Регуляція експресії хінолатфосфорибозилтрансферази

Даний винахід було зроблено при підтримці Уряду згідно з Грантом № МСВ-9206506 Національної Наукової Фундації. Уряд має певні права на цей винахід. Даний винахід відноситься до рослинної хінолат фосфорибозил трансферази (ХФРТази) та до ДНК, що кодує цей фермент. Зокрема, даний винахід пов'язаний з використанням ДНК, що кодує хінолат фосфорибозил трансферазу, для одержання трансгенних рослин, які мають генетично змінені рівні нікотину, та до рослин, одержаних таким чином. Одержання тютюну зі зменшеними рівнями нікотину представляє інтерес, уважаючи на притягальну природу нікотину. Крім того, рослини тютюну з екстремально ризькими рівнями продукції нікотину, або ті, що не виробляють нікотину, привабливі як реципієнти для трансгенів, які експресують комерційно цінні продукти, такі як ліки, складові косметичних препаратів, або харчові добавки. Різноманітні способи призначені для видалення нікотину з тютюну. Проте більшість цих способів видаляє також інші інгредієнти з тютюну разом з нікотином, при цьому несприятливо впливаючи на тютюн. Класична технологія розведення культур забезпечує одержання рослин тютюну з нижчими рівнями нікотину (приблизно 8%), ніж це знайдено у рослинах тютюну дикого типу. Бажаними є рослини тютюну та тютюн, що мають ще більше зменшення вмісту нікотину. Один підхід до зменшення рівня біологічного продукту полягає у зменшенні кількості необхідного ферменту у біосинтетичному шляху обміну, що веде до утворення цього продукту. Якщо фермент, який піддають впливу, у природі знаходиться у нормо-лімітуючій кількості (відповідно до інших ферментів, що необхідні у цьому шляху обміну), будь-яке зменшення достатку ферменту буде зменшувати продукцію кінцевого продукту. Якщо кількість ферменту у природі не є нормо-лімітуючою, його присутність у клітині повинна бути зменшена до нормо-лімітуючих рівнів для того, щоб зменшити вихід продукту цього шляху обміну. Навпаки, якщо існуюча у природі кількість ферменту є нормо-лімітуючою, будь-яке збільшення ферментативної активності буде призводити до збільшення виходу кінцевого продукту біосинтетичного шляху обміну. Нікотин утворюється, головним чином, у корінні рослин тютюну при подальшому транспорті до листя, де він запасається (Tso, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants, pp.233-34, Dowden, Hutchinson & Ross, Stroudsburg, Pa (1972)). Обов'язковим етапом біосинтезу нікотину є формування утворення нікотинової кислоти з хінолінової кислоти, цей етап каталізується за допомогою ферменту хінолін фосфорибозил трансферази (ХФРТази). Як виявляється, ХФРТаза є нормо-лімітуючим ферментом шляху обміну, забезпечуючи нікотинову кислоту для синтезу нікотину у тютюні. Див., наприклад, Feth et al. "Регуляція ферментативної активності шляху обміну нікотину у капсулах тютюну", Planta, 168, рр.402-07 (1986); Wagner et al. "Регуляція ферментативної активності шляху обміну нікотину у тютюні", Physiol. Plant., 68, рр.667-72 (1986). Модифікація рівнів нікотину у рослинах тютюну шляхом антисмислової регуляції експресії путресцин метил трансферази (ПМТази) була запропонована у патентах США №5,369,023 та №5,260,205, Nakatani та Malik. Заявка РСТ WO94/28142, Wahad та Malik, описує ДНК, що кодує ПМТ, та використання смислових та антисмислових конструкцій ПМТ. Першим аспектом даного винаходу є ізольована молекула ДНК, що включає послідовність SEQ ID N0:1; послідовності ДНК, що кодують фермент, який має послідовність SEQ ID N0:2; послідовності ДНК, що гібридизуються з цими ДНК, та які кодують фермент хінолат фосфорибозил трансферазу; та послідовності ДНК, які мають відмінності від вищезгаданих ДНК, що зумовлені виродженістю генетичного коду. Пептид, який кодується цими ДНК, представляє собою наступний аспект винаходу. Ще один аспект даного винаходу представляє собою конструкцію ДНК, що включає оперативний у рослинній клітині промотор та кодуючий фермент хінолат фосфорибозил трансферазу сегмент ДНК, який розміщений нижче від промотора та оперативно зв'язаний з ним. ДНК, що кодує фермент може бути у антисмисловій або смисловій орієнтації. Наступний аспект даного винаходу полягає у способі одержання трансгенної рослинної клітини, що має зменшену експресію хінолат фосфорибозил трансферази (ХФРТази), шляхом забезпечення рослинної клітини типу, відомого для експресії хінолат фосфорибозил трансферази; трансформації рослинної клітини за допомогою екзогенної конструкції ДНК, що охоплює промотор та ДНК, яка включає частину послідовності, що кодує ІРНК хінолат фосфорибозил трансферази. Наступний аспект даного винаходу представляє собою трансгенну рослину видів роду Nicotiana, що має зменшену експресію хінолат фосфорибозил трансферази (ХФРТази) порівняно з нетрансформованою контрольною рослиною. Клітини таких рослин містять конструкцію ДНК, яка включає сегмент послідовності ДНК, що кодує рослинну ІРНК хінолат фосфорибозил трансферази. Наступний аспект даного винаходу представляє собою спосіб зменшення експресії гена хінолат фосфорибозил трансферази у рослинній клітині шляхом вирощування рослинної клітини, трансформованої внесенням екзогенної ДНК, при цьому ланцюг, який транскрибується, екзогенної ДНК, який транскрибується є комплементарним ендогенній по відношенню до клітини ІРНК хінолат фосфорибозил трансферази. Транскрипція комплементарного ланцюга зменшує експресію ендогенного гена хінолат фосфорибозил трансферази. Наступний аспект даного винаходу полягає у способі одержання рослини тютюну, що має зменшені рівні нікотину у листях рослин тютюну, шляхом вирощування рослини тютюну з клітинами, що містять екзогенну послідовність ДНК, при цьому ланцюг, що транскрибується, екзогенної послідовності ДНК є комплементарний до ендогенної ІРНК хінолат фосфорибозил трансферази у клітинах. Наступний аспект даного винаходу представляє собою спосіб одержання трансгенної рослинної клітини, що має збільшену експресію хінолат фосфорибозил трансферази (ХФРТази), шляхом трансформації рослинної клітини, що експресує хінолат фосфорибозил трансферазу, за допомогою екзогенної конструкції ДНК, яка включає послідовність ДНК, яка кодує хінолат фосфорибозил трансферазу. Наступний аспект даного винаходу представляє собою трансгенну рослину Nicotiana, що має збільшену експресію хінолат фосфорибозил трансферази (ХФРТази), при цьому клітини трансгенної рослини включають екзогенну послідовність ДНК, яка кодує рослинну хінолат фосфорибозил трансферазу. Наступний аспект даного винаходу представляє собою спосіб збільшення експресії гена хінолат фосфорибозил трансферази у рослинній клітині шляхом вирощування рослинної клітини, трансформованої внесенням екзогенної ДНК, що кодує хінолат фосфорибозил трансферазу. Наступний аспект даного винаходу представляє собою спосіб одержання рослини тютюну, що має збільшені рівні нікотину у листях, шляхом вирощування рослини тютюну, що має клітини, які містять екзогенну послідовність ДНК, яка кодує функціональну у Клітинах хінолат фосфорибозил трансферазу. Фігура 1 показує біосинтетичний шлях обміну, що веде до утворення нікотину. Відомо, що ферментативна активність, яка регулюється Nic1 та Nic2, пов'язана з ХФРТазою (хінолат фосфорибозилтрансферазою) та ПМТазою (путресцин метил трансферазою). Фігура 2А показує послідовність нуклеїнової кислоти кДНК NtOPTI (SEQ ID N0:1), з кодуючою послідовністю (SEQ ID N0:3), що показана великими літерами. Фігура 2В показує дедуковану амінокислотну послідовність (SEQ ID N0:2) ХФРТази тютюну, що кодується кДНК NtOPTI. Фігура 3 вирівнює дедуковану амінокислотну послідовність NtOPTI та споріднені послідовності Rhodospirillum rubrum, Μ у со bacterium lepre, Salmonella typhimurium, Esherichia coli, людини, та Saccharomyces cerevisiae. Фігура 4 показує результати комплементації мутанта Esherichia coli, у якого відсутня хінолат фосфорибозил трансфераза (ТН265)) з кДНК NtOPTI. Клітини були трансформовані за допомогою експресійного вектора, що несе NtOPTI; ріст трансформованих клітин ТН265, що експресують NtOPTI на мінімальному середовищі, в якому відсутня нікотинова кислота, показує, що NtOPTI кодує ХФРТазу. Фігура 5 порівнює рівні нікотину та відповідні існуючі стійкі рівні ІРНК NtOPTI у мутантах тютюну Nic1 та Nic2: дикий тип Burley 21 (Nic1/Nic1 Nic2/ Nic2); Niс1- Burley 21 (niс1/niс1 Nic2/ Nic2); Nic2- Burley 21 (Nic1/Nic1 nic2/nic2); Nic1-Nic2- Burley 21 (nic1/nid nic2/nic2). Суцільний стовпчик показує рівні транскрипту ІРНК, заштрихований стовпчик показує рівні нікотину. Фігура 6 представляє діаграму відповідних рівнів ІРНК NtOPTI у рослинах тютюну після топпінгу порівняно з контрольними рослинами, що не зазнали топпінгу. Суцільний стовпчик показує рівні транскрипту ІРНК, заштрихований стовпчик показує рівні нікотину. Нікотин виробляється у рослинах тютюну шляхом конденсації нікотинової кислоти та 4метиламінобутаналу. Біосинтетичний шлях обміну, що призводить до продукції нікотину, ілюструється на фігурі 1. Два регуляторні локуси (Niс1 та Nic2) діють як кодомінантні регулятори продукції нікотину. Ферментні аналізи коренів одиничного та подвійного Nic мутантів показують, що активності двох ферментів, хінолат фосфорибозил трансферази (ХФРТази) та путресцинметил трансферази (ПМТази), є прямо пропорційними до рівнів біосинтезу нікотину. Порівняння ферментативної активності у тканинах тютюну (кореня та калусів) з різною здатністю до синтезу нікотину показує, що ХФРТазна активність строго корелює з вмістом нікотину (Wagner та Wagner, Planta 165:532 (1985)). Saunders та Bush (Plant Physiol. 64:236 (1979) показали, що рівень ХФРТази у коренях мутантів з низьким вмістом нікотину є пропорційним до рівнів нікотину у листі. Даний винахід охоплює нові послідовності кДНК (SEQ ID N0:1), що кодують рослинну хінолат фосфорибозил трансферазу (ХФРТазу) послідовності SEQ ID N0:2. Оскільки ХФРТазна активність строго корелює з вмістом нікотину, створення трансгенних рослин тютюну, в яких ХФРТазні рівні знижені у коренях рослини (порівняно з рівнями рослин дикого типу), призводять до утворення рослин, що мають зменшені рівні нікотину у листі. Даний винахід забезпечує способи та конструкції нуклеїнової кислоти для одержання таких трансгенних рослин, так само і самих трансгенних рослин. Такі способи включають експресію антисмислової РНК NtOPTI, яка знижує кількість ХФРТази у коренях тютюну. Нікотин додатково було знайдено у видах та родинах рослин, що не відносяться до тютюну, але наявна кількість нікотину, звичайно, набагато нижча, ніж у N.tabacum. Даний винахід також стосується смислових та антисмислових рекомбінантних молекул ДНК, що кодують ХФРТазу або антисмислові молекули РНК ХФРТази, та векторів, що включають ці рекомбінантні молекули ДНК, а також трансгенні рослинні клітини та рослини, трансформовані за допомогою цих молекул ДНК та векторів. Трансгенні клітини табака та рослини згідно з даним винаходом характеризуються нижчим або вищим вмістом нікотину, ніж нетрансформовані контрольні клітини та рослини. Рослини тютюну з екстремально низькими рівнями продукції нікотину, або ті, що не виробляють нікотину, привабливі як реципієнти для трансгенів, що експресують комерційно цінні продукти, такі як ліки, складові косметитчних препаратів, або харчові добавки. Тютюн привабливий як рецепієнтна рослина для трансгену, що кодує бажаний продукт, оскільки табак легко піддається генноінженерним маніпуляціям, та виробляє дуже велику біомасу на акр; рослини тютюну зі зменшеними ресурсами, призначені для одержання нікотину, таким чином, будуть мати більше ресурсів, доступних для продукції трансгенних продуктів. Способи трансформації тютюну за допомогою трансгенів, що виробляють бажані продукти, відомі у даній галузі; будь-яка придатна методика може бути використана на рослинах тютюну з низьким рівнем нікотину згідно з даним винаходом. Рослини тютюну зі зменшеною експресією ХФРТази згідно з даним винаходом, та зі зменшеними рівнями нікотину, можуть бути бажані при одержанні тютюнових виробів, що мають зменшений вміст нікотину. Рослини тютюну згідно з даним винаходом можуть бути придатні для використання у будь-якому традиційному тютюновому продукті, включаючи, але не обмежуючись, курильну трубку, сигари, цигарки, та жувальний табак, та можуть бути у будь-якій формі, включаючи листя тютюну, пресоване листя тютюну або різаний тютюн. Конструкції згідно з даним винаходом можуть також бути корисні у забезпеченні трансгенних рослин, що мають підвищену експресію ХФРТази та збільшений вміст нікотину у рослині. Такі конструкції, способи при використанні цих конструкцій та рослини, отримані таким чином, можуть бути бажаними при одержання тютюнових виробів, що мають змінений вміст нікотину, або в одержанні рослин, що мають збільшений вміст нікотину для інсектицидної дії. Автори винаходу відкрили, що ген TobRD2 (див. Conkling та ін., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) кодує ХФРТазу Nicotiana tabacum і розкрили послідовність кДНК NtOPTI (раніше позначеної як TobRD2) та амінокислотну послідовність ферменту, що кодується. Порівняння амінокислотної послідовності NtOPTI з амінокислотною послідовністю з бази даних GenBank, виявило обмежену подібність послідовності до бактеріальних білків хінолат фосфорибозил трансферази (ХФРТази) (Фігура 3). Хінолат фосфорибозил трансфераза необхідна для біосинтезу de novo нікотин аденін динуклеотиду (NAD) як у прокаріотах, так і в еукаріотах. У тютюні високі рівні ХФРТази визначились у корінні, але не в листях. Для встановлення, що NtOPTI кодує ХФРТазу, автори даного винаходу використали бактеріальний штам Escherichia coli (ТН265), мутант, у якого відсутня хінолат фосфорибозил трансфераза (nadCT). Цей мутант не може рости на мінімальному середовищі, в якому відсутня нікотинова кислота. Проте, експресія NtOPTI білка у цьому бактеріальному штамі демонструє NadC+ фенотип (Фігура 4), підтверджуючи, що NtOPTI кодує ХФРТазу. Винахідники перевіряли дію Nic1 та Nic2 мутантів тютюну, та дію топпінгу на рослин тютюну на стабільні рівні ІРНК NtOPTI та рівні нікотину. (Видалення апікального домінування шляхом відрізування на початку цвітіння, як добре відомо, призводить до збільшених рівнів біосинтезу нікотину та транспорту у тютюн, та є стандартною практикою при одержанні тютюнових виробів). Якщо NtOPTI насправді втягнена у біосинтез нікотину, можна очікувати, що (1) рівні ІРНК NtOPTI будуть нижчі у Nic1/Nic2 подвійних мутантів та (2) рівні ІРНК NtOPTI будуть підвищуватись після топпінгу. Було виявлено, що рівні ІРНК NtOPTI у Nic1/Nic2 подвійних мутантах були на 25% вищими, ніж у дикого типа (Фігура 5). Далі, протягом 6 годин після топпінгу, рівні mPHK NtOPTI у рослинах тютюну збільшувались приблизно у 8 разів. Таким чином, було визначено, що NtOPTI є ключовим регуляторним геном у біосинтетичному шляху обміну нікотину. Трансгенні рослинні клітини та рослини Регуляція експресії гена у геномі рослинних клітин може бути досягнута шляхом інтеграції гетерологічної ДНК під транскрипційним контролем промотора, який є функціональним у хазяїні, та в якому ланцюг, що транскрибується, гетерологічної ДНК є комплементарним до ланцюга ДНК, який транскрибується з ендогенного гена, що піддають регуляції. Вбудована ДНК, Що згадується як антисмислова ДНК, забезпечує послідовність РНК, яка є комплементарною до ІРНК, що одержують у природних умовах (ендогенної), та яка інгібує експресію ендогенної ІРНК. Механізм такої регуляції експресії гена за допомогою антисмислової ДНК повністю ще не зрозумілий. Оскільки не виказано побажання дотримуватись будь-якої єдиної теорії, можна зазначити, що одна теорія антисмислової регуляції пропонує, що транскрипція антисмислової ДНК продукує РНК молекулу, яка зв'язується та запобігає або інгібує транскрипцію ендогенних молекул ІРНК. У способах згідно з даним винаходом, антисмисловий продукт може бути комплементарним до кодуючої або некодуючої (або до обох) частин природно одержаних цільових РНК. Антисмислова конструкція може бути вбудована у рослинні клітини будь-яким придатним способом, та може бути інтегрована у рослинний геном для індукованої або конститутивної транскрипції антисмислової послідовності. Див., наприклад, патенти США №5,453, 566 та №5,107,065, Shewmaker та ін. (введені в опис як посилання). Як використовується у контексті даної заявки, екзогенна або гетерологічна ДНК |або РНК) відноситься до ДНК (або РНК), яка була вбудована у клітину (або у її предка) Завдяки зусиллям людини. Така гетерологічна ДНК може бути копією послідовності, яка Знайдена у природі у трансформованій клітині, або фрагментом останньої. ; Для одержання рослини тютюну, що має зменшені рівні ХФРТази, і таким чином, нижчий рівень нікотину, ніж нетрансформована контрольна рослина тютюну, клітина тютюну, може бути трансформована за допомогою екзогенної антисмислової транскрипційної одиниці ХФРТ, що включає частину послідовності кДНК ХФРТ, повну довжину послідовності кДНК ХФРТ, частину хромосомної послідовності ХФРТ, або повну довжину хромосомної послідовності ХФРТ, оперативно з'єднані з придатними регуляторними послідовностями у смисловій орієнтації. Придатні регуляторні послідовності включають послідовність ініціації транскрипції ("промотор"), оперативний у трансформованій рослині, та послідовність термінації поліаденілування/транскрипції. Стандартні методи, такі як рестрикційне картування, Саузерн блоттінг гібридизація, аналіз нуклеотидної послідовності, пізніше використовуються для ідентифікації клонів, що несуть послідовності ХФРТази, оперативно зв'язані з регуляторними послідовностями у антисмисловій орієнтації. Рослини тютюну потім регенерують з успішно трансформованих клітин. Найбільш бажано, щоб антисмислова послідовність, що використовується, була комплементарна до ендогенної послідовності, проте, незначні варіації у екзогенній та ендогенній послідовностях можуть бути припустимі. Бажано, щоб антисмислова послідовність ДНК мала достатню подібність допослідовності, що робить її здатною до ув'язування з ендогенною послідовністю у клітині, що піддають регуляції, у жорстких умовах, як описано нижче. Антисмислова методика використовується у деяких лабораторіях для створення трансгенних рослин, що характеризуються нижчим, ніж нормальний, вмістом специфічних ферментів. Наприклад, рослини зі зниженими рівнями синтази халькона, фермента біосинтетичного шляху квіткових пігментів, одержували шляхом вбудовування антисмислового гена синтази халькона у геном тютюну та петунії. Ці трансгенні рослини тютюну та петунії продукували квіти з більш світлим, порівняно з нормальним, забарвленням (Van der Krol та ін. "Антисмисловий ген синтази халькона у трансгенних рослинах інгібує пігментацію квітів", Nature, 333, pp.866-69 (1988)). Технологія антисмислової РНК також успішно використовується для інгібування продукції ферменту полігалактуронази у томатах (Smith та ін. "Антисмислове РНК інгібування експресії гена полігалактуронази у трансгенних томатах", Nature, 334, pp. 724-26 (1988); Sheehy та ін. "Зменшення полігалактуроназної активності у плодах томатів за допомогою антисмислової РНК", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp.8805-09 (1988)), та малої субодиниці ферменту рибулозо біфосфат карбоксилази у тютюні (Rodermel та ін. "Ядерно-органельні взаємодії: ядерний антисмисловий ген інгібує рівні ферменту рибулозо біфосфат карбоксилази у трансформованих рослинах тютюну", Cell, 55, pp.673-81 (1988)). З іншого боку, трансгенні рослини, що характеризуються більшою, ніж у нормі кількістю даного ферменту, можуть бути створені шляхом трансформації рослин за допомогою гена фермента у смисловій (тобто, нормальній) орієнтації. Рівні нікотину у трансгенних рослинах тютюну згідно з даним винаходом можуть бути визначені стандартними аналізами на нікотин. Трансформовані рослини, в яких рівень ХРФТази зменшений порівняно з нетрансформованими контрольними рослинами, будуть мати відповідно зменшені рівні нікотину порівняно з контролем; трансформовані рослини, в яких рівень ХРФТази збільшений порівняно з контрольними рослинами будуть відповідно мати збільшений рівень нікотину порівняно з контролем. Гетерологічні послідовності, що використовуються у антисмислових способах згідно з даним винаходом, можуть бути відібрані як такі, що виробляють продукт РНК, комплементарний до повної послідовності ІРНК ХФРТази, або до частини останньої. Послідовність може бути комплементарною до будь-якої наявної поєднаної послідовності природної інформаційної РНК, вона може бути комплементарною до ендогенної послідовності ІРНК, проксимальної до 5'-термінального сайту або до кепппінг сайту, нижче від кеппінг сайту, між кеппінг сайтом та кодоном ініціації, та може містити усю або тільки частину некодуючої ділянки, може зв'язуватись з некодуючою або кодуючою ділянкою бути комплементарною до усієї або частини кодуючої ділянки, комплементарною до 3'-кінця кодуючої ділянки, або комплементарною до 3'-ділянки, що не транслюється, ІРНК. Придатні антисмислові послідовності можуть складатися, принаймі, приблизно з 13 або 15 нуклеотидів, принаймі, приблизно з 16 до приблизно 20 Иуклеотидів, принаймі, приблизно з 20 нуклеотидів, принаймі, приблизно з 30 нуклеотидів, принаймі, приблизно з 50 нуклеотидів, принаймі, приблизно з 75 нуклеотидів, принаймі, Приблизно з 100 нуклеотидів, принаймі, приблизно з 125 нуклеотидів, принаймі, приблизно з 150 нуклеотидів, принаймі, приблизно з 200 нуклеотидів, або більше. Крім того, послідовності можуть бути розширені або вкорочені на 3' та 5'- кінцях останніх. Конкретна антисмислова послідовність та довжина антисмислової послідовності будуть варіювати в залежності від ступеня бажаного інгібування, стабільності антисмислової послідовності, і т.п. Будь-який спеціаліст у даній галузі буде керуватись у виборі придатних антисмислових послідовностей ХФРТази використанням методів, доступних у даній галузі, та інформацією, яка тут наводиться. Як згадується стосовно фігури 2А та SEQ ID N0:1, що наводяться у даній заявці, олігонуклеотиди згідно з винаходом можуть бути безперервним фрагментом послідовності кДНК ХФРТази у амтисмисловій орієнтації будь-якої довжини, яка достатня для досягнення бажаного результату, коли вбудовуєтьсяу реципієнтну рослинну клітину. Даний винахід може також бути використаний у способах смислової косупресії продукції нікотину. Смислові ДНК, залучені до реалізації даного винаходу, під час експресії у рослинній клітині мають довжину, достатню для супресії природньої експресії рослинного білка фермента ХФРТази у цій рослинній клітині, як описано у даній заявці. Такі смислові ДНК можуть бути суттєво повною геномною або комплементарною ДНК, що кодує фермент ХФРТазу, або фрагментом останньої, такі фрагменти, звичайно, мають довжину, яка становить 15 нуклеотидів. Способи встановлення довжини смислової ДНК, що призводить до супресії експресії нативного гена у клітині, знайомі спеціалістам у даній гаілузі. В альтернативному втіленні даного винаходу, клітини рослини Nicotiana трансформують за допомогою конструкції ДНК, що містить сегмент ДНК, який кодує ферментативну молекулу РНК (тобто "рибосому"), така ферментативна молекула РНК спрямовується проти (тобто розрізає) ІРНК транскрипту ДНК, що кодує рослинну ХФРТазу, як описано у даній заявці. Рибосоми містять зв'язуючи субстрат домени, що зв'язують доступні ділянки цільової ІРНК, та домени, що каталізують розрізання РНК, запобігаючи трансляції та продукції білка. Зв'язуючи домени можуть включати антисмислові послідовності, комплементарні до послідовності цільової ІРНК; каталітичний фрагмент може бути хамерхеад фрагментом або іншим фрагментом, таким як шпильковий фрагмент. Рибосомальні сайти розрізування усередині РНК можуть попередньо бути ідентифіковані шляхом сканування цільової молекули на рибосомальні сайти розрізування (тобто, GUA, GUU або GUC послідовності). Короткі ідентифіковані послідовності РНК розміром 15, 20, ЗО або більше рибонуклеотидів, що відповідають ділянці цільового гена, що містить сайт розрізування можуть бути оцінені на передбачені структурні риси. Придатність кандидатів мішеней може також бути оцінена шляхом тестування їх доступності для гібридизації з комплементарними олігонуклеотидами, використовуючи методи захисту від рибонуклеази, що добре відомі у цій галузі. ДНК, що кодує ферментативні молекули РНК, може бути одержана згідно з відомими способами. Див., наприклад Т. Cech та ін. Патент США №4,987,071; Keen та ін. Патент США №5,559,021; Donson та ін. Патент США №5,589,367; Torrence та ін. Патент США №5,583,032; Joyce та |ін. Патент США № 5,580,967; Gold та ін, Патент США №5,595,877; Wagner та ін. Патент США №5,591,601; та Патент США № 5,622,854 (вказівка на які введена удану заявку як посилання). Продукція такої ферментативної молекули РНК у рослинній клітині та переривання продукції білка ХФРТази зменшує ХФРТазну актвиність у рослинних клітинах таким самим чином, як і продукція антисмислової молекули РНК: тобто, шляхом Переривання трансляції ІРНК у клітині, що продукує фермент. Термін "рибосома", як такий, що використовується в контексті даної заявки, описує нуклеїнову кислоту, що діє як фермент (як ендорибонуклеаза) та може використовуватись поряд з терміном "ферментативна молекула РНК". Даний винахід також включає ДНК, що кодує рибосоми, та яка була вбудована в експресійний вектор, хазяйські клітини, що містять такі вектори, та способи зменшення продукції ХФРТази у рослинах при використанні рибосом. Послідовності нуклеїнової кислоти, що використовувались у даному винаході, включають ті, що мають подібність до SEQ ID N0:1, та кодують білок, що має хінолат ффсфорибозил трансферазну активність. Це визначення призанчене для охоплення природних алельних варіацій ХФРТазних білків Таким чином, ДНК послідовності, які гібридизуються з ДНК послідовносте SEQ ID N0:1, та несуть інформацію для експресії ХФРТази, особливо рослинних ХФРТазних ферментів, можуть також використовуватись для реалізації даного винаходу. Можуть існувати різноманітні форми рослинного ферменту ХФРТ. Різноманітні форми ферменту можуть існувати завдяки пост-транскрипційним модифікаціям єдиного генного продукту, або завдяки різноманітним формам гена NtОРТ1. Умови, які потребують інших послідовностей ДНК, які несуть інформацію для експресії білка, що має ХФРТазну активність, для гібридизації ДНК з послідовністю SEQ ID N0:1 або іншими послідовностями ДНК, що кодують білок, представлений послідовностю SEQ ID N0:2, можуть бути визначені звичайним способом. Наприклад, гібридизація таких послідовностей може бути виконана у жорстких умовах (наприклад, умови, що визначаються жорсткістю 0.3 Μ NaCI, 0.03 Μ цитрату натрію, 0.1% SDS при 60°С або навіть 70°С з ДНК, що кодує білок, представлений SEQ ID N0:2 в стандартному гібридизаційному аналізі in situ. Див. J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)). Взагалі, такі послідовності будуть Гіринаймі на 65% подібні, на 75% подібні, на 80% подібні, на 85% подібні, на 90% подібні, або навіть на 95% подібні, або більше, до послідовності, наведеної тут як послідовність SEQ ID N0:1, або послідовностей ДНК, що кодують білки послідовності SEQ ID N0:2. (Визначення подібності послідовності роблять з двома послідовностями, вирівняними для максимального підбору; пробіли у будь-якій з двох послідовностей, що підбираються, дозволені у максимізуючому значенні. Довжина пробілу 10 або менше є більш бажаною, довжина пробілу 5 або менше є більш бажаною, довжина пробілу 2 або менше є найбільш бажаною. Для того, щоб ізолювати клони кДНК, рівні іРНК яких знаходяться у межах 0.05% poly(A+)PHK існує процедура диференційної гібридизації. Див. M.Conkling та ін., Plant Physiol. 93, 1203-1211 (1990). Таким чином, бібліотеки кДНК відбираються при використанні одноланцюгових кДНК зондів зворотньо транскрибованих ІРНК з рослинних тканин (наприклад, коренів та/або листя). Для диференційного відбору нітроцелюлозні або нейлонові мембрани змочують у 5xSSC, поміщають у прилад на 96 відсмоктувальних комірок, 150 мкл стаціонарної нічної культури переносять з чашок у кожну комірку, використовують вакуум доки уся рідина не пройде через фільтр. 150мкл денатуруючого розчину (0.5М NaOH, 1.5M NaCI) поміщають у кожну комірку, використовуючи прилад для багатократного піпетування, та залишають для осадження протягом 3 хвилин. Відсмоктування проводять так, як описано вище, фільтр видаляють та нейтралізують у 0.5M Трис-НСІ (pΗ8,0), 1.5 Μ NaCI. Витримують 2 години у вакуумі та інкубують з релевантними зондами. За допомогою використання нейлонових мембранних фільтрів та витримування для зберігання при -70°С у 7% ДМСО, фільтри можуть бути використані багато разів з різноманітними зондами та підходящі клони відновлені після декількох років зберігання. Як такий, що використовується в контексті заявки, термін "ген" відноситься до послідовності ДНК, що включає (1) вище розташований (5') регуляторний сигнал, включаючи промотор, (2) кодуючу ділянку, специфічну для продукту, білка або РНК гена, (3) нижче розташовані (3') ділянки, включаючи сигнали термінації транскрипції та поліаденілування, та (4) асоційовані послідовності, необхідні для ефективної та специфічної експресії. Послідовність ДНК згідно з даним винаходом, може суттєво складатися з послідовності, що наведена у даній заявці (SEQ ID N0:1), або еквівалентної нуклеотидної послідовності, що являє собою алельні або поліморфні варіанти цих генів, або кодуючи ділянки останніх. Використання виразу "суттєва подібність послідовності" у даному описі та формулі означає, що ДНК, РНК або амінокислотна послідовності, які мають незначні та непослідовні варіанти послідовностей, розкритих та заявлених у даній заявці, вважаються еквівалентними до послідовностей даного винаходу. У цьому зв'язку, "незначні та непослідовні варіанти послідовностей" означають, що "подібні" послідовності (тобто, послідовності, які мають суттєву подібність послідовності з ДНК, РНК, або білком, розкритими та заявленими у даній заявці) будуть функціонально еквівалентні до послідовностей, розкритих та заявлених у даному винаході. Функціонально еквівалентні послідовності будуть функціонувати таким самим чином для продукції суттєво тих самих сполук, як і нуклеїнові кислоти, амінокислотні сполуки, розкриті та заявлені у даній заявці. Послідовності ДНК, що забезпечуються даним винаходом можуть бути трансформовані у широке коло хазяйських клітин. Різноманітність придатних хазяйських клітин, що мають бажаний ріст та властивості, якими можна керувати, легко доступні у даній галузі. Використання виразів "ізольований" або "суттєво чистий" у даному описі та пунктах формули стосовно ДНК, РНК, поліпептидів або білків, означає, що ДНК, РНК, поліпептиди або білки відокремлені від свого клітинного оточення in vivo завдяки зусиллям людини. Як такі, що використовуються у контексті заявки, вирази "нативна послідовність ДНК" або "природна послідовність ДНК" означають послідовність ДНК, яка може бути ізольована з нетрансгенних клітин або тканин. Нативними послідовностями ДНК є такі, які не були штучно змінені, як наприклад, за допомогою сайтнаправленого мутагенезу. Якщо послідовності нативної ДНК, ДНК молекули, що містять нативні послідовності ДНК, визначеня, то вони можуть бути хімічно синтезовані або одержані при використанні методу рекомбінантних ДНК, що добре відомий у цій галузі. Як використовується у контексті даної заявки, нативна рослинна послідовность ДНК є такою, що може бути ізольована з нетрансгенних рослинних клітин або тканини. Як використовується у контексті даної заявки, нативна послідовність ДНК тютюну це така, що може бути ізольована з нетрансгенних клітин або тканини тютюну. Конструкції ДНК, або "транскрипційні касети" згідно з даним винаходом включають, від 5' до 3' кінця, у напрямку транскрипції, промотор, як зазначено у даній заявці, послідовність ДНК, як зазначено у даній заявці, оперативно зв'язану з промотором, та, необов'язково, послідовність термінації транскрипції, включаючи стоп сигнал для РНК полімерази та сигнал поліаденілування для поліаденілази. Усі ці регуляторні ділянки можуть бути здатні до роботи у клітинах трансформованих тканин. Будь-який придатний сигнал термінації може бути використаний для реалізації даного винаходу, приклади останніх включають, але не обмежені, термінатор нопалін синтази (nos), термінатор октапін синтази (ocs), термінатор вірусу мозаїки цвітної капусти, або нативні сигнали термінації, що походять від того самого гена, що і ділянка ініціації транскрипції або ті, що походять від різних генів. Див. , наприклад, Rezian та ін. (1988), supra та Rodermel та ін. (1988), supra. Термін "оперативно зв'язаний" як такий, що використовується у контексті даної заявки, відноситься до послідовностей ДНК у єдиній молекулі ДНК, які зв'язані таким чином, що функція однієї з них піддається впливу з боку інших. Таким чином, промотор є оперативно зв'язаним з ДНК, коли він здатний впливати на транскрипцію цієї ДНК (тобто, ДНК знаходиться під транскрипційним контролем промотора). Вказаний промотор розміщений "вище" від ДНК, яка в свою чергу розміщується "нижче" від промотора. Транскрипційна касета може бути забезпечена у ДНК конструкції, яка також має принаймні одну реплікаційну систему. Зручно мати реплікаційну систему, що є функціональною в Escherichia coli, таку як СоІЕ1, pSC101, pACYC184, і т.п. Таким чином, на кожному етапі, після кожної маніпуляції, одержана конструкція може бути клонована, ееквенована, та визначена правильність маніпуляцій. Крім того, замість реплікаційної системи Е. coli, може бути використане широке коло хазяйських реплікаційних систем Р-1 несумісних плазмід, наприклад, pRK290. У доповнення до реплікаційної системи часто присутній принаймі один маркер, який може бути корисним в одному або більше хазяїні, або різні маркери для індивідуальних хазяїв. Таким чином, один маркер може використовуватись для селекції у прокаріотичному хазяїні, у той час, як інший маркер може використовуватись для селекції в еукаріотичному хазяїні, особливо у рослинному хазяїні. Маркери можуть забезпечувати захист від біоцидів, таких як антибіотики, токсини, важкі метали, і.т.п.; можуть забезпечувати комплементацію шляхом надання прототрофності ауксотрофному хазяїну; або може забезпечувати видимий фенотип шляхом продукції нової сполуки у рослині. Різноманітні фрагменти, що включають різні конструкції, транскрипційні касети, маркери, і.т.п. можуть бути вбудовані послідовно за допомогою розрізування рестрикційними ферментами придатних реплікаційних систем, та інсерції певної конструкції або фрагменту у доступний сайт. Після лігування та клонування конструкція ДНК може бути ізольована для подальших маніпуляцій. Усі ці методи повністю підтверджені у літературі, як описано Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory). Вектори, які можуть використовуватись для трансформації рослинної тканини за допомогою конструкцій нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом, включають вектори на основі Agrobacterium та балістичні вектори, так як вектори, придатні для проведення ДНК-опосередкованої трансформації. Термін "промотор" відноситься до ділянки послідовності ДНК, що містить необхідні сигнали для успішної експресії кодуючої ділянки. Він може включати послідовності, з якими зв'язується РНК-полімераза, але не обмежується цими послідовностями, може також включати ділянки, з якими зв'язуються інші регуляторні білки разом з ділянками, що втягнені у процес контролю трансляції білків та можуть включати кодуючі послідовності. Промотори, що використовуються для реалізації даного винаходу, можуть бути конститутивно активними промоторами. Доступною є велика кількість конститутивно активних промоторів, які є оперативними у рослинах. Прикладом промотора, якому надається перевага, є промотор 35S вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV), який конститутивно експресується у багатьох рослинних тканинах. Альтернативно, промотор може бути промотором, специфічним для коріння, або промотором, специфічним для кори коріння, як пояснюється більш детально нижче. Антисмислові послідовності були експресовані у трансгенних рослинах тютюну при використанні 35S промотора вірусу мозаїки цвітної капусти. Див., наприклад, Comeiissen та ін.,"Рівень РНК та ефективність трансляції зменшуються при використанні антисмислової РНК у трансгенному тютюні", Nucleic Acids Res. 17, рр.833-43 (1989): Rezaian та іню., "Антисмислові РНК вірусу мозаїки огірків у трансгенних рослинах для контролю вірусу", Plant Molecular Biology 11, рр.463-71 (1988); Rodermel та ін., "Ядерно-рганельні взаємодії: ядерний антисмисловий ген інгібує рівні ферменту рибулозо біфосфат карбоксилази у трансформованих рослинах тютюну", Cell 55, рр.673-81 (1988); Smith та ін., "Антисмислове РНК інгібування експресії гена полігалактуронази у трансгенних томатах", Nature 334, рр.724-26 (1988); Van der Krol та ін.,"Антисмисловий ген синтази халькона у трансгенних рослинах інгібує пігментацію квітів", Nature 333, рр.866-69 (1988). Використання промотора CaMV 35S для експресії ХФРТази у трансформованих клітинах тютюну та рослинах згідно з даним винаходом є найбільш бажаним. Використання промотора CaMV для експресії інших рекомбінантних генів у коренях тютюну було добре описано (Lam та ін. "Сайт-специфічні мутації змінюють in vitro фактор зв'язування та експресійну модель промотора у трансгенних рослинах", Proc.Nat.Acad.Sci. USA 86, рр.7890-94 (1989); Poulsen та ін. "Вичленення 5' нижче розташованих послідовностей для селективної експресії гена rbcS-8B Nicotiana plumbaginifolia" Мої. Gen.Genet. 214, рр.16-23 (1988)). Інші промотори, які є активними тільки у тканинах кореня (промотори, специфічні для коріння), також інколи придатні для способів згідно з даним винаходом. Див., наприклад, Патент США №5,459,252, Conkling та ін.; Jamamoto та ін. The Plant Cell, 3:371 (1991). Може також бути використаний специфічний для кори кореня промотор TobRD2. Див., наприклад, патентну заявку США SN 08/508,786, по якій на даний момент винесено рішення, Concling та ін.; РСТ WO 9705261. Усі патенти, що цитуються у даній заявці, призначені для включення у заявку як посилання у їх цільності. Рекомбінантні молекули ДНК ХФРТази та вектори, що використовуються для одержання трансформованих клітин тютюну та рослин згідно з даним винаходом, можуть включати домінантний селективний маркерний ген. Придатні домінантні селективні маркери для використання у тютюні включають, поміж інших, гени резистентності до антибіотиків, що кодують неоміцин фосфотрансферазу (NPTII), гігроміцин фософотрансферазу (НРТ), та хлорамфенікол ацетилтарнсферазу (CAT). Іншим добре відомим домінантним селективним маркером, придатним для використання у тютюні, є мутант гена дигідрофолат редуктази, що кодує резистентну до метотрексату дигідрофолат редуктазу. Вектори ДНК, що містять придатні гени стійкості до антибіотику, та відповідні антибіотики є комерційно доступними. Трансформовані клітини тютюну вибирають з оточуючої популяції нетрансформованих клітин шляхом перенесення змішаної популяції клітин у культуральне середовище, що містить придатну концентрацію антибіотика (або іншої сполуки, що у нормі токсична для клітин тютюну), проти якого вибраний продукт домінантного селективного маркерного гена забезпечує резистентність. Таким чином, тільки ті клітини тютюну, що були трансформовані, будуть виживати та розмножуватись. Способи одержання рекомбінантних рослин згідно з даним винаходом передбачають, перш за все, забезпечення рослинних клітин, здатних до регенерації (рослинна клітина, що знаходиться у тканині, здатній до регенерації). Рослинну клітину потім піддають трансформації за допомогою конструкції ДНК, що включає транскрипційну касету згідно з даним винаходом (як описано у даній заявці), а рекомбінантну рослину регенерують з трансформованої рослинної клітини. Як пояснюється нижче, етап трансформації виконують за допомогою методів, добре знайомих спеціалісту у даній галузі, що включають, але не обмежуються, методи бомбардування рослинної клітини мікрочастинками, що несуть транскрипційну касету, інфікування клітини Agrobacterium tumefaciens, що містить Ті-плазміду, яка несе транскрипційну касету, або будь-який інший метод, придатний для одержання трансгенної рослини. Відомі різноманітні векторні системи на основі Agrobacterium, що є корисними у реалізації даного винаходу. Наприклад, Патент США №4,459,355 розкриває спосіб трансформації чутливих рослин, включаючи дводольні, за допомогою штаму Agrobacterium, що містить Ті-плазміду. Трансформація деревних рослин за допомогою вектора на основі Agrobacterium розкрита у патенті США №4,795,855. Патент США № 4,940,838, Schilperoort та ін. розкриває бінарний вектор Agrobacterium (наприклад, в одному з них Agrobacterium містить одну плазміду, що має vir ділянку Ті-плазміди, але не Т-ділянку, а друга плазміда має Т-ділянку, але не virділянку), корисний для реалізації даного винаходу. Мікрочастинки, що несуть ДНК конструкцію згідно з даним винаходом, і є придатними для балістичної трансформації рослинної клітини, також корисні для одержання трансформованих рослин згідно з даним винаходом. Мікрочастинки вводять у рослинну клітину для одержання трансформованої рослинної клітини, а рослину регенерують з трансформованої рослинної клітини. При цьому може бути використана будь-яка придатна технологія балістичної трансформації клітини та будь-яке придатне обладнання для реалізації даного винаходу. Приклади обладнання та процедури виконання розкриті у Sandorf та Wolf, Патент США № 4,945,050 та Christou та ін. Патент США № 5,015,580. Коли використовують балістичну трансформаційну процедуру, транскрипційна касета може бути вбудована у плазміду, здатну до реплікації у клітині, що піддають трансформації, або до інтеграції у цю клітину. Приклади мікрочастинок, придатних для використання у таких системах, включають частинки золота розміром 1-5мкм. Конструкція ДНК може бути осаджена на мікрочастинці шляхом будь-якого придатного способу, такого, як преципітація. Види рослин можуть бути трансформовані конструкціями ДНК згідно з даним винаходом за допомогою ДНК-опосередкованої трансформації протопластів рослинних клітин та подальшої регенерації рослин з трансформованих протопластів згідно зі способами, що добре відомі у даній галузі. Злиття протопластів тютюну з ліпосомами, що містять ДНК, шляхом електропорації добре відомо у даній галузі (Shillito та ін. "Прямий генний перенос до протопластів дводольних та однодольних рослин рядом методів, включаючи.електропорацію", Methods in Enzymology 153, рр.313-36 (1987)). Як такий, що використовується у контексті даної заявки, термін трансформація відноситься до вбудовування екзогенної ДНК в клітини, для того, щоб одержати трансгенні рослини, стабільно трансформовані за допомогою екзогенної ДНК. Трансформовані клітини індукуються до регенерації непошкоджених рослин тютюну шляхом використання клітин тютюну та методів тканинної культури, що добре відомі у даній галузі. Спосіб регенерації рослин вибраний як сумісний з методом трансформації. Стійка присутність та орієнтація послідовності ХФРТази у трансгенних рослинах тютюну може бути перевірена за допомогою методів Менделівського наслідування ХФРТазної послідовності, що виявляється стандартними методами аналізу ДНК, які застосовуються до потомства, що походить від контрольного схрещування. Після регенерації трансгенних рослин тютюну з трансформованих клітин вбудована послідовність ДНК легко переноситься до інших сортів тютюну при використанні практики умовного рослинного розведення та при відсутності неправильих експериментів. Наприклад, для того, щоб проаналізувати сегрегацію трансгена, регенеровані трансформовані рослини (R0) можуть бути вирощені до зрілості, тестовані на рівні нікотину, та самозапилені для одержання R1 рослин. Розподіл R1 рослин, що несуть трансген, є гомозиготним по трансгену. Для ідентифікації гомозиготних R1 рослин, трансгенні рослини вирощують до зрілості та самозапилюють. Гомозиготні рослини R1 будуть давати потомство, в якому кожний нащадок рослин несе трансген; потомство гетерозиготних R1 рослин буде мати розподіл 3:1. Нікотин служить природним пестицидом, що допомогає захистити рослини тютюну від збитків, що зумовлені пестицидами. Виходячи з цього, може бути бажаним додатково трансформувати одержані описаним способом рослини тютюну з низьким рівнем нікотину або ті, у яких відсутній нікотин, за допомогою трансгена (такого, як Bacillus thuringiensis), що буде привносити додатковий захист від комах. Рослинами, яким надається перевага для використання у даних методах, є види Nicotiana, або тютюну, включаючи N. tabacum, N.rustica, N. glutinosa. Можуть використовуватись будь-які штами або сорти тютюну. Штамами, яким надається перевага, є штами з низьким вмістом нікотину, такі, як Nic1/Nic2 подвійні мутанти. Будь-яка рослинна тканина, здатна до подальшого клонального розмноження, або шляхом органогенезу, або шляхом ембріогенезу, може бути трансформована за допомогою вектора згідно з даним винаходом. Термін "органогенез", як такий, що використовується у контексті даної заявки, означає процесе, внаслідок якого паростки та корені розвиваються послідовно з меристематичних центрів; термін "ембріогенез", як такий, що використовується у контексті даної заявки, означає процес, внаслідок якого паростки та корені розвиваються одночасно в узгодженому поєднанні (не послідовно), з соматичних клітин, або гамет. Зокрема, культури, які вибирають, будуть варіювати, залежно від придатності систем клонального розмноження, та найбільшої придатності для специфічних видів, які піддають трансформації. Приклади цільових тканин включають листові диски, пилок, зародки, сім'ядолі, гіпокотилі, калусні тканини, існуючі меристематичні тканини (наприклад, апікальні меристеми, пазушні бруньки та кореневі меристеми), та індуковані меристематичні тканини (наприклад, сім'ядольні меристеми та меристеми гіпокотилей). Рослини згідно з даним винаходом можуть мати різноманітні форми. Рослини можуть бути химерними, що складаються з трансформованих та нетрансформованих клітин; рослини можуть бути клональними трансформантами (наприклад, усі клітини трансформовані за допомогою транскрипційної касети); рослини можуть включати живці трансформованих та нетрансформованих тканин (наприклад, трансформований стовбур кореня, прищеплений на нетрансформовану прищепу виду цитрусових). Трансформовані рослини можуть бути розмножені різноманітними способами, такими, як клональне розмноження або класична технологія розведення. Наприклад, перше покоління (або T1) трансформованих рослин може бути самозапилене для одержання гомозиготного другого покоління (або Т2) трансформованих рослин, та Т2 рослини можуть бути далі розмножені шляхом класичних способів розведення. Домінантний селективний маркер (такий як nptll) може бути асоційований з транскрипційною касетою для допомоги у розведенні. З огляду на зазначене вище, є очевидним, що рослини, які можуть бути використані у практиці даного винаходу, включають ті, які відносяться до роду Nicotiana. Для того, хто добре обізнаний з методами рекомбінантних ДНК, які описані вище, зрозуміло, що кожен може використати молекулу кДНК повної довжини, що кодує ХФРТазу, або хромосомний ген повної довжини, що кодує ХФРТазу, оперативно зв'язані у смисловій орієнтації з придатними регуляторними послідовностями, для створення трансгенних клітин або рослин. (Обізнаний з методами у даній галузі також знає, що придатні регуляторні послідовності для експресії генів у смисловій орієнтації включають будь-яку з відомих стартових послідовностей трансляції еукаріот, у доповнення до промотора та послідовностей поліаденілування/термінації транскрипції, що описані вище). Taw трансформовані рослини тютюну характеризуються збільшеними рівнями ХФРТази, і таким чином, більш високим вмістом нікотину, ніж нетрансформовані контрольні рослини тютюну. Зрозуміло, що використання послідовностей ДНК ХФРТази для зменшення або збільшення рівнів ферменту ХФРТази, і таким чином, для зменшення або збільшення вмісту нікотину у рослинах тютюну охоплюється даним винаходом. У контексті даного винаходу культури рослин включають багатоманітність рослин згідно з даним винаходом, того самого роду, що вирощуються разом на тому самому сільськогосподарському полі. Під "сільськогосподарським полем" розуміють спільну ділянку грунту або вегетаційний будиночок. Таким чином, даний винахід забезпечує спосіб одержання врожаю рослин, що мають змінену активність ХФРТази, і таким чином, мають Збільшений або зменшений рівні нікотину, порівняно до подібного врожаю нетрансформованих рослин того самого виду та сорту. Приклади, які наведені, представлені для ілюстрації даного винаходу, та не можуть розглядатись як такі, що обмежують даний винахід. Приклад 1 Ізоляція та секвенування кДНК TobRD2 (Conkling та ін., Plant Phys. 93, 1203 (1990)), була секвенована, вона представлена тут як SEQ ID N0:1, дедукована амінокислотна послідовність представлена SEQ ID N0:2. Було передбачено, що дедукована послідовність являє собою білок цитозоля. Хоча рослинні гени ХФРТази були опубліковані, порівняння NtPT1 амінокислотної послідовності з базою даних GenBank виявило обмежену подібність до певних бактеріальних та інших білків; хінолат фосфотрансферазна активність (ХФРТазна) активність була продемонстрована для генів S.typhimurium, E.coli та N.tabacum. NtQPTI, що кодує ХФРТазу має подібність до дедукованого пептидного фрагменту, що кодується послідовністю EST Arabidopsis (мічена експресійна послідовність) (депозитний номер у GenBank F20096), яка може представляти собою частину гена ХФРТази Arabidopsis. Приклад 2 Гібридизація in situ Для визначення просторового розміщення TobRD2 ІРНК транскриптів у різноманітних тканинах кореня, проводили гібридизацію in situ у трансформованих рослинах. Гібридизація in situ антисмислового ланцюга TobRD2 з ІРНК TobRD2 у клітинах кореня була зроблена при використанні способа, як описано Meyerowitz, Plant Мої. Biol. Rep. 5, 242 (1987) та Smith та ін. Plant Мої. Biol. Rep. 5, 237 (1987). Пагони кореня табака віком 7 днів (Nicotiana tabacum) фіксували у забуференому фосфатом глутаральдегіді, переносили у Paraplast Plus (Monoject Inc., St. Louis, MO) та розрізували на шматочки товщиною 8 мм для одержання поперечних та поздовжніх шматків. Антисмислові транскрипти TobRD2, синтезовані in vitro у присутності 35S-AT0, використовували як зонди. Мічену РНК гідролізували за допомогою лужної обробки до отримання від 100 до 200 основної маси середньої довжини, що використовувалась раніше. Гібридизіцію проводили у 50%-ному формаміді протягом 16 годин при 42°С, з міченою РНК, що давала приблизно 5 х 106 імпульсів за хвилину на мілілітр гібридизаційного розчину. Після витримування, препарати візуалізовали в освітленому та темному полях мікроскопа. Гібридизаційний сигнал був локалізований у кортикальному шарі клітин кореня (результати не показані). Порівняння обох освітленого та темного полів відображало одне й те саме місце локалізації транскриптів TobRD2 по відношенню до паренхіматозних клітин кортикального шару кореня. Не було одержано сигналу гібридизації в епідермісі або у центральному стрижні стовбура судинної системи рослини (стели). ПРИКЛАД 3 Рівні ІРНК TobRD2 у мутантах тютюну Nic1 та Nic2 та їх кореляція з рівнями нікотину Стійкі рівні ІРНК TobRD2 перевіряли у Niс1 та Nic2 мутантних рослинах тютюну. Nic1 та Nic2 відомі як такі, що регулюють активність хінолат фосфорибозил трансферази та активність путресцин-метил-трансферази, вони також є кодомінантними регуляторами продукції нікотину. Ці результати проілюстровані на фігурах 5А та 5В, вони показують, що експресія TobRD2 регулюється Nic1 та Nic2. РНК ізолювали з коренів рослин тютюну дикого типу Buriey 21 (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2); коренів Nid- Buriey 21 (nic1/niс1 Nic2/Nic2); коренів Nic2- Buriey 21 (Nic1/Nic1 nic2/nic2); та коренів Niс1 - Nic2- Buriey 21 (nic1/niс1 nic2/nic2). Чотири лінії тютюну Buriey 21 (nic) вирощували з насіння у грунті протягом місяця, потім переносили до гідропонних камер на поживне середовище, яке піддавали аерації, у вегетаційний будиночок, де вирощували протягом наступного місяця. Ці лінії були ізогенними, за винятком двох низьконікотинових локусів, та мали генотипи Nic1/Nic1 Nic2/Nic2, Nic1/Nic1 nic2/nic2, nic1/nic1 Nic2/Nic2, nic1/nic1 nic2/nic2. Відбирали корені приблизно 20 рослин для кожного генотипу та розділяли на пули для ізоляції РНК. Загальну РНК (1мкг) кожного генотипу піддавали електрофорезу у 1% агарозному гелі, що містить 1.1 Μ формальдегіда та переносили на нейлонові мембрани згідно з Sambrook та ін. (1989). Мембрани гібридизували з 32Р- міченими фрагментами кДНК TobRD2. Відносну інтенсивність транскриптів TobRD2 вимірювали за допомогою денситометру. Фігура 5 (суцільний стовпчик) ілюструє відповідні рівні транскрипту (порівняно до Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) для кожного з чотирьох генотипів. Відповідний вміст нікотину (порівняно до Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) чотирьох генотипів показано заштрихованим стовпчиком. На фігурі 5 графічно порівнюється відповідний стабільний рівень ІРНК TobRD2 у порівнянні з рівнем, знайденим у рослинах тютюну дикого типу Buriey 21 (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2), як кількість, з якою роблять порівняння. Рівні ІРНК TobRD2 у Nic1/Nic2 подвійних мутантах складали приблизно 25%, від такого у тютюні дикого типу. Фігура 5В далі порівнює відповідні рівні нікотину у близько ізогенних лініях тютюну, що вивчалися у цьому прикладі (суцільний стовпчик відображає транскрипційний рівень TobRD2; заштрихований стовпчик відображає рівень нікотину). Існувала близька кореляція між рівнями нікотину та транскрипційними рівнями TobRD2. ПРИКЛАД 4 Вплив топпінгу на рівні ЇРНК TobRD2 Добре відомо у даній галузі, що видалення суцвіття у рослин тютюну (топпінг) збільшує ріст коренів та збільшує вміст нікотину у листях цих рослин. Топпінг рослин є стандартною практикою при комерційному культивуванні тютюну, оптимальний час для топпінгу даної рослини табака залежить від відомого набору ростових умов, що може бути легко визначено будь-яким спеціалістом у даній галузі. Рослини тютюну (N.tabacum SR1) вирощували з насіння у грунті протягом місяця та переносили до сосудів, що містили пісок. Рослини вирощували у вегетаційних будиночках протягом двох інших місяців до початку зав'язуваня квіток. Квіткові суцвіття та два вузли потім видаляли з чотирьох рослин (топпінг). Частину коренів збирали з кожної рослини після фіксованого часу та розділяли на пули для екстракції РНК. Контрольні рослини не піддавали такій обробці. Загальну РНК (1мкг) для кожного моменту часу піддавали електрофорезу в 1%-ному агарозному гелі, що містив 1.1 Μ формальдегіду та переносили на нейлонові мембрани згідно з Sambrook та ін. (1989). Мембрани гібридизували з 32Р міченими фрагментами кДНК TobRD2. Відповідну інтенсивність транскриптів TobRD2 вимірювали за допомогою денситометра. Фігура 6 ілюструє відповідні рівні транскриптів (порівняно до нульового часу) для кожної точки часу при топпінгу (суцільний стовпчик) або при відсутності топпінгу (заштрихований стовпчик). Відповідні рівні TobRD2 визначали у тканині кореня через 24 години; результати представлені на Фігурі 6 (суцільний стовпчик показує рівні транскрипції TobRD2 у рослинах, які піддавали топпінгу; заштрихований стовпчик показує рівні транскрипції TobRD2 у контролі, що не піддавали топпінгу). Протягом 6 годин після топпінгу рослин тютюну, рівні ІРНК TobRD2 збільшувались приблизно у 8 разів у рослин, які піддали топпінгу; не спостерігали збільшення у контрольних рослинах протягом того самого періоду часу. ПРИКЛАД 5 Комплементація бактеріального мутанту, ν якого відсутня ХФРТаза з ДНК, що має послідовність SEQ ID N0:1 Штам ТН265 Escherichia coli є мутантом, у якого відсутня хінолат фосфорибозил трансфераза (nadC-), і таким чином, він не може рости на середовищі, в якому відсутня нікотинова кислота. ТН265 клітини трансформували за допомогою експресійного вектора (pWS161), який містив ДНК згідно з послідовністю SEQ ID N0:1, або трансформованих тільки за допомогою експресійного вектора (рКК233). Ріст трансформованих бактерій порівнювали з ростом ТН265 (рКК233) трансформантів, та з ростом нетрансформованогоТН265 мутанту nadC-. Ріст порівнювали на мінімальному середовищі ME (в якому була відсутня нікотинова кислота) та на ME мінімальному середовищі, до якого додавали нікотинову кислоту. Штам Е.соlі з ХФРТазною мутацією (nadC), TH265, був люб'язно наданий доктором К.Т. Хаггісом (Hughes та ін., J.Bact. 175: 479 (1993). Клітини переносили на середовище LB та компетентні клітини готували так, як описано Sambrook та ін. (1989). Експресійну плазміду конструювали у рКК2233 (Brosius, 1984) з кДНК TobRD2, клонованою під контролем промотора Тас. Одержану плазміду, pWS161, трансформували у ТН265 клітини. Трансформовані клітини потім переносили на мінімальне середовище (Vogel та Воппег, 1956) на агарові пластинки з доданням (0.0002%) або без додання нікотинової кислоти. Клітини ТН265 та ТН265, трансформовані за допомогою рКК2233, висаджували на такі самі агарові пластинки і використовували як контроль. Результати представлені на фігурі 4. Тільки ТН265, трансформовані за допомогою послідовності SEQ ID N0:1, росли на середовищі, в якому була відсутня нікотинова кислота. Ці результати показують, що експресія ДНК згідно з SEQ ID N0:1 у бактеріальних клітинах ТН265 надає цим клітинам фенотип NadC+, підтверджуючи, що ця послідовність кодує ХФРТазу. TobRD2 номенклатура була таким чином змінена на NtOPT1. Приклад 6 Трансфомація рослин тютюну ДНК послідовності SEQ ID N0:1 у антисмисловій орієнтації оперативно зв'язували з рослинним промотором (CaMV 35S або TobRD2 промотором, специфічним для кори коренів) для одержання двох різних касет ДНК: CaMV 35S промотор/антисмислова SEQ ID N0:1 та TobRD2 промотор/антисмислова SEQ ID N0:1. Лінію тютюну дикого типу та лінію з низьким вмістом нікотину відбирали для трансформації, наприклад, тютюну дикого типу Burley 21 (Nic1+/Nic2+) та гомозиготну nic1-/nic2- Burley 21. Багаточисельні клітини рослин тютюну кожної лінії трансформували, іикористовуючи кожну касету ДНК. Трансформацію проводили при використанні вектора Agrobacterium, наприклад Agrobacterium-бінарного вектора, що несе Ті-граничні послідовності, та ген nptll (що несе резистентність до канаміцину та знаходиться під контролем nos промотора (nptll)). Трансформовані клітини відбирали та регенерували у трансгенні рослини тютюну (R0). R0 рослини вирощували до зрілості та тестували на рівні нікотину; підгрупа трансформованих рослин тютюну показала значно нижчі рівні нікотину порівняно з нетрансформованими контрольними рослинами. Ro рослини потім піддавали самозапиленню, а сегрегацію трансгена аналізували в R1 потомстві. R1 потомство вирощували до зрілості та піддавали самозапиленню; сегрегація трансгена у R2 потомстві показала, які R1 рослини є гомозиготними по трансгену. СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ (1) Загальна інформація: (і) Заявник: Конклінг, Марк А. Менду, Нандіні Сонг, Вен (іі) Назва винаходу: Регуляція експресії хінолат фосфорибозил трансферази (ііі) Кількість послідовностей: 4 (iv) Адреса для листування: (A) Адресат: Кеннет Сіблі, Белл Зельтцер Парк енд Гібсон (B) Вулиця: Пост Офіс Драйвер 34009 (C) Місто: Шарлотт (D) Штат: Північна Кароліна (E) Країна: США (F) Поштовий код: 28234 (ν) Форма , що зчитується з комп'ютера (A) Тип носія: диск (B) Комп'ютер: IBM PC сумісний (C) Оперуюча система: PC-DOS/MS-DOS (D) Програмне забезпечення: Patentin Release #1.0, версія #1.30 (vi) Дані стосовно заявки (A) Номер заявки: (B) Дата подачі: (C) Класифікація: (viii) Представник/інформація стосовно агента: (A) Ім'я: Сіблі, Кеннет Д. (B) Реєстраційний номер: 31,665 (C) Номер справи: 5051-338Р (іх) Інформація стосовно засобів зв'язку (A) Телефон: 919-420-2200 (B) Телефакс: 919-881-3175 (2) Інформація для послідовності SEQ ID N0:1 (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 1399 пар основ (B) Тип: нуклеїновокислотний (C) Кількість ланцюгів: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: кДНК (іх) Характерні риси: (A) Назва/Ключове слово: CDS (B) Розташування: 52...1104 (хі) Відображення послідовності: SEQ ID N0:1 (2) Інформація для послідовності SEQ ID N0:2 (і) Характеристики послідовності (A) Довжина: 351 амінокислота (B) Тип: амінокислотний (C) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: білок (хі) Відображення послідовності: SEQ ID N0:2 (2) Інформація для послідовності SEQ ID N0:3 (і) Характеристики послідовності: (A) Довжина: 1053 пари основ (B) Тип: нуклеїновокислотний (C) Кількість ланцюгів: одноланцюгова (D) Топологія: лінійна (іі) Тип молекули: кДНК (хі) Відображення послідовності: SEQ ID N0:3