Тест-система “dia-real-avian influenza” для виявлення рнк вірусу пташиного грипу типу а (h5n1) методом одностадійної зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу

Тест-система «DIA-REAL-AVIAN INFLUENZA» для виявлення РНК вірусу пташиного грипу типу A 3 18814 4 реагентів для виділення РНК «QIAamp Viral RNA Проведення одностадійної реакції зворотної Mini Kit» (QAIGEN, GmbH), який є складовою частранскрипції та полімеразної ланцюгової реакції на тиною корисної моделі. II етапі (ідентифікація клінічних зразків, що містять А саме, в необхідну кількість пробірок на 1,5мл РНК вірусу пташиного грипу типу А штаму H5N1). додають по 5мкл внутришнього контрольного зраДля проведення етапу ідентифікації відбиразку (ВКЗ) та 560мкл Буферу AVL (лізуючий розчин, ють РНК-проби тих клінічних зразків, які на І-етапі що містить носій РНК (poly-А), а також по 140мкл мали позитивний результат. Готують відповідну досліджуваної проби. Перемішують за допомогою кількість мікропробірок (0,2мкл) з оптичноцентрифуги-вортекса 15 секунд і залишають у прозорими кришками або 96-пробірковий планшет штативі на 10хв. при кімнатній температурі (15(Applied Biosystems, USA), в який вносять по 20мкл 25°С). Потім в кожну пробірку додають по 560мкл реакційної суміші Master-mix 2 (до складу якого етилового спирту (96-100%) і ретельно перемішувходять MultiScribe ревертаза, AmpliTaq Gold ють. Далі обережно переносять з кожної пробірки Polymerase та всі необхідні компоненти для просуміш об'ємом 630мкл, що утворилась на попереведення одностадійної реакції зворотної транскридньому етапі до відповідної окремої QiAamp колопції та полімеразної ланцюгової реакції, праймери нки (яку попередньо встановили у 2-мл пробірку та TaqMan-проби для одночасної ідентифікації для збору надосадової рідини). Після центрифугуспецифічних послідовностей генів Н5 та N1) і туди вання при 8000об/хв. протягом 1 хвилини, QiAamp додають по 5мкл РНК-проби. Обережно центрифуколонку переносять у чисту 2-мл пробірку для збогують при 2000об/хв. протягом 30сек. в центрифузі ру надосадової рідини. Додають в пробірки по з ротором для 96-пробіркових планшетів і став500мкл буферу AW1. Знов центрифугують при лять у сиквінатор реального часу АВІ PRISM 7000 8000об/хв. протягом 1хв. Обережно переносять (Applied Biosystems, USA). Програмують прилад кожну QiAamp колонку у чисту 2-мл пробірку для для виконання наступного температурного режиму збору надосадової рідини і додають 500мкл Буфеампліфікації: ру AW2. Центрифугують при 14000об/хв. протягом 1. 48°С - 45хв 1 цикл 3 хвилин. Переносять кожну QiAamp колонку у 2. 94°С - 10хв 1 цикл чисту 1,5-мл пробірку і додають 60мкл Буферу 3. 94°С - 15сек AVE для елюції РНК з колонки і залишають для 55°С - 30сек. інкубації з буфером у штативі при кімнатній темпе72°С - 40сек. 1 цикл ратурі протягом 1хв. Центрифугують при Детекція продуктів ампліфікації в кожній пробі8000об/хв. протягом 1 хвилини для збору супернарці відбувається автоматично за допомогою ССД танту, що містить чисті РНК ортоміксовірусу та камери приладу АВІ PRISM 7000. програмне заРНК транскрипт ВКЗ. безпечення приладу автоматично обраховує реПроведення одностадійної реакції зворотної зультати відносно результатів, отриманих при тестранскрипції та полімеразної ланцюгової реакції на туванні контролів та визначає наявність чи І етапі (скринінговий відбір клінічних зразків, що відсутність РНК вірусу пташиного грипу типу містять РНК вірусу пташиного грипу типу А). A(H5N1) в кожній взятій для ідентифікації пробі Готують мікропробірки (0,2мкл) з оптичноклінічного зразка. прозорими кришками або 96-пробірковий планшет Приклад 2. Визначення чутливості та специфі(Applied Biosystems, USA), в який вносять по 20мкл чності пропонованої тест-системи. реакційної суміші Master-mix 1 (до складу якого Специфічність тест-системи визначалась при входять MultiScribe ревертаза, AmpliTaq Gold тестуванні панелі різних штамів ортоміксовірусів Polymerase та всі необхідні компоненти для про(віруси грипу типу В та типу С), аденовірусів, герведення одностадійної реакції зворотної транскрипес вірусів людини; респіраторно-синцитіального пції та полімеразної ланцюгової реакції) і додають вірусу типу А та В; вірусів парагрипу 1, 2, та 3 типо 5мкл РНК-проби та позитивних(QS1, QS2, QS3, пів. Всього було проконтрольовано 59 штамів віруQS4) і негативного контролів для даного етапу. сів та клінічний матеріал від здорових людей - 52 Обережно центрифугують при 2000об/хв. протязразка смивів з носоглотки та 30 зразків фекалій. гом 30сек в центрифузі з ротором для 96Специфічність пропанованої тест-системи пробіркових планшетів і ставлять у сиквінатор рестановила 100%, а аналітична чутливість тестального часу АВІ PRISM 7000 (Applied Biosystems, системи - 103 копій/мкл геному вірусу пташиного USA). Програмують прилад для виконання наступгрипу типу А штаму H5N1. ного температурного режиму ампліфікації: Таким чином, пропонована тест-система за1. 48°С - 45хв 1 цикл безпечує виявлення вірусу пташиного грипу типу А 2. 94°С - 10хв 1 цикл штаму H5N1. Тест-система надійна в роботі, про3. 94°С - 15сек являє високу чутливість та специфічність. 53°С - 30сек. Використана література: 72°С - 40сек. 1 цикл 1. Influenza Report 2006 // Kamps B.S., Hoffman Детекція продуктів ампліфікації в кожній пробіCh., Preiser W. 2006. Flying publisher - Paris, 2006, рці відбувається автоматично за допомогою ССД 225р. камери приладу АВІ PRISM 7000. програмне за2. Інструкція до тест-системи "Artus ™ безпечення приладу автоматично обраховує реInfluenza/H5 LC" RT-PCR kit for use with the зультати відносно результатів, отриманих при тесLίghtCyclerR Instrument (Roche Diagnostics). User туванні контролів та визначає наявність чи Manual. November 2005. 12 p. "Artus GmbH" (Німевідсутність РНК вірусу пташиного грипу типу ччина) A(HxNx) в кожній пробі клінічного зразка. 5 Комп’ютерна верстка М. Мацело 18814 6 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601