Даун-регуляція експресії гена за допомогою штучних мікро-рнк
Формула / Реферат
1. Виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, що включає дезоксирибонуклеотидну послідовність, як описано в SEQ ID NO: 15, де (і) нуклеотиди 83-103 у SEQ ID NO: 15 заміщені першою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від 19 до 24 нуклеотидів залежно від мішеневої послідовності, чия експресія підлягає зниженню, (іі) нуклеотиди 172-192 у SEQ ID NO: 15 заміщені другою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від 19 до 24 нуклеотидів, причому вказана друга мінлива нуклеотидна субпослідовність здатна гібридизуватися з першою мінливою субпослідовністю міРНК-попередника, та (ііі) міРНК-попередник, продукований зазначеним виділеним фрагментом нуклеїнової кислоти, має таку ж саму стеблову структуру, як і міРНК-попередник, продукований ендогенною SEQ ID NO: 15.
2. Рекомбінантний конструкт, що включає виділений фрагмент нуклеїнової кислоти за п. 1, функціонально зв'язаний щонайменше з однією регуляторною послідовністю.
3. Рослинна клітина, що включає рекомбінантний конструкт за п. 2.
4. Рослинна клітина за п. 3, де рослинна клітина є рослинною клітиною однодольної рослини.
5. Спосіб зниження експресії мішеневої послідовності в рослинній клітині, за яким:
(а) трансформують щонайменше одну рослинну клітину нуклеїновокислотним конструктом, що включає дезоксирибонуклеотидну послідовність, як описано в SEQ ID NO:15, де (і) нуклеотиди 83-103 у SEQ ID NO: 15 заміщені першою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від 19 до 24 нуклеотидів залежно від мішеневої послідовності, чия експресія підлягає зниженню, (іі) нуклеотиди 172-192 у SEQ ID NO: 15 заміщені другою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від 19 до 24 нуклеотидів, причому вказана друга мінлива нуклеотидна субпослідовність здатна гібридизуватися з першою мінливою субпослідовністю міРНК-попередника, та (ііі) міРНК-попередник, продукований зазначеним виділеним фрагментом нуклеїнової кислоти, має таку ж саму стеблову структуру, як і міРНК-попередник, продукований ендогенною SEQ ID NO: 15; та
(b) добирають ту трансформовану рослинну клітину (клітини), чий рівень експресії мішеневої послідовності знижений у порівнянні з рівнем експресії мішеневої послідовності в рослинній клітині дикого типу.
Текст
Реферат: Винахід стосується виділених фрагментів нуклеїнової кислоти, що включають міРНКпопередник, штучні міРНК і їхнє застосування в даун-регулюванні експресії гена. UA 113950 C2 (12) UA 113950 C2 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Дана заявка заявляє перевагу попередньої заявки на патент США № 61/014510, поданої 18 грудня 2007 p., розкриття якої цим посиланням включено у всій своїй повноті. Галузь даного винаходу стосується в цілому молекулярної біології рослин. Зокрема, вона стосується конструктів і способів для даун-регуляції експресії мішеневих послідовностей. МікроРНК (міРНК) були вперше ідентифіковані тільки кілька років тому, але вже стало ясно, що вони відіграють важливу роль у регулюванні генної активності. Ці некодуючі РНК із 20-22 нуклеотидів мають здатність гібридизуватися через спарювання основ зі специфічними мішеневими мРНК і даун-регулювати експресію цих транскриптів, опосередковуючи або РНК розщеплення, або трансляційну репресію. Останні дослідження показали, що міРНК мають важливі функції при розвитку. У рослинах, як показали, вони контролюють ряд процесів розвитку, що включають період цвітіння, морфологію листа, полярність органів, морфологію квітки та розвиток кореня (розглянуте Mallory і Vaucheret (2006) Nat Genet 38: S31-36). З урахуванням установленої регуляторної ролі міРНК, цілком імовірно, що вони також залучені до контролю деяких з основних ознак культур, таких як посухостійкість і стійкість до хвороб. МіРНК транскрибуються РНК полімеразою II як поліаденільовані та кеповані сигнали, відомі як прай-міРНК (первинна міРНК). Такі прай-міРНК перетворюються до більш дрібних транскриптів, відомих як пре-міРНК, і такі попередники мають здатність формувати стабільні шпилькові структури (розглянуте Bartel (2004) Cell 116: 281-297; Jones-Rhoades MW, Bartel DP, Bartel B. MicroRNAS and their regulatory roles in plants. Annu Rev Plant Biol. 2006; 7:19-53) He дивлячись на те, що прай-міРНК перетворюються до пре-міРНК за допомогою Drosha у ядрі, і Dicer розщеплює пре-міРНК у цитоплазмі багатоклітинних, дозрівання міРНК у рослинах відрізняється від шляху метаболізму у тварин, оскільки рослини позбавлені гомолога Drosha. Замість цього, фермент РНКаза III DICER-LIKE 1 (DCL1), що є гомологічним тваринному Dicer, може мати функцію Drosha додатково до його відомої функції в шпильковому процесингу (Kurihara і Watanabe (2004) Proc Natl Acad Sci 101: 12753-12758). У Arabidopsis нещодавно описані штучні міРНК (шміРНК), що націлюються на вірусні мРНК послідовності (Niu et al. (2006) Nature Biotechnology 24:1420-1428) або на ендогенні гени (Schwab et al. (2006) Plant Cell 78:1121-1133). ШміРНК конструкт може бути експресований під контролем різних промоторів для зміни просторової структури сайленсингу (Schwab et al. (2006) Plant Cell 78:1121-1133). Штучні міРНК заміняють мікроРНК і комплементарну їй послідовність, позначену штрихом, у міРНК-попереднику та заміщають послідовності, що намічають мРНК на те, щоб бути підданою сайленсингу- Сайленсинг ендогенними міРНК можна знайти в ряді просторових, часових і пов'язаних з розвитком патернів експресії (Parizotto et al. (2007) Genes Dev 18:2237-2242; Alvarez et al. (2006) Plant Cell 78:1134-51). Штучні міРНК можна побудувати як для захвату, так і для розширення різноманітності та специфічності в патернах сайленсингу. Дотепер не повідомлялося про застосування шміРНК у культурних рослинах. WO 2004/009779, опублікована 29 січня 2004 p., розкриває композиції та способи модулювання експресії генів у рослинах. Заявка на патент США 2005/0138689 правонаступника заявника, опублікована 23 червня 2005 p., описує міРНК і їхнє застосування в сайленсингу мішеневої послідовності. Короткий опис списку послідовностей Даний винахід можна більш повно зрозуміти з наступного Детального опису та супроводжуючого Списку послідовностей, що становить частину даної заявки. Опис послідовностей резюмує Список послідовностей, доданий до документа. Список послідовностей включає однобуквені коди символів нуклеотидних послідовностей і одне- і трибуквені коди для амінокислот, як визначено в стандартах IUPAC-IUB, розкритих у Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) і в Biochemical Journal 219(2):345-373 (1984). SEQ ID NO:1-10 відповідають праймерам, використовуваним для ампліфікації попередників геномної мікроРНК (міРНК) маїсу. SEQ ID NO: 11-15 відповідають послідовностям попередника міРНК маїсу для 159с, 164h, 168а, 169r і 396h, відповідно. SEQ ID NO: 16 відповідають послідовності штучної міРНК (шміРНК), використовуваної для сайленсингу транскрипту фітоєн-десатурази маїсу (PDS). SEQ ID NO: 17-21 відповідають "послідовностям, позначеним штрихом", що містяться в попередниках шміРНК для 159C-PDS, 164h-PDS, 168a-PDS, 169r-PDS і 396h-PDS, відповідно. Послідовності, позначені штрихом, є в основному комплементарними послідовностям в попереднику міРНК, що формує дуплекс із міРНК. 1 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 SEQ ID NO: 22-26 відповідають попередникам шміРНК для 159C-PDS, 164h-PDS, 168a-PDS, 169r-PDS і 396h-PDS, відповідно. Ці попередники, у випадку, якщо експресуються в маїсі, керують сайленсингом ендогенного транскрипту PDS. SEQ ID NO: 27-30 відповідають усіченим попередникам шміРНК 169r-PDS-sht, 169r-PDSmed, 396h-PDS-sht і 396-PDS-med, відповідно. 169r-PDS попередник (SEQ ID NO: 25) був укорочений до 11 % його довжини (169r-PDS-sht, SEQ ID NO: 27) і 35 % його довжини (169rPDS-med, SEQ ID NO: 28) у порівнянні з 169r-PDS. 396h-PDS попередник (SEQ ID NO: 26) був укорочений до 18 % його довжини (396h-PDS-sht, SEQ ID NO: 29) і 46 % його довжини (396hPDS-med, SEQ ID NO: 30) у порівнянні з 396h-PDS. Усі з усічених попередників містили міРНК і послідовності, позначені штрихом. SEQ ID NO: 31-34 відповідають попередникам шміРНК для 159C-FAD, 168a-FAD, 169r-FAD і 396h-FAD, відповідно. Ці попередники, у випадку якщо експресуються в маїсі, керують сайленсингом ендогенного fad2-1 (жирнокислотна десатураза, що відповідає за перетворення олеїнової кислоти у лінолеву кислоту) транскрипту. SEQ ID NO: 35-38 відповідають міРНК-мішені та послідовностям, позначеним штрихом, для летальної плямистості листя. SEQ ID NO: 39-41 відповідають міРНК-мішені та послідовностям, позначеним штрихом, для білка стійкості до декількох лікарських засобів, що є транспортним білком. SEQ ID NO: 42-43 відповідають послідовностям попередників шміРНК для 168a-MRP і 396hMRP, відповідно. Ці попередники, у випадку якщо експресуються в маїсі, керують сайленсингом MRP, що призводить до знижених рівнів фітинової кислоти. Короткий опис винаходу Даний винахід стосується виділеного фрагмента нуклеїнової кислоти, що включає міРНКпопередник, причому вказаний міРНК-попередник значною мірою відповідає дезоксирибонуклеотидній послідовності, викладеній в SEQ ID NO: 11, (і) де нуклеотиди 430-450 у SEQ ID NO: 11 заміщені першою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів залежно від мішеневої послідовності, чия експресія підлягає зниженню, і (іі) крім того, де нуклеотиди 244-264 у SEQ ID NO: 11 заміщені другою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів, причому вказана друга мінлива нуклеотидна субпослідовність здатна гібридизуватися з першою мінливою субпослідовністю міРНК-попередника. Інші виділені нуклеїнові фрагменти, що також становлять інтерес, включають наступне: а) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, що включає міРНК-попередник, причому вказаний міРНК-попередник значною мірою відповідає дезоксирибонуклеотидній послідовності, викладеній в SEQ ID NO: 12, (і) де нуклеотиди 94-114 у SEQ ID NO: 12 заміщені першою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів залежно від мішеневої послідовності, чия експресія підлягає зниженню, і (іі) крім того, де нуклеотиди 163-183 у SEQ ID NO: 12 заміщені другою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів, причому вказана друга мінлива нуклеотидна субпослідовність здатна гібридизуватися з першою мінливою субпослідовністю міРНК-попередника; b) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, що включає міРНК-попередник, причому вказаний міРНК-попередник значною мірою відповідає дезоксирибонуклеотидній послідовності, викладеній в SEQ ID NO: 13, (і) де нуклеотиди 53-73 у SEQ ID NO: 13 заміщені першою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів залежно від мішеневої послідовності, чия експресія підлягає зниженню, і (іі) крім того, де нуклеотиди 97-117 у SEQ ID NO: 13 заміщені другою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів, причому вказана друга мінлива нуклеотидна субпослідовність здатна гібридизуватися з першою мінливою субпослідовністю міРНК-попередника; c) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, що включає міРНК-попередник, причому вказаний міРНК-попередник значною мірою відповідає дезоксирибонуклеотидній послідовності, викладеній в SEQ ID NO: 14, (і) де нуклеотиди 110-130 у SEQ ID NO: 14 заміщені першою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів залежно від мішеневої послідовності, чия експресія підлягає зниженню, і (іі) крім того, де нуклеотиди 184-203 у SEQ ID NO: 14 заміщені другою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів, причому вказана друга мінлива нуклеотидна субпослідовність здатна гібридизуватися з першою мінливою субпослідовністю міРНК-попередника; і 2 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 d) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, що включає міРНК-попередник, причому вказаний міРНК-попередник значною мірою відповідає дезоксирибонуклеотидній послідовності, викладеній в SEQ ID NO: 15, (і) де нуклеотиди 83-103 у SEQ ID NO: 15 заміщені першою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів залежно від мішеневої послідовності, чия експресія підлягає зниженню, і (іі) крім того, де нуклеотиди 172-192 у SEQ ID NO: 15 заміщені другою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів, причому вказана друга мінлива нуклеотидна субпослідовність здатна гібридизуватися з першою мінливою субпослідовністю міРНК-попередника. Будь-який з цих виділених фрагментів нуклеїнової кислоти може бути використаний для створення рекомбінантного конструкта, що включає ці виділені фрагменти нуклеїнової кислоти, функціонально зв'язані, щонайменше, з однією регуляторною послідовністю. Ці конструкти можуть бути трансформовані в рослинну клітину так, що трансформована рослинна клітина буде включати рекомбінантний конструкт у своєму геномі. В іншому аспекті даний винахід стосується способу зниження експресії мішеневого гена в рослинній клітині, за яким: (a) трансформують, щонайменше, одну рослинну клітину нуклеїновокислотним конструктом, що включає кожний з виділених фрагментів нуклеїнової кислоти, описаних у даному документі; та (b) добирають ту трансформовану рослинну клітину (клітини), чий рівень експресії мішеневої послідовності знижений у порівнянні з рівнем експресії мішеневого гена в рослинній клітині дикого типу. Детальний опис винаходу Інформацію, що відповідає даній заявці, можна знайти в заявках на патенти США №№ 10/963238 і 10/963394, які подані 12 жовтня 2004 р. Повні змісти вищевказаних заявок включені в даний документ посиланням. Інші посилання, які можна використовувати в розумінні даного винаходу, включають заявку на патент США № 10/883374, подану 1 липня 2004 p.; заявку на патент США № 10/913288, подану 6 серпня 2004 p., і заявку на патент США № 11/334776, подану 6 січня 2006 р. Розкриття кожного посилання, викладеного в даному документі, цим включено посиланням у всій своїй повноті. Як використовується в даному документі та у доданій Формулі винаходу, форми однини включають посилання на множину, якщо в контексті чітко не диктується інше. Таким чином, наприклад, посилання на "рослину" включають безліч таких рослин, посилання на "клітину" включають одну або більш клітин і їхніх еквівалентів, відомих фахівцю в даній галузі, і т. д. У контексті даного розкриття використовується ряд виразів і абревіатур. Представлено наступні визначення. "МікроРНК або міРНК" означає олігорибонуклеїнову кислоту, що регулює експресію полінуклеотиду, що включає мішеневу послідовність. МікроРНК (міРНК) є некодуючою РНК від близько 19 до близько 24 нуклеотидів (нк) довжиною, що ідентифіковані та у тварин, і в рослин (Lagos-Quintana et al., Science 294:853-858 2001, Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12:735-739 2002; Lau et al., Science 294:858-862 2001; Lee і Ambros, Science 294:862-864 2001; Llave etal., РlаntСеll 14:1605-1619 2002; Mourelatos et al., Genes. Dev. 16:720-728 2002; Park et al., Curr. Biol. 12:1484-1495 2002; Reinhart et al., Genes. Dev. 16:1616-1626 2002), що регулюють експресію полінуклеотиду, що включає мішеневу послідовність. Вони отримані з більш довгих попередників транскриптів, розмір яких варіює від приблизно 70 до 2000 нк або більш, і ці попередники транскрипти мають здатність формувати стабільні шпилькові структури. У тварин фермент, залучений у процесинг попередників міРНК, називають Dicer, РНКаза III-подібний білок (Grishok et al., Cell 106:23-34 2001; Hutvagner et al., Science 293:834-838 2001; Ketting et al., Genes. Dev. 15:2654-2659 2001). рослини також мають Dicer-подібний фермент, DCL1 (раніше названий CARPEL FACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/ SUSPENSOR1), і нещодавні відомості показують, що він, подібно Dicer, залучений у процесинг шпилькових попередників для утворення зрілих міРНК (Park et al., Curr. Biol. 12:1484-1495 2002; Reinhart et al., Genes. Dev. 16:1616-1626 2002). Крім того, з останньої роботи стає ясно, що, щонайменше, деякі шпилькові попередники міРНК утворюються як більш довгі поліаденільовані транскрипти, а декілька різних міРНК і зв'язаних шпильок можуть бути присутні в одному транскрипті (Lagos-Quintana et al., Science 294:853-858 2001; Lee et al., EMBO J21:4663-4670 2002). В останній роботі також розглядали вибір нитки міРНК із продукту двониткової РНК, що походить від процесингу шпильки за допомогою DICER (Schwartz et al., 2003, Cell 115:199-208). Схоже, що стабільність (тобто вміст G:C проти A:U і/або помилкові спарювання) двох кінців обробленої двониткової 3 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 РНК впливає на вибір нитки, при цьому кінець низької стабільності легше розкручується геліказною активністю. Нитка з 5' кінцем на кінці з низькою стабільністю включена в RISC комплекс, у той час як інша нитка розпадається. "Прай-міРНК" або "первинні міРНК" є довгими поліаденільованими РНК, що транскрибуються РНК полімеразою II і які кодують міРНК. "Пре-міРНК" є первинними міРНК, що оброблені для формування більш короткої послідовності, що має здатність формувати стабільну шпильку, і далі оброблені для вивільнення міРНК. У рослин обидва етапи процесингу виконуються ферментом, подібним dicer, і, тому, важко функціонально диференціювати "прайміРНК" і "пре-міРНК". Тому міРНК-попередник, або первинна міРНК, функціонально визначена в даному документі як нуклеотидна послідовність, що здатна продукувати міРНК. З огляду на дане функціональне визначення, і як буде ясно з Прикладів і обговорення в даному документі, міРНК-попередник, первинна міРНК і/або міРНК даного винаходу можна представити як рибонуклеїнову або кислоту, альтернативно, у формі дезоксирибонуклеїнової кислоти, що "відповідає значною мірою" попереднику міРНК, первинної міРНК і/або міРНК. Зрозуміло, що ДНК у своїй двонитковій формі буде включати нитку, що здатна бути транскрибованою в описаний попередник міРНК. Описані експресуючі конструкти, рекомбінантні ДНК-конструкти та трансгенні організми, що включають міРНК, що кодує ДНК, яка приводить до експресії описаних попередників міРНК. "Мінлива нуклеотидна субпослідовність" означає частину нуклеотидної послідовності, що заміняє частину пре-міРНК послідовності за умови, що ця субпослідовність відрізняється від послідовності, яку заміщають, тобто не може бути тією же послідовністю. "Мішеневий ген" означає ген, що кодує мішеневу РНК, тобто ген, з якого мішенева РНК транскрибується. Ген може кодувати мРНК, тРНК, малу РНК і т. д. "Мішенева послідовність" означає РНК, чия експресія підлягає модулюванню, наприклад, даун-регулюванню. Мішенева послідовність може бути частиною відкритої рамки зчитування, 5' або 3' ділянкою, яка не транслюється, екзоном(екзонами), інтроном(інтронами), фланкувальною ділянкою і т. д. "Послідовність, позначена штрихом" являє собою комплементарну послідовність у попереднику міРНК, що формує дуплекс із міРНК. Комплементарність послідовності, позначеної штрихом, не повинна бути повною. Іноді зустрічаються неспіральні розриваючі заміщення (тобто G:T пари основ і т. д.), а також 1-3 помилкові спарювання. Вираз "геном" означає наступне: (1) повний комплемент генетичного матеріалу (гени та некодуючі послідовності), присутній у кожній клітині організму або у вірусі, або в органелі; (2) цілий набір хромосом, успадкований як (гаплоїдна) одиниця від одного батька. "Потомство" включає будь-яке наступне покоління рослини. Потомство буде успадковувати та стабільно сегрегувати гени та трансгени від своєї батьківської рослини(ин). Одиниці, приставки та символи можуть бути виражені в прийнятній формі SI (міжнародна система одиниць). Якщо не зазначене інше, нуклеїнові кислоти пишуться зліва направо у 5'-3' орієнтації; амінокислотні послідовності пишуться зліва направо в орієнтації аміно-карбоксил, відповідно. Числові діапазони, що перелічуються в специфікації, охоплюють числа, що визначають діапазон, і включають кожне ціле число у визначеному діапазоні. Амінокислоти можуть бути позначені в даному документі або загальновідомими трибуквеними символами, або однобуквеними символами, рекомендованими Комісією з біохімічної номенклатури IUPACIUB. Нуклеотиди, аналогічним чином, можуть бути позначені їх загальноприйнятими однобуквеними кодами. Якщо інше не передбачено, вирази програмного забезпечення, електричні та електронні, використовувані в даному документі, визначені в The New IEEE th Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms (5 edition, 1993). Вирази, визначені нижче, більш повно визначені посиланням на специфікацію в цілому. Вирази "рекомбінантний конструкт", "конструкт експресії", "химерний конструкт", "конструкт" і "рекомбінантний ДНК-конструкт" використовуються в даному документі взаємозамінно. Рекомбінантний конструкт включає штучну комбінацію фрагментів нуклеїнової кислоти, наприклад, регуляторні та кодуючі послідовності, які не виявляються разом у природі. Наприклад, химерний конструкт може включати регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, які походять з різних джерел, або регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, які походять з одного і того ж самого джерела, але розташовані способом, відмінним від такого, що зустрічається в природі. Такий конструкт може бути використаний окремо або може бути використаний у сполуці з вектором. Якщо використовується вектор, то вибір вектора залежить від способу, що буде використовуватися для трансформації хазяйських клітин, як добре відомо фахівцю в даній галузі. Наприклад, може використовуватися плазмідний вектор. Фахівцю добре відомі генетичні елементи, які повинні бути присутні у векторі для 4 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 успішної трансформації, селекції та розмноження хазяйських клітин, що включають будь-який з виділених фрагментів нуклеїнової кислоти даного винаходу. Фахівець також визнає, що різні незалежні події трансформації приведуть до різних рівнів і патернів експресії (Jones et al., EMBO J. 4:2411-2418 (1985); De Almeida et al., Моl. Gen. Genetics 218:78-86 (1989)) і, таким чином, що множинні події повинні обстежуватися для одержання ліній, які відображають бажані рівень і патерн експресії. Таке обстеження, серед інших, можна виконувати саузерн аналізом ДНК, нозерн аналізом мРНК експресії, аналізом імуноблотингу білкової експресії або фенотипичним аналізом. Такий конструкт може включати будь-яку комбінацію дезоксирибонуклеотидів, рибонуклеотидів і/або модифікованих нуклеотидів. Конструкт може транскрибуватися для формування РНК, де РНК може бути здатною формувати двониткову РНК і/або шпилькову структуру. Такий конструкт може бути експресований у клітині, або виділений, або отриманий синтетично. Конструкт може додатково включати промотор або інші послідовності, що полегшують маніпуляцію або експресію конструкта. Як використовується в даному документі, "супресія", або "сайленсинг", або "інгібування" використовуються взаємозамінно для позначення даун-регуляції експресії продукту мішеневої послідовності відносно її нормального рівня експресії в організмі дикого типу. Супресія включає експресію, що зменшується на близько 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 100 % відносно рівня експресії дикого типу. Як використовується в даному документі, "кодує" або "кодуюча" означає ДНК послідовність, що може бути оброблена для утворення РНК і/або поліпептиду. Як використовується в даному документі, "експресія" або "експресування" означає продукування функціонального продукту, наприклад, утворення РНК транскрипту із введеного конструкта, ендогенної ДНК або послідовності стабільно включеної гетерологічної ДНК послідовності. Вираз також може означати поліпептид, отриманий від мРНК, утвореної з кожного з вищезгаданих попередників ДНК. Таким чином, експресія фрагмента нуклеїнової кислоти може означати транскрипцію фрагмента нуклеїнової кислоти (наприклад, транскрипція, що приводить до мРНК або іншої функціональної РНК) і/або трансляцію РНК у попередник або зрілий білок (поліпептид). Як використовується в даному документі, "гетерологічна" стосовно послідовності означає послідовність, що походить від чужорідних видів, або, якщо від тих самих видів, є значною мірою модифікованою навмисним утручанням людини від її нативної форми за складом і/або геномним локусом. Наприклад, стосовно нуклеїнової кислоти, це може бути нуклеїнова кислота, що походить від чужорідних видів, або сконструйована синтетично, або, якщо від тих самих видів, є значною мірою модифікованою навмисним утручанням людини від її нативної форми за складом і/або геномним локусом. Гетерологічний білок може походити від чужорідних видів, або, якщо від тих самих видів, є значною мірою модифікованим навмисним утручанням людини від своєї первісної форми. Вираз "хазяйська клітина" означає клітину, що включає або в яку введено нуклеїновокислотний конструкт, і яка підтримує реплікацію та/або експресію конструкта. Хазяйські клітини можуть бути прокаріотичними клітинами, такими як Е. соlі, або еукаріотичними клітинами, такими як, клітини грибів, дріжджів, комахи, амфібії, нематоди або ссавця. Альтернативно, хазяйські клітини є рослинними клітинами однодольних або дводольних рослин. Прикладом хазяйської клітини однодольної рослини є хазяйська клітина маїсу. "Рослина" включає посилання на цілі рослини, органи рослин, тканини рослин, насіння та рослинні клітини та їхнє потомство. Рослинні клітини включають, без обмеження, клітини з насінин, суспензійних культур, зародків, меристематичних областей, калюсної тканини, листя, коренів, пагонів, гаметофітів, спорофітів, пилку та мікроспор. Вираз "рослинні частини" включає диференційовані та недиференційовані тканини, що включають, але без обмеження, наступне: корені, стебла, пагони, листя, пилок, насіння, пухлинну тканину та різні форми клітин і культуру (наприклад, окремі клітини, протопласти, зародки та калюсна тканина), рослинна тканина може бути в рослині або в органі рослини, тканинній або клітинній культурі. Вираз "орган рослини" означає рослинну тканину або групу тканин, що складає морфологічно і функціонально окрему частину рослини. Вираз "введений" означає доставку нуклеїнової кислоти (наприклад, експресуючого конструкта) або білка в клітину. Введений включає посилання на включення нуклеїнової кислоти в еукаріотичну або прокаріотичну клітину, де нуклеїнова кислота може бути включена в геном клітини, і включає посилання на транзиторне забезпечення клітини нуклеїновою кислотою або 5 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білком. Введений включає посилання на способи стабільної або транзиторної трансформації, а також статеве схрещування. Таким чином, "введений" у контексті вставки фрагмента нуклеїнової кислоти (наприклад, рекомбінантний ДНК-конструкт/експресуючий конструкт) у клітину означає "трансфекцію", або "трансформацію", або "трансдукцію" і включає посилання на включення фрагмента нуклеїнової кислоти в еукаріотичну або прокаріотичну клітину, де фрагмент нуклеїнової кислоти може бути включений у геном клітини (наприклад, хромосомна, плазмідна, пластидна або мітохондріальна ДНК), перетворений в автономний реплікон або транзиторно експресований (наприклад, трансфікована мРНК). Вираз "геном", як це застосовується для рослинних клітин, охоплює не тільки хромосомну ДНК, виявлену в ядрі, але і ДНК органелл, виявлену в субклітинних компонентах (наприклад, мітохондріальну, пластидну) клітини. Вираз "виділений" означає матеріал, такий як нуклеїнова кислота або білок, що є: (1) таким, що значною мірою або істотно не містить компоненти, що звичайно супроводжують або взаємодіють з матеріалом, яким його знаходять у його природному середовищі, або (2) якщо матеріал знаходиться у своєму природному середовищі, матеріал змінено навмисним утручанням людини в композицію і/або поміщено у локус у клітині, відмінного від локусу, нативного даному матеріалу. Як використовується в даному документі, "домен" або "функціональний домен" означає нуклеїновокислотну послідовність(послідовності), що здатна викликати біологічну відповідь у рослинах. Даний винахід стосується міРНК, що складається, щонайменше, з 21 нуклеотидної послідовності, що діє або окремо, або разом з іншими міРНК послідовностями, тому домен може означати або окремі міРНК, або групи міРНК. Також, міРНК послідовності, зв'язані з їхніми послідовностями остова, можна вважати доменами, використовуваними для процесингу міРНК у її активній формі. Як використовується в даному документі, "субдомени" або "функціональні субдомени" означають субпослідовності доменів, що здатні викликати біологічну відповідь у рослинах. МіРНК можна вважати субдоменом послідовності остова. "Суміжні" послідовності або домени означають послідовності, що послідовно зв'язані без доданих нуклеотидів, що знаходяться між доменами. Приклад нитки суміжного домена виявлено у SEQ ID NO:7957, що представляє собою SEQ ID NO: 1-2652, як безперервну нитку, що може бути представлена як 2652 міРНК послідовності, зв'язані разом у послідовне з'єднання у вигляді ланцюжка. РНК інтерференція означає процес специфічного по послідовності пост-транскрипційного генного сайленсингу у тварин, опосередкованого короткими інтерферуючими РНК (кіРНК) (Fire et al., Nature 391:806 1998). Відповідний процес у рослин звичайно називають посттранскрипційним генним сайленсингом (PTGS) або РНК сайленсингом, а також називають придушенням у грибах. Процес пост-транскрипційного генного сайленсингу вважається еволюційно-консервативним клітинним захисним механізмом, використовуваним для запобігання експресії чужорідних генів, і звичайно спільно використовується різноманітною флорою та таксономическими типами (Fire et al., Trends Genet. 15:358 1999). Такий захист від експресії чужорідних генів міг розвитися у відповідь на продукування двониткових РНК (днРНК), отриманих від вірусної інфекції або від випадкової інтеграції транспозонних елементів у хазяйський геном, шляхом клітинної відповіді, що специфічно руйнує гомологічну однониткову РНК вірусної геномної РНК. Присутність двониткової РНК у клітинах викликає відповідь РНКінтерференції через механізм, що повністю ще не охарактеризовано. Присутність довгих днРНК у клітинах стимулює активність ферменту рибонуклеаза III, названого "dicer". Dicer залучений у процесинг днРНК у короткі шматки днРНК, відомі як короткі інтерферуючі РНК (кіРНК) (Berstein et al., Nature 409:363 2001), і/або пре-міРНК у міРНК. Короткі інтерферуючі РНК, отримані в результаті активності dicer, типово мають довжину від близько 21 до близько 23 нуклеотидів і включають дуплекси з близько 19 пар основ (Elbashir et al., Genes Dev. 15:188 2001). Dicer також причетний до вирізання 21- і 22-нуклеотидних малих тимчасових РНК (мтРНК) із РНК-попередника консервативної структури, що залучені в трансляційний контроль (Hutvagner et al., 2001, Science 293:834). Відповідь РНК-інтерференції також характеризує ендонуклеазний комплекс, що звичайно називають комплекс РНК-індукованого сайленсингу (RISC), що опосередковує розщеплення однониткової РНК, що має комплементарність послідовності до антисмислової нитки дуплекса кіРНК. Розщеплення мішеневої РНК відбувається в середині ділянки, комплементарній антисмисловій нитці дуплекса кіРНК (Elbashir et al., Genes Dev. 15:188 2001). Крім того, РНК інтерференція також може включати опосередкований малою РНК (наприклад, мікроРНК або міРНК) генний сайленсинг, імовірно через клітинні механізми, що регулюють хроматинову структуру і тим самим запобігають транскрипції мішеневих генних послідовностей (див., наприклад, Allshire, Science 297:1818-1819 2002; Volpe et al., Science 297:1833-1837 2002; Jenuwein, Science 297:2215-2218 6 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2002; і Hall et al., Science 297:2232-2237 2002). Таким чином, молекули міРНК даного винаходу можна використовувати для опосередкування генного сайленсингу через взаємодію з РНК транскриптами або інакше взаємодією з конкретними генними послідовностями, де така взаємодія приведе до генного сайленсингу або на транскрипційному, або на посттранскрипційному рівні. РНК-інтерференція досліджена на ряді систем. Fire et al. (Nature 391:806 1998) першими спостерігали РНК-інтерференцію в С. elegans. Wianny і Goetz {Nature Cell Biol. 2:70 1999) описують РНК-інтерференцію, опосередковану двонитковою РНК у зародках мишей. Hammond et al. (Nature 404:293 2000) описують РНК-інтерференцію в клітинах Drosophila, трансфікованих двонитковою РНК. Elbashir et al. (Nature 411:494 2001) описують РНК-інтерференцію, індуковану введенням дуплексів синтетичних 21-нуклеотидних РНК у клітинах ссавця, що культивуються, включаючи первинну нирку людини та HeLa клітини. Малі РНК відіграють важливу роль у контролюванні експресії гена. Регуляція багатьох зв'язаних з розвитком процесів, включаючи цвітіння, контролюється малими РНК. Тепер можна конструювати зміни в генній експресії рослинних генів шляхом використання трансгенних конструктів, що продукують малі РНК у рослині. Малі РНК, як виявляється, функціонують спарюванням основ з комплементарною РНК або ДНК мішеневими послідовностями. При зв'язуванні з РНК малі РНК або запускають розщеплення РНК, або трансляційне інгібування мішеневої послідовності. При зв'язуванні з ДНК мішеневими послідовностями вважається, що малі РНК можуть опосередковувати ДНК метилювання мішеневої послідовності. Наслідком цих подій, незалежно від специфічного механізму, є те, що інгібується генна експресія. МікроРНК (міРНК) є некодуючими РНК довжиною від близько 19 до близько 24 нуклеотидів (нт), що ідентифіковані та у тварин, і в рослин (Lagos-Quintana et al., Science 294:853-858 2001, Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12:735-739 2002; Lau et al., Science 294:858-862 2001; Lee і Ambros, Science 294:862-864 2001; Llave et al., Рlаnt Сеll 14:1605-1619 2002; Mourelatos et al., Genes. Dev. 16:720-728 2002; Park et al., Curr. Biol. 12:1484-1495 2002; Reinhart etal., Genes. Dev. 16:1616-1626 2002). Вони отримані з більш довгих транскриптів-попередників, розмір яких варіює від приблизно 70 до 200 нт, і ці транскрипти-попередники мають здатність формувати стабільні шпилькові структури. У тварин фермент, залучений у процесинг попередників міРНК, називають Dicer, РНКаза III-подібний білок (Grishok et al., Cell 106:23-34 2001; Hutvagner et al., Science 293:834-838 2001; Ketting et al., Genes. Dev. 15:2654-2659 2001). У рослин також є Dicerподібний фермент, DCL1 (раніше називаний CARPEL FACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/ SUSPENSOR1), і останні дані показують, що він, подібно Dicer, залучений у процесинг шпилькових попередників для утворення зрілих міРНК (Park et al., Curr. Biol. 12:1484-1495 2002; Reinhart et al., Genes. Dev. 16:1616-1626 2002). Крім того, з останньої роботи стає ясно, що, щонайменше, деякі шпилькові попередники міРНК утворюються як більш довгі поліаденільовані транскрипти, і деякі інші міРНК і зв'язані шпильки можуть бути присутні в окремому транскрипті (Lagos-Quintana et al., Science 294:853-858 2001; Lee et al., EMBO J21:4663-4670 2002). Остання робота також розглядала вибір нитки міРНК з продукту двониткової РНК, що походить від процесингу шпильки за допомогою DICER (Schwartz et al., 2003, Cell 115:199-208). Стає ясно, що стабільність (тобто вміст G:C проти A:U і/або помилкові спарювання) двох кінців обробленої двониткової РНК впливає на вибір нитки, при цьому кінець з низькою стабільністю легше розкрутити геліказною активністю. Нитка з 5' кінцем низької стабільності включається в RISC комплекс, тоді як інша нитка розпадається. У тварин існують прямі докази ролі специфічних міРНК у розвитку. Знайшли, що Ііn-4 і let-7 міРНК у С. elegans контролюють тимчасовий розвиток на основі фенотипів, отриманих при мутації генів, продукуючих Ііn-4 і let-7 міРНК (Lee et al., Cell 75:843-854 1993; Reinhart et al., Nature 403-901-906 2000). Крім того, обидві міРНК відображають часовий патерн експресії відповідно до їхніх ролей у часовому патерні розвитку. Інші тваринні міРНК відображають регульовані розвитком патерни експресії як тимчасові, так і специфічні для тканини (LagosQuintana et al., Science 294:853-853 2001, Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12:735-739 2002; Lau et al., Science 294:858-862 2001; Lee і Ambros, Science 294:862-864 2001), що привело до гіпотези, що міРНК можуть бути в багатьох випадках залучені в регуляцію важливих процесів розвитку. Крім того, у рослинах диференціальні патерни експресії багатьох міРНК передбачають роль у розвитку (Llave et al., Plant Cell 14:1605-1619 2002; Park et al., Curr. Biol. 12:1484-1495 2002; Reinhart et al., Genes. Dev. 16:1616-1626 2002). Проте, роль у розвитку для міРНК безпосередньо не доведена в рослинах, оскільки дотепер не було ніяких повідомлень про фенотип, що відноситься дорозвитку, який зв'язаний зі специфічною рослинною міРНК. 7 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Очевидно, міРНК регулюють мішеневі гени зв'язуванням з комплементарними послідовностями, розташованими в транскриптах, що продукуються цими генами. У випадку lіn4 і let-7 мішеневі сайти розташовані в 3' UTR мішеневих мРНК (Lee et al., Cell 75:843-854 1993; Wightman et al., Cell 75:855-862 1993; Reinhart et al., Nature 403:901-906 2000; Slack et al., Моl. Cell 5:659-669 2000), і є трохи помилкових спарювань між lіn-4 і let-7 міРНК та їх мішеневими сайтами. Очевидно, зв'язування lіn-4 або let-7 міРНК викликає даун-регуляцію усталених рівнів білка, що кодується мішеневою мРНК, не впливаючи на сам транскрипт (Olsen і Ambros, Dev. Biol. 216:671-680 1999). З іншого боку, останні дані вказують на те, що міРНК можуть у деяких випадках викликати специфічне РНК розщеплення мішеневого транскрипту на мішеневому сайті (Hutvagner і Zamore, Science 297:2056-2060 2002; Llave et al., Plant Cell 14:1605-1619 2002). Імовірно, що міРНК можуть вступати, щонайменше, у два шляхи метаболізму регуляції мішеневого гена: даун-регуляцію білка та РНК розщеплення. МікроРНК, що вступають у шлях метаболізму РНК розщеплення, включені в комплекс РНК-iндукованого сайленсингу (RISC), що подібний або ідентичний тому, що спостерігався для РНК-інтерференції. Даний винахід стосується виділеного фрагмента нуклеїнової кислоти, що включає міРНКпопередник, причому вказаний міРНК-попередник значною мірою відповідає дезоксирибонуклеотидній послідовності, викладеній в SEQ ID NO:11, (і) де нуклеотиди 430-450 у SEQ ID NO:11 заміщені першою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів залежно від мішеневої послідовності, чия експресія підлягає зниженню, і (іі) крім того, де нуклеотиди 244-264 у SEQ ID NO:11 заміщені другою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів, причому вказана друга мінлива нуклеотидна субпослідовність здатна гібридизуватися з першою мінливою субпослідовністю міРНК-попередника. Цей виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, що включає міРНК-попередник, також можна називати "міРНК остов". Фахівцю в даній галузі добре відомо, що, якщо транскрипт являє собою повної довжини прай-міРНК або пре-міРНК, його важко диференціювати. Тому міРНКпопередник функціонально визначений, як нуклеотидна послідовність, яка здатна продукувати міРНК. Інші виділені нуклеїнові фрагменти інтересу включають наступне: а) транскрибований з виділеного фрагмента нуклеїнової кислоти, що включає міРНКпопередник, причому вказаний міРНК-попередник значною мірою відповідає дезоксирибонуклеотидній послідовності, викладеній в SEQ ID NO:12, (і) де нуклеотиди 94-114 у SEQ ID NO:12 заміщені першою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів залежно від мішеневої послідовності, чия експресія підлягає зниженню, і (іі) крім того, де нуклеотиди 163-183 у SEQ ID NO:12 заміщені другою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів, причому вказана друга мінлива нуклеотидна субпослідовність здатна гібридизуватися з першою мінливою субпослідовністю міРНК-попередника; b) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, що включає міРНК-попередник, причому вказаний міРНК-попередник значною мірою відповідає дезоксирибонуклеотидній послідовності, викладеній в SEQ ID NO:13, (і) де нуклеотиди 53-73 у SEQ ID NO:13 заміщені першою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів залежно від мішеневої послідовності, чия експресія підлягає зниженню, і (іі) крім того, де нуклеотиди 97-117 у SEQ ID NO: 13 заміщені другою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів, причому вказана друга мінлива нуклеотидна субпослідовність здатна гібридизуватися з першою мінливою субпослідовністю міРНК-попередника; c) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, що включає міРНК-попередник, причому вказаний міРНК-попередник значною мірою відповідає дезоксирибонуклеотидній послідовності, викладеній в SEQ ID NO: 14, (і) де нуклеотиди 110-130 у SEQ ID NO: 14 заміщені першою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів залежно від мішеневої послідовності, чия експресія підлягає зниженню, і (іі) крім того, де нуклеотиди 184-203 у SEQ ID NO: 14 заміщені другою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів, причому вказана друга мінлива нуклеотидна субпослідовність здатна гібридизуватися з першою мінливою субпослідовністю міРНК-попередника; і d) виділений фрагмент нуклеїнової кислоти, що включає міРНК-попередник, причому вказаний міРНК-попередник значною мірою відповідає дезоксирибонуклеотидній послідовності, викладеній в SEQ ID NO: 15, (і) де нуклеотиди 83-103 у SEQ ID NO: 15 заміщені першою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 8 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотидів залежно від мішеневої послідовності, чия експресія підлягає зниженню, і (іі) крім того, де нуклеотиди 172-192 у SEQ ID NO: 15 заміщені другою мінливою нуклеотидною субпослідовністю, розмір якої варіює від близько 19 до близько 30 нуклеотидів, причому вказана друга мінлива нуклеотидна субпослідовність здатна гібридизуватися з першою мінливою субпослідовністю міРНК-попередника. Будь-який з цих виділених фрагментів нуклеїнової кислоти можна використовувати для створення рекомбінантного конструкта, що включає ці виділені фрагменти нуклеїнової кислоти, функціонально зв'язані, щонайменше, з однією регуляторною послідовністю. Такі конструкти можна трансформувати в рослинну клітину так, що трансформована рослинна клітина буде включати рекомбінантний конструкт у своєму геномі. Переважно, рослинна клітина може бути рослинною клітиною однодольної рослини. Приклади рослинних клітин однодольних рослин включають, але без обмеження, клітини маїсу, сорго, пшениці, рису, вівса, жита, ячменя, цукрового очерету, просо, бамбука, банана та орхідні. Найбільш переважною рослинною клітиною однодольної рослини є клітина маїсу. В іншому аспекті даний винахід стосується способу зниження експресії мішеневої послідовності в рослинній клітині, причому вказаний спосіб включає: (a) здійснення трансформації, щонайменше, однієї рослинної клітини нуклеїновокислотним конструктом, що включає будь-який з виділених фрагментів нуклеїнової кислоти, описаний у даному документі; та (b) добір такої трансформованої рослинної клітини(клітин), чий рівень експресії мішеневої послідовності знижений у порівнянні з рівнем експресії мішеневої послідовності в рослинній клітині дикого типу. Біоінформаційні підходи успішно використовуються для прогнозування мішеней для рослинних мiPHK(Llave et at., Plant Cell 14:1605-1619 2002; Parket al., Curr. Biol. 12:1484-1495 2002; Rhoades et al., Cell 110:513-520 2002), і, таким чином, очевидно, рослинні міРНК мають більш високу загальну комплементарність з їх передбачуваними мішенями, ніж тваринні міРНК. Більшість з таких прогнозованих мішеневих транскриптів рослинних міРНК кодують членів сімейств транскрипційних факторів, залучених у зв'язане з розвитком структурування рослини або клітинну диференціацію. Загальні категорії послідовностей інтересу включають, наприклад, гени, залучені в регуляцію або інформацію, такі як цинкові пальці, транскрипційні фактори, гомеозисні гени або модулятори клітинного циклу та клітинної смерті, залучені в комунікацію, такі як кінази, і залучені в здійснення загальних для клітин функцій, такі як білки теплового шоку. Мішеневі послідовності можуть включати кодуючі ділянки і некодуючі ділянки, такі як промотори, енхансери, термінатори, інтрони та подібне. Мішенева послідовність може бути ендогенною послідовністю або може бути введеною гетерологічною послідовністю, або трансгеном. Наприклад, способи можна використовувати для зміни регуляції або експресії трансгена, або для видалення трансгена або іншої введеної послідовності, такої як введений сайт сайт-специфічної рекомбінації. Мішенева послідовність також може бути послідовністю з патогена, наприклад, мішенева послідовність може бути з рослинного патогена, такого як вірус, плісень або грибок, комаха або нематода. МіРНК може бути експресована в рослині, яка при інфекції або зараженні буде націлена на патоген і буде додавати деякий ступінь стійкості рослині. У рослинах інші категорії мішеневих послідовностей включають гени, що впливають на агрономічні ознаки, стійкість до комах, стійкість до хвороб, стійкість до гербіцидів, стерильність, характеристики зерна та комерційні продукти. Гени інтересу також включають залучені в метаболізм олії, крохмалю, вуглеводу або живильних речовин, а також впливають, наприклад, на розмір зерна, наповнення сахарозою і подібне. Якість зерна відображається в ознаках, таких як рівні і типи олій, насичених і ненасичених, якість і кількість незамінних амінокислот і рівні целюлози. Наприклад, гени біосинтетичного шляху метаболізму фітинової кислоти можуть бути супресовані для утворення фенотипу високої доступності фосфору. Дивись, наприклад, ферменти біосинтезу фітинової кислоти, що включають полінуклеотиди інозитол-поліфосфаткінази-2, розкриті в WO 02/059324, полінуклеотиди інозитол-1,3,4-трифосфат-5/6-кінази, розкриті в WO 03/027243, і полінуклеотиди міо-інозитол-1-фосфат-синтази та інші полінуклеотиди біосинтезу фітатов, розкриті в WO 99/05298, усі з якої включені посиланням у даний документ. Гени в шляху легніфікації можуть бути супресовані для посилення перетравності або доступності енергії. Гени, що впливають на клітинний цикл або клітинну смерть, можуть бути супресовані для впливу на ріст або стресову відповідь. Гени, що впливають на ДНК репарацію та/або рекомбінацію, можуть бути супресовані для підвищення генетичної варіабельності. Можуть бути супресовані гени, що впливають на період цвітіння, а 9 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 також гени, що впливають на фертильність. Будь-яка мішенева послідовність може бути супресована для оцінки або підтвердження її ролі в конкретній ознаці або фенотипі, або для аналізу молекулярного, регуляторного, біохімічного або протеомного шляху метаболізму або мережі. Можна використовувати ряд промоторів. Ці промотори можна вибрати залежно від бажаного результату. Варто визнати, що різні застосування будуть розширені застосуванням різних промоторів у рослинних експресуючих касетах для модуляції тимчасового патерна, розташування та/або рівня експресії міРНК. Такі рослинні експресуючі касети також можуть включати, при бажанні, промоторну регуляторну ділянку (наприклад, одна обговорювана індукована, конститутивна, екологічно або залежно сті від розвитку регульована або клітинно-, або ткане-специфічна/селективна експресія), сайт початку ініціації транскрипції, сайт зв'язування з рибосомою, сигнал процесингу РНК, сайт термінації транскрипції та/або сигнал поліаденілювання. Можна застосовувати конститутивні, переважні для тканини або індуковані промотори. Приклади конститутивних промоторів включають 35S ділянку ініціації транскрипції вірусу мозаїки кольорової капусти (CaMV), 1'- або 2'-промотор, отриманий від Т-ДНК Agrobactehum tumefaciens, ubiquitin 1 промотор, Smas промотор, промотор дегідрогенази коричного спирту (патент США № 5683439), Nos промотор, pEmu промотор, промотор rubisco (оксигеназа рибульозо-1,5-біфосфаткарбоксилази), GRP1-8 промотор і інші ділянки ініціації транскрипції з різних генів рослин, відомих фахівцю. Якщо бажаний низький рівень експресії, можна використовувати слабкий промотор(промотори). Слабкі конститутивні промотори включають, наприклад, коровий промотор Rsyn7 промотора (WO 99/43838 і патент США № 6072050), коровий 35S CaMV промотор і подібне. Інші конститутивні промотори включають, наприклад, патенти США №№ 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463 і 5608142. Див. також, патент США № 6177611, включений у даний документ посиланням. Прикладами індукованих промоторів є Adh1 промотор, що индукується гіпоксією або холодовим стресом, Hsp70 промотор, що індукується тепловим стресом, PPDK промотор і промотор пепкарбоксилази, обидва з яких індукуються світлом. Також використовуються промотори, що индукуються хімічно, такі як Іn2-2 промотор, що індукується сафенером (патент США № 5364780), ERE промотор, що индукується естрогеном, і Ахід1 промотор, що індукується ауксином і тапетум специфічний, але також активний у калюсі (РСТ US01/22169). Приклади промоторів, які контролюються розвитком, включають промотори, що ініціюють транскрипцію, переважно у певних тканинах, таких як листя, корені, плід, насіння або квітки. Ілюстративним промотором є специфічний для пиляка промотор 5126 (патенти США №№ 5689049 і 5689051). Приклади переважних для насіння промоторів включають, але без обмеження, 27 кДа gamma zein промотор і waxy промотор, Boronat, A. et al. (1986) Plant Sci. 47:95-102; Reina, M. etal. Nucl. Acids Res. 18(21):6426; і Kloesgen, R. B. et al. (1986) Моl. Gen. Genet. 203:237-244. Промотори, що експресуються в зародку, перикарпії та ендоспермі, розкриті в патенті США № 6225529 і РСТ публікації WO 00/12733. Розкриття яких включені в даний документ посиланням у всій їхній повноті. У деяких варіантах здійснення буде корисним експресувати ген від індукованого промотора, особливо від патоген-індукованого промотора. Такі промотори включають промотори від зв'язаних з патогенезом білків (PR білки), що індукуються після інфекції патогеном; наприклад, PR білки, SAR білки, бета-1,3-глюканаза, хітиназа і т. д. Див., наприклад, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; і Van Loon (1985) Plant Моl. Virol. 4:111-116. Див. також WO 99/43819, включену в даний документ посиланням. Становлять інтерес промотори, що експресуються локально в або поруч із сайтом патогенної інфекції. Див., наприклад, Marineau et al. (1987) Plant Моl. Biol. 9:335-342; Matton etal. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) Моl. Gen. Genet. 2:93-98; і Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Див. також, Chen et al. (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz etal. (1989) Plant Cell 1:961-968; патент США № 5750386 (індукований нематодой) і посилання, що цитуються в даних документах. Зокрема інтерес представляє індукований промотор для PRms гена маїсу, експресія якого індукована патогеном Fusarium moniliforme (див., наприклад, Cordero et al. (1992) Physiol. Моl. Plant Path. 41:189-200). Крім того, через те, що патогени знаходять вхід у рослини через рани або ушкодження комахою, у конструкціях полінуклеотидів можна використовувати індукований раною промотор. Такі індуковані раною промотори включають ген інгібітору протеїнази (ріn II) картоплі (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan etal. (1996) Nature Biotech. 14:494-498); wun1 і 10 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 wun2, патент США № 5428148; win1 і win2 (Stanford et al. (1989) Моl. Gen. Genet. 215:200-208); systemin (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Моl. Biol. 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Lett. 323:73-76); МРІ ген (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2):141-150) і подібні, включені в даний документ посиланням. Хімічно регульовані промотори можна використовувати для модуляції експресії гена в рослині шляхом застосування екзогенного хімічного регулятора. Залежно від мети промотор може бути хімічно індукованим промотором, де застосування хімікату індукує експресію гена, або промотором, що хімічно репресується, де застосування хімікату репресує експресію гена. Хімічно індуковані промотори відомі в даній галузі та включають, але без обмеження, Іn2-2 промотор маїсу, що активується сафенерами бензолсульфонамідних гербіцидів, GST промотор маїсу, що активується гідрофобними електрофільними сполуками, використовуваними як досходові гербіциди, і PR-1a промотор тютюну, що активується саліциловою кислотою. Інші хімічно регульовані промотори інтересу включають реагуючі на стероїди промотори (див., наприклад, індукований глюкокортикоїдом промотор у Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 і McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257), індукований тетрацикліном промотор і промотор, що репресується тетрацикліном, (див., наприклад, Gatz et al. (1991) Моl. Gen. Genet. 227:229-237 і патенти США №№ 5814618 і 5789156), включені в даний документ посиланням. Переважні для тканини промотори можна застосовувати для мішеневої посиленої експресії послідовності інтересу в конкретній рослинній тканині. Переважні для тканини промотори включають Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Моl. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini etal. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Моl Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; і Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Такі промотори можуть бути модифіковані, якщо необхідно, для слабкої експресії. Переважні для листя промотори відомі в даній галузі. Див., наприклад, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco etal. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; і Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590. Крім того, також можна використовувати промотори cab і rubisco. Див., наприклад, Simpson et al. (1958) EMBO J 4:2723-2729 і Timko et al. (1988) Nature 318:57-58. Переважні для коренів промотори відомі та можуть бути вибрані з багатьох, доступних з літератури або виділених de novo з різних сумісних видів. Див., наприклад, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (специфічний для кореня сої ген глютамінсинтетази); Keller і Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (специфічний для кореня елемент керування в GRP 1. 8 гені квасолі звичайної); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (специфічний для кореня промотор гена манопінсинтази (MAS) Agrobacterium tumefaciens); і Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1): 11-22 (кДНК клон повної довжини, що кодує цитозольну глутамінсинтетазу (GS), що експресується в коренях і кореневих клубеньках сої). Див. також Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7):633-641, де описані два специфічних для кореня промотори, виділені з генів гемоглобіну фіксуючого азот небобового Parasponia andersonii і родинного нефіксуючого азот небобового Trema tomentosa. Промотори цих генів були зв'язані з репортерним геном глюкуронідази і введені в небобове Nicotiana tabacum і бобове Lotus corniculatus, і в обох випадках активність специфічного для кореня промотора була збережена. Leach і Aoyagi (1991) описують їхній аналіз промоторів rоlС і rоlD індукованих коренем генів, що високо експресуються, Agrobacterium rhizogenes (див. Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Вони зробили висновок, що енхансер і переважні для тканини ДНК детермінанти дисоційовані в цих промоторах. Teeri et al. (1989) використовували генне злиття з lacZ, щоб показати, що Т-ДНК ген Agrobacterium, що кодує октопінсинтазу, особливо активний в епідермісі кінчика кореня, і що TR2' ген специфічний для кореня в здоровій рослині та стимулюється пораненням у листовій тканині, особливо бажана комбінація характеристик для застосування з інсектицидним або ларвіцидним геном (див. EMBO J. 8(2):343-350). TR1' ген, злитий з nptII (неоміцин фосфотрансфераза II), показав подібні характеристики. Додаткові переважні для кореня промотори включають промотор VfENOD-GRP3 гена (Kuster et al. (1995) Plant Моl. Biol. 29(4):759-772); і rоlВ промотор (Capana et al. (1994) Plant Моl. Biol. 25(4):681-691. Див. також патенти США №№ 5837876; 5750386; 5633363; 5459252; 5401836; 5110732 і 5023179. Ген 11 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 фазеоліна (Murai et al. (1983) Science 23:476-482 і Sengopta-Gopalen et al. (1988) PNAS 82:33203324. Протоколи трансформації, а також протоколи для введення нуклеотидних послідовностей у рослини, можуть варіювати залежно від типу рослини або клітини рослини, тобто, однодольного або дводольного, наміченого для трансформації. Придатні способи введення ДНК-конструкта включають мікроін'єкцію (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334 і патент США № 6300543), статеве схрещування, електропорацію (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), опосередковану Agrobacterium трансформацію (Townsend et al., патент США № 5563055 і патент США № 5981840), спрямований перенос генів (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722) і балістичне прискорення частинок (див., наприклад, Sanford et al., патент США № 4945050; Tomes et al., патент США № 5879918; Tomes et al., патент США № 5886244; Bidney et al., патент США № 5932782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, " у Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); і McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926). Також див. Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (цибуля); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (соя); Finer і McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (соя); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (соя); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (рис); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (маїс); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (маїс); Tomes, патент США № 5240855; Buising et al., патенти США №№ 5322783 і 5324646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (маїс); Fromm et al. (1990) Biotechnology8:833-839 (маїс); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen et al., патент США № 5736369 (зернові); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (лілейні); De Wet et al. (1985) у The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (пилок); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 і Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (whisker-опосередкована трансформація); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (електропорація); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 і Christou і Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (рис); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745750 (маїс за допомогою Agrobacterium tumefaciens) і патент США № 5736369 (трансформація меристеми), усі з яких включені посиланням у даний документ. Нуклеотидні конструкти можуть бути введені в рослини шляхом введення в контакт рослини з вірусом або вірусними нуклеїновими кислотами. Взагалі такі способи включають убудовування нуклеотидного конструкта даного винаходу в молекулу вірусної ДНК або РНК. Крім того, визнано, що придатні промотори охоплюють промотори, використовувані для транскрипції вірусними РНК-полімеразами. Способи введення нуклеотидних конструктів у рослини і експресія білка, закодованого в них, включення молекул вірусних ДНК або РНК, відомі в даній галузі. Див., наприклад, патенти США №№ 5889191, 5889190, 5866785, 5589367 і 5316931; включені в даний документ посиланням. У деяких варіантах здійснення може бути бажана транзиторна експресія. У цих випадках можна використовувати стандартні методики транзиторної трансформації. Такі способи включають, але без обмеження, способи вірусної трансформації та мікроін'єкцію ДНК або РНК, а також інші способи, добре відомі в даній галузі. Клітини з рослин, що мають стабільно включену нуклеотидну послідовність, можна вирощувати в рослинах відповідно до традиційних способів. Див., наприклад, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Потім ці рослини можна вирощувати та запилювати або тим же трансформованим сортом, або іншими сортами, та отриманий гібрид буде мати конститутивну експресію бажаної фенотипічної характеристики, забезпеченої нуклеотидною послідовністю інтересу, і/або генетичні маркери, що містяться в мішеневому сайті або касеті переносу. Для забезпечення стабільної підтримки та успадкування експресії бажаної фенотипічної характеристики можна виростити два або більш покоління, а потім зібрати насіння, щоб переконатися, що досягнуто експресію бажаної фенотипічної характеристики. Приклади Приклад 1 Виділення генів попередників геномних мікроРНК Послідовності, що кодують гени мікроРНК маїсу, як описано в Zhang В, et al. (2006) FEBS Lett. 580:3753-62, використовували як запити для BLAST аналізу колекції Pioneer Unicorn 6. 0 маркерних послідовностей, які експресуються. Приблизно 30 % запитів мали точні відповідності в колекції Unicorn 6. 0. Наступні праймери (придбані в MWG-BIOTECH Inc.) призначалися для ампліфікації вибору п'яти з цих послідовностей (див. Таблиця 1). 60 12 UA 113950 C2 Таблиця 1 Праймери для ампліфікації попередників геномних мікроРНК Праймер 159cs 159са 164hs 164ha 168as 168aa 169rs 169ra 396hs 396ha 5 10 Послідовність праймера SEQ ID NO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 159 смисловий праймер (159cs, SEQ ID NO: 1) включав нуклеотиди, що кодували Nco І сайт. 159 антисмисловий праймер (159са, SEQ ID NO: 2) включав нуклеотиди, що кодували Ват НІ сайт. Інші чотири смислових праймери (SEQ ID NO: 3, 5, 7 і 9) включали нуклеотиди, що кодували Ват НІ сайт. Інші чотири антисмислових праймери (SEQ ID NO: 4, 6, 8 і 10) включали нуклеотиди, що кодували Nco І сайт. Семена Zea mays cv. B73 проростили та геномну ДНК одержали з тканини проростків за допомогою набору Qiagen DNeasy Plant Maxi відповідно до інструкцій виробника. ДНК продукти ампліфікували за допомогою геномної ДНК як матриці і вищевказаних праймерних пар ExTaq полімеразою (TaKaRa Bio Inc.). Отримані ДНК продукти клонували в pCR2. 1 (Invitrogen) і повністю секвенували. Охарактеризовані попередники мікроРНК наведені в Таблиці 2. Таблиця 2 Послідовності попередників мікроРНК попередник мікроРНК 159с 164h 168а 169r 396h 15 20 25 30 SEQ ID NO 11 12 13 14 15 Довжина (нуклеотиди) 875 780 791 859 633 Приклад 2 Конструкція штучних мікроРНК послідовностей Штучні мікроРНК (шміРНК), що будуть мати здатність до сайленсингу гена фітоендесатурази маїсу (NCBI номер U37285), сконструювали головним чином відповідно до правил, описаних у Schwab R, et al. (2005) Dev Cell 8: 517-27. У підсумку, мікроРНК послідовності мають довжину 21 нуклеотид, починаються з їхнього 5'-кінця з "U", виявляють 5' нестабільність відносно їхньої послідовності, позначеної штрихом, що досягається включенням С або G у положенні 19, та їхнім 10-им нуклеотидом є або "А", або "U". Додаткова вимога до штучної мікроРНК конструкції полягало в тому, щоб штучна міРНК мала високу вільну енергію дельта G, за розрахунком за допомогою алгоритму ZipFold (Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) Nucleic Acids Res. 33: W577W581). Факультативно, заміну однієї пари основ додали в 5' частину шміРНК так, щоб послідовність відрізнялася від мішеневої послідовності одним нуклеотидом. ШміРНК, що використовували для сайленсингу фітоендесатурази, була 5'-ucagcagcaauuucaccagga-3' (ДНК послідовність, що відповідає цієї шміРНК, представлена в SEQ ID NO: 16). Дві додаткові шміРНК сконструювали для сайленсингу фітоендесатурази. Такими послідовностями є PDS 2, 5'-ugcaauaaaaaccucaucgua-3' (ДНК послідовність, що відповідає цієї шміРНК, представлена в SEQ ID NO: 35) і PDS 3, 5'-uacucgcaaaacaucucugag-3' (ДНК послідовність, що відповідає цієї шміРНК, представлена в SEQ ID NO: 36). Приклад 3 Конструкція штучних послідовностей, позначених штрихом "Послідовності, позначені штрихом" є такими, що пари основ з шміРНК послідовностями, у РНК-попереднику, формують 13 UA 113950 C2 5 10 недосконалі стеблові структури. Для формування досконалої стеблової структури послідовність, позначена штрихом, буде точним зворотним комплементом шміРНК. Послідовність попередника маїсу, як описано Zhang et al. у Таблиці S1 додаткового матеріалу, була згорнута за допомогою mfold (M. Zuker (2003) Nucleic Acids Res. 31: 3406-15; і D. H. Mathews, J. et al. (1999) J. Моl. Biol. 288: 911-940). Потім міРНК послідовності були заміщені шміРНК послідовністю, а ендогенна послідовність, позначена штрихом, була заміщена точним зворотним комплементом штучної міРНК. Заміни в штучній послідовності, позначеній штрихом, були введені так, щоб структура стебла залишилась тією ж, що та ендогенна структура. Потім змінену послідовність згорнули за допомогою mfold, а оригінальну та змінену структури порівняли візуально. Якщо необхідно, додаткові зміни в штучну послідовність, позначену штрихом, вводили для підтримки оригінальної структури. ДНК послідовностями, що відповідають штучним послідовностям, позначеним штрихом, які використовували для мовчання фітоендесатурази, є: Таблиця 3 Штучні мікроРНК послідовності, позначені штрихом попередник шміРНК 159C-PDS 164h-PDS 168a-PDS 169r-PDS 396h-PDS 396h-PDS 2 396h-PDS 3 послідовність, позначена штрихом SEQ ID NO 17 18 19 20 21 37 38 15 20 25 30 Приклад 4 Конверсія попередників геномних мікроРНК у попередники штучних мікроРНК Гени попередників геномних міРНК конвертували в шміРНК за допомогою ПЛР, (полімеразна ланцюгова реакція), що перекривається, а отримані ДНК повністю секвенували. Потім ці ДНК клонували в 5' - 3' напрямку придатного промотора у вектор, здатний до трансформації маїсу. Потім отримані плазміди були сумісно інтегровані в штам Agrobacterium LBA4404 vir плазмідою РНР10523 (РСТ публікація № WO2002/004649, опублікована 17 січня 2002 р.) і можуть бути використані для трансформації маїсу. Альтернативно, шміРНК можуть бути синтезовані комерційно, наприклад, за допомогою Codon Devices (Cambridge, MA). Потім синтезовану ДНК клонують у 5' - 3' напрямку придатного промотора у вектор, який здатний до трансформації маїсу. Потім отримані плазміди сумісно інтегрують у штам Agrobacterium LBA4404 плазмідою РНР10523 і можуть використовувати для трансформації маїсу. Приклад 5 Конверсія попередників геномних мікроРНК у попередники штучних мікроРНК Гени попередників геномних міРНК конвертували в попередники шміРНК за допомогою ПЛР, що перекривається, як описано в прикладі 4, а отримані ДНК повністю секвенували. Одержали наступні п'ять попередників шміРНК: Таблиця 4 Послідовності попередників штучних мікроРНК, що націлюються на фітоендесатуразу попередник мікроРНК 159C-PDS 164h-PDS 168a-PDS 169r-PDS 396h-PDS SEQ ID NO 22 23 24 25 26 довжина (нуклеотиди) 684 739 791 860 633 35 Потім ці ДНК клонували в 5'-3' напрямку ubiquitin промотор-інтрона РНР23576. РНР23576 включає Gateway (Invitrogen) L1 і L2 сайти. Потім отримані плазміди рекомбінували з плазмідою 14 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 РНР20622 (РСТ публікація № WO2006/107931, опублікована 12 жовтня 2006 р.). Потім отримані плазміди сумісно інтегрували в штам Agrobacterium LBA4404 vir плазмідою РНР10523 і використовували для трансформації маїсу. Приклад 6 Трансформація маїсу А. Опосередкована частинками доставка ДНК у маїсі ДНК-конструкт можна ввести в клітини маїсу, які здатні рости на придатному маїсовому культуральному середовищі. Такі компетентні клітини можуть бути з маїсової суспензійної культури, калюсної культури на твердому середовищі, свіжовиділених незрілих зародків або меристематичними клітинами. Незрілі зародки Ні-ІІ генотипу можна використовувати як мішеневі клітини. Качани збирають через приблизно 10 днів після запилення, 1,2-1,5 мм незрілі зародки виділяють із зерен і поміщають щитком зародка вниз на маїсове культуральне середовище. Незрілі зародки бомбардують протягом 18-72 годин після збору з качана. Між 6 і 18 годинами до бомбардування незрілі зародки поміщають на середовище з додатковою осмотично активною речовиною (основне середовище MS, Musashige і Skoog, 1962, Physiol. Plant 15:473-497, з 0,25 M сорбітолу). Зародки на високо осмотичному середовищі використовують як мішень для бомбардування і залишають на цьому середовищі ще на 18 годин після бомбардування. Для бомбардування частинками плазмідну ДНК (описану вище) осаджують на 1,8 мм вольфрамові частинки за допомогою стандартної СаСl2-спермідинової хімії (див., наприклад, Klein et al., 1987, Nature 327:70-73). Кожен планшет бомбардують один раз при 600 ПСІ за допомогою DuPont Helium Gun (Lowe et al., 1995, Bio/Technol 13:677-682). Для типових сполук середовища, використовуваних для виділення незрілих зародків маїсу, калюсної ініціації, калюсної проліферації та регенерації рослин, див. Armstrong, С, 1994, у "The Maize Handbook", M. Freeling and V. Walbot, eds. Springer Verlag, NY, pp 663-671. Протягом 1-7 днів після бомбардування частинками зародки переміщають на культуральне середовище на основі середовища N6, що включає 3 мг/л селективного агента біалофосу. Зародки та пізній калюс переносять на свіжі планшети для добору кожні 2 тижні. Калюс, що розвивається з незрілих зародків, обстежують на бажаний фенотип. Через 6-8 тижнів трансформований калюс відновлюють. В. Трансформація маїсу з використанням Agrobacterium Опосередковану Agrobacterium трансформацію маїсу виконують в основному як описано Zhao et al., у Meth. Моl. Biol. 318:315-323 (2006) (див. також Zhao et al., Моl. Breed. 8:323-333 (2001) і патент США № 5981840, виданий 9 листопада 1999, включені в даний документ посиланням). Процес трансформації включає інокуляцію бактеріями, спільну культивацію, спокій, добір і відновлення рослини. 1. Приготування незрілих зародків: Незрілі зародки маїсу висікають із зернівок і поміщають у 2 мл мікропробірку, що включає 2 мл РНІ-А середовища. 2. Інфекція Agrobacterium і сумісна культивація незрілих зародків: 2. 1 Етап інфекції: РНІ-А середовище (1) видаляють 1 мл мікропіпеткою та додають 1 мл суспензії Agrobacterium. Пробірку обережно перевертають для змішування. Суміш інкубують протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. 2. 2 Етап сумісного культивування: Суспензію Agrobacterium видаляють з етапу інфекції 1 мл мікропіпеткою. За допомогою стерильного шпателя зародки вишкрібають з пробірки та переносять на пластину РНІ-В середовища в 100×15 мм чашці Петрі. Зародки орієнтують віссю зародка вниз на поверхні середовища. Пластини з зародками культивували при 20 °C у темряві протягом трьох днів. У фазі сумісної культивації можна використовувати L-цистеїн. Зі стандартним бінарним вектором середовище для спільного культивування, доповнене 100-400 мг/л L-цистеїну, є критичним для відновлення стабільних трансгенних подій. 3. Добір передбачуваних трансгенних подій: На кожну пластину PHI-D середовища в 100×15 мм чашці Петрі переносять 10 зародків, підтримуючи орієнтацію, і чашки закупорюють парафілом. Пластини інкубують у темряві при 28 °C. Активно зростаючі передбачувані події, такі як блідо-жовта зародкова тканина, як очікується, будуть видні через шість - вісім тижнів. Зародки, що не дають подій, можуть бути коричневими і некротичними, і виражений невеликий ріст пухкої тканини. Передбачувану 15 UA 113950 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 трансгенну зародкову тканину пересівають на свіжі PHI-D пластини при дво-тритижневих інтервалах залежно від швидкості росту. Події реєструють. 4. Регенерація Т0 рослин: Зародкову тканину, розмножену на PHI-D середовищі, пересівають на РНІ-Е середовище (середовище дозрівання соматичних зародків) у 100×25 мм чашки Петрі й інкубують при 28 °C у темряві до дозрівання соматичних зародків, протягом від біля десяти до вісімнадцяти днів. Окремі зрілі соматичні зародки з добре визначеним щитком і колеоптилем переносять на PHI-F середовище для пророщення зародків і інкубують при 28 °C на світлі (близько 80 Е від холодно-білих або еквівалентних флуоресцентних ламп). На сьомий-десятий день регенеровані рослини, близько 10 см заввишки, висаджують у горщик у садівничу суміш і гартують з використанням стандартних садівничих способів. Середовище для трансформації рослин: 1. РНІ-А: 4 г/л CHU основних солей, 1,0 мол/л 1000Х вітамінної суміші Еріксона, 0,5 мг/л тіаміну НСl, 1,5 мг/л 2,4-D, 0,69 г/л L-проліну, 68,5 г/л сахарози, 36 г/л глюкози, рН 5,2. Додати 100 М ацетосирингону (стерилізованого фільтрацією). 2. РНІ-В: РНІ-А без глюкози, збільшити 2,4-D до 2 мг/л, знизити сахарозу до 30 г/л і доповнена 0,85 мг/л нітрату срібла (стерилізованого фільтрацією), 3,0 г/л Gelrite®, 100 М ацетосирингону (стерилізованого фільтрацією), рН 5,8. 3. РНІ-С: РНІ-В без Gelrite® і ацетосирингону, знизити 2,4-D до 1,5 мг/л і доповнена 8,0 г/л агару, 0,5 г/л буфера 2-[N-морфоліно]етан-сульфонової кислоти (MES), 100 мг/л карбеніциліну (стерилізованого фільтрацією). 4. PHI-D: РНІ-С доповнена 3 мг/л біалофосу (стерилізованого фільтрацією). 5. РНІ-Е: 4,3 г/л солей Мурасиге-Скуга (MS), (Gibco, BRL 11117-074), 0,5 мг/л нікотинової кислоти, 0,1 мг/л тіаміну НСl, 0,5 мг/л піридоксину НСl, 2,0 мг/л гліцину, 0,1 г/л міо-інозитола, 0,5 мг/л зеатину (Sigma, № за каталогом Z-0164), 1 мг/л індолоцтової кислоти (ІАА), 26,4 мкг/л абсцизової кислоти (ABA), 60 г/л сахарози, 3 мг/л біалофосу (стерилізованого фільтрацією), 100 мг/л карбеніциліну (стерилізованого фільтрацією), 8 г/л агару, рН 5,6. 6. PHI-F: РНІ-Е без зеатину, ІАА, ABA; знизити сахарозу до 40 г/л; заміняючи агар на 1,5 г/л Gelrite®; рН 5,6. Рослини можна регенерувати з трансгенного калюсу за допомогою спочатку переносу кластерів тканини на середовище N6, доповнене 0,2 мг на літр 2,4-D. Через два тижні тканину можна перенести на регенеруюче середовище (Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839 (1990)). Можна регенерувати трансгенні Т0 рослини та визначити їхній фенотип. Можна зібрати Т1 насіння. Крім того, рекомбінантний ДНК-конструкт, що містить перевірений ген Arabidopsis, може бути введений в інбредну лінію маїсу або прямою трансформацією, або інтрогресією з окремо трансформованої лінії. Трансгенні рослини, або інбредні, або гібридні, можна піддати більш інтенсивним польовим експериментам по вивченню ефектів експресії. Приклад 7 Випробування PDS Фенотипу та результати Через дев'ять-десять днів після запилення зародки інфікували Agrobacterium, як описано вище, і провели добір на Basta. Здійснили п'ять різних інфікувань, кожне за допомогою Agrobacterium, що містить одну з п'яти шміРНК, описаних у прикладі п'ять. Соматичні зародки були регенеровані та згруповані в сітку 3×3. Один шар пластин, які містять згруповані проростки, піддали ~ 14 мЕйнштейн м-2 сек. -1 світла. Проросток у середині сітки візуально оцінювали за фенотипом як будь-який з: "зелений", "білий" або "світлий". Відсоток сайленсингу являє собою підсумовування відсотка білих рослин і відсотка світлих рослин. В основному, 50 окремих подій оцінили для кожного конструкта. 16 UA 113950 C2 Таблиця 5 Ефективність сайленсингу шміРНК конструкт № РНР30223 РНР30448 РНР30225 РНР30451 РНР30452 РНР33006 РНР33007 5 10 15 20 25 30 шміРНК 159c-PDS 164h-PDS 168а-PDS 169r-PDS 396h-PDS 396h-PDS 2 396h-PDS 3 % білих рослин 0,0 0,0 немає даних 10,9 13,0 48,3 % 18,3 % % світлих 14,3 7,6 немає даних 47,3 59,3 41,4 % 68,4 % % сайленсингу 14 8 немає даних 58 76 90 87 Ці результати показують, що деякі з попередників шміРНК здатні продукувати шміРНК, що ефективні в генному сайленсингу. Дві додаткових міРНК, націлені на фітоендесатуразу, клонували в 396h остов разом з їхніми послідовностями, позначеними штрихом. Обидва конструкти показали ефективність сайленсингу, подібну РНР30452, яку показано в Таблиці 5. Приклад 8 Нозерн-блот аналіз РНК одержали з замороженої тканини проростка за допомогою Trizol (Invitrogen) відповідно до протоколу, наданому виробником. Загальну РНК прогнали на 15 % ТВЕ(трісборатний буфер)-сечовина гелі PAGE (аналіз методом електрофорезу в поліакриламідному гелі), прогін при 200 В в 0,5хТВЕ протягом приблизно 60-90 хвилин, а потім перенесли на позитивно заряджену нейлонову мембрану BrightStar-Plus (Ambion) за допомогою Trans-Blot SD камери. Після переносу блот промили з 0,5ХТВЕ, і РНК була поперечно зв'язана з мембраною за допомогою одного циклу на Auto-Energy у Stratalinker (Stratagene). Блот попередньо гібридизували в гібридизаційному буфері ULTRAhyb-oligo (Ambion) протягом 30 хвилин при 42 градусах С, а потім гібридизували протягом ночі при 42 градусах у гібридизаційному буфері ULTRAhyb-oligo з додаванням міченого біотином зонда. Мічений біотином зонд був конкатемером двох копій зворотного комплементу послідовності шміРНК, відділеної спейсером довжиною 4 пар основ, і був помічений за допомогою набору псорален-біотин неізотопного мічення BrightStar (Ambion). Після гібридизації блот промили розчином для промивання NorthernMax (Ambion), a визначення виконали за допомогою набору неізотопного визначення BrightStar BioDetect (Ambion) відповідно до протоколу, наданому виробником. В усіх випадках присутність послідовності шміРНК довжиною 21 пар основ корелювала з фенотипом. Крім того, помірні рівні сигналу корелювали з блідими рослинами, у той час як більш високі рівні сигналу корелювали з білими рослинами. Приклад 9 Усічені попередники штучних мікроРНК здатні до генного сайленсингу У спробі визначення здатності конструктів, що містять попередники штучних мікроРНК менш ніж повної довжини, до генного сайленсингу, за допомогою ПЛР одержали наступні укорочені попередники шміРНК. Таблиця 6 Усічені попередники штучних мікроРНК, націлені на фітоендесатуразу попередник мікроРНК 169r-PDS-sht 169r-PDS-med 396h-PDS-sht 396h-PDS-med 35 SEQ ID NO 27 28 29 30 довжина (нуклеотиди) 96 305 117 292 Ці укорочені шміРНК-конструкти повністю секвенували та клонували в конструкти, як описано в Прикладі 5. Ці конструкти трансформували в зародки маїсу та оцінили по їхній здатності до сайленсингу PDS. 17 UA 113950 C2 Таблиця 7 Ефективність сайленсингу усічених шміРНК конструкт № РНР32347 РНР32346 РНР32349 РНР32348 5 10 шміРНК 169r-PDS-sht 169r-PDS-med 396h-PDS-sht 396h-PDS-med % білих рослин 0,00 0,00 0,00 5,2 % світлих 0,00 % 33,9 0,00 29,3 % сайленсингу 0 33,9 0 34,5 Ці результати показують, що укорочені конструкти здатні продукувати шміРНК. Проте, якщо конструкт занадто укорочений, він уже не здатний продукувати шміРНК. Приклад 10 Штучні мікроРНК для того, щоб змусити мовчати fad2-1 Вищенаведені приклади показують сайленсинг PDS гена маїсу, але фахівцю в даній галузі відомо, що шміРНК можуть бути побудовані для того, щоб змусити мовчати багато генів. Як приклад іншого гена, якого можна змусити мовчати, побудували шміРНК, націлену на fad2-1, як описано в Прикладі 2, штучні послідовності, позначені штрихом, побудували, як описано в Прикладі 3, а попередники шміРНК були створені, як пояснювалося в Прикладі 4. Ці конструкти приведені в Таблиці 8. Таблиця 8 Попередники штучних мікроРНК, націлені на жирнокислотну десатуразу попередник мікроРНК 159cFAD 168a-FAD 169r-FAD 396h-FAD 15 20 25 30 35 40 SEQ ID NO 31 32 33 34 довжина (нуклеотиди) 684 790 861 633 Потім ці ДНК клонували в 5'-3' напрямку 16 кДа промотора oleosin гена Zea mays, що включає 5' UTR (нетрансльована ділянка), у плазміді РНР20790. РНР20790 включає Gateway (Invitrogen) L1 і L2 сайти. Отримані плазміди потім рекомбінували з плазмідою РНР20622. Отримані плазміди потім сумісно інтегрували в штам Agrobacterium LBA4404 плазмідою РНР10523 і використовували для трансформації маїсових зародків з культивара GS3, обпиленого пилком від культивара НС69. рослинам дозволили регенерувати та схрестили з використанням трансгенної рослини як жіночої особи і НС69 як чоловічої особи. Семена зібрали та проаналізували на вміст жирних кислот стандартними способами. Аналіз ГХ (газової хроматографії) FAME (жирнокислотного метилового ефіру) використовували для дослідження, або змінює експресія шміРНК жирнокислотний профіль насіння маїсу. Приблизно проаналізували 50 насінин на подію та проаналізували 18-25 подій на конструкт. Додали гексан, 1,5 мл, до подрібненого маїсу в лотку для екстракції. Гексан з розчиненим маслом перенесли в 1,8 мл скляні посудини для ГХ, в які додали 100 л триметілсульфонія гідроксиду для переетерифікації. Жирнокислотні метилові складні ефіри (1 мл ін'єкували з гексанового шару, індекс розведення 80 до 1) відокремили та кількісно визначили за допомогою газового хроматографу Agilent 6890, обладнаного 15 м капілярною колонкою Zebron ZB-wax, діаметр отвору 0,25 мм, товщина плівки 0, 25 мкм. (За каталогом № 7EG-G007-11, Phenomenex). Температура печі була ізотермічною 220 °C протягом 2,5 хвилин. Газом носієм був гелій стандартної марки. Час утримання порівняли з таким для метилових естерів комерційно доступних стандартів (Nu-Chek Prep, Inc.). Загальні підходи до зміни та аналізу олій у маїсу шляхом даун-регулювання шляхів метаболізму жирнокислотної десатурази можна знайти в заявці на патент США № 10/223646. Результати наведено в Таблиці 9. Конструкти з 168а остовом і 396h остовом давали ефективний сайленсинг. Конструкти, виконані як такі, що містять 159с остов і 169r остов, не дають ніякого сайленсингу (% сайленсингу fad2-1; який є відсотком подій, що показують сайленсинг). Наступні покоління трансгенних насінин вирощували в полі, а насіння Т2 і Т3 випробували на вміст жирних кислот. Як було показано, ефект цих конструктів спадковий і стабільний. При порівнянні із сайленсингом, досягнутим за допомогою шміРНК, націленої на PDS (% сайленсингу PDS у Таблиці 9), виявилося, що деякі остови попередників міРНК мовчать у 18 UA 113950 C2 багатьох типах тканин (396h і потенційно 164h), тоді як інші є більш специфічними за тканинами, у яких вони ефективні (159с і 169r). Усі з п'яти міРНК-остовів показали ефективність, щонайменше, в одному типі тканини. Таблиця 9 Попередники штучних міРНК, що виявляють виборчу ефективність Остов 159с 164h 168а 169r 396h SEQ ID NO 22, 31 23, немає 24, 32 25, 33 26, 34 % сайленсингу PDS 14 8 немає даних 58 76 % сайленсингу fad2-1 0 немає даних 85 0 92 5 10 15 20 Можливі пояснення результатів, представлених у Таблиці 9, включають, але без обмеження, диференціальну стабільність попередників міРНК тимчасовим, просторовим або специфічним для органів способами; диференціальний процесинг попередників міРНК (підставу для етапів диференціального пост-транскрипційного процесингу для міРНК виявлено у тваринних системах Obernosterer et al. (2007) RNA 12. 1161-1167); або диференціальну конкуренцію за dicer комплекс серед популяцій міРНК. Приклад 11 Штучні мікроРНК для того, щоб змусити мовчати летальну плямистість листя Вищенаведені приклади показують сайленсинг PDS гена маїсу і fad2 гена, але фахівцю в даній галузі відомо, що шміРНК можна побудувати для того, щоб змусити мовчати кілька генів. Як приклад іншого гена, якого можна змусити мовчати, була побудована шміРНК, що націлюється на летальну плямистість листя, як описано в Прикладі 2, мікроРНК являє собою 5'uuugaaaggacgguguaaggc-3' (ДНК-послідовність, що відповідає цієї шміРНК, предствлена в SEQ ID NO:35). Штучні послідовності, позначені штрихом, побудовані, як описано в Прикладі 3, і показані в Таблиці 10. Попередники шміРНК створили, як пояснено в Прикладі 4. Таблиця 10 Послідовності, позначені штрихом, штучних мікроРНК попередник шміРНК 168a-IIs 69r-IIs 396h-IIs 25 послідовність, позначена штрихом SEQ ID NO 36 37 38 Рослини маїсу, у яких змусили мовчати ген летальної плямистості листя (NCBI number, U77345; Gray J et al. (1997) A novel suppressor of cell death in plants encoded by the Lls1 gene of maize. Cell. Apr 4; 89(1):25-31.), виявляють фенотип смертельних ушкоджень у всіх листах, що розвиваються, а в деяких випадках смерть рослини. % сайленсингу визначили візуальним оглядом рослин через приблизно 8 тижнів після того, як рослини були перенесені в теплицю. Усі три конструкти дали ефективний сайленсинг (Таблиця 11). Таблиця 11 Конструкти штучних міРНК ефективно змушують мовчати летальну плямистість листів номер РНР РНР 36155 РНР 33788 РНР 36154 конструкт 168a-IIs 69r-IIs 396h-IIs % сайленсинг 82 80 85 30 Приклад 12 Штучні мікроРНК як для жирнокислотної десатурази, так і для білка стійкості до декількох лікарських засобів 19 UA 113950 C2 5 10 15 Іноді бажано змусити мовчати більше ніж один ген за допомогою заданого конструкта. Окремі попередники шміРНК можуть бути функціонально зв'язані з тим самим або з різними промоторами. Альтернативно, два або більш попередники шміРНК можуть бути функціонально зв'язані один з одним, а далі зв'язані з одним промотором. З такого конструкта можуть бути отримані дві або більш шміРНК. Конструкти, що включають штучні мікроРНК для того, щоб змусити мовчати fad2-1, показані в прикладі 10. Як приклад іншого гена, якого можна змусити мовчати, побудували штучну міРНК, що націлюється на білок стійкості до декількох лікарських засобів (MRP), як описано в Прикладі 2, мікроРНК являє собою 5'-uaauucacaaucucaccacuc-3' (ДНК-послідовність, що відповідає цієї шміРНК представлена в SEQ ID NO: 39). Штучні послідовності, позначені штрихом, побудовані, як описано в Прикладі 3, і показані в Таблиці 12. Створили два попередники MRP шміРНК, 168a-MRP (SEQ ID No: 42) i 396h-MRP (SEQ ID No: 43), як пояснювалося в Прикладі 4. Сайленсинг MRP приводить до зниження фітинової кислоти (Shi J. et al. (2007) Embryo-specific silencing of a transporter reduces phytic acid content of maize and soybean seeds. Nat Biotechnol. Aug; 25(8):930-7). Таблиця 12 Послідовності, позначені штрихом, штучних мікроРНК попередник шміРНК 168a-MRP 396h-MRP 20 послідовність, позначена штрихом SEQ ID NO 40 41 Ці попередники клонували або в 3' - 5' напрямку, або в 5' - 3' напрямку попередників fad 2 (описаних у Прикладі 10) для створення касет, і потім клонували в конструкти і перенесли в Agrobacterium для створення конструктів, описаних у Таблиці 13, як описано раніше. Трансформацію маїсу виконали, як описано в Прикладі 6, і трансгенні насіння будуть оцінені на вміст фітату та жирних кислот. Таблиця 13 Конструкти штучних міРНК, що включають шміРНК, побудовані для того, щоб змусити мовчати як fad2-1, так і MRP номер РНР РНР38380 РНР38381 РНР38382 РНР38383 25 конструкт 168aFAD2-1/168a-MRP 396h-Fad2-1/168a-MRP 168a-MRP/396h-FAD2-1 396h-MRP/396h-FAD2-1 Перелік послідовностей Е. І. дю Пон де Немур енд Компани, Інк. ДАУН-РЕГУЛЯЦІЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНА ЗА ДОПОМОГОЮ ШТУЧНИХ МІКРО-РНК 30 ВВ1618 US 61/014,510 2007-12-18 35 43 Patentln версія 3.5 40 1 30 ДНК Штучна 20 UA 113950 C2 ДНК праймер 159cs 5 10 1 2 31 ДНК Штучна ДНК праймер 159са 15 2 20 25 3 30 ДНК Штучна ДНК праймер 164hs 3 30 4 30 ДНК Штучна 35 ДНК праймер 164ha 4 40 5 31 ДНК Штучна 45 ДНК праймер 168as 5 50 55 6 33 ДНК Штучна ДНК праймер 168аа 21 UA 113950 C2 6 5 10 7 31 ДНК Штучна ДНК праймер 169rs 7 15 8 30 ДНК Штучна 20 ДНК праймер 169rа 8 25 9 30 ДНК Штучна 30 ДНК праймер 396hs 9 35 40 10 30 ДНК Штучна ДНК праймер 396ha 45 50 10 11 875 ДНК Zea mays 11 22 UA 113950 C2 5 12 780 ДНК Zea mays 12 10 23 UA 113950 C2 5 13 791 ДНК Zea mays 13 10 14 859 24 UA 113950 C2 ДНК Zea mays 14 5 10 15 633 ДНК Zea mays 15 misc_feature (594)…(594) n is a, c, g, or t 15 25 UA 113950 C2 5 16 21 ДНК Штучна PDS міРНК 10 16 15 20 17 21 ДНК Штучна 159c-PDS-nocлiдовність, позначена штрихом 17 25 18 20 ДНК Штучна 30 164h-РDS-послідовність, позначена штрихом 18 35 19 21 ДНК Штучна 40 168а-РDS-послідовність, позначена штрихом 19 45 50 20 22 ДНК Штучна 26 UA 113950 C2 169r-РDS-послідовність, позначена штрихом 5 10 20 21 21 ДНК Штучна SID21 396h-PDS-star 15 21 20 25 22 684 ДНК Штучна 159c-PDS міРНК попередник 22 30 23 739 ДНК Штучна 35 164h-PDS міРНК попередник 23 27 UA 113950 C2 5 24 791 ДНК Штучна 168a-PDS міРНК попередник 10 24 28
ДивитисяДодаткова інформація
Автори російськоюMcgonigle Brian
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/82, A01H 5/00
Мітки: допомогою, даун-регуляція, експресії, мікро-рнк, штучних, гена
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/39-113950-daun-regulyaciya-ekspresi-gena-za-dopomogoyu-shtuchnikh-mikro-rnk.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Даун-регуляція експресії гена за допомогою штучних мікро-рнк</a>
Попередній патент: Даун-регуляція експресії гена за допомогою штучних мікро-рнк
Наступний патент: Перемикальний модуль електроінсталяційного перемикача
Випадковий патент: Спосіб оцінки ефективності лікування целіакії