Спосіб виявлення рнк вірусу пташиного грипу субтипу h5n1 реакцією ізотермічної ампліфікації нуклеїнових кислот

Реферат: Спосіб виявлення РНК вірусу грипу птиці субтипу H5N1 за допомогою реакції ізотермічної ампліфікації нуклеїнових кислот (LAMP включає індикацію в досліджуваних зразках специфічних фрагментів РНК за допомогою LAMP. Для проведення LAMP використовують специфічну реакційну суміш при температурі 59 °C та 60 хвилин об'ємом 25 мкл, яка містить: 2,5 L 10х Termopol буфера, 1 mmol/L бетаїну, 5 mmol/L MgSO 4, 1,4 mmol/L деоксинуклеотид трифосфату (вNTP), 12,5 mol/L SYBR GREEN, 0,5 mmol/L MnCL2, Up to 25 L Nuclease-free water, 8 U Bsm DNA полімерази, 0,1 М/1 of F3, 0,1 М/1 of В3, 0,8 М/1 of FIP, 0,8 М/1 of ВІР, 0,4 М/1 of LF, 0,4 of LB, 2 L зразків кДНК з наступною візуальною інтерпретацією результатів при УФ-випромінюванні. UA 100226 U (12) UA 100226 U UA 100226 U 5 10 15 20 25 30 35 Корисна модель належить до ветеринарної вірусології, зокрема до лабораторної діагностики, призначена для визначення специфічних фрагментів нуклеїнових кислот (РНК) вірусу пташиного грипу штаму H5N1 (Avian Influenzis), може бути використаний для проведення діагностики вірусу грипу птиці, в науково-дослідних роботах, проведенні моніторингових досліджень, в навчальних процесах. Існують способи лабораторної діагностики грипу птиці, такі як виділення вірусу на культурі клітин, полімеразна ланцюгова реакція та ідентифікація вірусу в імуноферментному аналізі або імунопероксидазному тесті. Постановка цих методів досить трудомісткий процес, який вимагає великих затрат коштів, матеріалів і часу. Відома полімеразна ланцюгова реакція в режимі реального часу. Цей метод базується на ампліфікації специфічних ділянок геному певного збудника. Детекція продуктів ампліфікації здійснюється шляхом вимірювання флуоресценції фотооптичною системою термостатаампліфікатора. Недоліком методу є довготривалість проведення дослідження, висока вартість за рахунок необхідності наявності дорогого обладнання (ампліфікатора) та реактивів [1]. Найближчим аналогом є RT-LAMP з використанням реакційної суміші, в склад якої входять праймери, що описані в статті (S. Shivakoti et al.,2010) та Bst ДНК полімераза, яка застосовувалася іншими авторами з аналогічною метою [3]. В зв'язку з цим, актуальним питанням є розробка ефективного і швидкого методу детекції збудника. Правильний підбір складових компонентів реакційної суміші, оптимізація часу та температурного режиму для проведення реакції визначає ефективність і відтворюваність LAMP. Одним із таких є запропонований спосіб, який заснований на ізотермічній ампліфікації нуклеїнових кислот (LAMP). Задачею корисної моделі є створення нового способу виявлення вірусу грипу птиці субтипу H5N1 у патологічному матеріалі. Поставлена задача вирішується тим, що в досліджуваних зразках виявляють специфічні фрагменти за допомогою ізотермічної ампліфікації нуклеїнових кислот (LAMP), що включає індикацію в досліджувальних зразках специфічних фрагментів РНК за допомогою LAMP, згідно з корисною моделлю, використовують визначені праймери в поєднані з ферментом полімерази Bsm. Ампліфікація нуклеїнових кислот відбувається на водяній бані в ізотермічних умовах 59 °C протягом 60 хв.обємом 25 мкл, яка містить 5 L 10х Termopol буфера, 1 mmol/L бетаїну, 5 mmol/L MgSO4, 1,4 mmol/L деоксинуклеотид трифосфату (вNTP), 12,5 mol/L SYBR GREEN, 0,5 mmol/L MnCL2, Up to 25 L Nuclease-free water, 8 U Bsm DNA полімерази, 0,1 М/1 °F F3, 0,1 М/1 °F В3, 0,8 М/1 °F FIP, 0,8 М/1 °F ВІР, 0,4 М/1 °F LF, 0,4 °F LB, 2 L зразків кДНК з наступною візуальною інтерпретацією результатів при УФ-випромінюванні. Подібно звичайній ПЛР, ізотермічна ампліфікація дозволяє збільшувати вміст нуклеїнової кислоти в пробі в мільйони разів та дозволяє отримати готовий результат протягом години. Облік реакції проводять візуально шляхом додавання флуоресцентного реагенту (кальцеін і MnC12, SYBR GREEN та інш.) в реакційну суміш для спостереження за зміною кольору при денному світлі або ультрафіолетовому випромінюванні. 40 Оптимальний склад реакційної суміші для проведення RT-LAMP Компоненти реакційної суміші 10х Termopol буфер Betain MgSO4 Деоксинуклеотид трифосфату (dNTP) SYBR GREEN MnCL2 Nuclease-free water Bsm DNA полімерази F3 B3 FІР PRIMER BІР LF LB DNA Об'єм 2,5 μL 1 mmol/L 5 mmol/L 1,4 mmol/L 12,5 μmоl/L 0,5 mmol/L Up to 25 μL 8U 0,1 μmоl/L 0,1 μmоl/L 0,8 μmоl/L 0,8 μmоl/L 0,4 μmоl/L 0,4 μmоl/L 2μL 1 UA 100226 U 5 10 15 20 25 30 35 Приклад: пробу (гомогенат патологічного матеріалу тощо) (1г) поміщають у пластикову 3 3 пробірку ємністю 1,5 см і додають 0,5 см деіонізованої води. Суміш струшують і центрифугують, після чого проводять виділення РНК набором реагентів для виділення РНК. З виділеної РНК за допомогою реакції зворотної транскрипції синтезують кДНК. Вміст пробірки струшують і центрифугують, а потім переносять на водяну баню при температурі 59 °C на 60 хвилин. Детекцію продуктів реакції проводили візуально під УФ-світлом та за допомогою електрофорезу у 1,2 % агарозному гелі з використанням трис-боратного буфера при градієнті напруги 10 В/см. Результати оцінювали при перегляді гелю після електрофорезу на трансілюмінаторі під УФ-світлом за наявністю (або відсутністю) ампліконів різного розміру. Промислове застосування - для виявлення вірусу грипу птиці у патологічному матеріалі. Джерела інформації: 1. Francesco, Sidoti, Development of a Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assay for Type A Influenza Vims and Avian H5 and H7 Hemagglutinin Subtypes. / Francesca Sidoti, Francesca Rizzo, Cristina Costa and all // Моl. Biotechnol.-2010. Vol 44:41-50, P.41-50. 2. J. Ji, Molecular detection of Muscovy duck parvovirus by loop-mediated isothermal amplification assay. / J. Ji, Q. M. Xie, С Y. Chen and all // Pultru Science.-2010. - Vol 89: 477, P. 477-483. 3. Shivakoti, S., Ito, H., Murase, Т., Ono, E., Takakuwa, h., Yamashiro, Т., Otsuki. Development of reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for detection of avian influenza viruses in field specimens // J. Vet. Med. Sci.-2010. - Vol. 72. - P. 519-523. 4. Wai-Yip Lam, Development and Comparison of Molecular Assays for the Rapid Detection of the Pandemic Influenza A (HlNl) 2009 Virus. / Wai-Yip Lam, Ting-Fan Leung, Nelson Lee and all // Journal of Medical Virology.-2010. -Vol. 82: 675, P. 675-863. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб виявлення РНК вірусу грипу птиці субтипу H5N1 за допомогою реакції ізотермічної ампліфікації нуклеїнових кислот (LAMP), що включає індикацію в досліджуваних зразках специфічних фрагментів РНК за допомогою LAMP, який відрізняється тим, що для проведення LAMP використовують специфічну реакційну суміш при температурі 59 °C та 60 хвилин об'ємом 25 мкл, яка містить: 2,5 L 10х Termopol буфера, 1 mmol/L бетаїну, 5 mmol/L MgSO4, 1,4 mmol/L деоксинуклеотид трифосфату (вNTP), 12,5 mol/L SYBR GREEN, 0,5 mmol/L MnCL2, Up to 25 L Nuclease-free water, 8 U Bsm DNA полімерази, 0,1 М/1 of F3, 0,1 М/1 of В3, 0,8 М/1 of FIP, 0,8 М/1 of ВІР, 0,4 М/1 of LF, 0,4 of LB, 2 L зразків кДНК з наступною візуальною інтерпретацією результатів при УФ-випромінюванні. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2