартні плазміди, такі як, наприклад, похідні pUC. Трансформовані клітини розвиваються в рослині як звичайно. Вони можуть утворювати зародкові клітини і передавати трансформовану(і) ознаку(и) потомству. Такі рослини можуть бути вирощені звичайним способом і схрещені з рослинами, що мають трансформовані наслідувані фактори або інші наслідувані фактори. Отримані гібридні рослини мають відповідні фенотипічні властивості. У переважному варіанті винаходу, рослини трансформують генами, у яких зустрічальність кодонів оптимізована для рослин. Див., наприклад, патент США № 5380831, що вводиться в даний опис за допомогою посилання. Хоча в даній заявці описані деякі зрізані токсини, однак, фахівцям з Bt добре відомо, що токсини, які належать до типу токсинів довжиною 130 кДа (повнорозмірні), мають N-кінцеву половину, що являє собою коровий токсин, і С-кінцеву половину, що являє собою протоксиновий "хвіст". Таким чином, відповідні "хвости" можуть бути використані разом із зрізаними/коровими токсинами відповідно до винаходу. Див., наприклад, патент США № 6218188 і патент США № 6673990. Крім того, методи створення синтетичних генів Bt для їхнього використання в рослинах відомі фахівцям (Stewart and Burgin, 2007). Одним з необмежувальних прикладів переважного трансформованої рослини є фертильна рослина кукурудзи, що містить експресований у рослині ген, кодуючий білок Cry1Fa, а також другий експресований у рослині ген, кодуючий білок Cry1Da. Перенесення (або інтрогресія) Cry1Fa- і Cry1Da-детермінованого(их) ознаки(к) в інбредні лінії кукурудзи може бути досягнуть шляхом рекурентного селективного схрещування, наприклад, зворотного схрещування. У цьому випадку, потрібну рекурентну рослину спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентним батьком), що несе відповідний(і) ген(и), що повідомляє(ють) Cry1F- і Cry1D-детерміновані ознаки. Потім потомство цього кроса піддають зворотному схрещуванню з рекурентною рослиною з наступним відбором отриманого потомства на потрібну(і) ознаку(и), перенесену(і) від нерекурентного батька. Через три, переважно, чотири, а ще більш переважно, через п'ять або більше поколінь "бекросів" з рекурентним батьком з відбором на потрібну(і) ознаку(и), потомство буде гетерозиготним по локусах, що контролює перенесену(і) ознаку(и), але воно буде аналогічне рекурентному батьку по більшості або майже по всіх інших генах (див., наприклад, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376). Стратегії вирощування культур, резистентних до комах (IRM). Наприклад, Roush і співробітниками були описані стратегії з використанням двох токсинів, що також називаються створенням "пірамід" або "кластерів" для вирощування трансгенних культур, що мають інсектицидні властивості. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786). 9 UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 На web-сайті Агенства США по захисту навколишнього середовища (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006. htm) опубліковані наступні вимоги по забезпеченню площ-сховищ з не-трансгенними культурами (тобто, не-B.t.) культурами (земельної ділянки із сільськогосподарськими не-вt-культурами/кукурудзою) для їхнього використання під трансгенні культури, що продукують один білок Bt, що має активність проти шкідників-мішеней. "Конкретними структурними вимогами до продуктів з Bt-кукурудзи (Cry1Ab чи Cry1F), захищеної від кукурудзяного трача, є: Структурні площі-"сховища": 20 % площі-притулку під Bt- кукурудзу, не захищену від Лускокрилих у Кукурудзяному поясі; 50 % площі-притулку під Bt-бавовник, не захищений від Лускокрилих у Бавовняному поясі; Блоки: Внутрішні (тобто, у полях з Bt); Зовнішні (тобто, окремі поля в межах ½ милі (по можливості ¼ милі) від Bt-поля для максимізації вільного схрещування). Смужки регулярно оброблюваних сільськогосподарських земель: Ці смужки повинні мати ширину щонайменше в 4 ряди (переважно, 6 рядів) для зниження числа випадків міграції личинок". Крім того, Національна асоціація виробників кукурудзи, на своєму web-сайті (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) також опублікувала аналогічний посібник з вимог для площ-сховищ. Так, наприклад: "Вимоги до IRM у випадку кукурудзяного трача: - засівати щонайменше 20 % акрів кукурудзою для збереження нетрансгенних гібридів; - у регіонах вирощування бавовнику, повинно залишатися 50 % площі-притулку; - повинно бути засіяно 1/2 милі нетрансгенними гібридами; - площі-сховища можуть бути засіяні смугами на Bt-поля; площі-сховища повинні бути засіяні у вигляді смуг, що повинні мати ширину щонайменше в 4 ряди; - площі-сховища можуть бути оброблені стандартними пестицидами тільки, якщо досягаються економічні пороги для комах-мішеней; - розпилювані інсектициди на основі Bt не можуть бути використані на площах-сховищах під кукурудзу; - відповідне сховище повинне бути засіяне Bt-кукурудзою на кожній фермі" Як указували Roush і співробітники (наприклад, на сторінках 1780 і 1784 у правому стовпчику), кластери або піраміди з двох різних білків, кожний з який є ефективним проти шкідників-мішеней з мінімальною перехресною резистентністю або з відсутністю такої резистентності, можуть бути використані на дрібніших "сховищах" нетрансгенних рослин. Roush висловив припущення, що для успішного використання кластерів, площа-сховище, розмір якого складає менше ніж 10 %, може бути оброблений культурою з резистентністю, порівнянною з резистентністю культур, оброблюваною приблизно на 50 % площі-притулку для одного (непірамідного) токсину. Що стосується доступних у даний час продуктів з кукурудзи, що містять "пірамідні" Bt, то Агентство США по захисту навколишнього середовища вимагає, щоб значно менша (звичайно 5 %) площа структурного притулку була засіяна не-Bt кукурудзою, а не культурою з одним токсином (звичайно 20 %). Існують різні шляхи забезпечення IRM-ефектів використання площ-сховищ, включаючи різні геометричні схеми засівання на поля (як згадувалося вище) і суміші насіння в одному пакеті, що також обговорюється Roush і ін. (див. вище), і в патенті США № 6551962. Вищевказані відсотки або аналогічні співвідношення площ-сховищ можуть бути використані для розглянутих двокомпонентних або трикомпонентних кластерів або пірамід. Для трикомпонентних кластерів із трьома механізмами дії проти одного шкідника-мішені, притулку взагалі бути не повинно (або наприклад, площа-сховище повинен бути меншим 5 %). Це особливо справедливо для площ під комерційні культури, наприклад, понад 10 акрів. Усі патенти, патентні заявки, попередні заявки і або публікації цитовані в них роботи у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання в тому ступені, у якому вони відповідають детальному опису даної заявки. Нижче приводяться приклади, що ілюструють способи практичного здійснення даного винаходу. Ці приклади не повинні розглядатися як обмеження обсягу винаходу. Усі відсотки дані по масі, а всі співвідношення сумішей розчинників дані по обсязі, якщо це не обговорено особливо. Усі температури дані в градусах Цельсія. 10 UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Якщо це не зазначено або не мається на увазі конкретно, то використовувані тут артиклі "a", "an" і "the" означають "щонайменше один". Приклад 1 Дані біоаналізу Cry1Da, експресований у трансгенній кукурудзі (pDAS5163), забезпечує захист від поїдання совкою трав'яною (FAW), Spodoptera frugiperda (J.E. Smith). Така експресія є ефективнішої для боротьби з FAW, у яких виробляється резистентність до Cry1Fa, і очевидно, ще ефективнішої для рослин кукурудзи, що містять модифікацію TC1507, де зазначена модифікація, імовірно, є ознакою, що повідомляє резистентність, що може бути використана у провідних галузях промисловості для боротьби з FAW. Авторами винаходу було також продемонстровано, що Cry1Fa (білок від рекомбінантного штаму DR1649 Pseudomonas fluorescens; плазміда pDAB1817) і Cry1Da (білок від рекомбінантного штаму DC782 Pseudomonas fluorescens) є ефективними для боротьби з FAW, як показали біоаналізи, проведені з використанням штучного корму, і що активність цієї комбінації виявилася вище, ніж це очікувалося у випадку використання цих білків окремо. Виходячи з даних, описаних вище, до-експресія Cry1Da і Cry1Fa дає можливість одержати IRM-кластери, що у високій дозі можуть бути використані для боротьби з FAW, з іншим важливим видом Spodoptera species і, імовірно, з іншими лускокрилими шкідниками. У цю комбінацію, для розширення спектра, можуть бути додані й інші білки. Так, наприклад, для кукурудзи, додавання Cry1Ab дозволяє створити IRM-кластер для боротьби з європейським кукурудзяної трачем (ECB), Ostrinia nubilalis (Hubner). На фігурі 1 проілюстроване ушкодження (середній % ушкодження листів + порівн. кв. пом.) сегментів листів кукурудзи, уражених FAW (сині стовпці) або rFAW (пурпурові стовпці). Всі оброблювані зразки, перед яким стоять числа "5163", являють собою сегменти від рослин, трансформованих конструкцією, що містить Cry1Da. Рослини, у яких не була детектована експресія Cry1Da, були розділені на групи, зазначені в лівій крайній частині графіка. Рослини, у яких детектувалася експресія Cry1Da, були розділені на групи, зазначені в центральній частині графіка. Нетрансгенний (тобто, негативний) контроль зазначений у крайній правій частині графіка і позначений "B104", "Hill" і "Isoline". Комерційно доступна інбредна лінія, що містить Cry1Fa, представлена першим обробленим зразком, зазначеним праворуч (позначений "Herculex I"), і є тим же самим генетичним тлом, як і нетрансгенний контроль, позначений "Isoline". Протоксинову химеру, що складається з послідовності, яка кодує розщеплений по кінцях трипсином токсин Cry1Da, і послідовності, яка кодує С-кінцеву область протоксину Cry1Ab, конструювали, а потім вбудовували в експресійний кластер, здатний здійснювати спрямовану експресію в кукурудзі (pDAS5163). Кукурудзу трансформували з використанням Agrobacterium tumefacians, і ідентифікували модифікації, що містять химеру Cry1Da/1Ab. Зрізи листів регенерованих рослин піддавали біоаналізу на поїдання совкою трав'яною дикого типу (FAW) або личинками популяції совки трав'яної, котра є резистентною до Cry1Fa (rFAW). Cry1Da/lAbтрансформовані рослини в меншій мірі поїдалися личинками FAW, однак вони були не так ефективні, як інбредні рослини, що містять 2 копії Cry1Fa (фігура 1). (Протестовані Cry1Daмодифікації були гемізиготними по трансгену, а конвертована інбредна рослина була гомозиготною по модифікації TC1507). На противагу цьому, ті ж самі модифікації, що містять Cry1Da/1Ab, по суті, були набагато ефективнішими відносно зниження міри поїдання личинками rFAW, ніж інбредні лінії, що містять Cry1Fa (фігура 1). Інсектицидну активність Cry1Fa (білка від рекомбінантного штаму Pseudomonas fluorescens DR1649; плазміда pDAB1817), Cry1Da (білка від рекомбінантного штаму P. fluorescens DC782), і комбінації з цих 2 білків у відношенні 1:1 (мас:мас) тестували в стандартних біоаналізах, проведених з використанням штучного корму для оцінки активності. Оцінку активності ® проводили за допомогою аналізу LOGIT (JMP 8.0, SAS Inc. 2008), що давав оцінки LC50 і верхня і нижня межі (95 %) для LC50. Тест на синергізм проводили методом, описаним Tabashnik (1992), у якому передбачувану величину активності комбінації обчислювали по активностях кожного окремого компонента. Дія комбінації вважалася синергічною, якщо оцінена верхня довірча межа активності даної комбінації був нижча, ніж обчислена величина передбачуваної активності. У випадку совки трав'яної (FAW) і популяції совки трав'яної, котрі є резистентними до Cry1Fa (rFAW), верхні довірчі межі для LC50 даної комбінації нижчі, ніж обчислена величина передбачуваної активності (таблиці 1 і 2), з чого можна зробити висновок, що дія комбінації Cry1Fa і Cry1Da на ці 2 популяції є синергічною. Таблиця 1. Оцінка активності, верхня і нижня межі 95 % довірчого інтервалу (LCL і UCL, відповідно) для Cry1Fa, Cry1Da і комбінації 1:1 (мас./мас) з цих 2 білків стосовно совки трав'яної 11 UA 113273 C2 5 дикого типу (FAW), Spodoptera frugiperda. В останньому стовпчику зазначені очікувані величини LC50, отримані виходячи з активності кожного окремого білка по формулі, описаній Tabashnik (1992) (Tabashnik B.E. Evaluation of synergism among Bacillus thuringiensis toxins Applied and Environmental Microbiology 58[10], 3343-3346, 1992). Комбінація вважається синергічною, якщо очікувана величина вища верхньої довірчої межі для даної комбінації. Таблиця 1 FAW Тільки 1Da Тільки 1Fa 1Fa-1Da 10 Величини, що спостерігаються LC50 LCL UCL 530 234 1731 136 75 252 79 49 126 Очікувані LC50 215,8909 Таблиця 2. Оцінка активності, верхня і нижня межі 95 % довірчого інтервалу (LCL і UCL, відповідно), для Cry1Fa, Cry1Da і комбінації 1:1 (мас./мас) з цих 2 білків стосовно Cry1Faрезистентної совку трав'яної (rFAW), Spodoptera frugiperda. В останньому стовпчику зазначені очікувані величини LC50, отримані виходячи з активності кожного окремого білка по формулі, описаній Tabashnik (1992). Комбінація вважається синергічною, якщо очікувана величина вища верхньої довірчої межі для даної комбінації. Таблиця 2 FAW Тільки 1Da Тільки 1Fa 1Fa-1Da LC50 92 3000 39 Величини, що спостерігаються LCL UCL 58 144 27 58 Очікувані LC50 177,9434 15 20 25 30 35 40 45 Приклад 2 Систематизовані дані зв'язування 125 Експерименти по конкурентному зв'язуванню, проведені з використанням I-міченого Cry1Da і мембранних везикул щіткової облямівки (BBMV), виділених у FAW, описані нижче. Результати цих експериментів продемонстрували, що Cry1Da тісно зв'язано зі своїм рецептором, і що Cry1Fa не конкурує з Cry1Da за сайти зв'язування. Якщо резистентність до Cry1Da обумовлена мутацією рецептора, що спостерігається в цих дослідженнях, то отримані дані дають підставу припустити, що Cry1Fa є гарним IRM-засобом для знищення таких резистентних популяцій або зниження розвитку такої резистентності. Результати біоаналізів, проведених з використанням Cry1Fa-резистентної FAW (rFAW), продемонстрували, що Cry1Da є активним стосовно цієї популяції. У цілому, ці дані дозволяють припустити, що Cry1Fa і Cry1Da можуть являти собою IRM-кластер, що ефективно пригнічує розвиток резистентності до будьякого інсектицидного білка. 125 Аналізи на зв'язування з рецептором показали, що I-Cry1Da тісно зв'язується зі своїм(и) рецептором(ами) і може ефективно конкурувати за зв'язування з неміченим Cry1Da. Жоден з 125 Cry1Ab, Cry1Fa або Cry1Be не може конкурувати з I-Cry1Da за зв'язування із сайтом його рецептора в BBMV FAW, що вказує на те, що Cry1Da має унікальний сайт зв'язування в середній частині кишечнику FAW, за зв'язування з яким не можуть конкурувати Cry1Ab, Cry1F і Cry1Be. Оскільки rFAW є такими ж чутливими до Cry1Da, як і FAW дикого типу, то це означає, що передбачуваний сайт рецептора, що є модифікованим у комах rFAW, не є сайтом рецептора, з яким зв'язується Cry1Da. Таким чином, Cry1Da є чудовим партнером по кластеризації для Cry1Fa, оскільки він взаємодіє в іншому сайті мішені, що відповідає за його біологічну активність. 125 125 При додаванні I-Cry1Da до BBMV FAW, витісняти зв'язаний I-Cry1Da здатний тільки сам Cry1Da, що не був позначений радіоактивною міткою. Нездатність Cry1Fa, Cry1Ab і Cry1Be 125 витісняти зв'язаний I-Cry1Da з BBMV указує на те, що в середній частині кишки FAW, Cry1Da зв'язується з унікальним сайтом рецептора, з яким не взаємодіють Cry1Fa, Cry1Ab і Cry1Be, навіть незважаючи на те, що всі ці чотири різні токсини Cry мають активність, спрямовану проти личинок FAW. Приклад 3 Конструювання химерних токсинів, що містять корові токсини Cry1 і гетеролігічні протоксини 12 UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Химерні токсини. Химерні білки, що містять домен корового токсину одного Cry, приєднаного до протоксинового сегмента іншого токсину Cry, були вже описані, наприклад, у патенті США № 5593881 і в патенті США № 5932209. Варіантами химерних білків Cry1Da відповідно до винаходу є химерні токсини, що містять Nкінцевий сегмент корового токсину, що походить від інсектицидного токсину Cry1Da, приєднаного до гетерологічного протоксинового сегмента ендотоксину дельта у визначеному положенні, розташованому за межами сегмента корового токсину. Перехід від корового токсину в гетерологічний сегмент протоксину може відбуватися приблизно в природній області стику токсин/протоксин, або альтернативно, частина нативного протоксину (що простягається за межі сегмента корового токсину) може зберігатися, причому, перехід у гетерологічний протоксин може відбуватися нижче. В одному з варіантів, сегменти корового токсину і протоксину можуть включати точно таку ж амінокислотну послідовність нативних токсинів, від яких вони походять, або вони можуть включати амінокислотні додавання, делеції або заміни, що не погіршують, а можуть навіть поліпшувати біологічну функцію сегментів, зв'язаних один з одним. Так, наприклад, химерний токсин відповідно до винаходу містить сегмент корового токсину, що походить від Cry1Da, і гетерологічний протоксин. У переважному варіанті винаходу, сегмент корового токсину, що походить від Cry1Da2 (594 амінокислоти), приєднаний до гетерологічного сегмента, що містить сегмент протоксину, що походить від дельта-ендотоксину Cry1Ab (545 амінокислот). Послідовність химерного білка з 1139 амінокислот позначена тут Cry1Da. Слід зазначити, що інші химерні гібриди, що містять варіанти корового токсину Cry1Da2, і протоксини, що походять від Cry1Аb, входять в обсяг даного винаходу. Другий химерний білок відповідно до винаходу містить сегмент корового токсину, що походить від Cry1Fa (603 амінокислоти) і приєднаний до гетеролігічного сегмента, що містить сегмент протоксину, що походить від дельта-ендотоксину Cry1Ab (545 амінокислот). Послідовність химерного білка з 1148 амінокислот позначена тут Cry1Fa. Приклад 4 Конструювання експресійних плазмід, що кодують химерні білки і їх експресію в Pseudomonas Для створення експресійної конструкції pDOW2848 Pseudomonas fluorescens (Pf), отриманої з метою продукування повнорозмірного химерного білка Cry1Da, були застосовані стандартні методи клонування [описані, наприклад, в посібнику Sambrook et al, (1989) і Ausubel et al, (1995), і в більш пізніх виданнях]. Продукування білка здійснювали в штамі MB214 Pseudomonas fluorescens (похідному штаму MB101; Р. fluorescens, біовар 1), що має інсерцію модифікованого оперонк lac, як описано в патенті США № 5169760. Основна стратегія клонування включає субклонування фрагмента ДНК, що кодує білок Cry1Da, в плазмідні вектори, в результаті чого цей фрагмент буде поміщений під експресійний контроль промотору Ptac і термінатора rrnBTlT2, що походить від плазміди pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, WI). Одна з таких плазмід позначена pDOW2848, а ізолят MB214, що містить цю плазміду, позначений Dpfl50. Аналіз на ріст і експресію в шейкерних колбах. Продукування білка Cry1Da для характеризації і біологічного аналізу на його дію проти комах здійснювали з використанням штаму Dpf150 P. fluorescens, вирощеного в шейкерних колбах. Продукування білка Cry1Da, що знаходиться під контролем промотору Ptac, здійснювали як описано раніше в патенті США № 5527883. Докладний опис мікробіологічних маніпуляцій приводиться в публікації Squires et al., (2004), в заявці на патент США 20060008877, в заявці на патент США 20080193974 і в заявці на патент США 20080058262, які вводяться в даний опис за допомогою посилання. Експресія була індукована шляхом додавання ізопропіл-(-D-1-тіогалактопіранозиду (IPTG) після першого інкубування протягом 24 годин при 30 °C зі струшуванням. Зразки культур брали під час індукування і в різні періоди часу після індукування. Клітинну густину вимірювали по оптичній густині на 600 нм (OD600). Фракціонування клітин і аналіз зразків в шейкерних колбах, що проводиться за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН. При кожному взятті зразка, клітинну густину зразків доводили до OD600=20, і 1 мл-аліквоти центрифугували при 14000 х g протягом п'яти хвилин. Клітинний осад заморожували при -80 °C. Розчинні і нерозчинні фракції, взяті із заморожених зразків клітинного осаду в шейкерних колбах, отримували з використанням розчину для екстракції бактеріального білка EasyLyse™ (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, WI). Кожний клітинний осад ресуспендували в 1 мл розчину EasyLyse™, а потім розводили 1:4 в буфері для лізису і інкубували зі струшуванням при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Лізат центрифугували при 14000 про/міна протягом 20 хвилин при 40C, і супернатант виділяли у вигляді розчинної фракції. Потім осад (нерозчинну фракцію) ресуспендували в рівному об'ємі 13 UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 забуференого фосфатом фізіологічного розчину (PBS; 11,9 мM Na2HPО4, 137 мM NaCl, 2,7 мM KCl, pH 7,4). Зразки змішували у відношенні 1:1 з 2 х буфером для зразків Леммлі, що містить βмеркаптоетанол (Sambrook et al, див. вище), і кип'ятили протягом 5 хвилин, а потім завантажували на 12 % біс-тріс-гель Criterion XT (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Електрофорез здійснювали в ХТ-буфері MOPS, рекомендованому виробником. Гелі забарвлювали кумасі синім Bio-Safe відповідно до протоколу, рекомендованого виробником (Bio-Rad), і візуалізували з використанням візуалізуючої системи Alpha Innotech (San Leandro, CA). Отримання тілець включення. Отримання тілець включення білка Cry1Da (IB) здійснювали в клітинах, отриманих шляхом реакції ферментації Р. fluorescens, які продукували нерозчинний інсектицидний Bt-білок, як показав аналіз, що проводиться за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН і MALDI-MS (матрична лазерна десорбція/іонізувати мас-спектрометрія). Гранули, отримані шляхом ферментації Р. fluorescens, відтавали на водяній бані при 37 °C. Клітини ресуспендували до 25 % мас/об в буфері для лізису [50 мM трісу, pH 7,5, 200 мM NaCl, 20 мM EDTA-динатрієвої солі (етилендіамінтетраоцтової кислоти), 1 % тритони X-100 і 5 мМ дитіотреїтолу (DTT); 5 мл/л "коктейлю" інгібіторів бактеріальної протеази (Catalog # P8465; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), який додавали безпосередньо перед застосуванням]. Клітини суспендували на гомогенізаторі з ручним керуванням з установкою шкали найменшого значення (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Лізоцим (25 мг Sigma L7651, виділеного з білка курячих яєць) додавали до клітинної суспензії шляхом змішування металевим шпателем, і суспензію інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години. Суспензію охолоджували на льоду протягом 15 хвилин, а потім обробляли ультразвуком на ультразвуковому генераторі Branson Sonifier 250 (два раунди по 1 хвилині, 50 % черговий цикл, 30 % вихід). Лізис клітин підтверджували за допомогою мікроскопії. При необхідності додавали 25 мг лізоциму, а потім інкубування і обробку ультразвуком повторювали. Після підтвердження лізису клітин під мікроскопом, лізат центрифугували при 11500 х g протягом 25 хвилин (4 °C) з отриманням осаду тілець включення (IB), і супернатант відкидали. Осад IB ресуспендували зі 100 мл буфера для лізису, гомогенізували в міксері з ручним керуванням і центрифугували як описано вище. Осад IB повторно промивали шляхом ресуспендування (в 50 мл буфера для лізису), гомогенізації, обробки ультразвуком і центрифугування доти, доки супернатант не ставав безбарвним, а осад IB твердим і не зовсім білим. Для кінцевогго промивання, осад IB ресуспендували в стерильно відфільтровуваній (на фільтрі 0,22 мкм) дистильованій воді, що містить 2 мM EDTA, і центрифугували. Кінцевий осад ресуспендували в стерильно відфільтровуваній дистильованій воді, що містить 2 мM EDTA, і зберігали у вигляді 1 мл-аліквот при -80 °C. Аналіз, що проводиться за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН, і кількісну оцінку білка в препаратах IB здійснювали шляхом відтавання 1 мл-аліквоти осаду IB і розведення 1:20 стерильно відфільтровуваною дистильованою водою. Потім розведений зразок кип'ятили з 4 х відновлюваним буфером для зразків [250 мМ тріс, pH 6,8, 40 % гліцерину (об/об), 0,4 % бромфенолового синього (мас/об), 8 % ДСН (мас/об) і 8 % β-меркаптоетанолу (об/об)] і завантажували на 4-20 % тріс-гліцин Novex® в гелі в ямку 12+2 (Invitrogen), обробленому 1 х тріс/гліцин/ДСН-буфер (BioRad). Гель піддавали електрофорезу протягом 60 хвилин при 200 вольт, а потім забарвлювали кумасі синім (50 % G-250/50 % R-250 в 45 % металолі, 10 % оцтовій кислоті), і знебарвлювали 7 % оцтовою кислотою, 5 % метанолом в дистильованій воді. Кількісну оцінку смуг-мішеней здійснювали шляхом порівняння денситометиричних величин для смуг зі стандартними зразками альбуміну бичачої сироватки (BSA), проаналізованих на тому ж гелі для побудови стандартної кривої. Солюбілізація тілець включення. 6 мл суспензії тілець включення Cry1Da від клону Pf, DPfl50 центрифугували на мікроцентрифузі Еппендорфа моделі 5415C, встановленій на найвище значення (приблизно 14000 х g), в результаті чого отримували осад тілець включення. Супернатант буфера для зберігання видаляли і замінювали 25 мл 100 мМ натрійкарбонатного буфера, pH 11, в конічній 50 мл-пробірці. Тільця включення ресуспендували піпеткою і піддавали вихровому перемішуванню до отримання однорідної суміші. Пробірку поміщували на платформу, що повільно обертається, і залишали на ніч при 4 °C для екстракції білка-мішені. Екстракт центрифугували при 30000 х g протягом 30 хвилин при 4 °C, і отриманий супернатант 5-кратно концентрували на центрифугальному фільтруючому пристрої з регенерованою целюлозою Amicon Ultra-15 (з відсічкою молекулярної маси 30000; Millipore). Буфер для зразків замінювали 10 мМ CAPS [3-(циклогексаміно)-1-пропансульфоновою кислотою], pH 10, з використанням одноразових колонок PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). 14 UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Солюбілізація білка тілець включення і їх активація трипсином. У деяких випадках, суспензію Cry1Da тілець включення від клону Pf, DPfl50, центрифугували на мікроцентрифузі Еппендорфа моделі 5415C, встановленій на найвище значення (приблизно 14000 х g), в результаті чого отримували осад тілець включення. Супернатант буфера для зберігання видаляли і замінювали 100 мМ CAPS, pH 11, з отриманням білка, концентрація якого становила приблизно 50 мг/мл. Пробірку обертали при кімнатній температурі протягом трьох годин до повної солюбілізації білка. Потім додавали трипсин в рівних кількостях до 5 % - 10 % (мас. %, по вихідній масі порошку IB) і здійснювали гідроліз шляхом інкубування при обертанні протягом ночі при 4 °C або обертанні протягом 90-120 хвилин при кімнатній температурі. Нерозчинний матеріал видаляли шляхом центрифугування при 10000 х g протягом 15 хвилин, і супернатант наносили на аніонообмінну колонку MonoQ (10 мм х 10 см). Активований білок Cry1Da елюювали (як було визначено за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН) 25 колонковими об'ємами 0-100 % 1М градієнта NaCl. Фракції, що містять активований білок, об'єднували, і при необхідності, концентрували до менше ніж 10 мл на центрифугальному фільтруючому пристрої з регенерованою целюлозою Amicon Ultra-15 як описано вище. Потім матеріал пропускали через колонку з Superdex 200 (16 мм х 60 см) в буфері, що містить 100 мМ NaCl, 10 % гліцерину, 0,5 % твіну-20 і 1 мМ EDTA. Аналіз, що проводиться за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН, показав, що активований (ферментативно зрізаний) білок елююється при 65-70 мл. Фракції, що містять активований білок, збирали і концентрували на центрифугальному концентраторі як описано вище. Гель-електрофорез. Препарати концентрованого білка отримували для проведення електрофорезу шляхом розведення 1:50 в буфері для зразків LDS NuPAGE® (Invitrogen), що містить 5 мМ DTT як відновник, і нагрівали при 95 °C протягом 4 хвилин. Зразок завантажували на доріжки-дублікати з 4-12 % гелем NuPAGE® разом з п'ятьма BSA-стандартами в кількості від 0,2 мкг до 2 мкг/доріжка (для побудови стандартної кривої). Потім подавали напруження в 200 В з використанням буфера MOPS для електрофорезу з ДНС (Invitrogen) доти, доки барвник"свідок" не досягав основи гелю. Гель забарвлювали 0,2 % кумасі синім G-250 в 45 % метанолі, 10 % оцтовій кислоті, і знебарвлювали спочатку шляхом швидкої обробки 45 % металолом, 10 % оцтовою кислотою, а потім шляхом тривалої обробки 7 % оцтовою кислотою, 5 % метанолом до появи прозорого фону. Після знебарвлення, гель сканували на мультивізуалізаторі BioRad Fluor-S. Для отримання об'ємів забарвлених смуг білка з відніманням фону і для побудови стандартної кривої BSA, яка була використана для обчислення концентрації химерного білка Cry1Da в маточному розчині, використовували комп'ютерну програму Quantity One Software v.4.5.2. Приклад 5 Отримання білків, що містять корові токсини Cry1Fa і Cry1Da, і виділення мембранних везикул щіткової облямівки Spodoptera frugiperda для проведення експериментів по конкурентному зв'язуванню У нижченаведених прикладах описана оцінка конкурентного зв'язування білків, що містять коровий токсин Cry1, з передбачуваними рецепторами в тканині кишечнику комахи. Було 125 показано, що I-мічений білок, що містить коровий токсин Cry1Da, зв'язується з високою афінністю з мембранними везикулами щіткової облямівки (BBMV), отриманими від Spodoptera frugiperda (совки трав'яної), і що білок, який містить коровий токсин Cry1Fa, не конкурує за зв'язування з цими везикулами. Очищення білків Cry. Ген, що кодує химерний білок Cry1Da, експресувави в експресійному штамі Pseudomonas fluorescens як описано в прикладі 4. Аналогічним чином, ген, що кодує химерний білок, який містить коровий токсин Cry1Fa (603 амінокислоти) і протоксин Cry1Ab (545 амінокислот), експресували в системі Pf. У випадку Cry1Fa, експресійна плазміда була позначена pDAB1817, а штам Р. fluorescens, що містить pDAB1817, був позначений DPf129. Білки очищали методами, описаними в прикладі 4, і здійснювали гідроліз трипсином з отриманням активованих корових токсинів з повнорозмірних білків, а потім ці продукти очищали методами, описаними в прикладі 4. Препарати оброблених трипсином білків (що містять активований коровий токсин) мали чистоту >95 %, а їх молекулярна маса становила приблизно 65 кДа як було експериментально визначено за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ. Використовуваний тут активований коровий токсин отриманий з білка Cry1Da, називається білком, що містить коровий токсин Cry1Da, а активований коровий токсин, отриманий з білка Cry1Fa, називається білком, що містить коровий токсин Cry1Fa. Отримання і фракціонування солюбілізованих BBMV. Стандартні методи кількісної оцінки білка і електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН проводили як описано, наприклад, в посібнику Sambrook et al. (1989) і Ausubel et al. (1995), і в більш пізніх виданнях. 15 UA 113273 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Личинки S. frugiperda в останній віковій стадії витримували в умовах голодування протягом ночі, а потім, після охолоджування на льоду протягом 15 хвилин, розкривали. Тканину середньої частини кишечнику видаляли з порожнини тіла, а задню частину кишечнику залишали приєднаною до покривного шару. Середню частину кишечнику вміщували в 9 х об'єм охолодженого льодом гомогенізуючого буфера (300 мМ маніт, 5 мМ EGTA, 17 мМ основи тріс, pH 7,5), в який була додана суміш інгібіторів протеази (Sigma-Aldrich Р-2714), розведена відповідно до рекомендації постачальників. Тканину гомогенізували 15-а імпульсами, що подаються скляним гомогенізатором тканини. BBMV отримували методом MgCl 2-преципітації, описаним Wolfersberger (1993). Коротко, рівний об'єм 24 мМ розчину MgCl 2 в 300 мМ маніту змішували з гомогенатом, виділеним з середньої частини кишки, перемішували протягом 5 хвилин і залишали на льоду на 15 хвилин. Розчин центрифугували при 2500 х g протягом 15 хвилин при 40 °C. Супернатант зберігали, і осад суспендували у вихідному об'ємі 0,5 х розведеного гомогенізуючого буфера, а потім знову центрифугували. Два супернатанти об'єднували і центрифугували при 27000 х g протягом 30 хвилин при 4 °C з отриманням фракції BBMV. Осад суспендували в буфері для зберігання BBMV (10 мМ HEPES, 130 мМ KCl, 10 % гліцерин, pH 7,4) до отримання концентрації білка приблизно 3 мг/мл. Концентрацію білка визначали з використанням альбуміну бичачої сироватки (BSA) як стандарт. Визначення рівня лужної фосфатази (ферменту-маркера для фракції BBMV) проводили до заморожування зразків з використанням набору для аналізу лужний фосфатази QuantiChrom™ DALP-250 (Gentaur Molecular Products, Kampenhout, BE) відповідно до інструкцій виробників. Питома активність цього ферменту звичайно зростала в 7 разів в порівнянні з активністю, що виявляється у вихідній фракції гомогенату середньої частини кишки. BBMV розділяли на зразки-аліквоти по 250 мкл, швидко заморожувалив рідкому азоті і зберігали при -80 °C. Електрофорез. Аналіз білків за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ проводили у відновних умовах (тобто, в 5 % β-меркаптоетанолі, BME) і в денатуруючих умовах (тобто, при нагріванні протягом 5 хвилин, при 90 °C в присутності 2 % ДСН). Білки завантажували на ямку з 4-20 % тріс-гліциновим поліакриламідним гелем (BioRad; Hercules, CA) і розділяли під напругою 200 вольт протягом 60 хвилин. Смуги білка детектували шляхом фарбування кумасі діамантовим блакитним R-250 (BioRad) протягом однієї години, і знебарвлювали розчином 5 % метанолу в 7 % оцтовій кислоті. Гелі візуалізували і аналізували на візуалізаторі BioRad Fluro-S Multi Imager™. Відносні молекулярні маси смуг білка визначали шляхом порівняння з рухливістю білків з відомою молекулярною масою, що спостерігаються в зразку ледера білка BenchMark™ (Life Technologies, Rockville, MD), завантаженого на одну ямку гелю. Йодування білка, що містить коровий токсин Cry1Da. Очищений білок, що містить коровий токсин Cry1Da, піддавали реакції йодування з використанням йодуючих сфер Pierce Iodination Beads (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Коротко, дві йодуючі сфери два рази промивали 500 мкл PBS (20 мМ фосфат натрію, 0,15 M NaCl, pH7,5), і вміщували в центрифугальну 1,5 мл125 пробірку, що містить 100 мкл PBS. Потім додавали 0,5 мКі I-міченого йодиду натрію, після чого компоненти залишали для реакції на 5 хвилин при кімнатній температурі, а потім до розчину додавали 1 мкг білка, що містить коровий токсин Cry1Da, і суміш залишали для реакції ще на 3-5 хвилин. Реакцію завершували шляхом піпетування розчину з йодуючих сфер і наносили на центрифугальну колонку Zeba™ (Invitrogen), урівноважену в 50 мМ CAPS, pH 10,0, 1 мМ DTT (дитіотреїтол), 1 мМ EDTA і 5 % гліцерині. Йодуючі сфери два рази промивали 10 мкл PBS і промивальний розчин також наносили на знесолювальну колонку Zeba™. Радіоактивний розчин елюювали з центрифугальної колонки шляхом центрифугування при 1000 х g протягом 2 125 хвилин. Потім, білок, що містить коровий токсин Cry1Da і мічену радіоактивну I, діалізували проти 50 мМ CAPS, pH 10,0, 1 мМ DTT, 1 мМ EDTA і 5 % гліцерину. Візуалізація. Нерадіоактивний йодований білок, що містить коровий токсин Cry1Da, визначали за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ і візуалізації флуоресцентним методом. Коротко, ДСН-ПААГ-гелі сушили з використанням апарату для сушіння гелю BioRad відповідно до інструкцій виробників. Осушені гелі візуалізували шляхом їх загортання в плівку Mylar (товщиною в 12 мкм) і експонування під флуоресціюючим екраном з накопиченням Molecular Dynamics (35 см х 43 см) протягом 1 години. Планшети виявляли за допомогою флуоресцентного візуалізатора Molecular Dynamics Storm 820, і зображення аналізували за допомогою комп'ютерної програми ImageQuant™. Приклад 6 125 Зв'язування I-міченого білка, що містить коровий токсин Cry1, з BBMV від Spodoptera frugiperda З метою визначення оптимальної кількості білка BBMV для його використання в аналізах на зв'язування з білками, що містять корові токсини Cry1Da і Cry1Fa, будували криву насичення. 16 UA 113273 C2 125 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 0,5 нM I-міченого білка, що містить коровий токсин Cry1, інкубували протягом 1 години при 28 °C в буфері для зв'язування (8 мМ NaHPО4, 2 мМ KH2PО4, 150 мМ NaCl, 0,1 % BSA, pH7,4) з 125 білком BBMV в кількості, що складає від 0 мкг/мл до 500 мкг/мл (загальний об'єм 0,5 мл). Iмічений білок, що містить коровий токсин Cry1 і зв'язаний з білками BBMV, відділяли від незв'язаної фракції шляхом взяття зразків 150 мкл реакційної суміші з трьома повторностями, які вміщували в окремі центрифугальні 1,5 мл-пробірки і центрифугували при 14000 х g протягом 8 хвилин при кімнатній температурі. Супернатант обережно видаляли, і осад три рази промивали охолодженим льодом буфером для зв'язування. Дно центрифугальної пробірки, що містить осад, відрізали, вміщували в скляну пробірку для культивування розміром 13 × 75 мм, і кожний зразок підраховували протягом 5 хвилин в гамма-лічильнику. Потім будували графік залежності CPM (число імпульсів в хвилину) мінус фоновий CPM (за відсутності реакції з білком BBMV) від концентрації білка BBMV. Крім того, відповідно до результатів, отриманих в іншому аналізі (Luo et al., 1999) оптимальна концентрація білка BBMV, що використовується в аналізах на зв'язування, становила 150 мкг/мл. Приклад 7 Аналізи на конкурентне зв'язування BBMV від S. frugiperda з білками, що містять корові токсини Cry1Da і Cry1Fa Аналізи на гомологічне і гетерологічне конкурентне зв'язування проводили з використанням 125 150 мкг/мл білка BBMV S. frugiperda і 0,5 нM I-міченого білка, що містить коровий токсин Cry1Da. До реакційної суміші додавали конкурентний нерадіоактивний білок, що містить коровий токсин Cry1Fa, в концентраціях від 0,045 нМ до 1000 нМ, і одночасно додавали радіоактивний білок, що містить коровий токсин Cry1Da, для гарантії істинного конкурентного 125 зв'язування. Інкубування проводили протягом 1 години при 28 °C і вимірювали кількість Iміченого білка, що містить коровий токсин Cry1Da і зв'язаного з BBMV (специфічно зв'язаного) як описано вище. Неспецифічне зв'язування виражали як величину, отриману в присутності 1000 нМ нерадіоактивного білка, що містить коровий токсин Cry1Da. 100 %-е загальне зв'язування розглядається як кількість зв'язування за відсутності якого-небудь конкурентно зв'язаного білка, що містить коровий токсин Cry1Fa. 125 У аналізах на зв'язування з рецептором, що проводяться з використанням I-міченого білка, що містить коровий токсин Cry1Da, визначали здатність білка, який містить коровий токсин Cry1Fa, витісняти цей радіоактивно мічений ліганд з його сайту зв'язування з BBMV від S. frugiperda. Результати показали, що білок, який містить коровий токсин Cry1Fa, не витісняв 125 зв'язаний I-мічений білок, що містить коровий токсин Cry1Da, з його рецепторного(их) білка(ів) при концентрації до 1000 нМ (при концентрації, яка в 2000 разів перевищувала концентрацію радіоактивного зв'язувального ліганду). Як і передбачалося, немічений білок, що містить коровий токсин Cry1Da, мав здатність витісняти радіоактивно мічений білок, що містить коровий токсин Cry1Da, з його білка(ів), що зв'язується(ються), на що вказувала сигмоїдальна крива доза-відповідь, де 50 %-е витіснення відбувалося при 5 нМ. Таким чином, було показано, що білок, який містить коровий токсин Cry1Da, взаємодіє з сайтом зв'язування BBMV S. frugiperda, який не зв'язується з білком, що містить коровий токсин Cry1Fa. Джерела інформації: Finney, D.J. 1971. Probit analysis. Cambridge University Press, England. Hua, G., L. Masson, J. L. Jurat-Fuentes, G. Schwab, and M. J. Adang. Binding analyses of Bacillus thuringiensis Cry d-endotoxins using brush border membrane vesicles of Ostrinia nubilalis. Applied and Environmental Microbiology 67[2], 872-879. 2001. LeOra Software. 1987. POLO-PC. А user's guide to probit and logit analysis. Berkeley, CA. McGaughey, W. H., F. Gould, and W. Gelernter. Bt resistance management. Nature Biotechnology 16[2], 144-146. 1998 Marcon, P.R.G.C., L.J. Young, K. Steffey, and B.D. Siegfried. 1999. Baseline susceptibility of the European corn borer, Ostrinia nubilalis (Hubner) (Lepidoptera: Pyralidae) to Bacillus thuringiensis toxins. J. Econ. Entomol. 92 (2): 280-285. Robertson, L.J. and H.K. Preisler. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC Press, Boca Ranton, FL. SAS Institute Inc. 1988. SAS procedures guide, Release 6.03 edition. SAS Institute Inc, Cary, NC. Stone, B.F. 1968. А formula for determining degree of dominance in cases of monofactorial inheritance of resistance to chemicals. Bull. WHO 38:325-329. Van Mellaert, Н., J. Botterman, J. Van Rie, and H. Joos. Transgenic plants for the prevention of development of insects resistant to Bacillus thuringiensis toxins. (Plant Genetic Systems N.V., Belg. 89-401499[400246], 57-19901205. EP. 5-31-1989. 17 UA 113273 C2 18 UA 113273 C2 19 UA 113273 C2 20 UA 113273 C2 21 UA 113273 C2 22 UA 113273 C2 23 UA 113273 C2 24 UA 113273 C2 25 UA 113273 C2 26 UA 113273 C2 27 UA 113273 C2 28